title: 1996 m. liepos 30 d. Tarybos direktyva 96/54/EB, dvidešimt antrą kartą derinanti su technikos pažanga Direktyvą 67/548/EEB dėl pavojingų medžiagų klasifikavimą, pakavimą ir ženklinimą reglamentuojančių įstatymų ir kitų teisės aktų suderinimoTekstas svarbus EEE

eurovoc_concepts:
approximation of laws
chemical product
dangerous substance
labelling
packaging

formats: html pdf print

text: 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 31996L0054 1996 9 30 EUROPOS BENDRIJŲ OFICIALUSIS LEIDINYS TARYBOS DIREKTYVA 96/54/EB 1996 m. liepos 30 d. dvidešimt antrą kartą derinanti su technikos pažanga Direktyvą 67/548/EEB dėl pavojingų medžiagų klasifikavimą, pakavimą ir ženklinimą reglamentuojančių įstatymų ir kitų teisės aktų suderinimo (tekstas svarbus EEE) 173 L 248/1 EUROPOS BENDRIJŲ KOMISIJA, atsižvelgdama į Europos bendrijos steigimo sutartį, atsižvelgdama į 1967 m. birželio 27 d. Tarybos direktyvą 67/548/EEB dėl pavojingų medžiagų klasifikavimą, pakavimą ir ženklinimą reglamentuojančių įstatymų ir kitų teisės aktų suderinimo (1) su paskutiniais pakeitimais, padarytais Komisijos direktyva 94/69/EEB (2), ypač į jos 28 straipsnį, kadangi Direktyvos 67/548/EEB V priede nustatyti medžiagų ir preparatų fizikinių cheminių savybių, toksiškumo ir ekotoksiš- kumo nustatymo metodai; kadangi nurodytą priedą būtina suderinti su technikos pažanga; kadangi Direktyvos 67/548/EEB VI priede yra pateikti bendrieji pavojingų medžiagų klasifikavimo ir ženklinimo kriterijai; ka- dangi būtina nustatyti medžiagų ir preparatų, pavojingų sveika- jų įkvėpus, kriterijus; kadangi būtina iš dalies pakeisti tai jautrinančių medžiagų ir preparatų kriterijus; kadangi būtina nustatyti dujų konteinerių, skirtų propanui, butanui ar suskys- tintosioms naftos dujoms, ženklinimo kriterijus; kadangi šioje direktyvoje numatytos priemonės atitinka Direk- tyvų dėl techninių kliūčių panaikinimo pavojingų medžiagų ir srityje derinimo su technikos pažanga preparatų prekybos komiteto nuomonę, įgalinantys įvertinti kadangi Tarybos direktyvos 67/548/EEB I priede yra pateiktas pavojingų medžiagų sąrašas, šių medžiagų klasifikavimas, žen- klinimas ir, tam tikrais atvejais, jų apibūdinimas pagal koncent- jų racijos apribojimus bei kiti parametrai, keliamą riziką žmonių sveikatai ar aplinkai; kadangi I priede pateiktą sąrašą reikia suderinti su turimomis mokslo ir techni- kos žiniomis; kadangi, todėl, būtina iš dalies pakeisti I priedo įtraukiant pastabas apie preparatų ženklinimą ir B pratarmę, lentelę papildant nauja organinių medžiagų grupe; kadangi I priede pateikiamame pavojingų medžiagų sąraše yra medžiagų, dėl kurių Austrijos, Suomijos ir Švedijos stojimo aktu Austrijai ir Švedijai buvo suteiktos konkrečios laikinos leidžiančios nu- krypti nuo klasifikavimo ir ženklinimo reikalavimų nuostatos; kadangi Stojimo aktas numato tų medžiagų klasifikavimo ir ženklinimo reikalavimų peržiūrą; kadangi kai kurių iš tų me- džiagų klasifikavimas buvo atitinkamai peržiūrėtas; PRIĖMĖ ŠIĄ DIREKTYVĄ: 1 straipsnis Direktyva 67/548/EEB iš dalies keičiama taip: 1. I priedas iš dalies keičiamas taip: a) pratarmės 4 pastaba pakeičiama tokiu tekstu: kadangi Direktyvos 67/548/EEB III priede yra pateiktas su pavojingomis medžiagomis ir preparatais susijusios specialios rizikos pobūdį nurodančių frazių sąrašas; kadangi būtina nus- tatyti tam tikrų įkvėptų medžiagų ir preparatų keliamą pavojų sveikatai nurodančią frazę; „4 pastaba (1) OL L 196, 1967 8 16, p. 1. (2) OL L 381, 1994 12 31, p. 1. Preparatai, kurių sudėtyje yra šių medžiagų, klasifikuoja- mi kaip kenksmingi su R65 fraze, jeigu jie atitinka VI priedo 3. 2. 3 skirsnio kriterijus. “; 174 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. b) pridedama ši 5 pastaba: „5 pastaba Dujinių preparatų koncentracijos apribojimai tūrio procentais. “; išreiškiami c) Direktyvos 67/548/EEB I priedo pratarmės B lentelė papildoma tokia specialia organinių medžiagų klasifika- cija: d) šios direktyvos I priede pateikiami kamus įrašus; įrašai pakeičia atitin- e) šios direktyvos II priedo įrašai įtraukiami pirmą kartą; f) toliau nurodytais numeriais pažymėti įrašai išbraukiami: 008-002-00-3 612-045-00-9 648-011-00-5 648-025-00-1 648-157-00-X 648-158-00-5 648-159-00-0 649-192-00-3 g) šios direktyvos III priede nurodomi įrašai iš dalies keičia- mi pakeičiant visas „R 22“ nuorodas „R65“ nuorodomis. 2. III priede pridedama tokia frazė: 3. V priedo B dalis iš dalies keičiama taip: a) šios direktyvos IV priedo A punkto tekstas pakeičia B dalies antraštę ir bendrą įvadą: Toksiškumo nustatymo metodai; b) šios direktyvos IV priedo B punkto tekstas įterpiamas po B. 1 bis skyriaus; c) šios direktyvos IV priedo C punkto tekstas pakeičia B. 6 skyrių; d) šios direktyvos IV priedo D punkto tekstas pakeičia B. 7 skyrių; e) pabaigoje pridedamas šios direktyvos IV priedo E punkto tekstas. 4. VI priedas iš dalies keičiamas šios direktyvos V priede nurodytais tekstais priede nurodytomis sąlygomis. 2 straipsnis Nepažeidžiant 2 dalies, valstybės narės priima įstatymus 1. ir kitus teisės aktus, kurie, įsigalioję ne vėliau kaip iki 1998 m. gegužės 31 d. , įgyvendina šią direktyvą. Apie tai valstybės narės nedelsdamos praneša Komisijai. Valstybės narės priima įstatymus ir kitus teisės aktus, 2. įsigalioję ne vėliau kaip iki 1997 m. spalio 31 d. , kurie, įgyvendina šios direktyvos V priedo F, I ir J punktus. Apie tai valstybės narės nedelsdamos praneša Komisijai. Valstybės narės, 3. tvirtindamos 1 ir 2 dalyje nurodytas nuostatas, daro jose nuorodą į šią direktyvą arba tokia nuoroda daroma jas oficialiai skelbiant. Nuorodos darymo tvarką nusta- to valstybės narės. 3 straipsnis Ši direktyva įsigalioja dvidešimtą dieną po jos paskelbimo Europos Bendrijų oficialiajame leidinyje. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 175 Ši direktyva skirta valstybėms narėms. Priimta Briuselyje, 1996 m. liepos 30 d. 4 straipsnis Komisijos vardu Ritt BJERREGAARD Komisijos narė 176 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 177 ANEXO I — BILAG I — ANHANG I — ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ I — ANNEX I — ANNEXE I — ALLEGATO I — BIJLAGE I — ANEXO I — LIITE I — BILAGA I 178 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 179 180 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 181 182 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 183 184 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 185 186 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 187 188 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 189 190 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 191 192 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 193 194 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 195 196 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 197 198 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 199 200 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 201 202 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 203 204 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 205 206 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 207 208 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 209 210 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 211 212 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 213 214 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 215 216 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 217 218 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 219 220 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 221 222 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 223 224 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 225 226 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 227 228 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 229 230 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 231 232 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 233 234 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 235 236 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 237 238 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 239 240 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 241 242 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 243 244 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 245 246 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 247 248 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 249 250 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 251 252 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 253 254 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 255 256 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 257 258 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 259 260 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 261 262 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 263 264 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 265 266 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 267 268 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 269 270 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 271 272 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 273 274 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 275 276 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 277 278 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 279 280 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 281 282 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 283 284 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 285 286 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 287 288 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 289 290 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 291 292 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 293 294 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 295 296 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 297 298 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 299 300 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 301 ANEXO II — BILAG II — ANHANG II — ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ II — ANNEX II — ANNEXE II — ALLEGATO II — BIJLAGE II — ANEXO II — LIITE II — BILAGA II 302 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 303 304 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 305 306 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 307 308 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 309 310 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 311 312 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 313 314 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 315 316 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 317 318 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 319 320 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 321 322 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 323 324 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 325 326 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 327 328 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 329 330 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 331 332 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 333 334 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 335 336 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 337 338 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 339 340 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 341 342 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 343 344 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 345 346 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 347 348 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 349 350 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 351 352 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 353 354 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 355 356 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 357 358 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 359 ANEXO III — BILAG III — ANHANG III — ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ III — ANNEX III — ANNEXE III — ALLEGATO III — BIJLAGE III — ANEXO III — LIITE III — BILAGA III Index No 360 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 361 „B DALIS: TOKSIŠKUMO IR KITŲ POVEIKIŲ SVEIKATAI USTATYMO METODAI IV A PRIEDAS BENDRASIS ĮVADAS: B DALIS A. AIŠKINAMOJI PASTABA Bendrojo įvado tikslams taikomi žemiau išvardinti tyrimai: B. 15. Geno mutacija – Saccharomyces cerevisiae B. 16. Mitotinė rekombinacija – Saccharomyces cerevisiae B. 17. Žinduolių ląstelės geno mutacijos in vitro tyrimas B. 18. Žinduolių ląstelės DNR pažeidimas ir klaidinga DNR sintezė