title: Direttiva 98/57/CE del Consiglio del 20 luglio 1998 concernente la lotta contro Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.

eurovoc_concepts:
food inspection
fruit vegetable
plant disease
plant health control
potato
protection of plant life

text: 21. 8. 98 IT Gazzetta ufficiale delle Comunità europee L 235/1 I (Atti per i quali la pubblicazione è una condizioni di applicabilità) DIRETTIVA 98/57/CE DEL CONSIGLIO del 20 luglio 1998 concernente la lotta contro Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. IL CONSIGLIO DELL’UNIONE EUROPEA, visto il trattato che istituisce la Comunità europea, in particolare l’articolo 43, visto la proposta della Commissione (1), visto il parere del Parlamento europeo (2), visto il parere del Comitato economico e sociale (3), considerando che l’organismo nocivo Ralstonia solanace- arum (Smith) Yabuuchi et al. era noto precedentemente come Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith; che il termine diventerà probabilmente il nome generalmente accettato dell’organismo in questione; che la presente direttiva dovrebbe tener conto di questo sviluppo scienti- fico; considerando che la produzione di patate e di pomodori occupa un posto importante nell’agricoltura della Comu- nità; che la resa di tale produzione è costantemente minacciata da organismi nocivi; considerando che la protezione della coltivazione della patata e del pomodoro contro tali organismi nocivi sarebbe necessaria non soltanto per mantenere intatta la resa, ma anche per aumentare la produttività dell’agricol- tura; considerando che le misure protettive contro l’introdu- zione di organismi nocivi nel territorio di uno Stato membro avrebbero efficacia limitata se detti organismi nocivi non venissero combattuti simultaneamente e meto- dicamente in tutta la Comunità e se non se ne prevenisse la propagazione; considerando che uno degli organismi nocivi per la patata e il pomodoro è l’agente Ralstonia solanacearum (Smith) (1) GU C 124 del 21. 4. 1997, pag. 12 e GU C 108 del 7. 4. 1998, pag. 85. (2) GU C 14 del 19. 1. 1998, pag. 34. (3) GU C 206 del 7. 7. 1997, pag. 57. Yabuuchi et al. , agente patogeno del marciume bruno della patata e della verticillosi batterica del pomodoro; che casi di queste malattie si sono manifestati in una parte della Comunità e che sussistono ancora alcuni focolai d’infezione, anchorché di scarsa entità; considerando che in tutto il territorio della Comunità la coltivazione della patata e del pomodoro è esposta ad un serio pericolo, se non si effettuano interventi efficaci riguardo a queste coltivazioni per localizzare questi orga- nismi e determinarne lo stato di diffusione, prevenirne l’insorgenza e la propagazione e, qualora fossero consta- tati, impedirne la propagazione e combatterli ai fini della loro eradicazione; considerando che, per conseguire tale scopo, occorre adottare determinate misure di lotta nella Comunità, che gli Stati membri devono inoltre avere la possibilità di adottare misure supplementari o più rigorose, qualora risultino necessarie e perché non vengano creati ostacoli alla circolazione delle patate o dei pomodori nella Comu- nità, fatto salvo il disposto della direttiva 77/93/CEE del Consiglio, del 21 dicembre 1976, concernente le misure di protezione contro l’introduzione negli Stati membri di organismi nocivi ai vegetali o ai prodotti vegetali (4); che tali misure debbono essere notificate agli altri Stati mem- bri e alla Commissione; l’agente patogeno; che considerando che tali misure devono tener conto della necessità di effettuare accertamenti sistematici ufficiali per localizzare tali accertamenti dovrebbero comprendere procedure di ispezione e, se del caso — dato che la malattia in determinate circostanze ambientali può rimanere latente e inosservata durante la coltivazione delle patate nonché durante il magazzinaggio dei tuberi di patata — includere procedure di campiona- mento e di prova; che la propagazione dell’agente pato- geno durante la stagione vegetativa non è il fattore più importante, ma che l’infezione può essere diffusa dalle acque superficiali nonché da certe piante solanacee selva- tiche associate e che, pertanto, l’irrigazione delle colture di patate e pomodori con acque contaminate crea un evidente rischio di infezione per le colture stesse; che, (4) GU L 26 del 31. 1. 1977, pag. 20. Direttiva modificate da ultimo dalla direttiva 98/2/CE della Commissione (GU L 15 del 21. 1. 1998, pag. 34). L 235/2 IT Gazzetta ufficiale delle Comunità europee 21. 8. 98 inoltre, l’agente patogeno può sussistere durante l’inverno nelle piante di pomodoro e nelle patate dimenticate (spontanee), e che ciò rischia di trasportare l’infezione da una stagione all’altra; che l’infezione si trasmette anche quando le patate vengono a contatto con patate infette o con attrezzi utilizzati per l’impianto, la raccolta e la manipolazione, ovvero con imballaggi impiegati per il trasporto e il magazzinaggio, contaminati in occasione di un precedente contatto con patate infette; considerando che la propagazione dell’agente patogeno può essere ridotta od evitata mediante disinfezione degli oggetti in causa; che la contaminazione dei tuberi-seme rappresenta un grave rischio di propagazione dell’agente patogeno; che l’infezione latente rappresenta anch’essa un grave rischio di propagazione dell’agente patogeno e che ciò può essere evitato impiegando tuberi-seme prodotti nell’ambito di un programma approvato ufficialmente, durante il quale i tuberi-seme sono stati esaminati e riscontrati esenti dall’infezione; considerando che le attuali conoscenze sulla biologia e l’epidemiologia dell’agente Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. sul piano europeo sono incom- plete e che una revisione delle misure proposte si renderà prevedibilmente necessaria entro qualche stagione; che alla luce delle ulteriori ricerche sarà altresì necessario perfezionare le procedure di prova, particolarmente sotto l’aspetto della sensibilità e della specificità dei metodi, in modo da selezionare e standardizzare i più validi fra quelli disponibili; considerando che, per stabilire nei particolari i criteri di lotta generali e quelli supplementari o più rigorosi adot- tati dagli Stati membri per prevenire l’introduzione dell’agente patogeno nel loro territorio, è auspicabile stabilire fra gli Stati membri e la Commissione una stretta collaborazione nell’ambito del comitato fitosanitario per- manente (in prosieguo: «il comitato»), HA ADOTTATO LA PRESENTE DIRETTIVA: Articolo 1 La presente direttiva ha per oggetto i provvedimenti da adottare negli Stati membri per combattere l’agente pato- geno «Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. », precedentemente noto come Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith (in prosieguo: «l’organismo nocivo»), con riferimento alle piante ospiti dell’organismo nocivo elen- cate nell’allegato I, sezione 1 (in prosieguo: «il materiale vegetale elencato»), allo scopo di: a) localizzarlo e determinarne la distribuzione; b) prevenirne la comparsa e la propagazione; c) qualora venga individuato, prevenirne la propaga- zione e combatterlo ai fini della sua eradicazione. Articolo 2 1. Gli Stati membri effettuano ogni anno accertamenti ufficiali sistematici riguardanti la presenza dell’organismo nocivo nel materiale vegetale elencato originario dei rispettivi territori nazionali. Al fine di individuare altre possibili fonti di contaminazione che minacciano la pro- duzione del materiale vegetale elencato, essi procedono ad una valutazione dei rischi e, a meno che durante la valutazione non sia stato individuato alcun rischio di propagazione, effettuano, nelle zone di produzione del materiale vegetale elencato, accertamenti ufficiali mirati alla ricerca dell’organismo nocivo su vegetali diversi dal materiale vegetale elencato, comprese le solanacee selvati- che ospiti, nonché sulle acque superficiali impiegate per l’irrigazione o l’irrorazione del materiale vegetale elencato e sulle acque reflue scaricate dagli impianti di trasforma- zione industriale o di imballaggio in cui viene manipolato il materiale vegetale elencato e impiegate per l’irrigazione o l’irrorazione di questo materiale. La portata degli accertamenti mirati è definita a seconda dei rischi identi- ficati. Gli Stati membri possono inoltre effettuare accerta- menti ufficiali per la ricerca dell’organismo nocivo in altri materiali, quali terreno di coltura, suolo e rifiuti solidi di impianti di trasformazione industriale o di imballaggio. Gli accertamenti ufficiali di cui al paragrafo 1 2. devono essere effettuati: a) per il materiale vegetale elencato, secondo le indica- zioni dell’allegato I, sezione II, punto 1, e b) per le piante ospiti diverse dal materiale vegetale elencato, nonché per le acque, comprese le acque reflue, in base a metodi appropriati e, se del caso, saranno prelevati campioni da sottoporre a prove di laboratorio ufficiali o sotto controllo ufficiale; c) se del caso, su altri materiali in base a metodi appropriati. Per questi accertamenti, ulteriori particolari relativi alle procedure di ispezione e al numero, all’origine, alla stratificazione e al momento del prelievo dei campioni sono stabiliti dall’organismo ufficiale competente, quale definito dalla direttiva 77/93/CEE, in base a fondati principi scientifici e statistici e alla biologia dell’organi- smo nocivo, tenendo altresì conto, negli Stati membri interessati, degli specifici sistemi di produzione del mate- riale vegetale elencato e, se del caso, di altre piante ospiti dell’organismo nocivo. 