title: Genética inversa

text: En la mutagénesis dirigida por PCR, se seleccionan dos primers diferentes para que se unan a partes específicas del DNA, uniéndose ambos a los extremos 5’, cada uno en uno, uniéndose entonces los dos primers que habíamos seleccionado a sus lugares correspondientes. Uno de los primers corresponde al fenotipo normal y el otro al fenotipo mutante. A continuación la polimerasa realiza su función completando las moléculas dúplex, es decir, a partir de una dúplex se han obtenido dos monocadenas y a partir de ellas dos dúplex. Se vuelven a desnaturalizar dichas moléculas, por lo que ahora tendremos cuatro monocadenas, dos de ellas normales y dos de ellas con los fragmentos de nuestros dos primers (uno de ellos mutante). Se vuelve a producir la hebra que falta, pero ahora obtenemos una molécula duplex en la cual la polimerasa ha codificado la secuencia complementaria de nuestro primer mutante. Con esto, ya tenemos una molécula dúplex de DNA en la cual ambas hebras han cambiado unos pocos pares de bases con respecto a la salvaje. Este ciclo se sigue repitiendo un número determinado de veces, normalmente sobre las 40, y en ese momento la mutagénesis es detenida. Ya tenemos un número suficiente de cadenas de DNA mutadas como para considerar insignificantes a las cadenas no mutadas. Por último, la sección mutada del DNA se introduce en el organismo que hallamos elegido, normalmente una bacteria.


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text: Un ratón knockout es un ratón de laboratorio en el cual los investigadores han inactivado un gen reemplazándolo o interrumpiendo su secuencia con una secuencia de DNA artificial. La pérdida de la actividad del gen puede causar cambios en el fenotipo del ratón, lo que incluye apariencia, comportamiento y diversas características físicas y bioquímicas. Los primeros ratones knockout fueron creados por M. Capecchi, M. Evans y O. Smithies en 1989, ganando por ello el Nobel de Medicina en 2007.


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text: Inactivar la función de un gen nos da información sobre la función de dicho gen. Se han usado en el estudio de diferentes tipos de cáncer, obesidad, enfermedades cardíacas, diabetes,…así como en el Parkinson. También se usan para probar diferentes terapias y drogas que posteriormente se aplicarán a humanos, ya que compartimos una buena parte del genoma.


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text: Tiene varias desventajas, entre ellas que puede ser que la alteración de un gen no produzca resultados visibles o que no sean aplicables al ser humano, además de que algunas inactivaciones impiden que se desarrolle el embrión del ratón.


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text: En ambas técnicas, el vehículo utilizado suele ser un vector viral modificado o un fragmento lineal de DNA bacteriano. Las células madre embrionarias alteradas se cultivan en el laboratorio para posteriormente inyectarlas en embriones de ratón en sus primeros estadios. Después se implantan en el útero de una hembra de ratón. Los ratones resultantes tienen algunos tejidos en los cuales el gen ha sido inactivado, y otros en los que el gen sigue cumpliendo su función. Para obtener un ratón knockout completo se deben cruzar estos ratones hasta obtener líneas puras en las que la mutación se encuentre en los dos cromosomas, es decir, que todos los tejidos tengan el gen inactivado (homocigotos).


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text: Según la definición clásica, una fenocopia es un individuo cuyo fenotipo bajo unas determinadas condiciones ambientales es idéntico al de otro individuo cuyo fenotipo es determinado por su genotipo. Pero en este caso se refiere a la obtención de líneas de individuos con un gen inactivado, obteniendo toda una progenie de individuos mutantes que podremos estudiar.


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text: Fundamentalmente se usan dos mecanismos. Uno de ellos se basa en el t-RNA, que provoca que los niveles de mRNA bajen drásticamente y por lo tanto el gen no se pueda expresar, es decir se silencie. El otro mecanismo implica técnicas de genética química, siendo el objetivo de la fenocopia la misma proteína. Se basa en reducir la actividad del producto proteico del gen en estudio mediante la unión de una pequeña molécula inhibidora.


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text: El TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes) es una técnica que usa los métodos de la mutagénesis química tradicional para crear bibliotecas de individuos mutantes que se someterán a pruebas de alto rendimiento para descubrir las mutaciones. Se utiliza sobre todo en plantas, pero también se puede utilizar en animales como el "C. elegans".


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text: El proceso se basa en la habilidad de una enzima especial de detectar desajustes en el DNA tanto normal como mutante.


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text: En plantas, las semillas se tratan con etilmetanosulfonato (EMS) para generar una población de plantas con mutaciones aleatorias. Seleccionando los fragmentos y amplificándolos con primers marcados fluorescentemente, se observan los heteroduplex desajustados formados entre el DNA normal y el mutado. A continuación se incuban con la endonucleasa CEL I de la planta, que parte el heteroduplex por las zonas en que se localizan los desajustes. Por último se analiza el DNA de las plantas para identificar los mutantes.


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text: También conocido cono Seattle Tilling Project (STP). Se ocupa de mejorar el rendimiento de las distintas metodologías de TILLING, así como en la detección de las mutaciones. También se encargan de pedidos, es decir, les encargan producir mutaciones en distintos genes. Los análisis de las generaciones filiales, así como el desarrollo de las mismas, van a cagro del cliente.Los resultados son accesibles desde la base de datos de la Arabidopsis Information Resource.


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text: Es una variacíón de la PCR que permite realizar una amplificación de las regiones que flanquean a ambos lados a una secuencia conocida de DNA. Se puede producir la PCR incluso cuando se conoce solo una secuencia para elaborar los primers. Es especialmente útil para la determinación de inserciones.


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text: Primero, se identifica la región a analizar en la que la sección interna es conocida y las que la flanquean no lo son. El DNA se digiere en fragmentos de unas pocas kilobases por enzimas de restricción. Se induce el auto-ligamiento de esos fragmentos para generar un DNA circular y posteriormente se sigue con la PCR normal, con primers complementarios a las secciones de la secuencia interna conocida.


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text: La clonación tiene diferentes significados en contextos biológicos si nos referimos al ámbito de la Ingeniería Genética, clonar es aislar y multiplicar en tubo de ensayo un determinado gen o, en general, un trozo de ADN.