in vitro B. 19. Seserinių chromatidžių pasikeitimas in vitro B. 20. Su lytim susijęs recesyvinis letalinis Drosophila melanogaster tyrimas B. 21. Žinduolių ląstelės transformacijos in vitro tyrimai B. 22. Graužimų dominantinės letalinės mutacijos tyrimas B. 23. Žinduolių gemalo ląstelės citogenetika in vivo B. 24. Pelės taškinės mutacijos tyrimas B. 25. Pelės paveldima translokacija B. 26. Subchroninis toksiškumo tyrimas per virškinamąjį traktą: 90 dienų pakartotina dozė per virškinamąjį traktą, naudojant graužikų rūšis B. 27. Subchroninis toksiškumo tyrimas per virškinamąjį traktą: 90 dienų pakartotina dozė per virškinamąjį traktą, naudojant ne graužikų rūšis B. 28. Subchroninis toksiškumo tyrimas per odą: 90 dienų pakartotinos dozės per odą tyrimas, naudojant graužikų rūšis B. 29. Subchroninis toksiškumo tyrimas per kvėpavimo takus: 90 dienų pakartotinos dozės per kvėpavimo takus tyrimas, naudojant graužikų rūšis B. 30. Chroninis (lėtinis) toksiškumo tyrimas B. 31. Teratogeniškumo tyrimas – graužikai ir ne graužikai B. 32. Kancerogeniškumo tyrimas B. 33. Kombinuotas chroninis toksiškumo/kancerogeniškumo tyrimas B. 34. Vienos kartos reprodukcinio toksiškumo tyrimas B. 35. Dviejų kartų reprodukcinio toksiškumo tyrimas B. 36. Toksikokinetika B. TERMINŲ, NAUDOJAMŲ ŠIO PRIEDO TYRIMO METODUOSE, PAGRINDINIAI APIBRĖŽIMAI i) Ūmus toksiškumas yra neigiamas medžiagos poveikis, pasireiškiantis per tam tikrą laiko tarpą (paprastai per 14 dienų), po gautos vienkartinės medžiagos dozės. ii) Aiškus toksiškumas yra bendras terminas, apibūdinantis aiškius tiriamosios medžiagos sukeltus toksiškus Jo turėtų pakakti rizikos įvertinimui, o padidinus gaunamą dozę gali pasireikšti sunkūs toksiniai požymius. pakenkimai ir žūtis. iii) Dozė yra gautas tiriamosios medžiagos kiekis. Dozė yra išreiškiama mase (gramais ar miligramais) arba (pvz. , miligramas kilogramui kūno masės), arba tiriamosios medžiagos mase tiriamojo gyvūno masės vienetui kaip pastovi pašarų koncentracija (ppm-milijoninė dalis arba miligramas maisto kilogramui). iv) Diskriminacinė dozė yra keturių fiksuotų dozių didžiausias lygis, kuris nesukelia su junginiu susijusios žūties (tame tarpe humaniškų nužudymų). 362 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. v) Dozavimas tai yra bendras terminas, reiškiantis dozę, jos dažnumą ir dozės davimo laikotarpį. vi) LD50 (median lethal dose – vidutinė mirtina dozė) tai yra statistiškai apskaičiuota vienkartinė medžiagos dozė, kuri gali sukelti 50 % tiriamųjų gyvūnų žūtį. vii) LC50 (median lethal concentration – vidutinė mirtina koncentracija) tai yra statistiškai apskaičiuota medžiagos koncentracija, kuri poveikio metu arba po tam tikro laiko tarpo gali sukelti 50 % tiriamųjų gyvūnų žūtį. LC50 vertė yra išreikšta kaip bandomosios medžiagos masė oro etaloniniam tūrio vienetui (miligramais litre). viii) NOAEL (no observed adverse effect level – nepastebimo neigiamo poveikio lygis – NNPL) didžiausia dozė ar poveikio lygis, kuris nesukelia su poveikiu susijusių matomų pakitimų. tai yra ix) Pakartotinos dozės/Subchroninis toksiškumas apima neigiamus poveikius eksperimentiniams gyvūnams, ku- riuos sukelia kasdienė pakartotina dozė arba chemikalo veikimas per trumpą gyvūno gyvenimo amžiaus trukmę. x) Didžiausia toleruojama dozė (DTD) tai yra didžiausios dozės lygis, sukeliantis gyvūnui toksinius požymius, tačiau nekeliantis žūties vykdomame tyrime. xi) Odos dirginimas tai yra tiriamosios medžiagos odos uždegiminių pakitimų sukėlimas jos aplikacija. xii) Akies dirginimas tai yra tiriamosios medžiagos akies pakitimų sukėlimas jos priekinio paviršiaus aplikacija. xiii) Odos sensibilizacija (alerginis kontaktinis dermatitas) tai yra imuninės kilmės odos reakcija į medžiagą. xiv) Odos ardymas tai yra negrįžtamas odos audinio pažeidimas, kurį sukelia nuo 3 min. tiriamosios medžiagos odos aplikacija. iki 4 valandų laikoma xv) Toksikokinetika yra tiriamosios medžiagos absorbcijos, pasiskirstymo, metabolizmo ir ekskrecijos tyrimas. xvi) Absorbcija yra procesas (-ai), kurio metu duota medžiaga yra organizmo pasisavinama. xvii) Ekskrecija (pašalinimas) yra procesas (-ai), kurio metu duota medžiaga ir (arba) jos metabolitai yra pašalinami iš organizmo. xviii) Pasiskirstymas yra procesas (-ai), kurio metu absorbuota medžiaga ir (arba) jos metabolitai pasiskirsto organizme. xix) Metabolizmas yra procesas (-ai), kurio metu duota medžiaga fermentinių arba ne fermentinių reakcijų dėka organizme struktūriškai pakinta. B. I Ūmus – pakartotinos dozės/subchroninis ir chroninis toksiškumas Ūmūs medžiagos toksiniai poveikiai arba jos toksiškumas organui ar jų sistemai gali būti nustatyti, naudojant daugelį vienkartinės dozės tyrimų (Metodai B. 1–B. 5). Priklausomai nuo medžiagos toksiškumo, gali būti panaudojamas LD50 ribinis bandymas, tačiau jis netaikomas tyrimams per kvėpavimo takus, todėl kad yra neįmanoma nustatyti vienkartinio poveikio per kvėpavimo takus ribinės reikšmės. Dėmesys turėtų būti kreipiamas į tuos metodus, kurie naudoja kiek įmanoma mažiau gyvūnų bei kuriuose jie mažiausiai kenčia, kaip pavyzdžiui fiksuotos dozės metodas (Metodas B. 1 bis) ar ūmios toksinės klasės metodas (Metodas B. 1 tris). Antros gyvūnų rūšies tyrimus gali papildyti pradinių rūšių tyrimų išvados. Tokiais atvejais gali būti naudojami standartiniai tyrimo metodai arba šie metodai gali būti pritaikyti mažesniam gyvūnų skaičiui. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 363 Pakartotinos dozės toksiškumo tyrimas (Metodai B. 7, B. 8 ir B. 9) įvertina toksinius poveikius, kai gyvūnas medžiagą gauna pakartotinai. Tam kad gauti kuo daugiau informacijos, būtini tikslūs gyvūnų klinikiniai stebėjimai. Šie tyrimai padeda nustatyti organus taikinius bei toksiškas ir ne toksiškas dozes. Tolesnis ir gilesnis šių aspektų nagrinėjimas gali būti pratęstas ilgalaikiais tyrimais (Metodai B. 26–B. 30 ir B. 33). B. II Mutageniškumas – Genotoksiškumas Mutageniškumas susijęs su ląstelių ar organizmų genetinės medžiagos kiekio ar struktūros negrįžtamais persiduodančiais pokyčiais. Šie pokyčiai, „mutacijos“, gali apimti vieną geną ar jo segmentą, genų rinkinį ar visas chromosomas. Poveikiai gali keisti visų chromosomų struktūrą ir (ar) jų skaičių. Medžiagos mutageninis aktyvumas nustatomas bakterijos geno (taškinės) mutacijų (Metodas B. 13/14) ir (ar) žinduolių ląstelių chromosomos struktūrinių aberacijų (Metodas B. 10) in vitro bandymais. Tai pat taikomos in vivo procedūros, pvz. mikrobranduolių tyrimas (Metodas B. 12) arba kaulų čiulpų ląstelių metafazės tyrimas (Metodas B. 11). Tačiau nesant kontraindikacijų, griežta pirmenybė teikiama in vitro metodams. įvertinti riziką, keliamą žmonių sveikatai, tolesniam Jeigu medžiaga gaminama dideliais kiekiais ir (ar) stengiamasi mutageniškumo tyrimui arba kancerogenų priešatrankai gali būti reikalingi papildomi tyrimai. Jie skirti pagrindiniuose tyrimuose gautų rezultatų patvirtinimui, dar netirtų uždavinių sprendimui bei in vivo tyrimų pradėjimui arba tęsimui. Metodai B. 15–B. 25 naudoja ir in vivo ir in vitro eukariotines sistemas bei išplečia biologinių uždavinių sritį. Šie tyrimai teikia informaciją apie taškines mutacijas bei kitus pokyčius, vykstančius daug sudėtingesniuose organizmuose negu bakterijos. Reikia taip suplanuoti tolesnę mutageniškumo tyrimų programą, kad ji teiktų svarbios papildomos informacijos apie medžiagos mutageninį ir (ar) kancerogeninį pajėgumą. Kiekvienu konkrečiu atveju tyrimai priklausys nuo daugelio faktorių, tame tarpe nuo fizikinių ir cheminių medžiagos savybių, nuo pradinių bakterijų ir citogenetinių tyrimų rezultatų, nuo medžiagos metabolinių savybių, nuo kitų toksiškumo tyrimo rezultatų ir nuo medžiagos panaudojimo masto. Dėl daugybės šių faktorių, į kuriuos būtina atsižvelgti, griežta tyrimų atrankos schema netaikoma. Direktyva 93/67/EEC nustato kai kuriuos bendruosius tyrimo strategijos principus, o specialiuose rizikos įvertinimo direktyviniuose dokumentuose galima rasti aiškias tyrimo strategijas, kurios yra lanksčios ir taikomos konkrečioms sąlygoms. Žemiau pateikiami tolesnių tyrimų metodai, sugrupuoti pagal jų pagrindinius genetinius tikslus. Genų (taškinių) mutacijų tyrimai a) Ankstyvų ar atvirkštinių mutacijų tyrimai, naudojant eukariotinius mikroorganizmus (Saccharomyces cerevisiae) (Meto- das B. 15) b) Ankstyvųjų mutacijų žinduolių ląstelėse in vitro tyrimai (Metodas B. 17) c) Su lytim susijęs recesyvinis letalinis Drosophila melanogaster tyrimas (Metodas B. 20) d) Somatinės ląstelės mutacijos in vivo tyrimas, pelės taškinės mutacijos tyrimas (Metodas B. 24) Chromosomų aberacijų tyrimai a) Žinduolių citogenetiniai in vivo tyrimai; jeigu pradiniame įvertinime neatliktas kaulo čiulpų ląstelių metafazės analizės in vivo tyrimas (Metodas B. 11), jį reiktų atlikti. Papildomai galima tirti žinduolių gemalo ląstelės citogenetiką in vivo (Metodas B. 23) b) Jeigu pradiniame įvertinime žinduolių ląstelių citogenetiniai reiktų atlikti in vitro tyrimai (Metodas B. 10) nebuvo įtraukti, juos c) Graužikų dominantinės letalinės mutacijos tyrimai (Metodas B. 22) d) Pelės paveldimos translokacijos tyrimas (Metodas B. 25) 364 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. Genotoksiniai poveikiai – poveikiai DNR Genotoksiškumas yra potencialiai žalingas poveikis genetinei medžiagai, nebūtinai susijęs su mutageniškumu; poveikio metu sukeliami DNR pažeidimai tiesiogiai neįrodo mutacijų buvimo. Tokiems tyrimams galima pasitelkti metodus, naudojančius eukariotinius mikroorganizmus arba žinduolių ląsteles: a) Saccharomyces cerevisiae mitotinė rekombinacija (Metodas B. 16) b) Žinduolių ląstelės DNR pažeidimas ir klaidinga DNR sintezė in vitro (Metodas B. 18) c) Seserinių chromatidžių pasikeitimo in vitro tyrimas (Metodas B. 19) Kancerogeninio potencialo alternatyvūs tyrimo metodai Žinduolių ląstelės transformacijos tyrimai įvertina medžiagos sugebėjimą sukelti ląstelių kultūrų morfologinius ar elgesio pakitimus, kas susiję su žalinga transformacija in vivo (Metodas B. 21). Šiuose tyrimuose gali būti panaudoti skirtingi ląstelių tipai bei transformacijos vertinimų kriterijai. Paveldimų poveikių žinduoliams rizikos įvertinimas Yra metodai, galintys nustatyti žinduolių paveldimus pakitimus, kuriuos sukelia genų (taškinės) mutacijos, pvz. pelės specifinis lokuso tyrimas, skirtas nustatyti pirmos generacijos gemalo ląstelės mutacijoms (nėra įtrauktas į priedą) arba, pvz. , pelės paveldimos translokacijos tyrimas (Metodas B. 25), skirtas nustatyti chromosomų aberacijoms. Šie metodai tada, kai yra vertinamas medžiagos sugebėjimas kelti genetinę riziką žmogui. Tačiau dėl šių tyrimų naudojami sudėtingumo ir dėl jiems būtino labai didelio gyvūnų skaičiaus, ypač specifiniam lokuso tyrimui, reikalingas labai aiškus šių tyrimų būtinumo pagrindimas. B. III Kancerogeniškumas Žinant veikimo mechanizmą, kancerogenai gali būti apibūdinami kaip genotoksiniai arba ne genotoksiniai. Pradinė informacija apie medžiagą kaip galimą genotoksinį kancerogeną, gaunama iš mutageniškumo/genotoksiškumo tyrimų. Papildoma informacija gaunama iš pakartotinos dozės, subchroninio ar chroninio toksiškumo testų. Pakartotinos dozės toksiškumo testas, Metodas B. 7 ir ilgesnieji pakartotinos dozės tyrimai įvertina rastus histopatologinius pakitimus, pvz. , kai kurių audinių hiperplaziją. Šie tyrimai bei toksikokinetinė informacija gali tik padėti nustatyti potencialius kancerogenus, tačiau reikalingi tolesni gilesni tyrimai, naudojant kancerogeniškumo testą (Metodas B. 32) arba kombi- nuotą chroninio toksiškumo/kancerogeniškumo tyrimą (Metodą B. 33). B. IV Toksiškumas reprodukcijai Reprodukcinis toksiškumas gali būti nustatytas skirtingais būdais, pvz. , aptinkant patino ir patelės reprodukcinių funkcijų ir pajėgumo pakenkimą, apibūdinamą kaip „poveikiai vaisingumui“, arba sukeliant nepaveldimus palikuonių sveikatos sutrikimus, apibūdinamus kaip „vystymosi toksiškumas“, kuris apima teratogeniškumą bei poveikius laktacijos periodu. toksiškumo tyrimo dalis, visų pirma skirti medžiagos Teratogeniškumo tyrimai patekimui per virškinamąjį traktą. Pasirinktinai gali būti naudojami ir kiti patekimo keliai, atsižvelgiant į tiriamosios medžiagos fizikines savybes bei žmogui būdingus patekimo kelius. Tokiais atvejais tiriamasis metodas turėtų būti atitinkamai pakeistas pagal 28 dienų tiriamojo metodo atitinkamas dalis. (Metodas B. 31), kaip vystymosi Jeigu reikalingas trijų kartų reprodukcijos (vaisingumo) tyrimas, dviejų kartų reprodukcijos tyrimas (Metodas B. 35) gali būti pratęstas iki trijų kartų. B. V Neurotoksiškumas Neurotoksiškumas gali būti nustatytas skirtingais būdais, pvz. , aptinkant centrinėje ir periferinėje nervų sistemoje funkcinius ir (arba) struktūrinius ir biocheminius pakitimus. Preliminarinė informacija, kad medžiaga neurotoksiška, gali būti gauta ūmių toksiškumo tyrimų metu. Pakartotinos dozės toksiškumo testas, Metodas B. 7, įtraukia neurotoksi- kologinių poveikių įvertinimą bei tikslius gyvūnų klinikinius stebėjimus, suteikiančius daug informacijos. Metodas turėtų padėti nustatyti potencialiai neurotoksinius chemikalus, tačiau vėliau reikalingi tolesni gilesni tyrimai. Reikia atsižvelgti į tai, kad kai kurios medžiagos pasižymi specifiniu neurotoksiniu poveikiu, nenustatomu įprastais toksiškumo tyrimais. Pvz. , nustatyta, kad kai kurios fosfoorganinės medžiagos pasižymi uždelstu neurotoksiškumu, kas gali būti įvertinta tik metodais B. 37 ir B. 38, po vienkartinio ar pakartotinos dozės poveikio. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 365 B. VI Imunotoksiškumas Imunotoksiškumas gali būti nustatytas skirtingais būdais, pvz. , aptinkant imunosupresiją ir (arba) padidėjusį imuninės sistemos jautrumą, kilusį dėl hiperjautrumo arba dėl sukeltos autoimunizacijos. Pakartotinos dozės toksiškumo testas, Metodas B. 7, įvertina imunotoksinius poveikius. Metodas turėtų padėti nustatant potencialiai imunotoksinius chemikalus, tačiau vėliau reikalingi gilesni tyrimai. B. VII Toksikokinetika Toksikokinetiniai tyrimai padeda interpretuoti ir įvertinti gautus toksiškumo duomenis. Šie tyrimai paaiškina ypatingus chemikalo toksiškumo aspektus, o gauti tyrimo rezultatai gali padėti planuojant tolesnius toksiškumo tyrimus. Manoma, kad kiekvienu atveju nebūtina nustatyti visų parametrų. Tik retais atvejais būtini visi tyrimai (absorbcijos, ekskrecijos, pasiskirstymo ir metabolizmo). Kai kuriems junginiams galimi šios sekos pakeitimai arba pakankamas tik vienkartinės dozės tyrimas (Metodas B. 36). toksikokinetiniai Žinios apie medžiagos cheminę struktūrą bei fizikines chemines savybes ir medžiagos patekimo kelią taip pat gali suteikti duomenų apie jos absorbcijos ypatybes, metabolizmo ir pasiskirstymo audiniuose galimybes. Papildomos informacijos apie toksikokinetinius rodiklius galima gauti ir iš ankstesnių toksiškumo ir toksikokinetinių tyrimų. C. TIRIAMOSIOS MEDŽIAGOS APIBŪDINIMAS Tiriamosios medžiagos sudėtį, taip pat ir pagrindines priemaišas, bei jos svarbiausias fizikines ir chemines savybes, tarp jų pastovumą, reikėtų žinoti dar prieš bet kokio toksikologinio tyrimo planavimą. Tiriamosios medžiagos fizikinės ir cheminės savybės nulemia medžiagos patekimo kelio pasirinkimą, kai kurių tyrimo detalių planavimą, elgimąsi su medžiaga bei jos laikymą. Tiriamosios medžiagos (jeigu įmanoma ir pagrindinių priemaišų) dozuojamoje terpėje ar biologinėje medžiagoje nustatymo kokybinius ir kiekybinius analitinius metodus reikėtų parengti dar prieš tyrimą. Visa informacija susijusi su medžiagos nustatymu, medžiagos elgesiu reikėtų įtraukti į tyrimo ataskaitą. fizikinėmis ir cheminėmis jos savybėmis, grynumu, tiriamosios D. GYVŪNŲ PRIEŽIŪRA Giežta aplinkos sąlygų kontrolė ir tinkama gyvūnų priežiūra yra būtini toksikologiniame tyrime. i) Laikymo sąlygos Eksperimentinių gyvūnų kambarių ar aptvarų aplinkos sąlygos turėtų būti tinkamos tiriamosioms rūšims. Žiurkėms, pelėms ir jūrų kiaulytėms kambario temperatūra turėtų būti 22 °C ± 3 °C, santykinis drėgnis nuo 30 iki 70 %; triušiams temperatūra turėtų būti 20 ± 3 °C, santykinis drėgnis nuo 30 iki 70 %. Kai eksperimentinė įranga yra ypatingai jautri temperatūros poveikiui, tiriamajame metode reikėtų aprašyti jai tinkamas sąlygas. Visuose toksinių poveikių tyrimuose temperatūra ir drėgnis turėtų būti stebimi, registruojami į tyrimo baigiamąją ataskaitą. ir įtraukiami Apšvietimas turi būti dirbtinis, šviesos rėžimas – 12 valandų šviesos/12 valandų tamsos. Apšvietimo detalės turėtų būti registruojamos ir įtraukiamos į baigiamąją tyrimo ataskaitą. Jei metode kitaip nenurodoma, gyvūnai gali būti viename narve neturėtų būti daugiau negu penki gyvūnai. laikomi po vieną arba tos pačios lyties individų grupėmis, tačiau Eksperimentų su gyvūnais ataskaitose svarbu nurodyti gyvūnų laikymo būdą bei jų skaičių viename narve medžiagos poveikio bei vėlesniu stebėjimo periodu. ii) Šėrimas Tyrimo metu gyvūnams duodami pašarai turi atitikti visus tos gyvūnų rūšies mitybos reikalavimus. Tais atvejais, kai tiriamoji medžiaga dedama į pašarus, jų galiojimo laikas turėtų būti sutrumpinamas dėl tiriamosios medžiagos sąveikos tyrimų su pašaro sudedamosiomis dalimis. rezultatus. Standartiniai laboratorinių gyvūnų pašarai turėtų būti duodami neribojant geriamo vandens kiekio. Pasiren- kant minėtą poveikio metodą, pašaro turėtų būti duodama tiek, kad tai užtikrintų reikiamą tiriamosios medžiagos gaunamą kiekį. tokios reakcijos galimybę turėtų būti atsižvelgiama interpretuojant Į Maisto teršalai, kurie yra toksiški, neturėtų viršyti interferuojančių koncentracijų. 366 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. E. GYVŪNŲ GERBŪVIS Kada kruopščiai paruošti tyrimo metodai atitinka gyvūnų gerbūviui suteikiamą reikšmę. Žemiau glaustai yra pateikiami kai kurie pavyzdžiai, tačiau šis sąrašas yra neišsemiamas. Tikslus žodžių parinkimas ir (ar) nurodytos sąlygos turėtų būti surasti metodų tekstuose: — Nustatant ūmų toksiškumą per virškinamąjį traktą, turėtų būti atsižvelgiama į du alternatyvius metodus – „Fiksuotos dozės procedūrą“ ir „Ūmios toksinės klasės metodą“. „Fiksuotos dozės procedūros“ specifinis galutinis tikslas nėra gyvūno mirtis, be to šiame metode panaudojama mažiau gyvūnų. „Ūmios toksinės klasės metode“ panaudojama vidutiniškai 70 % mažiau gyvūnų negu ūmaus toksiškumo per virškinamąjį traktą Metode B. 1. Šie abu alternatyvūs metodai sukelia mažiau skausmo ir kančios, negu klasikinė metodologija. — Naudojamų gyvūnų skaičius yra sumažinamas iki moksliškai priimtino minimumo: tiriant vieną dozės lygį B. 1 ir B. 3 jūrų kiaulytės maksimizacijos teste (Metodas B. 6), metodais, yra panaudojami nustatant odos sensibilizaciją, yra panaudojama tik 10 gyvūnų (ir tik 5 neigiamoje kontrolės grupėje); pozityvios kontrolės gyvūnų skaičius, tiriant mutageniškumą in vivo (Metodai B. 11 ir B. 12) taip pat yra sumažintas. tik 5 tos pačios lyties gyvūnai; — Gyvūnų skausmas ir kančia tyrimų metu yra minimalūs: gyvūnai, patiriantys nepakeliamas ir užsitęsusias kančias bei skausmus turėtų būti humaniškai nužudomi; jeigu dėl tiriamosios medžiagos ardomųjų ir dirginamųjų savybių yra žinoma, kad tas metodas sukels gyvūnams didelį skausmą ir kančią, jis neturėtų būti atliekamas (Metodai B. 1, B. 2 ir B. 3). — Ūmiuose toksiškumo (Metodai B. 1, B. 2 ir B. 3) bei mutageniškumo in vivo (Metodai B. 11 ir B. 12) metoduose išvengiama didelių dozių tyrimų, naudojant ribinius bandymus. — Dabar leidžiama netirti dirginamųjų medžiagos savybių arba ištirti tik vieną gyvūną, jeigu yra pateikiamas pakankamas mokslinis įrodymas apie šias savybes. jau atliktų kitų tyrimų rezultatais Toks mokslinis įrodymas gali remtis medžiagos fizikinėmis cheminėmis savybėmis, jeigu medžiagos ūmaus toksiškumo tyrime per odą, naudojant arba patvirtintų tyrimų in vitro rezultatais. Pavyzdžiui, ribinio bandymo dozę, (Metodas B. 4) tolesni odos dirginimo tyrimai nebūtini; medžiagos, kurioms odos dirginimo tyrimu (Metodas B. 4) nustatomos aiškios ardomosios ar nepakeliamos odos dirginamosios savybės, toliau yra netiriamos akies dirginimo metodu (Metodas B. 5). (Metodas B. 3) nenustatytas odos dirginimas, F. ALTERNATYVUS TYRIMAS Vienas iš Europos Sąjungos mokslinių siekių yra vystymas ir tvirtinimas alternatyvių metodų, kurie teiktų panašią informaciją kaip ir įprasti gyvūnų tyrimai, tačiau naudotų mažiau gyvūnų, sukeltų jiems mažiau skausmo arba visiškai išvengtų jų panaudojimo. Kai tik tokie metodai ženklinimui. įsigalioja, juos privaloma taikyti rizikos įvertinimui, vėlesniam klasifikavimui ir kenksmingumo todėl gavus įrodymą apie medžiagos neigiamą poveikį žmonėms, G. ĮVERTINIMAS IR INTERPRETACIJA Vertinant ir interpretuojant gyvūnų ir in vitro tyrimų rezultatus, reikia atsižvelgti į jų tiesioginės ekstrapoliacijos žmogui ribotumą, turėtų patvirtinti gyvūnų tyrimų rezultatus. Tyrimų rezultatai galėtų būti naudojami klasifikuojant ir ženklinant naujus ir jau egzistuojančius chemikalus pagal poveikį žmonių sveikatai, remiantis jų būdingomis savybėmis, nustatytomis ir įvertintomis šiais metodais. VI priedo klasifikavimo ir ženklinimo atitinkamas reikalavimas taip pat yra susijęs su šių tyrimo metodų baigiamųjų atskaitų išvadomis. Tyrimų rezultatai taip pat yra panaudojami naujų ir jau esančių chemikalų rizikos įvertinimo tyrimuose, o šiuos tyrimus planuojant, reikalaujama remtis direktyviniais dokumentais. tai H. LITERATŪROS ŠALTINIAI Dauguma šių metodų remiasi EBPO programos tyrimo Gairėmis ir turėtų būti atliekami pagal Geros laboratorinės praktikos principus, tam kad užtikrinti kuo didesnį duomenų pripažinimą. Papildomą informaciją galima būtų rasti EBPO gairėse ir bet kurioje tinkamoje spausdintoje literatūroje. “ 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 367 „B. 1 tris ŪMUS TOKSIŠKUMAS (PER VIRŠKINAMĄJĮ TRAKTĄ) – ŪMIOS TOKSINĖS KLASĖS METODAS IV B PRIEDAS 1. METODAS 1. 1. Įvadas Ūmios toksinės klasės metodas teikia informaciją rizikos įvertinimui bei jos klasifikavimui. Metodas naudoja taip parinktas tris fiksuotas dozes, kad remiantis tyrimų rezultatais, medžiagą galima klasifikuoti. Be to šis tiriamasis metodas numato trijų papildomų fiksuotų dozių pasirinkimą, kurios gali būti Jeigu pageidaujamas ar būtinas panaudotos arba alternatyviam dozės pasirinkimui, arba tolesniam tyrimui. tolesnis LD50 reikšmės tobulinimas, gali būti svarstomas bet kurios papildomos dozės panaudojimas. Šis metodas naudoja pradines nustatytas dozes ir neleidžia preciziškai apskaičiuoti LD50, bet kadangi pagrindinis šio tyrimo tikslas vis dar yra dalies gyvūnų žūtis, jis leidžia apibrėžti mirtinas medžiagos veikimo leidžia klasifikuoti medžiagas pagal VI priedo kriterijus. Šis vykdomas pakopomis ribas. Tyrimo rezultatai tyrimas gali trukti ilgiau už aprašytą B. 1 procedūrą. Tačiau, palyginus su ūmaus toksiškumo (per virškinamąjį traktą) (B. 1) ir alternatyviu fiksuotos dozės metodu (B. 1 bis), šio pranašumas – mažesnis panaudotų gyvūnų skaičius. Taip pat žiūrėti Bendrojo įvado B dalį. 1. 2. Apibrėžimai Žiūrėti Bendrojo įvado B dalį. 1. 3. Tiriamojo metodo principas Tiriamoji medžiaga eksperimentinių gyvūnų grupei suleidžiama per virškinamąjį traktą sutartinai nustatytomis dozėmis. Medžiaga yra tiriama palaipsniui, kiekviename žingsnyje naudojant tris vienos lyties gyvūnus. Preliminarinis stebėjimo tyrimas nebūtinas. Viename žingsnyje medžiagos sukelta arba ne gyvūnų žūtis apsprendžia sekantį žingsnį, t. y. : — tolesni tyrimai nereikalingi — kitas žingsnis bus atliktas su ta pačia doze, bet su kitos lyties gyvūnais — žingsnis bus atliktas su sekančia didesne arba su sekančia mažesne doze. — 1. 4. Tiriamojo metodo aprašymas 1. 4. 1. Pasiruošimas jauni suaugę gyvūnai yra atrenkami atsitiktinės atrankos principu, kiekvienas gyvūnas individualiai Sveiki pažymimas ir mažiausiai 5 dienas prieš tyrimą aklimatizuojamas narvuose laboratorijos sąlygomis. Gyvūnai ir dozę, bet jų skaičius narve neturėtų trukdyti atidžiam kiekvieno gyvūno grupuojami narvuose pagal stebėjimui. lytį Vienkartinė tiriamosios medžiagos dozė suleidžiama zondu, naudojant skrandžio vamzdelį ar tinkamą intuba- vimo (įleidimo) kaniulę. Jeigu būtina, tiriamoji medžiaga yra ištirpinama arba padaroma jos suspensija tirpiklyje. Pirmiausia rekomen- duojamas vandens tirpalas/suspensija, esant svarioms priežastims naudojamas aliejaus (pvz. , kukurūzų) tirpa- las/suspensija ir tik po to galimi tirpalai kituose tirpikliuose. Naudojamo tirpiklio (ne vandens) toksinės savybės turi būti žinomos, o jeigu nežinomos, tai prieš tyrimą jos turi būti nustatytos. Gyvūnai prieš dozavimą turi badauti neribojamas. (pvz. žiurkės visą naktį, o pelės 3–4 valandas); vanduo turi būti 368 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 1. 4. 2. Tyrimo sąlygos 1. 4. 2. 1. T ir ia miej i g yv ūn a i Jeigu nėra kitokių nurodymų, žiurkėms teikiama pirmenybė. Patelės turi būti nevedę jauniklių ir nepastojusios. Tyrimo pradžioje gyvūnų kūno masės skirtumai turėtų būti minimalūs ir neviršyti tos lyties kūno masės vidurkio ± 20 %. 1. 4. 2. 2. Ska iči u s ir l y t i s Kiekviename žingsnyje naudojami trys vienos lyties gyvūnai. Pradiniame žingsnyje naudojama bet kuri lytis. 1. 4. 2. 