3. Le modalità specifiche e i risultati degli accertamenti ufficiali di cui al paragrafo 1 sono notificati ogni anno 21. 8. 98 IT Gazzetta ufficiale delle Comunità europee L 235/3 agli altri Stati membri e alla Commissione, secondo le prescrizioni dell’allegato I, sezione II, punto 2. Le notifi- che sono effettuate entro il 1o giugno ad eccezione di quelle relative alle patate usate come sementi ottenute dall’agricoltore e utilizzate nella sua azienda, che sono effettuate entro il 1o settembre. Le modalità specifiche e i risultati concernenti le colture si riferiscono alla produ- zione dell’anno precedente. I dati contenuti nelle notifiche possono essere presentati al comitato. Sono adottati secondo la procedura di cui all’arti- 4. colo 16 bis della direttiva 77/93/CEE: — i metodi appropriati per gli accertamenti e gli esami di laboratorio di cui al paragrafo 2, primo comma, lettera b). Possono essere adottati secondo la procedura di cui 5. all’articolo 16 bis della direttiva 77/93/CEE: — i metodi appropriati per gli accertamenti di cui al paragrafo 2, primo comma, lettera c), — ogni ulteriore dettaglio per gli accertamenti di cui al paragrafo 2, secondo comma, allo scopo di assicurare livelli comparabili di sicurezza nei vari Stati membri. Articolo 3 Gli Stati membri provvedono affinché, ogniqualvolta si sospetti o venga confermata la presenza nel loro territorio dell’organismo nocivo, ne venga data comunicazione ai rispettivi organismi ufficiali responsabili. gli organismi ufficiali responsabili degli Stati membri per quanto concerne la loro produzione: a) vietano il movimento delle piante e dei tuberi di tutte le colture, partite o spedizioni da cui sono stati prelevati i campioni, a meno che esso non avvenga sotto il controllo dei servizi stessi e purché sia stata accertata l’inesistenza di rischi effettivi di propaga- zione dell’organismo nocivo; b) attuano opportuni interventi per risalire all’origine della presenza sospetta; c) introducono altri provvedimenti cautelativi commisu- rati al rischio stimato, in particolare per quanto riguarda la produzione del materiale vegetale elencato e il movimento di partite di tuberi-seme di patata diverse da quelle di cui alla lettera a), prodotto nel luogo da cui sono stati prelevati i campioni di cui a detta lettera a), onde scongiurare la propagazione dell’organismo nocivo. 3. Nei casi di presenza sospetta in cui esista un rischio di contaminazione del materiale vegetale elencato o delle acque superficiali da o in uno o più altri Stati membri, lo Stato membro in cui la presenza sospetta è stata segnalata notifica immediatamente agli altri Stati membri interessati le caratteristiche della manifestazione stessa, a seconda del rischio identificato e detti Stati membri collaborano opportunamente tra loro. Lo(Gli) Stato(i) membro(i) destinatario(i) della suddetta notifica adotta(ano) misure precauzionali a norma del paragrafo 2, lettera c), e intraprende(ono), ove necessario, ulteriori azioni a norma dei paragrafi 1 e 2. Sono adottate secondo la procedura di cui all’arti- 4. colo 16 bis della direttiva 77/93/CEE: Articolo 4 — le misure di cui al paragrafo 2, lettera c). 1. In caso di presenza sospetta, gli organismi ufficiali competenti dello Stato membro, o degli Stati membri, dove è stato segnalato il caso, provvedono ad effettuare prove di laboratorio ufficiali o sotto controllo ufficiale utilizzando, per il materiale vegetale elencato, il metodo appropriato di cui all’allegato II secondo quanto disposto nell’allegato III, punto 1, ovvero, in tutti gli altri casi, secondo un qualsiasi altro metodo ufficialmente appro- vato, al fine di confermare o smentire la presenza sospetta. In caso di conferma si applicano le disposizioni dell’allegato III, punto 2. 2. In attesa della conferma o della smentita della presenza sospetta di cui al paragrafo 1, in ogni caso di presenza sospetta in cui: i) ii) siano stati individuati sintomi diagnostici della malat- tia e la prova (o le prove) di screening rapido di cui all’allegato II, sezione I, punto 1 e sezione II abbia(no) dato esito positivo, oppure la prova (o le prove) di screening rapido di cui all’allegato II, sezione 1, punto 2 e sezione III abbia(no) dato esito positivo, Articolo 5 1. Qualora le prove di laboratorio ufficiali o condotte sotto controllo ufficiale applicando, per il materiale vege- tale elencato, il metodo appropriato di cui all’allegato II oppure, in tutti gli altri casi, un qualsiasi metodo ufficial- mente approvato, confermino la presenza dell’organismo nocivo in un campione prelevato a norma della presente direttiva, gli organismi ufficiali responsabili di uno Stato membro, sulla base di fondati principi scientifici, della biologia dell’organismo nocivo e dei particolari sistemi di lavorazione e commercializzazione delle produzione, piante ospiti di tale organismo nocivo in detto Stato membro: a) per il materiale vegetale elencato, i) avviano un accertamento per determinare l’entità della contaminazione e la sua fonte o fonti pri- marie, ai sensi delle disposizioni dell’allegato IV ed eseguendo ulteriori esami a norma dell’arti- colo 4, punto 1, almeno su tutte le scorte di tuberi-seme di patata che hanno una relazione clonale, e L 235/4 IT Gazzetta ufficiale delle Comunità europee 21. 8. 98 ii) dichiarano contaminati il materiale vegetale elen- cato, le spedizioni e/o le partite da cui è stato prelevato il campione, nonché i macchinari, i veicoli, i contenitori, i magazzini, o le relative parti e qualsiasi altro oggetto, compresi i mate- riali di imballaggio, che sia stato a contatto col materiale vegetale elencato da cui è stato prele- vato il campione; dichiarano altresì contaminati, se del caso, il terreno o i terreni, l’appezzamento o gli appezzamenti di produzione sotto prote- zione del vegetale nonché il luogo o i luoghi di produzione dove è stato raccolto il materiale vegetale elencato e da cui è stato prelevato il campione; i campioni prelevati durante la stagione di crescita, dichiarano conta- minati il terreno o i terreni, il luogo o i luoghi di produzione e, se del caso, l’appezzamento o gli appezzamenti di produzione sotto protezione del vegetale da cui è stato prelevato il campione, inoltre, per iii) ai sensi delle disposizioni dell’allegato V, punto 1, determinano l’entità della contamina- zione probabile derivante da contatti prima o dopo la raccolta, collegata col ciclo produttivo, l’irrigazione o l’irrorazione o da relazioni clonali con la contaminazione dichiarata, e iv) delimitano una zona in base alla dichiarazione di contaminazione di cui al punto ii), alla determi- nazione dell’entità della contaminazione proba- bile di cui al punto iii) e alla potenziale propaga- zione dell’organismo nocivo, tenendo conto delle disposizioni dell’allegato V, paragrafo 2, punto i); b) per le colture o le piante ospiti diverse da quelle menzionate nella lettera a), dove sia stato ricono- sciuto che sussiste un rischio per la produzione del materiale vegetale elencato, i) avviano una ricerca ai sensi della lettera a), punto i), e ii) dichiarano contaminate le piante ospiti dell’orga- nismo nocivo da cui è stato prelevato il cam- pione, e iii) determinano l’entità della contaminazione proba- bile e delimitano una zona, ai sensi, rispettiva- mente, della lettera a), punti iii) e iv) e in rapporto alla produzione del materiale vegetale elencato; c) per le acque superficiali (comprese le acque reflue di lavorazione industriali o di stabilimenti di imballaggio che manipolano materiale vegetale elencato) e per le solanacee selvatiche associate a carattere di pianta ospite, dove sia stato riconosciuto che la produzione del materiale vegetale elencato è esposta ad un rischio di contaminazione attraverso l’irrigazione, l’irrora- zione o l’inondazione con acque superficiali, i) avviano un accertamento, comprendente esami ufficiali da effettuare nei momenti appropriati su campioni di acque superficiali nonché sulle sola- nacee selvatiche a carattere di pianta ospite even- tualmente presenti, per determinare l’entità della contaminazione, e ii) dichiarano contaminate le acque superficiali da cui sono stati prelevati campioni, nella misura appropriata e in base all’accertamento di cui al punto i), e iii) determinano l’entità della contaminazione proba- bile e delimitano una zona in base alla dichiara- zione di contaminazione di cui al punto ii) e alla possibile propagazione dell’organismo nocivo, tenendo conto delle disposizioni dell’allegato V, punto 1 e punto 2 ii). 2. Gli Stati membri notificano immediatamente agli altri Stati membri e alla Commissione, ai sensi delle disposizioni dell’allegato V, punto 3, i casi di contamina- zione dichiarata ai sensi del paragrafo 1, lettera a), punto ii), e lettera c), punto ii), nonché i dati specifici relativi alla delimitazione della zona di cui al paragrafo 1, lettera a), punto iv), e, se del caso, al paragrafo 1, lettera c), punto iii). I dati contenuti nella notifica ai sensi del presente paragrafo possono essere presentati al comi- tato. Contemporaneamente gli Stati membri presentano alla Commissione la notifica supplementare di cui al punto 4 dell’allegato V. I dati contenuti nella notifica ai sensi del presente comma sono presentati immediatamente ai mem- bri del comitato. In seguito alla notifica di cui al paragrafo 2 e in 3. base agli elementi ivi menzionati, gli altri Stati membri specificati nella notifica avviano un accertamento a norma del paragrafo 1, lettera a), punto i), e, dove applicabile, del paragrafo 1, lettera c), punto i), e, se del caso, intraprendono ulteriori azioni a norma dei para- grafi 1 e 2. Articolo 6 1. Gli Stati membri vietano la messa a dimora del materiale vegetale elencato dichiarato contaminato ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto ii), e dispongono che esso, sotto il controllo degli organismi nazionali responsabili, sia soggetto ad una delle disposi- zioni dell’allegato VI, punto 1, in modo che sia assicurata l’inesistenza di rischi identificabili di propagazione dell’organismo nocivo. 2. Gli Stati membri vietano la messa a dimora del materiale vegetale elencato ritenuto probabilmente conta- minato ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto iii), e lettera c), punto iii) — compreso il materiale vegetale elencato per il quale è stato individuato un rischio, prodotto in luoghi di produzione ritenuti proba- bilmente contaminati ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto iii) — e dispongono che esso, sotto il controllo degli organismi nazionali responsabili, sia desti- nato ad un impiego appropriato o sia eliminato ai sensi dell’allegato VI, punto 2, in modo che sia assicurata l’inesistenza di rischi identificabili di propagazione dell’organismo nocivo. 3. Gli Stati membri prescrivono che i macchinari, i veicoli, i contenitori, i magazzini o le relative parti, nonché qualsiasi altro oggetto, compresi i materiali di 21. 8. 98 IT Gazzetta ufficiale delle Comunità europee L 235/5 imballaggio, dichiarati contaminati ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto ii), o ritenuti probabilmente contaminti ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto iii) e lettera c), punto iii), siano distrutti o deconta- minati secondo i metodi adeguati di cui all’allegato VI, punto 3. Dopo la decontaminazione, gli oggetti in que- stione non sono più considerati contaminati. 4. Fatte salve le misure attuate ai sensi dei paragrafi 1, 2 e 3, gli Stati membri prescrivono che, nelle zone delimitate ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto iv), e lettera c), punto iii), sia applicata una serie di misure come precisato nell’allegato VI, punti 4. 1 e 4. 2. I dati relativi a tali misure sono notificati ogni anno agli altri Stati membri e alla Commissione. I dati contenuti nella notifica possono essere presentati al comitato. Articolo 7 1. Gli Stati membri dispongono che i tuberi-seme di patata debbono essere conformi ai requisiti della direttiva 77/93/CEE e derivare direttamente da materiali, ottenuti nell’ambito di un programma ufficialmente approvato, che sono risultati esenti dall’organismo nocivo in prove ufficiali o sotto controllo ufficiale, eseguite utilizzando il metodo appropriato di cui all’allegato II. Dette prove sono eseguite da uno Stato membro: a) qualora sia stata confermata la presenza dell’organi- smo nocivo nella propria produzione di tuberi-seme di patate, i) mediante prove effettuate sulle precedenti propa- gazioni, compresa la selezione clonale di partenza, e prove sistematiche effettuate su cloni di tuberi- seme di patate di base, oppure ii) qualora sia stata accertata l’assenza di relazione clonale, mediante prove effettuate su tutti i cloni di tuberi-seme di patate di base o su precedenti propagazioni, compresa la selezione clonale di partenza, e b) negli altri casi, su ciascuna pianta della selezione clonale di partenza oppure su campioni rappresenta- tivi dei tuberi-seme di base o di precedenti propaga- zioni. Possono essere adottate secondo la procedura di cui 2. all’articolo 16 bis della direttiva 77/93/CEE: — le modalità particolareggiate di applicazione del para- grafo 1, secondo comma, lettera a); — le disposizioni sui campioni rappresentativi di cui al paragrafo 1, secondo comma, lettera b). Articolo 9 Fatte salve le disposizioni della direttiva 77/93/CEE, gli Stati membri possono autorizzare deroghe alle diposizioni degli articoli 6 e 8 della presente direttiva, ai sensi delle disposizioni della direttiva 95/44/CE, per prove o scopi scientifici e per lavori di selezione varietale (1). Articolo 10 Per la propria produzione gli Stati membri possono adottare, qualora risultino necessarie, misure supplemen- tari o più rigorose per combattere l’organismo nocivo o per prevenirne la propagazione, sempreché siano con- formi alle disposizioni della direttiva 77/93/CEE. I dati relativi a tali misure sono notificati agli altri Stati membri e alla Commissione. I dati contenuti nella noti- fica possono essere presentati al comitato. Articolo 11 Le eventuali modifiche degli allegati della presente diret- tiva, da apportare alla luce degli sviluppi tecnici e scienti- fici, sono adottate secondo la procedura di cui all’arti- colo 16 bis della direttiva 77/93/CEE. Nel caso dei metodi stabiliti nell’allegato II e delle misure di cui all’allegato VI, punti 4. 1 e 4. 2, della presente direttiva, la Commissione presenta al comitato, anteriormente al 1o gennaio 2002, una relazione di riesame di tali metodi e misure elaborata alla luce dell’esperienza acquisita. Articolo 12 Gli Stati membri mettono in vigore le disposizioni 1. legislative, regolamentari e amministrative necessarie per conformarsi alla presente direttiva con effetto al 21 ago- sto 1999. Essi ne informano immediatamente la Commis- sione. Quando gli Stati membri adottano tali disposizioni, que- ste contengono un riferimento alla presente direttiva o sono corredate di un siffatto riferimento all’atto della pubblicazione ufficiale. Le modalità di tale riferimento sono decise dagli Stati membri. 2. Gli Stati membri comunicano immediatamente alla Commissione il testo delle disposizioni essenziali di diritto interno che essi adottano nel settore disciplinato dalla presente direttiva. La Commissione ne informa gli altri Stati membri. Articolo 8 Gli Stati membri vietano la detenzione e la manipolazione dell’organismo nocivo. (1) GU L 184 del 3. 8. 1995, pag. 34. Direttiva modificata da ultimo dalla direttiva 97/46/CE della Commissione (GU L 204 del 31. 7. 1997, pag. 43). L 235/6 IT Gazzetta ufficiale delle Comunità europee 21. 8. 98 Articolo 13 Fatto a Bruxelles, addì 20 luglio 1998. La presente direttiva entra in vigore il giorno della pubblicazione nella Gazzetta ufficiale delle Comunità europee. Articolo 14 Gli Stati membri sono destinatari della presente diret- tiva. Per il Consiglio Presidente W. MOLTERER 21. 8. 98 IT Gazzetta ufficiale delle Comunità europee L 235/7 ALLEGATO I SEZIONE I Elenco delle piante ospiti di Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. di cui all’articolo 1 Piante (compresi i tuberi) diverse dai semi veri di Solanum tuberosoum L. Piante diverse dai semi di Lycopersicon lycopersicum (L. ) Karsten ex Farw. Patata Pomodoro SEZIONE II Accertamenti 1. Gli accertamenti ufficiali di cui all’articolo 2, paragrafo 2, lettera a), debbono essere basati sulla biologia del microrganismo nocivo e sul particolare sistema di produzione nello Stato membro interessato. Essi debbono comprendere: i) nel caso delle patate, — a momenti appropriati, l’ispezione visuale della pianta durante la crescita e/o il prelievo di campioni di tuberi-seme e di altre patate durante la stagione di crescita oppure in magazzino. Questi campioni debbono essere sottoposti a ispezione visuale ufficiale o sotto sorveglianza ufficiale, comportante il sezionamento dei tuberi, e inoltre, — nel caso dei tuberi-seme e, se del caso, di altre patate, esami di laboratorio, ufficiali o sotto sorveglianza ufficiale secondo il metodo di cui all’allegato II; ii) nel caso del pomodoro, — l’ispezione visuale, a momenti appropriati, almeno durante la crescita delle piante destinate al reimpianto ad usi professionali. 