3. D oz ių lygiai Pradinis dozės lygis parenkamas iš trijų fiksuotų lygių, t. y. 25, 200 ir 2 000 mg/kg k. m. Pradinis dozės lygis turi mažiausiai bent jau keliems gyvūnams sukelti žūtį. Priklausomai nuo pradinės dozės pasirinkimo, panaudojama viena iš daugybės procedūrų schemų, pavaizduotų 1 priede. Parenkant lytį ir pradinę dozę, panaudojami visi turimi duomenys, taip pat santykis tarp medžiagos sandaros ir aktyvumo. Kai suleidus aukščiausią dozės lygį (2 000 mg/kg k. m. ) yra maža žūties tikimybė, tada atliekamas ribinis bandymas. Kai apie tiriamąją medžiagą nėra duomenų, gyvūnų gerbūvio tikslais rekomenduojama pradinė 200 mg/kg k. m. dozė. Kartais, ištyrus tris 25, 200 ir 2 000 mg/kg kūno masės fiksuotos dozės lygius, norima tikslesnės informacijos. Tokiais atvejais galimas tolimesnis papildomų 5, 50 ar 500 mg/kg kūno masės fiksuotų dozių lygių tyrimas. Jeigu žinoma, kad dėl ardomojo ar stipraus dirginamojo poveikio dozės sukels didelį skausmą ir kančias, jos neturėtų būti tiriamos. Laiko intervalai tarp tiriamųjų grupių yra nustatomi pagal toksinių požymių pradžią, trukmę ir ryškumą. Kol tikima, kad gyvūnai, gavę atitinkamą dozę, išgyvens, kitos lyties ar sekančios dozės tyrimas nepradedamas. 1. 4. 2. 4. Ri binis ba nd yma s 2 000 mg/kg kūno masės dozės lygio ribinis bandymas atliekamas su trimis vienos lyties gyvūnais. medžiaga sukelia žūtį, reikia atlikti 200 mg/kg (ar 500 mg/kg) k. m. dozių tyrimus. Jeigu 1. 4. 2. 5. Stebėj i m o p e r io da s Gyvūnai paprastai stebimi 14 dienų, ir pašalinami iš tyrimo, arba randami padvėsę. Stebėjimo periodas neturėtų būti griežtai fiksuojamas. Jeigu būtina, jis gali būti pratęstas. Tai turi apspręsti toksinės reakcijos, atsigavimo periodo pradžia ir trukmė. Jeigu toksiniai požymiai pasireiškia uždelstai, toksiškumo požymių atsiradimo ir išnykimo laikas ypač svarbus. Visi kiekvieno gyvūno stebėjimai yra sistemingai registruojami. jie humaniškumo sumetimais nužudomi išskyrus tuos atvejus, kai 1. 4. 3. Procedūra Po badavimo periodo, prieš suleidžiant medžiagą, gyvūnai pasveriami. Pašaras duodamas praėjus 3–4 valan- doms. Kada gyvūnams medžiagos dozė leidžiama dalimis per ilgą laiko tarpą pašaro ir vandens būtina duoti. Maksimalus vienkartinis suleidžiamo skysčio tūris priklauso nuo tiriamojo gyvūno dydžio. Graužikams tiriamosios medžiagos tirpalo tūris neturėtų viršyti 1 ml/100 g kūno masės, tačiau naudojant vandeninį tiriamosios medžiagos tirpalą galimas 2 ml/100 g kūno masės tūris. Medžiagos tūrio svyravimai visuose dozių lygiuose turėtų būti minimalūs, tai galėtų garantuoti koncentracijos reguliavimas. Jeigu vienkarti- nė dozė negalima, ji gali būti suleidžiama mažesnėmis dalimis per ne ilgesnį kaip 24 valandų laiko tarpą. Tiriamosios procedūros detalės aprašytos 1 priede. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 369 1. 4. 3. 1. B end r iej i stebėj i m a i Atidūs klinikiniai stebėjimai turėtų būti atliekami dozavimo dieną mažiausiai du kartus, o jeigu gyvūnų atsakas į poveikį reikalauja – dar dažniau; vėliau jie atliekami kartą per dieną. Dvesiantys, kenčiantys didelius skausmus ir ilgalaikes kančias gyvūnai turėtų būti humaniškai nužudomi. Nužudyti dėl humaniškų paskatų bei tyrimo metu žuvę gyvūnai vertinami vienodai. Dėl humaniškų paskatų nužudytų gyvūnų bei tyrimo metu žuvusių gyvūnų žūties laikas turi būti tiksliai registruojamas. Jeigu gyvūnams toksiškumo požymių pasireiškimas tęsiasi, būtini papildomi stebėjimai. Stebė- jimai turėtų įtraukti odos, kailio, akių ir gleivinės, o taip pat kvėpavimo, kraujotakos, autonominės ir centrinės nervų sistemos, somatinio-judamojo aktyvumo ir elgesio pokyčius. Dėmesys turėtų būti kreipiamas į drebulį, konvulsijas, seilių išsiskyrimą, viduriavimą, apatiją, miegą ir komą. Visi kiekvieno gyvūno stebėjimai yra sistemingai registruojami. 1. 4. 3. 2. Kūno m as ė Visi gyvūnai pasveriami prieš pat medžiagos suleidimą ir mažiausiai kas savaitę po to. Turi būti apskaičiuojami ir registruojami masės skirtumai. Išgyvenę gyvūnai tyrimo pabaigoje pasveriami ir humaniškai nužudomi. 1. 4. 3. 3. B end ra sis skro d imas iš tyrimo, turi būti skrodžiami. Visi kiekvieno gyvūno bendrieji Visi tiriamieji gyvūnai, taip pat ir pašalinti patologiniai pokyčiai registruojami. Taip pat reikėtų atsižvelgti į gyvūnų, išgyvenusių 24 valandas ir daugiau, bendrąją organų mikroskopinę patologiją, kuri gali suteikti naudingą informaciją. 2. DUOMENYS Turi būti pateikiami kiekvieno gyvūno duomenys. Be to, visi duomenys turėtų būti pateikiami lentelių forma, nurodant kiekvienoje tiriamojoje grupėje panaudotų, su toksinio poveikio požymiais bei žuvusių ar tyrimo metu humaniškumo sumetimais nužudytų gyvūnų skaičių, kiekvienos žūties laiką, pastebėtų toksinio poveikio požymių apibūdinimą, jų pasireiškimo laiką, grįžtamumą bei skrodimo duomenis. Rezultatų interpretavimo bendrosios gairės, skirtos klasifikavimui pateiktos 2 priede. 3. ATASKAITOS PATEIKIMAS Tyrimo ataskaita Tyrimo ataskaitoje turėtų būti ši informacija: Tiriamieji gyvūnai: — panaudotos rūšys/linijos, — gyvūnų mikrobiologinis būvis, jeigu žinoma, — gyvūnų skaičius, amžius ir lytis, — gavimo šaltinis, laikymo sąlygos, pašarai ir kt. , — kiekvieno gyvūno kūno masė tyrimo pradžioje, kiekvieną savaitę ir tyrimo pabaigoje. Tyrimo sąlygos: — pagrindimas, jeigu tirpikliu pasirinktas ne vanduo, — poveikio tiriamąja medžiaga detalės, taip pat tūriai ir dozavimo laikas, — pašarų ir vandens kokybė (taip pat tipas/šaltinis, vandens šaltinis), — pradinių dozių pasirinkimo logiškas pagrindimas. 370 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. Rezultatai: — duomenų apie kiekvieno gyvūno atsaką pagal toksiškumo požymių, taip pat žuvimų skaičių, jų kilmę, sunkumo laipsnį ir poveikių trukmę), lytį ir dozės lygį pateikimas lentelės forma (t. y. gyvūnų — gyvūnui sukeltų toksiškumo požymių atsiradimo laikas ir ar jie buvo praeinantys, — kiekvieno gyvūno skrodimo ir visi histopatologiniai duomenys, jeigu turimi. Rezultatų aptarimas. Išvados. LITERATŪRA Šis metodas yra analogiškas EBPO 423 tyrimo gairėms. 4. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 371 1 PRIEDAS TYRIMO PROCEDŪRA 1. Kaip nurodyta 1. 4. 2. 3. punkte, pradinė dozė turi mažiausiai bent jau keliems paveiktiems gyvūnams sukelti žūtį. Atrenkant pradinę dozę, galėtų būti naudinga ši informacija: — fizikinių ir cheminių savybių duomenys, — ryšys tarp medžiagos sandaros ir aktyvumo, — visi kitų toksiškumo tyrimų duomenys ir — tiriamosios medžiagos numanomas panaudojimas. 2. Pagal šiame priede pateiktą atitinkamą tyrimo schemą kiekvienai pradinei dozei nurodoma sekanti procedūra. Pagal humaniškai nužudytų arba padvėsusių gyvūnų skaičių rodyklė nurodo sekančią tyrimo procedūrą. 3. Kada nuo pradinės 25 ar 200 mg/kg kūno masės dozės žūva tiktai vienas antros lyties gyvūnas, tyrimas toliau netęsiamas. Tačiau toksiniams požymiams nepasireiškus kitiems penkiems gyvūnams, žuvusiojo gyvūno lavono skrodimas gali parodyti, kad jo žūtis nebuvo susijusi su tiriamąja medžiaga. Tokiu atveju tyrimas turėtų būti tęsiamas, dozuojant sekantį aukštesnį lygį. 4. Kada dėl 2 000 mg/kg kūno masės dozės kiekvienos lyties vienas gyvūnas žūva, LD50 reikšmė turėtų būti didesnė, nei 2 000 mg/kg kūno masės. Kadangi tai yra ribinis rezultatas, reikėtų atsižvelgti į kiekvienos lyties dviejų likusių gyvūnų atsaką; aiškių, ryškių šių gyvūnų toksiškumo požymių buvimas gali sąlygoti 2 000 mg/kg kūno masės ar žemesnę LD50 reikšmę, arba tai turėtų pateisinti to pačio lygio tolesnius tyrimus. 5. Procedūra leidžia tirti tris papildomas fiksuotas dozes (pasirinkimas 2). Šis pasirinkimas gali būti panaudotas arba alternatyvios dozės parinkimui, arba, atlikus einamąjį testą (pasirinkimas 1), tolesniam tyrimui. Pasirinkimo 1 tyrimo procedūra pažymėta ryškiomis rodyklėmis, tuo tarpu pasirinkimo 2 tyrimo procedūra pažymėta plonomis rodyklė- mis. 372 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. a) Tyrimo procedūra esant pradinei 25 mg/kg kūno masės dozei 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 373 b) Tyrimo procedūra esant pradinei 200 mg/kg kūno masės dozei 374 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. c) Tyrimo procedūra esant pradinei 2000 mg/kg kūno masės dozei 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 375 2 PRIEDAS TYRIMO REZULTATŲ, PAGRĮSTŲ 1 VARIANTU, INTERPRETAVIMAS Šio priedo schemose pilkuosiuose langeliuose, esančiuose po langeliu „toliau netirti“, pateikti klasifikacijos ribiniai dydžiai. Pagal tyrimo procedūrą, parodytą tiriant 1 variantą, reikia eiti rodykle žemyn tol, kol pasiekiamas pilkas nagrinėjamas langelis. a) Rezultatų, gautų bandant pagal 1 variantą, interpretavimas Pradinė dozė: 25 mg/kg kūno masės 376 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. b) Rezultatų, gautų bandant pagal 1 variantą, interpretavimas Pradinė dozė: 200 mg/kg kūno masės 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 377 c) Rezultatų, gautų bandant pagal 1 variantą, interpretavimas Pradinė dozė: 2000 mg/kg kūno masės 378 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. “IV C PRIEDAS „B. 6 ODOS SENSIBILIZACIJA 1. METODAS 1. 1. Įvadas Pastabos: Jautrūs ir galintys aptikti potencialius žmogaus odos alergenus tyrimai yra svarbūs klasifikuojant pavojus, kylančius žmonių sveikatai. Nėra vieno tyrimo metodo, tiksliai nustatančio visas odą galinčias sensibilizuoti medžiagas bei tinkančio visoms medžiagoms. Pasirenkant tyrimą, reikia atsižvelgti odą. į medžiagos fizikines savybes, taip pat ir sugebėjimą prasiskverbti pro Sukurti dviejų tipų tyrimai, naudojantys jūrų kiaulytes, t. y. adjuvantiniai tyrimai, kuriais alerginės reakcijos sustiprinamos tiriamąją medžiagą ištirpinant ir neadjuvantiniai tyrimai. (ar padarant suspensiją) Freudo pilname adjuvante (FPA) Adjuvantiniai tyrimai tiksliau nustato žmogaus odą galinčias sensibilizuoti medžiagas negu tyrimai, kurie nenaudoja Freudo pilno adjuvanto. Nors gali būti naudojami maksimizacijos tyrimas (JKMT) yra plačiausiai naudojamas adjuvantinis tyrimas. ir kiti metodai, nustatantys odą sensibilizuoti galinčias medžiagas, jūrų kiaulytės Manoma, kad neadjuvantiniai tyrimai (plačiausiai naudojamas Buehlerio tyrimas) daugeliui medžiagų klasių yra mažiau jautrūs. Kartais dėl svarių priežasčių pasirenkamas Buehlerio tyrimas, naudojantis antodines aplikacijas, o ne jūrų tai reikėtų kiaulytės maksimizacijos tyrimas, naudojantis įodines injekcijas. Naudojant Buehlerio tyrimą, moksliškai pagrįsti. Šiame metode aprašyti pagrindus, galima naudoti ir kitus standartizuotus metodus. jūrų kiaulytės maksimizacijos tyrimas (JKMT) ir Buehlerio tyrimas. Moksliškai Pripažintam atrankos tyrimui pateikus teigiamą rezultatą, tiriamoji medžiaga gali būti apibūdinama kaip turi būti potencialus alergenas, atliktas jūrų kiaulytės tyrimas, remiantis šiame metode aprašyta procedūra. ir tolesnis jūrų kiaulytės tyrimas nebūtinas. Pateikus neigiamą rezultatą, Taip pat žiūrėkite Bendrojo įvado B dalį. 1. 2. Apibrėžimai Odos sensibilizacija (alerginis kontaktinis dermatitas) – tai imuninės kilmės odos reakcija į medžiagą. Žmonėms atsakas gali pasireikšti odos niežėjimu, paraudimu, patinimu, spuogeliais, pūslėmis, pūslelėmis ar jų kombi- nacija. Gyvūnų odos reakcijos skiriasi, jos pasireiškia paraudimu ir patinimu. Indukcinis poveikis – eksperimentinis organizmo poveikis tiriamąja medžiaga, siekiant sukelti organizmo padidėjusio jautrumo būklę. Indukcinis periodas – ne trumpesnis negu viena savaitė po indukcinio poveikio; organizmo padidėjusio jautrumo būklė. jo metu gali išsivystyti Provokacinis poveikis – pakartotinis organizmo poveikis tiriamąja medžiaga po indukcinio periodo, siekiant nustatyti, ar organizmas reaguoja padidintai jautriai (alergiškai). 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 379 1. 3. Kontrolinės medžiagos Naudojamos eksperimentinės technikos jautrumas ir rezultatų patikimumas turi būti mėnesiai, naudojant medžiagas žinomas kaip silpno ar vidutinio stiprumo odos sensibilizatoriai. įvertinamas kas šeši Tinkamai atlikus tyrimą, adjuvantiniame bandyme mažiausiai 30 %, o neadjuvantiniame bandyme mažiausiai 15 % gyvūnų atsakų rodo silpną/vidutinio stiprumo sensibilizatorių (alergeną). Yra naudojamos šios medžiagos: CAS Nr. EINECS Nr. EINECS pavadinimas Įprastas pavadinimas 101-86-0 202-983-3 Cinamono rūgšties heksialdehidas Cinamono rūgšties heksialdehi- das 149-30-4 205-736-8 Benztiazol-2-tiolis tiazolas) (2-merkaptobenz- kaptaksas 94-07-7 202-303-5 benzokainas nordkainas Esant svarioms priežastims, atitinkamai pagrindus, galima naudoti kitas kontrolines medžiagas. 1. 4. Tiriamojo metodo principas Iš pradžių tiriamieji gyvūnai paveikiami tiriamosios medžiagos įodinėmis injekcijomis ir (arba) antodinėmis aplikacijomis (indukcinis periodas). Praėjus 10–14 dienų poilsio laikotarpiui (indukciniam periodui), kurio metu gali pasireikšti imuninis atsakas, gyvūnai paveikiami provokacine doze. Tiriamųjų gyvūnų odos reakcijos į provokacinį poveikį apimtis su kontrolinių gyvūnų, kurie patyrė imitacinį ir (nesensibilizuojančios medžiagos) indukcijos ir provokacijos poveikį. laipsnis yra lyginami 1. 