2. La notifica degli accertamenti ufficiali di cui all’articolo 2, paragrafo 3, deve comprendere: i) nel caso delle patate, — la superficie totale, valutata in ettari, coltivata a patate da seme e ad altri tipi di patata, — la stratificazione per categoria (patate da seme e da consumo), e se del caso, per regione, — il numero dei campioni prelevati per l’esame e il calendario dei prelievi, — il numero di ispezioni visuali sul terreno, — il numero delle ispezioni visuali sui tuberi (e l’entità dei campioni); ii) nel caso delle piante di pomodori, almeno durante la crescita, destinate al reimpianto ad usi professionali, — numero totale stimato delle piante, — il numero delle ispezioni visuali; iii) nel caso delle piante ospiti diverse dalla patata e dal pomodoro, comprese le solanacee selvatiche ospiti, — la specie, — il numero e la cadenza dei campioni prelevati, — la zona/il corso d’acqua sottoposti a prelievo, secondo i casi, — il metodo di analisi; iv) nel caso degli accertamenti sull’acqua e sugli scarichi di reflui degli impianti di trasformazione industriale o di imballaggio, — il numero e la cadenza dei campioni, — la zona/il corso d’acqua/l’ubicazione dell’impianto sottoposti a prelievo, secondo i casi, — il metodo di analisi. L 235/8 IT Gazzetta ufficiale delle Comunità europee 21. 8. 98 ALLEGATO II SCHEMA PER LA DIAGNOSI, IL RILEVAMENTO E L’IDENTIFICAZIONE DI RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL. SCOPO DELLO SCHEMA DIAGNOSTICO Questo schema descrive i vari procedimenti da usare per: i) la diagnosi del marciume bruno nei tuberi di patata e della verticillosi batterica nelle piante di patata e di pomodoro; ii) il rilevamento di Ralstonia solanacearum nei campioni di tuberi di patata, iii) l’identificazione di Ralstonia solanacearum. Nelle appendici vengono descritte le modalità per la preparazione dei materiali per i saggi, cioè terreni di coltura, tamponi, soluzioni, reagenti. INDICE SEZIONE I: Applicazione dello schema. 1. Diagnosi del marciume bruno nei tuberi di patata e di verticillosi batterica nelle piante di patata e di pomodoro. 2. Rilevamento e identificazione di Ralstonia solanacearum in campioni di tuberi di patata. SEZIONE II: Diagnosi del marciume bruno nei tuberi di patate e di verticillosi batterica nelle piante. di patata e di pomodoro 1. Sintomi del marciume bruno. 2. Saggi rapidi per selezione preliminare. 3. Procedimento di isolamento. 4. Saggi di conferma. SEZIONE III: Rilevamento e identificazione di Ralstonia solanacearum in campioni di tuberi di patata 1. Preparazione del campione per i saggi. 2. Colorazione di immunofluorescenza (IF). 3. Saggio immunoenzimatico (Elisa). 4. Reazione a catena del DNA polimerasi (PCR). 5. Isolamento selettivo in piastra. 6. Saggio biologico. 7. Prove di arricchimento. 8. Prova di patogenicità. Appendice 1: Substrati nutritivi per l’isolamento e la coltura di Ralstonia solanacearum. Appendice 2: Materiali per la preparazione del campione. Appendice 3: Materiali per il saggio IF. Appendice 4: Determinazione del livello di contaminazione nella prova IF. Appendice 5: Materiali per il saggio Elisa. Appendice 6: Materiali per la prova PCR. Appendice 7: Materiali per l’isolamento selettivo su piastra. 9 9 11 13 13 13 14 14 17 17 18 20 20 22 23 23 23 24 25 26 27 28 29 29 Bibliografia. 30 21. 8. 98 IT Gazzetta ufficiale delle Comunità europee L 235/9 SEZIONE I APPLICAZIONE DELLO SCHEMA 1. Diagnosi del marciume bruno nei tuberi di patata e di verticillosi batterica nelle piante di patata e di pomodoro Il procedimento qui indicato è da applicarsi alle piante e ai tuberi con sintomi tipici o sospetti di marciume bruno. Esso comporta una prova rapida di selezione preliminare, l’isolamento dell’agente patogeno dal tessuto vascolare infetto su terreni di coltura diagnostici e, in caso di esito positivo, l’identificazione della coltura come Ralstonia solanacearum. Diagramma di flusso piante di patata o di pomodoro o tuberi di patata con sintomi (1) saggio/i rapido/i per selezione preliminare (2) ISOLAMENTO colonie con morfologia tipica SÌ NO(3) SAGGI DI CONFERMA identificazione (4) di una coltura pura come Ralstonia solanacearum più prova di patogenicità (4) SÌ NO piante e/o tuberi non infetti da Ralstonia solanacearum piante e/o tuberi infetti da Ralstonia solanacearum L 235/10 IT Gazzetta ufficiale delle Comunità europee 21. 8. 98 Riferimenti del diagramma di flusso: (1) La descrizione dei sintomi è fornita nella sezione II, paragrafo 1. (2) I saggi rapidi di selezione preliminare permettono di formulare una diagnosi presunta. I saggi idonei sono: — fuoriuscita a filamenti della massa batterica dal tessuto vascolare del fusto (sezione II, paragrafo 2), — saggio dei granuli di poli-beta-idrossibutirrato (sezione II, paragrafo 2), — colorazione IF (sezione III, paragrafo 2), — Saggio Elisa (sezione III, paragrafo 3), — PCR (sezione III, paragrafo 4). (3) Sebbene l’isolamento del patogeno da materiali con sintomi tipici mediante la tecnica della diluizione in piastra sia immediato, in fasi avanzate di infezione la crescita delle sue colonie può non aver luogo. I batteri saprofiti che si sviluppano nel tessuto malato possono eliminare o inibire il patogeno sul substrato di isolamento. Se l’isolamento è negativo, ma i sintomi della malattia sono tipici, l’isolamento deve essere ripetuto, preferibilmente su un substrato selettivo. (4) Si può perseguire una identificazione affidabile di una coltura pura di Ralstonia solanacearum per mezzo di almeno uno dei saggi elencati nella sezione II, paragrafo 4. 1 abbinata a una prova di patogenicità (sezione II, paragrafo 4. 3). La caratterizzazione del ceppo è facoltativa ma è consigliabile per ogni nuovo caso. 21. 8. 98 IT Gazzetta ufficiale delle Comunità europee L 235/11 2. Rilevamento e identificazione di Ralstonia solanacearum in campioni di tuberi di patata Il procedimento è inteso a rilevare le infezioni latenti nei tuberi di patata mediante uno o, preferibilmente, più saggi di selezione preliminare che, se positivi, vengono confermati dall’isolamento del patogeno e quindi, in caso di isolamento di colonie tipiche, dall’identificazione di una coltura pura di Ralstonia solanacearum. Diagramma di flusso campione di tuberi di patata (1) SAGGIO (SAGGI) DI SELEZIONE PRELIMINARE (2) COLORAZIONE IF (3) e/o isolamento selettivo in piastra (4) con ulteriori prove facoltative: saggio Elisa (5) PCR (6) prova (prove) di arricchimento (7) almeno un saggio positivo tutti i saggi eseguiti sono negativi campione non infetto da Ralstonia solanacearum ISOLAMENTO isolamento selettivo in piastra e/o saggio biologico (8) colonie con morfologia tipica SÌ NO SAGGIO (SAGGI) DI CONFERMA identificazione (9) della coltura come Ralstonia solanacearum più prova di patogenicità (9) SÌ NO campione infetto da Ralstonia solanacearum campione non infetto da Ralstonia solanacearum campione non infetto da Ralstonia solanacearum L 235/12 IT Gazzetta ufficiale delle Comunità europee 21. 8. 98 Riferimenti del diagramma di flusso (1) C a m p i o n e Il campione standard è di 200 tuberi. Tuttavia il procedimento può essere convenientemente applicato anche a campioni aventi meno di 200 tuberi. (2) S a g g i o ( s a g g i ) d i s e l e z i o n e p r e l i m i n a r e Un singolo saggio di selezione preliminare può non essere sufficientemente sensibile o affidabile per rilevare Ralstonia solanacearum in un campione. È quindi consigliabile eseguire più di un saggio. Se possibile, tali saggi dovrebbero essere fatti con metodologie differenti. (3) C o l o r a z i o n e d i i m m u n o f l u o r e s c e n z a ( I F ) La colorazione IF (metodo indiretto) è un saggio di selezione preliminare ben collaudato. Esso ha pertanto vantaggi rispetto ad altre prove non ancora pienamente sviluppate o convalidate. Secondo i parametri di lettura specificati in tale metodo si tratta di un saggio sensibile (soglia di 103-104 cellule per ml di pellet di estratto di patata). Il fattore critico per l’affidabilità dell’esito del saggio è la qualità dell’antisiero. Solo un antisiero ad alto titolo (minimo 2 000 per l’antisiero grezzo) è accettabile e tutte le prove devono essere eseguite con antisiero a tale titolo o con una diluizione inferiore a detto titolo. Il metodo indiretto è preferibile. Il metodo diretto può essere usato se il saggio ha un livello di sensibilità e di specificità equivalente a quello del metodo indiretto. Il saggio IF ha il vantaggio di consentire una interpretazione soggettiva della morfologia di colorazione della cellula e dell’intensità della fluorescenza che forniscono le informazioni sulla specificità della reazione. Sono frequenti le reazioni incrociate con batteri sierologicamente affini provenienti dal suolo o associati a tessuti della patata con morfologia cellulare di Ralstonia solanacearum. Il saggio IF può essere usato come unico saggio di selezione preliminare sebbene, qualora si sospettino reazioni incrociate, dovrebbe essere fatto un saggio preliminare addizionale basato su differente base biologica. In questi casi l’isolamento selettivo è il più appropriato. (4) I s o l a m e n t o s e l e t t i v o i n p i a s t r a Si tratta di un saggio sensibile e selettivo per Ralstonia solanacearum se fatto con substrato SMSA modificato e con la metodologia specificata in questo schema. Il risultato è disponibile da 3 a 6 giorni dopo la preparazione del campione. Il patogeno viene ottenuto direttamente in coltura e può essere facilmente identificato. Ai fini di un perfetto sfruttamento del suo potenziale, il saggio richiede un’accurata preparazione di coni ombelicali piccoli per eliminare i batteri secondari associati al tessuto della patata che sono competitori di Ralstonia solanacearum sul terreno di coltura e ne possono influenzare la crescita. Alcuni ceppi possono stentare a crescere in quanto anche i componenti del terreno possono condizionare l’organismo obiettivo. Occorre particolare attenzione anche per distinguere Ralstonia solanacea- rum da altri batteri che si possono sviluppare sul terreno di coltura. L’isolamento selettivo in piastra può essere usato come unico saggio di selezione preliminare sebbene, nel caso in cui si ottenga un risultato negativo e si sospetti l’inibizione di Ralstonia solanacearum da parte di altri batteri presenti sul terreno di coltura, dovrebbe essere fatto un saggio di selezione preliminare di altro tipo per confermare o confutare la diagnosi. In tali casi, la colorazione IF è la più appropriata. (5) S a g g i o E l i s a Il saggio Elisa è generalmente meno sensibile della colorazione IF (soglia di 104-105 cellule/ml di pellet di estratto di patata). Il saggio è economico e veloce ma, generalmente, è più soggetto a falsi risultati positivi (reazioni incrociate) e a falsi risultati negativi (inibizione da parte di molecole fenoliche nell’estratto di patata). È richiesta una specificità dell’antisiero estremamente alta. Il saggio Elisa non può essere usato come unico saggio di selezione preliminare. (6) P C R Il saggio PCR ha potenzialmente un’elevata sensibilità di rilevamento. Il saggio viene facilmente inibito da componenti presenti nell’estratto di pianta o di tubero che portano a una falsa negatività. Alcune cultivar di patata contengono più inibitori di altre. È pertanto necessario rimuovere tali inibitori. Gli inibitori possono essere evitati con la diluizione, ma in tal modo anche le popolazioni di Ralstonia solanacearum vengono diluite. È necessario prestare molta attenzione in tutte le fasi di preparazione del campione e del saggio per impedire la contaminazione che porterebbe a risultati falsamente positivi. Falsi risultati positivi possono derivare anche da sequenze omologhe presenti in altri organismi. Per tali motivi la PCR diretta non può essere usata come unico saggio di selezione preliminare. (7) P r o v a d i a r r i c c h i m e n t o L’incubazione di campioni di sedimenti di centrifuga di estratto di patata in un brodo di coltura semiselettivo, come un brodo SMSA modificato, consente la moltiplicazione di Ralstonia solanacearum. Inoltre, cosa forse ancora più importante, diluisce i potenziali inibitori dei saggi Elisa o PCR. Ralstonia solanacearum può in tal modo essere rilevato nel brodo di arricchimento con i saggi IF, Elisa o PCR. Non consigliamo di fare l’isolamento diretto in piastra usando i brodi arricchiti. Questi metodi di arricchimento non sono stati ancora sperimentati e provati in modo approfondito. Sono stati inclusi in questo schema per il loro buon potenziale. Tuttavia, data la relativa mancanza di esperienza nella loro esecuzione, non possono essere utilizzati come unici metodi di rilevamento. (8) S a g g i o b i o l o g i c o Il saggio biologico è usato per l’isolamento di Ralstonia solanacearum dai sedimenti di centrifuga di estratti di patata sfruttando una pianta ospite come mezzo selettivo di arricchimento e può essere fatto su piante di pomodoro o di melanzana. Il saggio richiede condizioni ottimali di incubazione, come specificato in tale metodo. È molto probabile che in tale saggio i batteri inibitori di Ralstonia solanacearum sul mezzo SMSA non interferiscono. (9) S a g g i o ( i ) d i c o n f e r m a È possibile ottenere una identificazione affidabile di coltura pura di Ralstonia solanacearum almeno con uno dei saggi elencati nella sezione II, paragrafo 4. 1, abbinata a una prova di patogenicità (sezione II, paragrafo 4. 3). La caratterizzazione del ceppo è facoltativa, anche se consigliabile per ogni nuovo caso. 21. 8. 98 IT Gazzetta ufficiale delle Comunità europee L 235/13 DIAGNOSI DEL MARCIUME BRUNO NEI TUBERI DI PATATA E DI VERTICILLOSI BATTERICA NELLE PIANTE DI PATATA E DI POMODORO SEZIONE II 1. 1. 1. Sintomi del marciume bruno S i n t o m i n e l l a p a t a t a Pianta di patata. La fase iniziale dell’infezione consiste nella perdita di turgore delle foglie della parte superiore della pianta con le alte temperature diurne e loro ripresa durante la notte. La flaccidezza si aggrava, diventa presto irreversibile e porta a morte la pianta. Il tessuto vascolare dei fusti di piante avvizzite tagliato trasversalmente può diventare bruno e un liquido lattiginoso può essudare dalla superficie tagliata o può essere facilmente fatto uscire per compressione. Quando uno stelo tagliato viene immerso verticalmente in acqua, filamenti di mucillagine colano dai fasci vascolari. Tubero di patata. I tuberi di patata devono essere tagliati trasversalmente vicino all’ombelico (punto di attacco dello stolone). La fase iniziale dell’infezione consiste in una alterazione di colore da giallo vitreo a marrone chiaro dell’anello vascolare da cui fuoriesce spontaneamente un liquido color crema chiaro dopo pochi minuti o quando viene esercitata una lieve pressione delle dita sulla buccia vicino alla superficie sezionata. In seguito lo scoloramento vascolare diventa di un marrone più netto e la necrosi può estendersi al tessuto parenchimatico. Nelle fasi avanzate l’infezione si espande centrifugamente sino ad emergere in corrispondenza dell’ombelico e degli occhi dove causa tacche bruno-rossastre, leggermente infossate e fuoriuscita di gocciole di essudato cui rimangono aderenti particelle di terreno. 1. 2. S i n t o m i n e l p o m o d o r o Pianta di pomodoro. Il primo sintomo visibile è l’aspetto flaccido delle foglie più giovani. In condizioni ambientali favorevoli per l’agente patogeno (temperatura del suolo di circa 25 °C, umidità satura), epinastia e flaccidezza di un lato della pianta o dell’intera pianta seguono in pochi giorni portando alla rovina totale. In condizioni meno favorevoli (temperatura al suolo inferiore a 21 °C) possono svilupparsi sullo stelo molte radici avventizie. Si può osservare un cordone di grasso lungo lo stelo che indica la necrosi del sistema vascolare. Quando lo stelo è tagliato trasversalmente, dai tessuti vascolari bruni scoloriti dello stelo essudano gocce di liquido batterico bianco o giallastro. 2. Saggi rapidi per selezione preliminare Un saggio di selezione preliminare facilita la formulazione di una diagnosi presunta. Usare uno o più dei seguenti saggi: Prova dell’essudato batterico sul fusto La presenza di Ralstonia solanacearum nei fusti di patata aventi foglie flaccide può essere accertata mediante la seguente prova presuntiva. Tagliare lo stelo appena al di sopra del livello del suolo. Porre la superficie tagliata in un bicchiere contenente acqua. Poco dopo, filamenti di mucillagine batterica coleranno spontaneamente dai fasci vascolari. Altri batteri che causano infezione vascolare nelle piante di patate non provocheranno questo fenomeno. Rilevamento dei granuli di poli-beta-idrossibutirrato (PHB) I granuli PHB nelle cellule di Ralstonia solanacearum sono resi visibili con la colorazione blu Nilo A o nero Sudan B. Preparare uno striscio dell’essudato o della sospensione di tessuto su un vetrino da microscopio oppure preparare uno striscio di una coltura di 48 ore su YPGA o SPA (appendice 1). Preparare strisci di controllo positivo di un ceppo bio- var 2, razza 3. Lasciare seccare. Passare rapidamente diverse volte la parte inferiore del vetrino sopra la fiamma fino a quando lo striscio sia fissato. C o l o r a z i o n e b l u N i l o 1) Coprire lo striscio fissato con una soluzione acquosa all’1 % di blu Nilo A. Mantenere in incubazione per 10 minuti a 55 °C. 2) Far sgocciolare la soluzione colorante. Lavare rapidamente sotto un getto leggero di acqua corrente. Eliminare l’acqua in eccesso con carta bibula. 3) Coprire lo striscio con una soluzione di acido acetico all’8 %. Mantenere in incubazione per 1 minuto a temperatura di laboratorio. 4) Lavare sotto un getto leggero di acqua corrente. Asciugare tamponando con carta bibula. 5) Riumidificare con una goccia d’acqua. Applicare un vetrino coprioggetto. 