5. Tiriamojo metodo aprašymas Jeigu tiriamąją medžiagą būtina nuplauti, reikia naudoti vandenį ar tinkamą tirpiklį, kad nepakistų gautas atsakymas ar odos vientisumas. 1. 5. 1. Jūrų kiaulytės maksimizacijos tyrimas (JKMT) 1. 5. 1. 1. Pas ir uo ši m a s Sveikos jaunos suaugę jūros kiaulytės mažiausiai 5 dienas prieš tyrimą aklimatizuojamos laboratorijos sąlygomis. Gyvūnai prieš tyrimą atsitiktinės atrankos būdu paskirstomi tyrimo grupes. Kailis gali būti pašalinamas žirklėmis, skutimu ar chemine depiliacija, stengiantis išvengti odos įbrėžimų. Gyvūnai pasveriami prieš tyrimo pradžią ir jo pabaigoje. į 1. 5. 1. 2. Tyr imo są ly go s 1. 5. 1. 2. 1. Tiriamieji gyvūnai Naudojamos baltų jūros kiaulyčių įprastinės linijos. 1. 5. 1. 2. 2. Skaičius ir lytis Gali būti naudojami patinai ir (arba) patelės. Patelės turi būti nevedę jauniklių ir nepastojusios. Tiriamojoje grupėje turi būti mažiausiai 10 gyvūnų, o kontrolinėje mažiausiai 5. Panaudojus mažiau negu 20 tiriamųjų ir 10 kontrolinių jūros kiaulyčių, neįmanoma padaryti išvados, kad tiriamoji medžiaga yra alergenas; tiriant papildomą gyvūnų skaičių, griežtai rekomenduojamas bendras tiriamųjų gyvūnų skaičius turi būti ne mažesnis už 20, kontrolinių – ne mažesnis už 10. 380 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 1. 5. 1. 2. 3. Dozių lygiai Kiekvienam indukciniam poveikiui naudojama gerai organizmo toleruojama didžiausia tiriamosios medžiagos koncentracija, sukelianti nuo silpno iki vidutinio stiprumo odos sudirginimą. Provokaciniam poveikiui naudojama didžiausia nedirginanti odos tiriamosios medžiagos koncentracija. Jeigu būtina, tinkamos kon- centracijos nustatomos parengtiniu tyrimu, naudojant du ar tris gyvūnus. Šiam tikslui galima būtų panaudoti ir FPA paveiktus gyvūnus. 1. 5. 1. 3. Pro ced ūra 1. 5. 1. 3. 1. Indukcija 0 diena – tiriamoji grupė Menčių srityje atliekamos 0,1 ml tūrio trys poros įodinių injekcijų. Menčių srityje kailis pašalinamas taip, kad kiekvienos poros dalis yra kitoje nugaros vidurio pusėje. 1 injekcija: FPA/vandens ar fiziologinio tirpalo mišinys santykiu 1:1 2 injekcija: tiriamosios medžiagos, ištirpintos tinkamame tirpiklyje, pasirinkta koncentracija 3 injekcija: tiriamosios medžiagos pasirinkta koncentracija, pagaminta panaudojant mišinį – FPA/vanduo ar fiziologinis tirpalas santykiu 1:1. Ruošiant 3 injekciją, vandenyje tirpios medžiagos tirpinamos vandenyje, po to maišomos su FPA. Kai medžiagos tirpios riebaluose ir netirpios vandenyje, pirmiausia padaroma suspensija su FPA, po to įpilama vandens. Tiriamosios medžiagos galutinė koncentracija turi būti tokia pati, kaip ir antrojoje injekcijoje. 1 ir 2 injekcijos suleidžiamos arčiau galvos viena šalia kitos, tuo tarpu 3 injekcija suleidžiama arčiau uodegos esančiame tiriamajame plote. 0 diena – kontrolinė grupė Tose pat vietose kaip ir tiriamiesiems gyvūnams atliekamos 0,1 ml tūrio trys poros jodinių injekcijų. 1 injekcija: FPA/vandens ar fiziologinio tirpalo mišinys santykiu 1:1 2 injekcija: neskiestas tirpiklis 3 injekcija: tirpiklio 50 % tirpalas, pagamintas panaudojant mišinį – FPA/vanduo ar fiziologinis tirpalas santykiu 1:1. 5–7 diena – tiriamoji ir kontrolinės grupės Jeigu tiriamoji medžiaga nedirgina odos, apytikriai 24 valandas prieš antodines indukcines aplikacijas, nuo tų pačių odos plotelių nukirpus ir (ar) nuskutus kailį, tepamas 0,5 ml 10 % natrio laurilo sulfato tirpalas vazeline (siekiant sukelti vietinį dirginimą). 6–8 diena – tiriamoji grupė Nuo tiriamojo ploto vėl pašalinamas kailis. Filtravimo popierius (2 × 4 cm) sudrėkinamas (padengiamas) tiriamąja medžiaga, ištirpinta tirpiklyje, uždedamas ant tiriamojo ploto ir fiksuojamas okliuzine (nepralaidžia) tvarstomąja medžiaga 48 valandoms. Tirpiklio pasirinkimą reikia pagrįsti. Kietosios medžiagos yra susmulki- namos ir sumaišomos tirpiklyje. Skysčiai gali būti naudojami neskiesti. 6–8 diena – kontrolinė grupė Nuo tiriamojo ploto vėl pašalinamas kailis. Viskas atliekama tai pat kaip ir tiriamojoje grupėje, vietoj tiriamosios medžiagos naudojant tvarstomąja medžiaga 48 valandoms. fiksuojama okliuzine (nepralaidžia) tirpiklį; vėliau viskas 1. 5. 1. 3. 2. Provokacija 20–22 diena – tiriamoji ir kontrolinė grupės Nuo tiriamųjų ir kontrolinių gyvūnų šonų pašalinamas kailis. Lopas, sudrėkintas (padengtas) tiriamąja medžiaga, uždedamas ant vieno šono odos plotelio. Jeigu reikia, ant kito šono uždedamas lopas, sudrėkintas tirpikliu. Lopas yra fiksuojamos okliuzine tvarstomąja medžiaga 24 valandoms. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 381 1. 5. 1. 3. 3. Stebėjimas ir vertinimas: tiriamoji ir kontrolinė grupės — praėjus maždaug 21 valandai po lopo nuėmimo, provokacinis plotas nuvalomas, nukerpamas ir (arba) nuskutamas, o jeigu būtina depiliuojamas, — maždaug po 3 valandų (praėjus maždaug 48 valandoms nuo provokacinės aplikacijos pradžios) apžiūrima odos reakcija ir įvertinama balais, taip kaip paaiškinta priede, — praėjus maždaug 24 valandoms po šio apžiūrėjimo, odos reakcija apžiūrima antrą kartą (72 valandos) ir įvertinama balais. Skatinamas tiriamųjų ir kontrolinių gyvūnų vertinimas aklu būdu. Jeigu būtina išryškinti pirmoje provokacijoje pastebėtus rezultatus, praėjus maždaug vienai savaitei, atliekama antra provokacija (t. y. reprovokacija) su atitinkama nauja kontrolės grupe. Reprovokaciją taip pat galima atlikti su pradine kontroline grupe. Dėl indukcinių ir provokacinių procedūrų kilusios visos odos ir bet kokios neįprastos, tame tarpe somatinės, reakcijos, stebimos ir įvertinamos pagal Magnussono/Kligmano skalę (žiūrėti priedą). Kitos procedūros, pvz. , histopatologinis tyrimas, odos raukšlės sustorėjimo matavimas, gali būti atliekamos tik išryškėjus neaiškioms reakcijoms. 1. 5. 2. Buehlerio tyrimas 1. 5. 2. 1. Pas ir uo ši m a s Sveikos jaunos suaugę jūros kiaulytės mažiausiai 5 dienas prieš tyrimą aklimatizuojamos laboratorijos sąlygomis. Gyvūnai prieš tyrimą atsitiktinės atrankos būdu paskirstomi tyrimo grupes. Kailis gali būti pašalinamas žirklėmis, skutimu ar chemine depiliacija, stengiantis išvengti odos įbrėžimų. Gyvūnai pasveriami prieš tyrimo pradžią ir jo pabaigoje. į 1. 5. 2. 2. Tyr imo są ly go s 1. 5. 2. 2. 1. Tiriamieji gyvūnai Naudojamos baltų jūros kiaulyčių įprastinės linijos. 1. 5. 2. 2. 2. Skaičius ir lytis Gali būti naudojami patinai ir (arba) patelės. Patelės turi būti nevedę jauniklių ir nepastojusios. Mažiausiai 20 gyvūnų naudojama tiriamojoje ir mažiausiai 10 gyvūnų kontrolinėje grupėse. 1. 5. 2. 2. 3. Dozių lygiai Kiekvienam indukciniam poveikiui naudojama didžiausia tiriamosios medžiagos koncentracija, sukelianti silpną ne pernelyg didelį odos sudirginimą. Provokaciniam poveikiui naudojama didžiausia nedirginanti odos tiriamosios medžiagos koncentracija. Jeigu būtina, tinkamos koncentracijos nustatomos parengtiniu tyrimu, naudojant du ar tris gyvūnus. Vandenyje tirpioms ploviklio (detergento) etanolis, o provokacijai acetonas. tiriamosioms medžiagoms tirpalas. Kitoms tiriamosioms medžiagoms indukcijai tirpikliu naudojamas vanduo ar atskiestas nedirginantis tirpikliu naudojamas 80 % 1. 5. 2. 3. Pro ced ūra 1. 5. 2. 3. 1. Indukcija 0 diena – tiriamoji grupė Nuo vieno gyvūno šono pašalinamas kailis. Tyrimui naudojamas lopas turi būti pilnai prisigėręs tiriamosios medžiagos, ištirpintos tirpiklyje (tirpiklio pasirinkimą reikia pagrįsti; skystos tiriamosios medžiagos gali būti neskiedžiamos). Tyrimui naudojamas lopas (kompresas) pridedamas prie bandomojo ploto ir 6 h laikomas prispaustas prie odos okliuziniu lopu arba gaubteliu ir tinkama tvarstomąja medžiaga. 382 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. Tyrimui naudojamas lopas turi būti okliuzinis. Jam tinka vatos sluoksnis, jis gali būti apvalus ar kvadratinis, maždaug 4–6 cm2. Nepralaidi medžiaga geriausiai užtikrina okliuziją. Naudojant kitokią medžiagą, lopą reiktų ilgiau laikyti. 0 diena – kontrolinė grupė Nuo vieno gyvūno šono pašalinamas kailis. Viskas atliekama tai pat kaip ir tiriamojoje grupėje, vietoj tiriamosios medžiagos naudojant tik tirpiklį. Tyrimui naudojamas lopas fiksuojamas tinkama tvarstomąja Jeigu parodoma, kad imitacinė kontrolinė grupė nebūtina, gali būti naudojama medžiaga 6 valandoms. paprasta kontrolinė grupė. 6–8 ir 13–15 diena – tiriamoji ir kontrolinė grupė 6–8 ir 13–15 dienomis ant to pačio šono tiriamojo ploto (jei būtina, pašalinus kailį) atliekamos tokios pačios pakartotinos aplikacijos kaip ir 0 dieną. 1. 5. 2. 3. 2. Provokacija 27–29 diena – tiriamoji ir kontrolinė grupė Nuo netirto tiriamųjų ir kontrolinių gyvūnų šono pašalinamas kailis. Ant tiriamųjų ir kontrolinių gyvūnų užpakalinio netirto šono dedamas prisigėręs reikiamo kiekio tiriamosios medžiagos okliuzinis lopas. Medžiaga turi būti didžiausios nedirginančios koncentracijos. Kada reikia, ant tiriamųjų ir kontrolinių gyvūnų priekinio netirto šono dedamas okliuzinis lopas, prisigėręs tik tirpiklio. Viskas fiksuojama tinkama tvarstomąja medžiaga 6 valandoms. 1. 5. 2. 3. 3. Stebėjimas ir vertinimas — praėjus maždaug 21 valandai po lopo nuėmimo, nuo provokacinio ploto pašalinamas kailis, — maždaug po 3 valandų (praėjus maždaug 30 valandų nuo provokacinės aplikacijos) apžiūrima odos reakcija ir įvertinama balais, taip kaip paaiškinta priede, — praėjus maždaug 24 valandoms po 30 valandų apžiūrėjimo (maždaug 54 valandoms po provokacinės aplikacijos), odos reakcija apžiūrima antrą kartą ir įvertinama balais. Skatinamas tiriamųjų ir kontrolinių gyvūnų vertinimas akluoju būdu. Jeigu būtina išryškinti pirmoje provokacijoje pastebėtus rezultatus, praėjus maždaug vienai savaitei, atliekama antra provokacija (t. y. reprovokacija) su atitinkama nauja kontrolės grupe. Reprovokaciją taip pat galima atlikti su pradine kontroline grupe. Dėl indukcinių ir provokacinių procedūrų kilusios visos odos ir bet kokios neįprastos, tame tarpe somatinės, reakcijos, stebimos ir įvertinamos pagal Magnussono/Kligmano skalę (žiūrėti priedėlį). Kitos procedūros, pvz. , histopatologinis tyrimas, odos raukšlės sustorėjimo matavimas, gali būti atliekamos tik išryškėjus neaiškioms reakcijoms. 2. DUOMEDYS (JKMT IR BUEHLERIO) Duomenys turi būti pateikti metu. lentelės forma, parodant kiekvieno gyvūno odos reakciją kiekvieno stebėjimo 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 383 3. 5. ATASKAITOS PATEIKIMAS (JKMT IR BUEHLERIO) Jeigu prieš jūrų kiaulyčių buvo atliktas atrankos tyrimas, mazgo tyrimas, Pelės akies patinimo tyrimas) medžiagų gautais rezultatais. jo aprašymas ir šaltiniai (pvz. , Vietinio limfinio turi būti pateikiami kartu su tiriamosios ir kontrolinės Tyrimo ataskaita (JKMT ir Buehlerio) Tyrimo ataskaitoje turėtų būti ši informacija: Tiriamieji gyvūnai: — panaudotos jūrų kiaulyčių linijos, — skaičius, amžius ir gyvūnų lytis, — gavimo šaltinis, laikymo sąlygos, pašarai ir kt. , — kiekvieno gyvūno kūno masė tyrimo pradžioje. Tyrimo sąlygos: — ploto aplikacijai paruošimo technika, — detalės apie lopui panaudotas medžiagas ir techniką, — atrankos tyrimo rezultatai su išvada apie indukcijai ir provokacijai naudotinas koncentracijas, — detalės apie tiriamosios medžiagos paruošimą, aplikaciją ir nuėmimą, — tirpiklio parinkimo pagrindimas, — tirpiklio ir tiriamosios medžiagos koncentracijos, naudotos indukciniam ir provokaciniam poveikiui bei bendras medžiagos kiekis, sunaudotas indukcijai ir provokacijai. Rezultatai: — rezultatų suvestinė su paskutiniu jautrumo ir patikimumo patikrinimu, be to informacija apie panaudotą medžiagą, koncentraciją ir tirpiklį, — kiekvieno gyvūno įvertinimas balais kartu su vertinimo sistema, — sukeltų poveikių prigimties ir laipsnio pasakojamasis aprašymas, — histopatologiniai duomenys. Rezultatų aptarimas. Išvados. LITERATŪRA Šis metodas yra analogiškas EBPO 406 tyrimo gairėms. 384 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. Priedėlis LENTELĖ Magnussono/Kligmano skalė reakcijai į provokacinį mėginį įvertinti 0 = nėra matomų pakitimų 1 = ribotas arba nevienodo intensyvumo paraudimas 2 = vidutinis ir susiliejantis paraudimas 3 = intensyvus paraudimas ir patinimas“ 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 385 „B. 7 PAKATOTINOS DOZĖS (28 DIENŲ) TOKSIŠKUMAS (PER VIRŠKINAMĄJĮ TRAKTĄ) IV D PRIEDAS 1. METODAS 1. 1. Įvadas Žiūrėti Bendrojo įvado B dalį. 1. 2. Apibrėžimai Žiūrėti Bendrojo įvado B dalį. 1. 