6) Esaminare lo striscio colorato con un microscopio a epifluorescenza a 450 nm in olio da immersione a 1 000 ingrandimenti. Osservare se vi sia una fluorescenza arancio vivo dei granuli PHB. Osservare anche a luce normale per accertare che i granuli siano intracellulari e che la morfologia della cellula sia tipica di Ralstonia solanacearum. L 235/14 IT Gazzetta ufficiale delle Comunità europee 21. 8. 98 C o l o r a z i o n e n e r o S u d a n 1) Coprire lo striscio fissato con una soluzione allo 0,3 % di nero Sudan B in 70 % di etanolo. Mantenere in incubazione per 10 minuti a temperatura ambiente. 2) Far sgocciolare la soluzione colorante. Lavare rapidamente in acqua corrente. Eliminare l’acqua in eccesso con carta bibula. 3) Immergere rapidamente lo striscio in xilolo. Asciugare tamponando con carta bibula. Attenzione: Lo xilolo è un prodotto nocivo. Operare in ambiente provvisto di cappa a tiraggio forzato. 4) Coprire lo striscio con una soluzione acquosa di safranina allo 0,5 % (p/v) e lasciare per 10 secondi a temperatura ambiente. Attenzione: La safranina è un prodotto nocivo. Operare in ambiente provvisto di cappa a tiraggio forzato. 5) Lavare sotto un getto leggero di acqua corrente. Asciugare tamponando con carta bibula. Applicare un vetrino coprioggetto. 6) Esaminare lo striscio colorato con un microscopio ottico a luce trasmessa con olio da immersione a 1 000 ingrandimenti. I granuli PHB in cellule di Ralstonia solanacearum si colorano di blunero. La parete della cellula si colora di rosa. A l t r i s a g g i Altri saggi appropriati per la selezione preliminare sono la colorazione IF (sezione III. 2), il saggio Elisa (sezione III. 3) e il saggio PCR (sezione III. 4). Procedimento di isolamento Rimuovere l’essudato o le parti di tessuto cromaticamente alterate dall’anello vascolare del tubero di patata e dai fasci vascolari dello stelo delle piante di patata o di pomodoro. Sospenderlo in una piccola quantità di acqua distillata sterile o in tampone fosfato a 50 mM. Lasciare riposare per 5-10 minuti. Della sospensione preparare almeno due diluizioni decimali, 1/10 e 1/100, od altre se opportune. Trasferire un volume standard della sospensione su un substrato nutritivo generale (NA, YPGA, SPA, appendice 1) e/o sul substrato di Kelman al tetrazolio (appendice 1) e/o sul substrato selettivo SMSA (appendice 7) e inseminare le piastre con tecnica appropriata o con un’ansa, arroventandola tra un inseminamento e l’altro. Se viene usato SMSA, preparare a parte una serie di piastre con una coltura diluita in sospensione di cellule di Ralstonia solanacearum di ceppo virulento biovar 2, razza 3, come controllo positivo. Mantenere le piastre in incubazione per 3 giorni a 28 °C. L’incubazione può essere prolungata fino a 6 giorni se la crescita è lenta, ma le colonie su piastre di SMSA spesso divengono atipiche e muoiono. Sul terreno nutritivo generale gli isolati virulenti di Ralstonia solanacearum sviluppano colonie bianco-perlacee, piatte, irregolari e fluide, spesso con caratteristici vortici. Sul substrato di Kelman le colonie tipiche degli isolati virulenti di Ralstonia solanacearum sono fluide, irregolari, piatte, bianco-latte, con vortici color rosso sangue al centro. Le forme avirulente di Ralstonia solanacearum divengono butirrose di color rosso scuro. Sul substrato SMSA gli isolati virulenti di Ralstonia solanacearum sviluppano colonie bianco latte, piatte, irregolari e fluide con centri color rosso sangue. Le forme non virulente di Ralstonia solanacearum sviluppano colonie meno fluide che sono completamente di colore tra il rosa e il rosso. Purificare le colonie con morfologia caratteristica mediante subcoltura su un terreno nutrivivo generale. Evitare di fare subcolture ripetute che possono portare a perdita di virulenza. Saggi di conferma Identificazione di Ralstonia solanacearum Identificare le colture pure di Ralstonia solanacearum con almeno uno dei seguenti procedimenti: S a g g i n u t r i z i o n a l i e d e n z i m a t i c i Nota: includere appropriati ceppi di controllo in ogni saggio che si effettua. 3. 3. 1. 3. 2. 3. 3. 3. 4. 3. 5. 4. 4. 1. 21. 8. 98 IT Gazzetta ufficiale delle Comunità europee L 235/15 Sono universalmente presenti o assenti le seguenti proprietà fenotipiche della Ralstonia solanacearum: Pigmento fluorescente Inclusioni PHB Prova O/F Catalasi Ossidasi di Kovacs Riduzione dei nitrati Utilizzazione del citrato Crescita a 40 °C Crescita in NaCl dell’1 % Crescita in NaCl del 2 % Arginina deidrolasi Liquefazione della gelatina Idrolisi dell’amido Idrolisi dell’esculina Produzione di levano − + O +/F − + + + + − + − − − − − − Substrati e metodi reperibili su Lelliott e Stead (1987). C o l o r a z i o n e I F Preparare una sospensione di concentrazione a 106 cellule per ml dalla coltura in esame e da un ceppo di controllo positivo. Preparare una serie di diluizioni 1:2 dell’antisiero. Applicare il procedimento IF (sezione III, paragrafo 2). Il titolo IF della coltura in esame deve essere equivalente a quella del controllo positivo. S a g g i o E l i s a Preparare una sospensione di concentrazione superiore a 106 cellule per ml dalla coltura in esame e da un ceppo di controllo positivo. Applicare il procedimento Elisa (sezione III, paragrafo 3). Il valore Elisa della coltura in esame deve essere equivalente a quello del controllo positivo. S a g g i o P C R Preparare una sospensione di 106 cellule per ml dalla coltura in esame e da un ceppo di controllo positivo. Applicare la PCR (sezione III, paragrafo 4). Il prodotto PCR della coltura in esame deve avere le stesse dimensioni e profilo enzimatico di restrizione (REA) del controllo positivo. I b r i d a z i o n e f l u o r e s c e n t e i n s i t u ( F I S H ) Preparare una sospensione di 106 cellule per ml dalla coltura in esame e da un ceppo di controllo positivo. Applicare il procedimento FISH (Van Beuningen et al. , 1995) con il primer OLI-1 PCR (Seal et al. , 1993). La coltura in esame deve manifestare la stessa reazione del controllo positivo. P r o f i l o d e l l e p r o t e i n e Le proteine cellulari totali denaturate vengono separate mediante elettroforesi in gel di poliacrilamide — PAGE (Stead, 1992a). P r o f i l o d e g l i a c i d i g r a s s i ( F A P ) Far crescere la coltura in esame e un ceppo di controllo positivo per 48 ore a 28 °C su TSA e applicare il procedimento FAP (Janse, 1991; Stead, 1992a; Stead, 1992b). Il profilo della coltura in esame deve essere identico a quello del controllo positivo. In base alle condizioni specificate, gli acidi grassi caratteristici sono: 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH e 18:1 2OH. 4. 2. Caratterizzazione del ceppo La caratterizzazione del ceppo è opzionale, ma si raccomanda per ogni nuovo caso usando almeno uno dei seguenti schemi: L 235/16 IT Gazzetta ufficiale delle Comunità europee 21. 8. 98 D e t e r m i n a z i o n e d e l l e b i o v a r Ralstonia solanacearum è suddiviso in biovar in base alla capacità di produrre acidità da tre alcoli esosi e tre zuccheri (Hayward, 1964 & 1994). Utilizzo di: — maltosio — lattosio — cellobioso — mannitolo — sorbitolo — dulcitolo 1 − − − − − − 2 + + + − − − Biovar 3 + + + + + + 4 − − − + + + 5 + + + + − − Ulteriori saggi differenziano la biovar 2 in subfenotipi (Hayward, 1994): utilizzo di trealosio utilizzo di inositolo utilizzo di D-ribosio attività pectolitica Biovar 2 Biovar 2-A Biovar 2-T − + − bassa + − − bassa + + + alta D e t e r m i n a z i o n e d e l l a r a z z a La razza (Buddenhagen et al. , 1962) viene determinata con prova di patogenicità su piante di pomodoro o melanzana e su piante di tabacco e con la reazione di ipersensibilità (HR) nelle foglie di tabacco (Lozano e Sequeira, 1970): Reazione in: — piante di pomodoro melanzana — piante di tabacco — foglie di tabacco 1 Razza (*) 2 3 avvizzimento avvizzimento nessuna reazione avvizzimento nessuna reazione nessuna reazione necrosi (48 ore) e avvizzimento (7-8 gg) HR (12-24 ore) clorosi (2-8 giorni) (*) Non sono incluse la razza 4 (patogena su zenzero e su pochi altri ospiti) e la razza 5 (patogena solo su gelso). La caratterizzazione della razza in base ai saggi di patogenicità o di ipersensibilità su tabacco può non essere molto affidabile ed allora può essere dedotta dalla biovar e dall’ospite naturale di origine. La coltura in esame può essere ulteriormente caratterizzata mediante le seguenti tecniche. I m p r o n t e g e n o m i c h e La differenziazione molecolare dei ceppi nel complesso di Ralstonia solanacearum può essere effettuata mediante: — analisi RFLP (Cook et al. , 1989). — PCR su sequenze ripetute [REP-, ERIC- & BOX-PCR (Louws et al. , 1995; Smith et al. , 1995)]. 4. 