3. Tiriamojo metodo principas Tiriamosios medžiagos dozės duodamos 28 dienas kasdien paeiliui kelioms eksperimentinių gyvūnų grupėms – po vieną dozės lygį vienai grupei. Kiekvieną dieną medžiagos davimo periodu gyvūnai atidžiai stebimi toksiškumo požymiams nustatyti. Tyrimo metu žuvę arba nužudyti gyvūnai skrodžiami, o tie, kurie išgyveno, nužudomi ir skrodžiami tyrimo pabaigoje. Šio tiriamojo metodo specifinis tikslas yra medžiagos neurologino poveikio nustatymas, o tai reikalauja labai atidžių gyvūnų klinikinių stebėjimų. Šis metodas nustato potencialiai neurotoksinius chemikalus, kas sąlygoja vėlesnius tyrimus šiuo aspektu. Be to šis metodas gali suteikti duomenų apie medžiagos imunologinį poveikį bei poveikį reproduktyvumui. 1. 4. Tiriamojo metodo aprašymas 1. 4. 1. Pasiruošimas Sveiki jauni suaugę gyvūnai atsitiktinės atrankos principu suskirstomi į kontrolinę ir tiriamąsias grupes. Galimas narvų išdėstymo poveikis tyrimo rezultatams turėtų būtų minimalus. Kiekvienas gyvūnas individualiai pažymi- mas ir mažiausiai 5 dienas prieš tyrimą aklimatizuojamas narvuose laboratorijos sąlygomis. Tiriamoji medžiaga leidžiama zondu arba duodama su pašarais ar geriamu vandeniu. Medžiagos patekimo į virškinamąjį traktą kelias priklauso nuo tyrimo tikslų bei fizikinių ir cheminių medžiagos savybių. Jeigu būtina, tiriamoji medžiaga yra ištirpinama arba padaroma jos suspensija tirpiklyje. Pirmiausia rekomen- duojamas vandens tirpalas/suspensija, esant svarioms priežastims naudojamas aliejaus (pvz. , kukurūzų) tirpa- las/suspensija ir tik po to galimi tirpalai kituose tirpikliuose. Naudojamo tirpiklio (ne vandens) toksinės savybės turi būti žinomos. Turėtų būti nustatytas tiriamosios medžiagos pastovumas tirpiklyje. 1. 4. 2. Tyrimo sąlygos 1. 4. 2. 1. T ir ia miej i g yv ūn a i Nors gali būti naudojamos ir kitos graužikų rūšys, pirmenybė teikiama žiurkėms. Naudojamos jaunų sveikų suaugusių gyvūnų įprastos laboratorinės linijos. Patelės turi būti nevedę jauniklių ir nepastojusios. Medžiagos dozavimas prasideda tuoj po nujunkymo, bet ne vėliau nei gyvūnams sueina devynios savaitės. Tyrimo pradžioje gyvūnų kūno masės skirtumai turi būti minimalūs ir neviršyti tos lyties kūno masės vidurkio ± 20 %. Jeigu prieš ilgalaikį atliekamas preliminarinis pakartotinos dozės per virškinamąjį traktą tyrimas, abiejuose tyrimuose naudojami gyvūnai turi būti tos pačios linijos ir gauti iš to pačio šaltinio. 1. 4. 2. 2. Ska iči u s ir l y t i s Kiekvienam dozės lygiui turėtų būti panaudota mažiausiai 10 gyvūnų (penki patinai ir penkios patelės). Jeigu bandymo eigoje planuojamas dalies gyvūnų žudymas, tai pradinis jų skaičius turėtų būti tiek pat padidintas. 386 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. Tam kad 14 dienų po dozavimo būtų galima tirti toksinių poveikių grįžtamumą, pastovumą ar uždelstumą, gali būti sudaryta papildoma 10 gyvūnų grupė (po penkis kiekvienos lyties gyvūnus), 28 dienas gaunanti didelę medžiagos dozę. Tokiais atvejais naudojama ir papildoma 10 gyvūnų kontrolinė grupė (po penkis kiekvienos lyties gyvūnus). 1. 4. 2. 3. D oz ių lygiai Iš viso turėtų būti panaudotos mažiausiai trys tiriamosios ir viena kontrolinė grupės. Su kontrolinės grupės gyvūnais reikia elgtis lygiai taip pat kaip ir su tiriamaisiais gyvūnais, išskyrus tai, kad jie negauna tiriamosios Jeigu duodant tiriamąją medžiagą naudojamas tirpiklis, kontrolinė grupė turėtų gauti didžiausią medžiagos. tiriamojoje grupėje panaudotą tirpiklio tūrį. Jeigu įvertinus turimus duomenis, nesitikima jokio 1 000 mg/kg k. m. /d medžiagos dozės poveikio, galima atlikti ribinį bandymą. Jeigu dozių nustatymui nėra tinkamų duomenų, galima atlikti papildomus tyrimus. Dozės lygius reikia parinkti atsižvelgiant į jau turimus tiriamosios ar jai giminingos medžiagos toksiškumo ir (toksiko-) kinetinius duomenis. Pasirinktas aukščiausias dozės lygis turi sukelti tačiau nesukelti gyvūno žūties ar nepakeliamų kančių. Kiti mažesni dozių lygiai turėtų sukelti atitinkamai mažesnius pokyčius (atsakus), o mažiausias dozės lygis turi turėti nepastebimą neigiamą poveikį (NNPL). Mažėjančia tvarka einantys dozių lygiai vienas nuo kito turėtų skirtis du–keturis kartus, tik ketvirtai papildomai tiriamajai grupei dažnai parenkamas didesnis intervalas tarp dozių (pvz. , faktorius didesnis negu 10). toksinius poveikius, Tiriamosios medžiagos, duodamos su pašarais ar geriamu vandeniu turi netrukdyti normaliam gyvūnų maitinimuisi ar vandens balansui. Kai tiriamoji medžiaga duodama su pašarais, jos dozė gali būti išreiškiama kaip pastovi pašarų koncentracija (ppm) arba kaip pastovus dozės lygis gyvūno kūno masės vienetui; kitus pasirinktus dozės išraiškos būdus reikėtų tiksliai apibrėžti. Zondu medžiagas reikia suleisti kasdien tuo pačiu laiku, be to, medžiagos dozės lygis gyvūno kūno masės vienetui turėtų būti pastovus. Jeigu prieš ilgalaikį atliekamas preliminarinis pakartotinos dozės tyrimas, abiejuose tyrimuose gyvūnams turi būti duodami panašūs pašarai. 1. 4. 2. 4. Ri binis ba nd yma s Jeigu vieno dozės lygio, ne žemesnio negu 1 000 mg/kg k. m. /d, ir atitinkamo procento pašaruose ar geriamame vandenyje (nustatant pagal gyvūno kūno masę, gaunant su pašarais ar geriamu vandeniu), tyrimas nesukelia pastebimų toksinių poveikių ir jeigu iš turimų duomenų apie struktūriškai panašias medžiagas nesitikima toksiškumo, pilnas trijų dozių lygių tyrimas nebūtinas. Ribinis bandymas neatliekamas tais atvejais, kai nustatant poveikį žmogui, reikia naudoti didesnes dozes. 1. 4. 2. 5. Stebėj i m o p e r io da s Stebėjimo periodas turėtų trukti 28 dienas. Papildoma gyvūnų grupė dar mažiausiai 14 dienų po tiriamosios medžiagos gavimo galėtų būti stebima, nustatant poveikių uždelstumą, pastovumą ar atsigavimą nuo jų. 1. 4. 3. Procedūra Gyvūnams tiriamoji medžiaga duodama 28 dienas kasdien septynias dienas savaitėje; jeigu laikomasi penkių dienų savaitėje rėžimo, tai reikia pagrįsti. Vienkartinė tiriamosios medžiagos dozė suleidžiama zondu, naudojant skrandžio vamzdelį ar tinkamą intubavimo (įleidimo) kaniulę. Maksimalus vienkartinis suleidžiamo skysčio tūris priklauso nuo tiriamojo gyvūno dydžio. Tiriamosios medžiagos tirpalo tūris neturi viršyti 1 ml/100 g kūno tiriamosios medžiagos tirpalą galima suleisti 2 ml/100 g kūno masės. masės, tačiau naudojant vandeninį Dirginamųjų ir ardančiųjų medžiagų, kurių didelės koncentracijos sukelia sunkius poveikius, tūrio svyravimai turi būti minimalūs. 1. 4. 3. 1. B end r i s tebėj i m a i Bendrus klinikinius stebėjimus reikia atlikti mažiausiai kartą per dieną, geriausiai – tuo pačiu dienos metu, atsižvelgiant į laukiamų poveikių piką. Gyvūnų sveikatos būklę reikia registruoti. Mažiausiai du kartus per dieną visi gyvūnai turėtų būti patikrinami – ar sveiki, ar nepadvėsę. Dvesiantys ar patiriantys dideles kančias ir skausmą gyvūnai turi būti iškeliami iš narvų, pažymimi, humaniškai nužudomi ir skrodžiami. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 387 Prieš viso tyrimo pradžią atliekami atidesni klinikiniai visų gyvūnų stebėjimai (individų palyginimui), o vėliau mažiausiai kartą per savaitę. Kiekvieną kartą šie stebėjimai atliekami tuo pačiu metu, perkėlus gyvūną iš narvo į tam skirtą vietą. Geriausia, kai toje laboratorijoje tiksliai apibūdintą vertinimo sistemą. Tyrimo aplinkybių svyravimas turi būti minimalus ir stebėtojai apie tyrimą turėtų nežinoti. Stebėjimo metu nereikėtų apsiriboti odos, kailio, akių, gleivinės pakitimų, išskyrų atsiradimų, autonominio aktyvumo (pvz. , ašarojimo, plaukų pašiaušimo, vyzdžio dydžio, neįprastų kvėpavimo pakitimų) registravimu. Reikėtų registruoti eisenos, pozos, reakcijos į paėmimą rankomis pakitimus, kloninių ar toninių judesių atsiradimą bei stereotipinį (pvz. , besaikį valymąsi, pasikartojantį sukimąsi ratu) ar keistą (pvz. , savęs luošinimą, vaikščiojimą atbulomis) elgesį. stebėjimai yra kruopščiai registruojami pagal Ketvirtą poveikio savaitę turėtų būti įvertintas juntamasis reaktyvumas į skirtingų tipų stimulą (pvz. , klausos, regėjimo ir proprioreceptorinį), judamasis aktyvumas. Procedūrų papildomos detalės pateiktos Bendrojo įvado B dalyje. jėgos (spaudimo) stiprumas bei Jeigu prieš subchroninį (90 dienų) atliekamas preliminarinis pakartotinos dozės tyrimas, funkciniai stebėjimai ketvirtą savaitę gali būti neatliekami. Tokiu atveju šie stebėjimai atliekami subchroninio tyrimo metu. Iš kitos pusės, tokie funkciniai stebėjimai pakartotinos dozės tyrime padidina galimybę geriau parinkti dozių lygius tolesniam subchroniniam tyrimui. Išimtiniais atvejais funkciniai stebėjimai neatliekami tokio laipsnio, kad reikšmingai trukdo funkciniams tyrimams. ir tose grupėse, kuriose toksiškumo požymiai nustatomi 1. 4. 3. 2. Kūno m as ė i r m a i s to / v a n d e n s s u v a r to j i m a s Visus gyvūnus mažiausiai vieną kartą per savaitę reikia pasverti. Mažiausiai vieną kartą per savaitę reikia išmatuoti maisto ir vandens suvartojimą. Jeigu tiriamoji medžiaga yra duodama su geriamu vandeniu, vandens suvartojimas taip pat turi būti išmatuojamas nerečiau kaip kartą per savaitę. 1. 4. 3. 3. Hema to lo g ij a Tyrimo pabaigoje nustatoma: hematokritas, hemoglobino koncentracija, eritrocitų kiekis, bendras ir atskiras leukocitų kiekis, trombocitų kiekis ir kraujo krešėjimo laikas/potencialas. Kraujo pavyzdžius reikėtų paimti atitinkamomis sąlygomis. iš nurodomų vietų dar prieš arba gyvūnų žudymo metu ir saugoti 1. 4. 3. 4. Klinik inė b i och emij a Tam, kad ištirti pagrindinius toksinius poveikius audiniams, o ypač inkstams ir kepenims, dar prieš arba gyvūnų žudymo metu (neskaitant dvesiančių gyvūnų ar nužudytų bandymo metu), reikėtų atlikti kraujo klinikinius biocheminius tyrimus. Prieš kraujo pavyzdžių paėmimą rekomenduojama iš vakaro gyvūnams badauti (1). Kraujo plazmoje arba serume tiriama: natris, kalis, bendras cholesterolis, šlapalas, kreatininas, bendras baltymas ir albuminas, mažiausiai du fermentai, rodantys poveikį kepenų ląstelėms (tokie kaip alaninaminotransferazė, aspartataminotransferazė, šarminė fosfatazė, gamaglutamiltranpeptidazė ir sorbitoldehi- drogenazė). Tam tikromis aplinkybėmis papildomi fermentų (hepatinės ar kitos kilmės) ir tulžies rūgščių tyrimai gali suteikti naudingos informacijos. (1) Kai kuriems serumo ir plazmos tyrimams, ypač gliukozės, ypatingai svarbus gyvūnų badavimas iš vakaro. Maistą gaunant, neišvengiami rodiklių svyravimai, o tai apsunkina duomenų interpretavimą. Tačiau iš kitos pusės šis badavimas gali pakeisti gyvūnų bendrą medžiagų apykaitą, o mitybos tyrimuose tai ypač gali pakeisti tiriamosios medžiagos poveikį. Klinikiniai biocheminiai tyrimai turi būti atliekami tik ketvirtą tyrimų savaitę atlikus funkcinius stebėjimus. 388 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. Jeigu paskutinę tyrimų savaitę atliekami neprivalomi šlapimo tyrimai, jis surenkamas per nurodytą laiko tarpą bei nustatoma: šlapimo tūris, išvaizda, kvapas, lyginamasis svoris, pH, baltymai, gliukozė ir kraujo ląstelės. Galima atlikti papildomus serumo rodiklių, rodančių pagrindinių audinių pažeidimus, tyrimus. Jeigu žinomas ar įtariamas tiriamosios medžiagos poveikis organizmo medžiagų apykaitai, galima tirti kalcį, fosforą, trigliceridus badavus, specifinius hormonus, methemoglobiną bei cholinesterazę. Tam tikrų grupių medžiagoms arba pastebėjus kai kuriuos neigiamus pakitimus tokie tyrimai būtini. Naudojamos gyvūnų rūšys, pastebėti pasirinkti tiriamuosius rodiklius. ir (ar) laukiami tiriamos medžiagos sukelti pokyčiai verčia lanksčiai Jeigu turimi duomenys apie medžiagą yra prieštaringi, pagrindinį dėmesį dar prieš dozavimo pradžią reikėtų kreipti į hematologinių ir klinikinių biocheminių kintamųjų nustatymo kokybę. 1. 4. 3. 5. B end ra sis skro d imas ištiriamas jo kūno paviršius bei visos jo angos, Kiekvienas tiriamasis gyvūnas turi būti skrodžiamas, atidžiai kaukolė, krūtinės ląsta, pilvo ertmės bei jų turinys. Vengiant inkstai, antinksčiai, sėklidės, prielipai, užkrūčio liauka, blužnis, smegenys bei širdis turi būti nuvalyti nuo prigludusių pašalinių audinių ir kuo greičiau pasverti. išdžiuvimo, visų gyvūnų kepenys, Audinius reikia konservuoti geriausiai jiems tinkamoje fiksavimo terpėje. Histopatologiškai reikėtų ištirti visus bendruosius pakenkimus, smegenis (jų būdingiausias dalis – didžiąsias smegenis, smegenėles ir smegenų tiltą), nugaros smegenis, skrandį, mažąsias ir didžiąsias žarnas (tame tarpe Peyerio plokšteles), kepenis, inkstus, antinksčius, blužnį, širdį, užkrūčio liauką, skydliaukę, trachėją ir plaučius (pripučiant fiksuojamosios medžiagos, lytines liaukas, papildomus lytinius organus (pvz. , gimdą, prostatą), šlapimo pūslę, o po to panardinant), limfinius mazgus (vienas limfinis mazgas turėtų atspindėti medžiagos patekimo kelią, o kitas, esantis tolėliau, turėtų atspindėti sisteminius poveikius), esantį arčiau raumens periferinį nervą (sėdimąjį arba blauzdikaulio) bei kaulų čiulpų dalį (arba šviežiai paruoštą kaulų čiulpų punkciją). Gauti klinikiniai ir kitokie duomenys gali pareikalauti ištirti papildomus audinius. Be to turėtų būti konservuojami visi numanomi organai taikiniai. 