3. Prova di patogenicità Questa prova è intesa per confermare la diagnosi di Ralstonia solanacearum e per valutare la virulenza delle colture identificate come Ralstonia solanacearum. Preparare un inoculo di 106 cellule per ml dalla coltura in esame e da un ceppo di controllo positivo. Inoculare 5-10 piante di pomodoro o melanzana preferibilmente allo stadio fogliare 3 (sezione III, paragrafo 6). Mantenere in incubazione per un massimo di due settimane a temperatura tra 22 °C e 28 °C ed alta umidità relativa e innaffiare giornalmente. Tenere in osservazione per sintomi di collasso e/o epinastia, clorosi e nanismo. Effettuare isolamenti dalle piante sintomatiche come segue: — asportare una sezione di tessuti di fusto, 2 cm sopra il punto di inoculazione, — ridurla a pezzetti, sospendere il tutto in un piccolo volume di acqua distillata o di tampone fosfato 50 mM, inseminare in piastra, incubare e controllare se si sviluppano colonie di Ralstonia solanacearum. 21. 8. 98 IT Gazzetta ufficiale delle Comunità europee L 235/17 SEZIONE III RILEVAMENTO E IDENTIFICAZIONE DI RALSTONIA SOLANACEARUM IN CAMPIONI DI TUBERI DI PATATA Nota: Il campione standard è di 200 tuberi. Tuttavia il procedimento può essere convenientemente applicato anche a campioni aventi meno di 200 tuberi. 1. Preparazione del campione per i saggi 1. 1. 1. 2. 1. 3. N. B. : Il sedimento di centrifuga di estratto di patata ottenuto in questo procedimento può essere usato anche per il rilevamento di Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Procedere alle seguenti opzioni prima del saggio, se ritenuto utile. i) Mantenere in incubazione il campione a 25-30 °C per un massimo di 2 settimane per favorire la moltiplicazione di basse popolazioni di Ralstonia solanacearum; ii) lavare i tuberi in acqua corrente con disinfettanti e detergenti appropriati. Far asciugare i tuberi all’aria. Rimuovere la buccia con un bisturi o con un coltello per ortaggi intorno all’ombelico del tubero in modo da rendere visibili i tessuti vascolari. Asportare accuratamente un piccolo cono (3-5 mm di diametro) di tessuto vascolare dall’ombelico di ciascun tubero. Ridurre al minimo la quantità di tessuto non vascolare. Togliere il cono ombelicale da ciascun tubero del campione. N. B. : L’esame viviso dei tuberi (sezione II, paragrafo 1) può essere effettuato durante questa fase. Mettere da parte i tuberi con sintomi gravemente marcescenti e saggiarli individualmente (sezione II). Raccogliere i coni ombelicali in un contenitore chiuso. I coni ombelicali dovrebbero preferibilmente essere trattati immediatamente. Se ciò non fosse possibile, conservarli per non più di 24 ore o, a 4 °C, non oltre 72 ore. Trattare i coni ombelicali in uno dei seguenti modi: i) Trasferire i coni ombelicali in un contenitore idoneo. Aggiungere un volume sufficiente di tampone di macerazione (appendice 2) per coprire i coni. Sminuzzare i coni in un Waring Blender o con Ultra Thurrax fino a completa omogeneizzazione. Evitare un’omogeneizzazione eccessiva. Lasciar riposare il macerato per 15-30 minuti. ii) Trasferire i coni ombelicali in un contenitore idoneo. Aggiungere un volume sufficiente di tampone di macerazione per coprire i coni. Porre il contenitore in un agitatore rotativo. Mantenere in incubazione a 50-100 giri/m per 4 ore a 20-22 °C o per 16-24 ore a 4 °C. iii) Trasferire i coni ombelicali in un robusto sacchetto monouso (per esempio sacchetti da Stomacher di dimensioni 105 mm × 150 mm, sterile per irradiazione). Schiacciare accuratamente i coni ombelicali con uno strumento appropriato, per esempio un martello, fino al raggiungimento della completa omogeneizzazione. Aggiungere un volume sufficiente di tampone di macerazione sino a coprire i coni schiacciati. Lasciar riposare il macerato per 15-30 minuti. 1. 4. Estrarre i batteri dal macerato dei coni ombelicali in uno dei seguenti modi. i) Far decantare lentamente il macerato in una provetta da centrifuga lasciando i frammenti nel contenitore o nel sacchetto. Se il macerato decantato è molto torbido, centrifugare a non oltre 180 × g per 10 minuti a una temperatura inferiore a 10 °C. Centrifugare il macerato decantato o il sopranatante della prima fase di centrifugazione a 7 000 × g per 15 minuti o a 10 000 × g per 10 minuti a una temperatura inferiore ai 10 °C. Scartare il sopranatante senza far muovere il sedimento. ii) Filtrare il macerato con un sistema di filtraggio avente pori di dimensioni di 40-100 em. Accelare il filtraggio utilizzando una pompa a vuoto. Raccogliere il filtrato in una provetta da centrifuga. Lavare il filtro con il tampone di macerazione. Centrifugare il filtrato a 7 000 × g per 15 minuti o a 10 000 × g per 10 minuti a una temperatura inferiore ai 10 °C. Scartare il sopranatante senza far muovere il sedimento. L 235/18 IT Gazzetta ufficiale delle Comunità europee 21. 8. 98 1. 5. Risospendere il sedimento in 1 ml di tampone per il sedimento da centrifuga (appendice 2). Dividere in due parti uguali e trasferire ciascuna parte in una microprovetta. Utilizzare una microprovetta per la prova. Conservare la parte di estratto non usata a 4 °C durante il saggio. Aggiungere 10-25 % (v/v) di glicerolo sterile all’altra microprovetta. Mescolare nel vortex. Conservare a − 18 °C (per settimane) o a − 70 °C (per mesi). 2. Colorazione di immunofluorescenza (IF) Usare un antisiero per Ralstonia solanacearum, preferibilmente di biovar 2 razza 3. Determinare il titolo di una sospensione di 106 cellule per ml da un ceppo omologo di Ralstonia solanacearum con un’appropriata diluizione del coniugato di isotiocianato di fluoresceina (FITC), secondo le istruzioni del produttore. L’antisiero grezzo dovrebbe avere un titolo IF almeno 1:2 000. Utilizzare vetrini multipli per microscopio preferibilmente con 10 pozzetti di almeno 6 mm di diametro. Includere un controllo del coniugato FITC e un controllo del tampone fosfato isotonico (PBS) su ciascun vetrino del saggio. Il saggio dovrebbe essere ripetuto con il controllo PBS incluso se viene notata qualche cellula positiva nel controllo FITC. Preparare vetrini separati di controllo positivo con una sospensione di 106 cellule per ml da un ceppo di appropriata razza biovar di Ralstonia solanacearum. Usare un vetrino in ciascuna serie di prove. 2. 1. Preparare i vetrini di saggio con uno dei seguenti procedimenti. i) Per sedimento con relativamente poco amido: Trasferire con una pipetta un volume standard misurato (15 el è adeguato per un pozzetto di 6 mm di diametro — aumentare il volume per pozzetti più grandi) del sedimento risospeso su una fila di pozzetti. L’altra fila può essere usata come duplicato o per un secondo campione, come illustrato nella figura 1. ii) Per altri sedimenti: Preparare diluizioni decimali (1:10, 1:100 e 1:1 000) del sedimento risospeso nel tampone per sedimento. Trasferire con una pipetta un volume standard misurato (15 el è adeguato per un pozzetto di 6 mm di diametro — aumentare il volume per pozzetti più grandi) di sedimento risospeso su una fila di pozzetti. L’altra fila può essere utilizzata come duplicato o per un secondo campione, come illustrato nella figura 2. 2. 2. Lasciare seccare le goccioline. Fissare le cellule batteriche al vetrino scaldando o passando alla fiamma o con etanolo al 95 %. 2. 3. Procedimento IF i) Secondo la preparazione del vetrino di saggio di cui al paragrafo 2. 1 i): Preparare una serie di diluizioni 1:2 del titolo (T) dell’antisiero nel tampone IF (appendice 3): 1/4 (T/4), 1/2 (T/2), pari al titolo e il doppio del titolo (2T). ii) Secondo la preparazione del vetrino di saggio di cui al paragrafo 2. 1 ii): Preparare la diluizione di lavoro (WD) dell’antisiero nel tampone IF. La diluizione WD è la diluizione dell’antisiero con specificità ottimale ed è abitualmente pari alla metà del titolo. Figura 1 Preparazione del vetrino di saggio secondo i paragrafi 2. 1 i) e 2. 3 i) Una diluizione standard del sedimento di centrifuga risospeso FITC T/4 Campione 1 Duplicato del campione 1 o campione 2 Q 1 Q 6 Q 2 Q 7 T = Titolo T/2 Q 3 Q 8 T 2T Diluizioni 1/2 dell’antisiero Q 4 Q 9 Q 5 Q 10 (cid:222) 21. 8. 98 IT Gazzetta ufficiale delle Comunità europee L 235/19 Figura 2 Preparazione del vetrino di saggio secondo i paragrafi 2. 1. ii) e 2. 3. ii) FITC Diluizione standard dell’antisiero Puro Q 1 Q 6 Puro Q 2 Q 7 Campione 1 Duplicato del campione 1 o campione 2 1/10 1/100 1/1 000 Diluizione decimale del sedimento risospeso Q 3 Q 8 Q 4 Q 9 Q 5 Q 10 2. 3. 1. Disporre i vetrini su carta bibula umida. Coprire i pozzetti di saggio con la (le) diluizione (i) di antisiero. Mettere PBS sui pozetti FITC. Il volume di antisiero messo sui pozzetti deve essere equivalente al volume di estratto. 2. 3. 2. Mantenere in incubazione sotto copertura per 30 minuti a temperatura ambiente. 2. 3. 3. ds Scuotere via le goccioline di antisiero dal vetrino e sciacquare accuratamente con tampone IF. Lavare per 5 minuti con tampone IF Tween e poi per 5 minuti nel tampone IF (appendice 3). Eliminare accuratamente l’umidità in eccesso con carta bibula e lasciar asciugare i pozzetti. 2. 3. 4. Disporre i vetrini su carta bibula umida. Coprire i pozzetti di saggio e il pozzetto FITC con la diluizione di coniugato di FITC utilizzato per determinare la concentrazione. Il volume di coniugato messo sui pozzetti deve essere identico al volume dell’antisiero. 