1. 4. 3. 6. Histo pa to lo g inis išt y r im a s Visų kontrolinės ir didžiausios dozės grupių gyvūnų organus ir audinius reikia pilnai histopatologiškai ištirti. Jeigu didžiausios dozės gyvūnų grupėje dėl medžiagos poveikio kilo pakitimai, histopatologiškai ištirti galima ir kitų grupių gyvūnus. Visus bendruosius pakenkimus reikia ištirti. Papildomos grupės gyvūnų pakenktus audinius ir organus taip pat reikia histopatologiškai ištirti. 2. DUOMENYS Turėtų būti pateikiami kiekvieno gyvūno duomenys. Be to visi duomenys turėtų būti sutraukti lenteles, pateikiant kiekvienos tiriamosios grupės gyvūnų skaičių tyrimų pradžioje, padvėsusių gyvūnų ar tyrimo metu humaniškumo sumetimais nužudytų bei gyvūnų su toksinio poveikio požymiais skaičių, kiekvienos žūties ar nužudymo laiką, pastebėtų toksinio poveikio požymių apibūdinimą, tame tarpe jų pasireiškimo pradžią, trukmę ir sunkumo laipsnį, gyvūnų su pakenkimais skaičių, pakenkimų tipą ir gyvūnų su įvairių tipų pakenkimais procentą. į Jeigu įmanoma, skaitmeniniai rezultatai Statistiniai metodai turėtų būti pasirinkti planuojant tyrimą. turėtų būti apdoroti tinkamais ir priimtinais statistiniais metodais. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 389 3. ATASKAITOS PATEIKIMAS Tyrimo ataskaita Tyrimo ataskaitoje turėtų būti ši informacija: Tiriamieji gyvūnai: — panaudotos rūšys/linijos, — gyvūnų skaičius, amžius ir lytis, — gavimo šaltinis, laikymo sąlygos, pašarai ir kt. , — kiekvieno gyvūno kūno masė tyrimo pradžioje, kiekvieną savaitę ir tyrimo pabaigoje. Tyrimo sąlygos: — pagrindimas, jeigu tirpikliu pasirinktas ne vanduo, — dozių lygių parinkimo paaiškinimas, — detalės apie tiriamosios medžiagos mišinio su pašarais paruošimą, preparato gauta koncentracija, pastovu- mas ir homogeniškumas, į faktinę dozę (mg/kg k. — poveikio tiriamąja medžiaga detalės, — perskaičiavimas tiriamosios medžiagos koncentracijos maiste/vandenyje (ppm) m. /d), jeigu įmanoma, — maisto ir vandens kokybė. Rezultatai: — kūno masė/kūno masės pokyčiai, — maisto ir vandens suvartojimas, jeigu įmanoma, — duomenys apie atsaką į toksinį poveikį, taip pat ir toksiškumo požymius, pagal lytį ir dozės lygį, — klinikinių stebėjimų tipas, sunkumo laipsnis ir trukmė (kurie grįžtami, kurie ne), — juntamojo aktyvumo, spaudimo (jėgos) stiprumo ir judamojo aktyvumo įvertinimas, — hematologiniai tyrimai su svarbiausiomis palyginamosiomis reikšmėmis; — klinikiniai biocheminiai tyrimai su svarbiausiomis palyginamosiomis reikšmėmis, — kūno masė nužudymo metu bei organų masė, — skrodimo duomenys, — visų histopatologinių duomenų smulkus aprašymas, — absorbcijos duomenys, jeigu yra, — statistinis rezultatų apdorojimas ten, kur tinka. Rezultatų aptarimas. Išvados. LITERATŪRA Šis metodas yra analogiškas EBPO 407 tyrimo gairėms. “ 5. 390 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. „B. 37 FOSFOROORGANINIŲ MEDŽIAGŲ ŪMAUS POVEIKIO SUKELTAS UŽDELSTAS NEUROTOKSIŠKUMAS IV E PRIEDAS 1. METODAS 1. 1. Įvadas toksinius medžiagų poveikius reikia žinoti, kad kai kurios medžiagų klasės sukelia specifinius Vertinant neurotoksiškumo tipus, nenustatomus įprastais toksiškumo tyrimais. Pavyzdžiui, kai kurios fosforoorganinės medžiagos sukelia uždelstą neurotoksiškumą ir vertinant šios grupės medžiagas į tai reikėtų atsižvelgti. Nustatant medžiagas, sukeliančias uždelstą polineuropatiją, gali būti taikomi atrankos tyrimai neigiami tyrimo in vitro duomenys dar neįrodo, kad duotoji medžiaga yra ne neurotoksiška. in vitro, tačiau Žiūrėti Bendrojo įvado B dalį. 1. 2. Apibrėžimai Fosforoorganinės medžiagos reiškia fosforoorganinius esterius, tioesterius ar fosforoorganinius anhidridus, fosfo- noorganines ar fosforamidoorganines rūgštis ar giminingas fosforotiono, fosforonotiono ar fosforotioamido rūgštis, ar kitas medžiagas, kurios gali sukelti uždelstą neurotoksiškumą, būdingą šiai medžiagų klasei. Uždelstas neurotoksiškumas yra sindromas, susijęs su ataksijos, nugaros smegenų ir periferinio nervo distalinės aksonopatijos ilgai trunkančiu uždelsimu bei neuropatijos sukeltu esterazės slopinimu nervų audiniuose. 1. 3. Kontrolinės medžiagos Norint parodyti, kontrolės grupė gali gauti kontrolinę medžiagą. jog laboratorinėmis sąlygomis tiriamųjų rūšių atsakas reikšmingai nesikeičia, pozityvinė Plačiai naudojamas neurotoksikantas yra tri-o-tolilfosfatas (CAS 78-30-8, EINECS 201-103-5, CAS nomenkla- tūra: fosforo rūgštis, tris(2-metilfenil)esteris), taip pat žinomas kaip tris-o-krezilfosfatas. 1. 4. Tiriamojo metodo principas Naminėms vištoms, kurios, jeigu reikia, yra apsaugotos nuo ūmaus cholinerginio poveikio, per virškinamąjį traktą duodama tiriamosios medžiagos vienkartinė dozė. 21 dieną stebimi gyvūnų elgesio nukrypimai, ataksija ir paralyžius. Paprastai praėjus 24 ir 48 valandoms po dozavimo, atsitiktiniu atrankos būdu paimtoms iš kiekvienos grupės vištoms atliekami biocheminiai t. y. nustatomas neuropatijos sukeltas esterazės tyrimai, slopinimas. Praėjus 21 dienai po medžiagos poveikio, likusios vištos nužudomos ir tam tikri nervų audiniai ištiriami histopatologiškai. 1. 5. Tiriamojo metodo aprašymas 1. 5. 1. Pasiruošimas Sveikos jaunos suaugusios vištos, nesirgusios virusinėmis ligomis ir negydytos, neturinčios eisenos pakitimų, atsitiktinės atrankos principu paskirstomos į tiriamąją ir kontrolinę grupes ir mažiausiai 5 dienas prieš tyrimą aklimatizuojamos laboratorijos sąlygomis. Reikia naudoti pakankamai didelius narvus arba aptvarus, kurie leistų vištoms laisvai judėti bei laisvai stebėti jų eiseną. Tiriamoji medžiaga turėtų būti dozuojama per virškinamąjį traktą, naudojant zondą, želatinines kapsules arba panašiu metodu. Skysčiai gali būti leidžiami neskiesti arba ištirpinti tirpiklyje, tokiame, kaip kukurūzų aliejus; kadangi didelės dozės kietųjų medžiagų želatininėse kapsulėse gali būti neefektyviai absorbuojamos, jas reikėtų ištirpinti. Naudojamo tirpiklio (ne vandens) toksinės savybės turi būti žinomos, o jeigu nežinomos, tai prieš tyrimą jos turi būti nustatytos. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 391 1. 5. 2. Tyrimo sąlygos 1. 5. 2. 1. T ir ia miej i g yv ūn a i Rekomenduojamos nuo 8 iki 12 mėnesių amžiaus jaunos suaugusios naminės vištos (Gallus gallus domesticus), dedančios kiaušinius. Turėtų būti naudojamos standartinio dydžio veislės ir linijos vištos, užaugintos sąlygomis, leidžiančiomis laisvai judėti. 1. 5. 2. 2. Ska iči u s ir l y t i s Be tiriamosios grupės turi būti dar tirpiklio kontrolinė bei pozityvinės kontrolės grupės. Su tirpiklio kontrolinės grupės gyvūnais reikia elgtis lygiai taip pat kaip ir su tiriamaisiais gyvūnais, išskyrus tai, kad jie negautų tiriamosios medžiagos. Kiekvienoje paukščių grupėje reikia panaudoti tokį skaičių vištų, kad mažiausiai šešias galima būtų nužudyti biocheminiams tyrimams (po tris, praėjus dviems skirtingiems laiko tarpams) ir kad po 21 stebėjimo dienos patologiniams tyrimams išgyventų dar šešios vištos. Pozityvinės kontrolės grupė gali būti tiriama paraleliai su kitomis grupėmis arba gali būti panaudojama nesena istorinė kontrolės grupė. Šioje grupėje turi būti mažiausiai šešios vištos, paveiktos žinomais uždelsto veikimo neurotoksikantais, trys vištos yra skirtos biochemijai ir trys patologijai. Rekomenduojama periodiškai atnaujinti istorinius duomenis. Kai tyrimo laboratorija pakeičia keletą esminių tyrimo elementų (pvz. , vištų liniją, pašarus, laikymo sąlygas), turi būti gauti nauji pozityvinės kontrolės duomenys. 1. 5. 2. 3. D oz ių lygiai Pagrindiniame tyrime naudotinų dozių lygių nustatymui reikalingas preliminarinis tyrimas su atitinkamu vištų ir dozių grupių skaičiumi. Nustatant pagrindinio tyrimo dozės ribas, preliminariniame tyrime yra būtinos kelių paukščių žūtys. Norint užkirsti kelią dėl ūmaus cholinerginio poveikio kylančioms mirtims, galima naudoti atropiną ar kitą apsauginę medžiagą, kuri netrukdytų uždelsto neurotoksiškumo atsakams. Apskaičiuojant maksimalią nemirtiną tiriamosios medžiagos dozę, galima panaudoti daugybę tiriamųjų metodų (žiūrėkite metodą B. 1 bis). Parenkant dozę, gali būti naudingi jau turimi vištų duomenys arba bet kokia kita toksikologinė informacija. Atsižvelgiant į preliminarinio tyrimo rezultatus ir aukščiausią ribinę 2 000 mg/kg kūno masės dozę, tiriamosios medžiagos dozės lygis pagrindiniame tyrime turi būti kuo aukštesnis. Bet kokia žūtis per 21 dieną turi nepakeisti reikalingo išgyvenusių paukščių skaičiaus – šešių biocheminiams ir šešių histologiniams tyrimams. Užkertant kelią dėl ūmaus cholinerginio poveikio kylančioms žūtims, galima naudoti atropiną arba bet kurią kitą apsauginę medžiagą, netrukdančią uždelsto neurotoksiškumo atsakams. 1. 5. 2. 4. Ri binis ba nd yma s Jeigu tirtas dozės lygis, ne žemesnis, negu 2 000 mg/kg kūno masės, nesukelia pastebimų toksinių poveikių ir jeigu iš turimų duomenų apie struktūriškai panašias medžiagas nesitikima toksiškumo, didesnių dozių tyrimai nebūtini. Ribinis bandymas neatliekamas tais atvejais, kai nustatant poveikį žmogui, reikia naudoti didesnes dozes. 1. 5. 2. 5. Stebėj i m o p e r io da s Stebėjimo periodas turėtų trukti 21 dieną. 1. 5. 3. Procedūra Po to, kai paukštis gauna apsauginę medžiagą, kuri užkerta kelią nuo dėl ūmaus cholinerginio poveikio galimai žūčiai, duodama tiriamosios medžiagos vienkartinė dozė. 1. 5. 3. 1. B end ra sis stebė jima s Stebėjimai prasideda tuoj pat po medžiagos gavimo. Pirmas dvi dienas visos vištos atidžiai stebimos kelis kartus, o vėliau mažiausiai vieną kartą dienoje, kol jos nužudomos arba praeina 21 diena. Visi toksiškumo požymiai turi būti registruojami, žymint jų pradžią, tipą, ryškumą ir elgesio nukrypimų trukmę. Ataksiją reikėtų vertinti mažiausiai pagal keturių lygių skalę, reikėtų žymėti paralyžių. Norint pastebėti minimalų toksinį poveikį, vištos, atrinktos patologijai, mažiausiai du kartus per savaitę išimamos iš narvų ir stebimas jų judamasis aktyvumas, priverčiant jas judėti, pvz. , kopėčiomis. Dvesiantys ir patiriantys dideles kančias bei skausmą paukščiai išimami iš narvų, pažymimi, humaniškai nužudomi ir skrodžiami. 392 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. 1. 5. 3. 2. Kūno m as ė Prieš tiriamosios medžiagos davimą visas vištas reikia pasverti, vėliau sveriama mažiausiai vieną kartą per savaitę. 1. 5. 3. 3. B io ch emija (jei ši grupė paraleliai išimamos galvos smegenys ir juosmens dalies nugaros smegenys bei Atsitiktinės atrankos būdu šešios vištos iš kiekvienos tiriamosios ir tirpiklio kontrolinių grupių bei trys vištos iš tiriama) praėjus kelioms dienoms po dozavimo pozityvinės kontrolinės grupės nužudomos, ištiriamas neuropatijos sukeltas esterazės slopinimo aktyvumas. Kartais naudinga ištirti sėdimojo nervo audinio neuropatijos sukeltą esterazės slopinimo aktyvumą. Paprastai, praėjus 24 valandoms, nužudomi trys kontrolinės ir trys tiriamosios grupės paukščiai, o praėjus 48 valandoms, dar po tris, tuo tarpu trys pozityvinės kontrolės vištos nužudomos (tai visada gali būti nustatyta stebint cholinerginių po 24 valandų. požymių pradžios laiką) rodo, kad toksinė medžiaga perduodama labai lėtai, tada geriau paukščių audinių pavyzdžius imti du kartus tarp 24 ir 72 valandų po dozavimo. intoksikacijos požymiai Jeigu klinikiniai Taip pat galima tirti acetilcholinesterazę (AChE). Tačiau gali įvykti spontaninė AChE reaktyvacija in vivo, o tai gali sąlygoti nepakankamą medžiagos, kaip AChE inhibitoriaus, jėgos įvertinimą. 1. 5. 3. 4. B end ra sis skro d imas Visų gyvūnų bendrojo skrodimo metu reikia apžiūrėti galvos bei nugaros smegenų išvaizdą. 1. 5. 3. 5. Histo pa to lo g inis išt y r im a s ištirti. Audiniai Išgyvenusių visą stebėjimo periodą ir nepanaudotų biocheminiams tyrimams paukščių nervų audiniai turi būti in situ, naudojant perfuzijos techniką. Reikia įtraukti mikroskopiškai smegenėlių (vidurinįjį-pailgąjį lygį), pailgųjų smegenų, nugaros smegenų ir periferinių nervų dalis. Reikia paimti nugaros smegenų atkarpas iš viršutinio kaklinio segmento, vidurinės-krūtininės ir juosmens-kryžmens dalių. Reikia paimti blauzdikaulio nervo distalines ir jo atšakų į skrandžio raumenį bei sėdimojo nervo atkarpas. Šias atkarpas reikia dažyti būdingais mielinui ir specifiniais aksonui dažais. turi būti fiksuojami 2. DUOMENYS Pasirinktų metodų (biochemijos, histopatologijos ir elgesio stebėjimo) požiūriu gauti neigiami rezultatai paprastai nereikalauja uždelsto neurotoksiškumo tyrimo tęsimo. Tik šiuo požiūriu dviprasmiai arba negalutiniai rezultatai gali reikalauti tolesnio įvertinimo. Turėtų būti pateikiami kiekvieno paukščio duomenys. Be to, visi duomenys turi būti pateikiami lentelių forma, nurodant kiekvienoje tirtoje grupėje tyrimo pradžioje buvusių paukščių skaičių, paukščių skaičių su pažeidimais, elgesio ar biocheminiais pakitimais, šių pažeidimų ar pakitimų tipus ir jų sunkumo laipsnį bei paukščių procentą su kiekvieno pažeidimo ar pakitimo tipu ir sunkumo laipsniu. Gautus duomenis reikia vertinti pagal pakitimų pasireiškimą ir sunkumo laipsnį bei nustatant koreliacinius ryšius tarp elgesio, biochemijos ir histopatologinių pakitimų bei visų kitų pastebėtų pakitimų tiriamojoje ir kontrolinėje grupėse. Skaitmeniniai rezultatai turėtų būti apdoroti tinkamais ir priimtinais statistiniais metodais. Statistiniai metodai turėtų būti pasirinkti planuojant tyrimą. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 393 3. ATASKAITOS PATEIKIMAS Tyrimo ataskaita Tyrimo ataskaitoje turėtų būti ši informacija: Tiriamieji gyvūnai: — panaudotos linijos, — gyvūnų skaičius ir amžius, — gavimo šaltinis, laikymo sąlygos ir kt. , — kiekvieno gyvūno kūno masė tyrimo pradžioje. Tyrimo sąlygos: — detalės apie tiriamosios medžiagos paruošimą, pastovumą ir homogeniškumą, kur to reikalaujama, — tirpiklio pasirinkimo pagrindimas, — detalės apie poveikį tiriamąja medžiaga, — detalės apie pašarų ir vandens kokybę, — dozės pasirinkimo pagrindimas, — duotų dozių detalizavimas, tame tarpe naudotas tirpiklis, jo tūris ir duotos medžiagos fizikinė forma, — detalės apie naudotas apsaugines medžiagas ir poveikį jomis. Rezultatai: — kūno masės duomenys, — grupės toksinio atsako duomenys, taip pat ir žuvimai, — stebėti klinikiniai pokyčiai, sunkumo laipsnis ir trukmė (kurie grįžtami, kurie ne), — smulkus biocheminių metodų ir gautų duomenų aprašymas, — skrodimo duomenys, — smulkus visų gautų histopatologinių duomenų aprašymas, — statistinis rezultatų apdorojimas ten, kur tinka. Rezultatų aptarimas. Išvados. LITERATŪRA Šis metodas yra analogiškas EBPO 418 tyrimo gairėms. 4. 394 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. B. 38 FOSFOROORGANINIŲ MEDŽIAGŲ 28 DIENŲ PAKARTOTINOS DOZĖS SUKELTO UŽDELSTO NEUROTOKSIŠ- KUMO TYRIMAS 1. METODAS 1. 1. Įvadas toksinius medžiagų poveikius reikia žinoti, kad kai kurios medžiagų grupės sukelia specifinius Vertinant neurotoksiškumo tipus, nenustatomus įprastais toksiškumo tyrimais. Pavyzdžiui, kai kurios fosforoorganinės medžiagos sukelia uždelstą neurotoksiškumą ir vertinant šios grupės medžiagas į tai reikėtų atsižvelgti. Nustatant medžiagas, sukeliančias uždelstą polineuropatiją, gali būti taikomi atrankos tyrimai neigiami tyrimo in vitro duomenys dar neįrodo, kad duotoji medžiaga yra ne neurotoksiška. in vitro, tačiau Šis 28 dienų uždelsto neurotoksiškumo tyrimas rodo kylančią riziką sveikatai, gaunant medžiagą pakartotinai per tam tikrą laiko tarpą. Šis tyrimas rodys reakciją į dozę bei įvertins nepastebimą neigiamą poveikio lygį, reikalingą nustatant medžiagos saugumo kriterijus. Žiūrėti Bendrojo įvado B dalį. 1. 2. Apibrėžimai Fosforoorganinės medžiagos reiškia fosforoorganinius esterius, tioesterius ar fosforoorganinius anhidridus, fosfo- noorganines ar fosforamidoorganines rūgštis ar giminingas fosforotiono, fosforonotiono ar fosforotioamidino rūgštis, ar kitas medžiagas, kurios gali sukelti uždelstą neurotoksiškumą, būdingą šiai medžiagų klasei. Uždelstas neurotoksiškumas yra sindromas, susijęs su ataksijos, nugaros smegenų ir periferinio nervo distalinės aksonopatijos ilgai trunkančiu uždelsimu bei neuropatijos sukeltu esterazės slopinimu nervų audiniuose. 1. 3. Tiriamojo metodo principas Naminėms vištoms per virškinamąjį traktą 28 dienas kasdien duodama tiriamoji medžiaga. Medžiagos davimo periodu ir praėjus 14 dienų po to rečiausiai vieną kartą dienoje stebimi gyvūnų elgesio nukrypimai, ataksija ir paralyžius. Paprastai praėjus 24 ir 48 valandoms po paskutinio dozavimo, atsitiktiniu atrankos būdu paimtoms iš kiekvienos grupės vištoms atliekami biocheminiai tyrimai, t. y. nustatomas neuropatijos sukeltas esterazės slopinimas. Praėjus dviems savaitėms po paskutinės dozės, likusios vištos nužudomos ir tam tikri nervų audiniai ištiriami histopatologiškai. 1. 4. Tiriamojo metodo aprašymas 1. 4. 1. Pasiruošimas Sveikos jaunos suaugusios vištos, nesirgusios virusinėmis ligomis ir negydytos, neturinčios eisenos pakitimų, atsitiktinės atrankos principu paskirstomos į tiriamąsias ir kontrolinę grupes ir mažiausiai 5 dienas prieš tyrimą aklimatizuojamos laboratorijos sąlygomis. Turi būti naudojami pakankamai dideli narvai arba aptvarai, kurie leistų vištoms laisvai judėti bei laisvai stebėti jų eiseną. Tiriamoji medžiaga kasdien septynias dienas per savaitę dozuojama per virškinamąjį traktą, naudojant zondą arba želatinines kapsules. Skysčiai gali būti leidžiami neskiesti arba ištirpinti tirpiklyje, tokiame kaip kukurūzų aliejus; kadangi didelės dozės kietųjų medžiagų želatininėse kapsulėse gali būti neefektyviai absorbuojamos, jas reikėtų ištirpinti. Naudojamo tirpiklio (ne vandens) toksinės savybės turi būti žinomos, o jeigu nežinomos, tai prieš tyrimą jos turi būti nustatytos. 1. 4. 2. Tyrimo sąlygos 1. 4. 2. 1. T ir ia miej i g yv ūn a i Rekomenduojamos nuo 8 iki 12 mėnesių amžiaus jaunos suaugusios naminės vištos (Gallus gallus domesticus), dedančios kiaušinius. Turėtų būti naudojamos standartinio dydžio veislės ir linijos vištos, užaugintos sąlygomis, leidžiančiomis laisvai judėti. 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 395 1. 4. 2. 2. Ska iči u s ir l y t i s Reikia sudaryti mažiausiai tris tiriamąsias grupes bei vieną tirpiklio kontrolinę grupę. Su tirpiklio kontrolinės grupės gyvūnais reikia elgtis lygiai taip pat kaip ir su tiriamaisiais gyvūnais, išskyrus tai, kad jie negautų tiriamosios medžiagos. Kiekvienoje paukščių grupėje reikia panaudoti tokį skaičių vištų, kad mažiausiai šešias galima būtų nužudyti biocheminiams tyrimams (po tris, praėjus dviems skirtingiems laiko tarpams) ir, kad praėjus 14 dienų po paskutinio dozavimo patologiniams tyrimams išgyventų dar šešios vištos. 1. 4. 2. 3. D oz ių lygiai Dozės lygius reikia parinkti atsižvelgiant į uždelsto neurotoksiškumo ūmaus tyrimo tris rezultatus arba į jau turimus tiriamosios medžiagos toksiškumo ar kinetinius duomenis. Pasirinktas aukščiausias dozės lygis turi tačiau turi nesukelti gyvūno žūties ar toksinius poveikius, geriausiai uždelstą neurotoksiškumą, sukelti nepakeliamų kančių. Sekantys mažėjančia tvarka einantys dozių lygiai turi sukelti atitinkamai mažesnius pokyčius (atsakus), o mažiausias dozės lygis turėtų nesukelti pastebimų neigiamų poveikių. 1. 4. 2. 4. Ri binis ba nd yma s Jeigu tirtas dozės lygis, ne žemesnis, negu 1 000 mg/kg kūno masės/d nesukelia pastebimų toksinių poveikių ir jeigu iš turimų duomenų apie struktūriškai panašias medžiagas nesitikima toksiškumo, didesnių dozių tyrimai nebūtini. Ribinis bandymas neatliekamas tais atvejais, kai nustatant poveikį žmogui, reikia naudoti didesnes dozes. 1. 4. 2. 5. Stebėj i m o p e r io da s Visi paukščiai stebimi mažiausiai vieną kartą per dieną visą medžiagos dozavimo periodą ir 14 dienų po to, iki atliekamas skrodimas. 1. 4. 3. Procedūra Paukščiams tiriamoji medžiaga duodama 28 dienas kasdien septynias dienas per savaitę. 1. 4. 3. 1. B end ra sis stebė jima s Stebėjimai prasideda tuoj pat po medžiagos gavimo. 28 dozavimo dienas ir 14 dienų po to visos vištos atidžiai stebimos mažiausiai vieną kartą per dieną, po to jos nužudomos. Visi turi būti registruojami, žymint jų pradžią, tipą, sunkumo laipsnį ir elgesio nukrypimų trukmę. Nereikėtų apsiriboti elgesio nukrypimų stebėjimais. Ataksiją reikėtų vertinti mažiausiai pagal keturių lygių skalę, reikėtų žymėti paralyžių. Norint pastebėti minimalų toksinį poveikį, vištos mažiausiai du kartus per savaitę išimamos iš narvų ir stebimas jų judamasis aktyvumas, priverčiant judėti, pvz. , kopėčiomis. Dvesiantys ir patiriantys dideles kančias bei skausmą paukščiai išimami iš narvų, pažymimi, humaniškai nužudomi ir skrodžiami. toksiškumo požymiai 1. 4. 3. 2. Kūno m as ė Prieš pirmąjį tiriamosios medžiagos davimą visas vištas reikia pasverti, vėliau mažiausiai vieną kartą per savaitę. 1. 4. 3. 3. B io ch emija Atsitiktinės atrankos būdu šešios vištos iš kiekvienos tiriamosios ir tirpiklio kontrolinių grupių, praėjus kelioms dienoms po paskutinės dozės, nužudomos, išimamos galvos smegenys ir juosmens dalies nugaros smegenys bei ištiriamas neuropatijos sukeltas esterazės slopinimo aktyvumas. Kartais naudinga ištirti sėdimojo nervo audinio neuropatijos sukeltą esterazės slopinimo aktyvumą. Paprastai, praėjus 24 valandoms po paskutinės dozės, nužudomi trys kontrolinės ir trys kiekvienos tiriamosios grupės paukščiai, o praėjus 48 valandoms, dar po tris. Jeigu ūmaus arba kitų tyrimų (pvz. toksikokinetinių) duomenys rodo, kad po paskutinės dozės geriau pasirinkti kitą žudymo laiką, negu siūloma, tai reikia raštiškai pagrįsti. 396 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. Taip pat galima tirti acetilcholinesterazę (AChE). Tačiau gali įvykti spontaninė AChE reaktyvacija in vivo, o tai gali sąlygoti nepakankamą medžiagos, kaip AChE inhibitoriaus, jėgos įvertinimą. 1. 4. 3. 4. B end ra sis skro d imas Bendrojo skrodimo metu reikia apžiūrėti visų gyvūnų galvos bei nugaros smegenų išvaizdą. 1. 4. 3. 5. Histo pa to lo g inis išt y r im a s turi būti ištirti. Audiniai Išgyvenusių visą stebėjimo periodą ir nepanaudotų biocheminiams tyrimams paukščių nervų audiniai turi būti mikroskopiškai in situ, naudojant perfuzijos techniką. Reikia įtraukti smegenėlių (vidurinįjį-pailgąjį lygį), pailgųjų smegenų, nugaros smegenų ir periferinių nervų dalis. Reikia paimti nugaros smegenų atkarpas iš viršutinio kaklinio segmento, vidurinės-krūtininės ir juosmens-kryžmens dalių. Reikia paimti blauzdikaulio nervo distalines ir jo atšakų į skrandžio raumenį bei sėdimojo nervo atkarpas. Šias atkarpas reikia dažyti būdingais mielinui ištirti Jeigu didžiausios dozės grupėje visų kontrolinės ir didžiausios dozės grupių paukščių fiksuotus audinius. nustatomi pakitimai, galima mikroskopiškai tirti viduriniosios ir mažiausios dozės grupių paukščių audinius. ir specifiniais aksonui dažais. Pradžioje reikia mikroskopiškai fiksuojami 2. DUOMENYS Pasirinktų metodų (biochemijos, histopatologijos ir elgesio stebėjimo) požiūriu gauti neigiami rezultatai paprastai nereikalauja uždelsto neurotoksiškumo tyrimo tęsimo. Tik šiuo požiūriu dviprasmiai arba negalutiniai rezultatai gali reikalauti tolesnio įvertinimo. Turėtų būti pateikiami kiekvieno paukščio duomenys. Be to, visi duomenys turi būti pateikiami lentelių forma, nurodant kiekvienoje tirtoje grupėje tyrimo pradžioje buvusių paukščių skaičių, paukščių skaičių su pažeidimais, elgesio ar biocheminiais pakitimais, šių pažeidimų ar pakitimų tipus ir sunkumo laipsnį bei paukščių procentą su kiekvieno pažeidimo ar pakitimo tipu ir sunkumo laipsniu. Gautus duomenis reikia vertinti pagal pakitimų pasireiškimą ir sunkumo laipsnį bei nustatant koreliacinius ryšius tarp elgesio, biochemijos ir histopatologinių pakitimų bei visų kitų pastebėtų pakitimų tiriamosiose ir kontrolinėje grupėse. Skaitmeniniai rezultatai turėtų būti apdoroti tinkamais ir priimtinais statistiniais metodais. Statistiniai metodai turėtų būti pasirinkti planuojant tyrimą. 3. ATASKAITOS PATEIKIMAS Tyrimo ataskaita Tyrimo ataskaitoje turėtų būti ši informacija: Tiriamieji gyvūnai: — panaudotos linijos, — gyvūnų skaičius ir amžius, — gavimo šaltinis, laikymo sąlygos ir kt. , — kiekvieno gyvūno kūno masė tyrimo pradžioje. Tyrimo sąlygos: — detalės apie tiriamosios medžiagos paruošimą, pastovumą ir homogeniškumą, kur to reikalaujama, — tirpiklio pasirinkimo pagrindimas, — detalės apie poveikį tiriamąja medžiaga, — detalės apie pašarų ir vandens kokybę, — dozės pasirinkimo pagrindimas, — duotų dozių detalizavimas, taip pat ir naudotas tirpiklis, jo tūris ir duotos medžiagos fizikinė forma, — pagrindimas, pasirinkus biocheminiams tyrimams kitą laiką (ne po 24 ir 48 valandų). 13/17 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 397 Rezultatai: — kūno masės duomenys, — duomenys apie toksinį atsaką pagal dozės lygį, taip pat ir žuvimai, — nepastebimas neigiamas poveikio lygis, — stebėti klinikiniai pokyčiai, sunkumo laipsnis ir trukmė (kurie grįžtami, kurie ne), — smulkus biocheminių metodų ir gautų duomenų aprašymas, — skrodimo duomenys, — smulkus visų gautų histopatologinių duomenų aprašymas, — statistinis rezultatų apdorojimas ten, kur tinka. Rezultatų aptarimas. Išvados. LITERATŪRA Šis metodas yra analogiškas EBPO 419 tyrimo gairėms. “ 4. 398 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/17 t. žr. Komisijos direktyvą 2001/59/EB, OL L 225, 2001 8 21, p. 1. V PRIEDAS