2. 3. 5. 2. 3. 6. 2. 3. 7. Mantenere in incubazione sotto copertura per 30 minuti a temperatura ambiente. Scuotere via le goccioline di coniugato dal vitrino. Sciacquare e lavare come in precedenza (paragrafo 2. 3. 3). Rimuovere accuratamente l’umidità in eccesso. Trasferire con una pipetta 5-10 el di tampone fosfato 0,1 M aggiunto di glicerina o simile liquido di montaggio su ciascun pozzetto e applicare un vetrino coprioggetti (appendice 3). 2. 4. Lettura della colorazione IF Esaminare i vetrini con un microscopio a epifluorescenza dotato di filtri idonei all’eccitazione del FITC, in olio di immersione, a 500-1000 ingrandimenti. Esaminare attentamente i pozzetti lungo due diametri ad angolo retto e lungo il perimetro. Esaminare anzitutto il vetrino del controllo positivo. Le cellule devono avere fluorescenza brillante ed essere colorate interamente. Nota: il saggio deve essere ripetuto se la colorazione è abberrante. Passare ora ad osservare i vetrini di saggio. Verificare prima l’assenza di cellule fluorescenti nei pozzetti di controllo PBS e FITC. Cellule fluorescenti nel controllo FITC indicano un legame non specifico del coniugato a autofluorescenza o contaminazione. Nota: in questo caso ripetere il saggio. Verificare la presenza di cellule fluorescenti brillanti con morfologia caratteristica di Ralstonia solanacearum nei pozzetti di saggio. L’intensità della fluorescenza deve essere equivalente al ceppo di controllo positivo con la stessa diluizione di antisiero. Le cellule con colorazione a pelle di leopardo o incompleta o con debole fluorescenza devono essere ignorate, a meno che non siano numerose. (Vedi interpretazione del risultato della colorazione IF). Interpretazione del risultato della colorazione IF i) Per ciascun campione in cui non vengono trovate cellule fluorescenti brillanti con morfologia caratteristica il saggio IF è negativo. ii) Per ciascun campione in cui vengono trovate cellule fluorescenti brillanti con morfologia caratteristica, determinare il numero medio di cellule per campo ottico e calcolare il numero di cellule (N) per ml di sedimento centrifuga risospeso (appendice 4). Una popolazione approssimativamente di 103 cellule per millilitro di «pellet» in sospensione deve essere considerata quale limite per la diagnosi secondo il metodo dell’immunoflorescenza: — per i campioni con N. 103, il saggio IF è positivo, — per i campioni con N , 103, il saggio IF può essere considerato positivo. (cid:222) L 235/20 IT Gazzetta ufficiale delle Comunità europee 21. 8. 98 iii) Se si trova un elevato numero di cellule (. 105 cellule/ml) aventi fluorescenza incompleta o debole ad una diluizione di antisiero pari al titolo, si deve fare un secondo saggio basato: — su un differente principio biologico — o ripetere la colorazione IF con un altro antisiero o una diluizione decimale del sedimento. 3. Saggio immunoenzimatico (Elisa) (Secondo Robinson Smith et al. , 1995) Usare un antisiero per Ralstonia solanacearum, preferibilmente di razza 3 biovar 2. Determinare il titolo su una sospensione di 106 cellule per ml dal ceppo omologo di Ralstonia solanacearum. È consigliato l’uso di piastre da microtitolazione NUNC Polysorp. Includere un controllo negativo di estratto di patata e un controllo con tampone fosfato isotonico (PBS). Usare una sospensione di concentrazione superiore a 106 cellule per ml di una razza biovar appropriata di Ralstonia solanacearum come controllo positivo. Eseguire la prova come per il (i) campione(i), ma tenendo una netta separazione dei campioni sulla piastra da microtitolazione. Trasferire con una pipetta 100-200 el del sedimento risospeso in una microprovetta. Scaldare per 4 minuti a 100 °C. Trasferire la microfiala su ghiaccio. Aggiungere un volume equivalente di tampone di rivestimento carbonato a doppia forza (appendice 5). Mescolare in agitatore. Applicare a ciascuno di almeno due pozzetti della piastra da microtitolazione, aliquote di 100 el. Mantenere in incubazione per 1 ora a 37 °C o per una notte a 4 °C. Dare dei colpetti per espellere gli estratti dai pozzetti. Lavare i pozzetti tre volte con PBS-Tween (appendice 5), lasciando l’ultima soluzione di lavaggio nei pozzetti per almeno 5 minuti. Preparare la diluizione appropriata di antisiero di Ralstonia solanacearum in un tampone di bloccaggio (appendice 5). Applicare ai pozzetti 100 el di diluizione di antisiero. Mantenere in incubazione per 1 ora a 37 °C. Dare dei colpetti per espellere l’antisiero dai pozzetti. Lavare i pozzetti come in precedenza (paragrafo 3. 4). Preparare la diluizione appropriata di coniugato di fosfatasi alcalina nel tampone di bloccaggio. Applicare 100 el di diluizione di coniugato ai pozzetti. Mantenere in incubazione per 1 ora a 37 °C. Dare dei colpetti per espellere il coniugato dai pozzetti. Lavare i pozzetti come in precedenza (paragrafi 3. 4 e 3. 6). Preparare la soluzione di substrato per la fosfatasi alcalina (appendice 5). Applicare 100 el ai pozzetti. Mantenere in incubazione da 30 minuti a un’ora al buio a temperatura di laboratorio. 3. 1. 3. 2. 3. 3. 3. 4. 3. 5. 3. 6. 3. 7. 3. 8. 3. 9. 3. 10. Leggere l’assorbimento a 409 nm. Interpretazione del saggio Elisa Il saggio Elisa è negativo se la densità ottica (D. O. ) del campione è minore di 2 × D. O. del controllo negativo. Il saggio Elisa è positivo se la densità ottica del campione è maggiore di 2 × D. O. del controllo negativo. 4. Reazione a catena del DNA polimerasi (PCR) (Secondo Seal et al. , 1993) N. B. : Durante tutte le fasi di preparazione della PCR e le relative manipolazioni devono essere utilizzate pipette munite di filtro. Preparare una sospensione di 106 cellule per ml da un ceppo di razza 3, biovar 2 di Ralstonia solanacearum come controllo positivo. Eseguire il saggio nello stesso modo del (dei) campione (i). 4. 1. Trasferire con una pipetta 100 el del sedimento risospeso in una micro provetta. In alternativa, traferire 90 el del sedimento risospeso in una microprovetta contenente 10 el di NaOH 0,5 M. Mescolare invertendo ripetutamente la microprovetta. 21. 8. 98 IT Gazzetta ufficiale delle Comunità europee L 235/21 4. 2. 4. 3. 4. 4. Scaldare per 4 minuti a 100 °C. Trasferire la microprovetta immediatamente in ghiaccio. Preparare almeno due diluizioni decimali, per esempio 1:10 e 1:100, o di più — se si ritengono opportune — in acqua distillata sterile o ultrapura (UPW). Preparare la miscela di reazione PCR (appendice 6) in una provettina sterile aggiungendo i seguenti componenti nell’ordine indicato. Per un volume di reazione di 50 el Componente Quantità Concentrazione Acqua distillata sterile o UPW 10 × tampone PCR d-ATP d-CTP d-GTP d-TTP Primer OLI-1 (20 eM) Primer Y-2 (20 eM) Taq Polimerasi (5U/el) 30,8 el-33,8 el 5,0 el 1,0 el 1,0 el 1,0 el 1,0 el 2,5 el 2,5 el 0,2 el finale 1 × 0,2 mM 0,2 mM 0,2 mM 0,2 mM 1 eM 1 eM 1,0 U Volume totale 45 el-48 el Per più reazioni Calcolare la quantità di ciascum componente per il numero voluto di reazioni. Miscelare i componenti e trasferire 45-48 el della miscela in provettine da PCR sterili. Tenere le provettine con la miscela di reazione PCR in ghiaccio. Per volumi di reazione di 25 el: ridurre conseguentemente i componenti. Amplificazione della PCR Facoltativo! Centrifugare a impulsi le provettine con il campione bollito e il controllo positivo. Aggiungere nelle provettine la miscela di reazione PCR e nell’ordine specificato, 2-5 el del (i) campione (i), del controllo acqua e del controllo positivo. Porre le provettine nel blocco di riscaldamento della macchina per cicli termici DNA. 4. 5. 4. 5. 1. 4. 5. 2. Eseguire il seguente programma: 1 ciclo di: i) 2 minuti a 96 °C: denaturazione dello stampo 50 cicli di: ii) 20 secondi a 94 °C: denaturazione iii) 20 secondi a 68 °C: appaiamento dei primer iv) 30 secondi a 72 °C: allungamento della copia 1 ciclo di: v) 10 minuti a 72 °C: ulteriore allungamento 1 ciclo di: vi) mantenere a 4 °C N. B. : Questi sono i parametri di un apparecchio Perkin Elmer 9600. Altre macchine per cicli termici possono richiedere una copertura di olio nelle provettine di reazione PCR e/o modifiche della durata delle fasi ii), iii) e iv) nel profilo di amplificazione. 4. 5. 3. Togliere le provettine dalla macchina per cicli termici. Analizzare il prodotto della PCR. Se non lo si fa immediatamente, mantenere le fiale a 4 °C per un uso nello stesso giorno o a −18 °C se devono essere conservate più a lungo. 4. 6. Analisi del prodotto della PCR I frammenti prodotti dalla PCR vengono evidenziati mediante elettroforesi in gel di agarosio e colorazione con etidio bromuro. 4. 6. 1. Preparare un gel appropriato di agarosio portando lentamente a ebollizione l’agarose in tampone di elettroforesi triacetato (TAE). L 235/22 IT Gazzetta ufficiale delle Comunità europee 21. 8. 98 4. 6. 2. 4. 6. 3. 4. 6. 4. 4. 6. 5. 4. 6. 6. 4. 6. 7. 4. 6. 8. 4. 6. 9. Raffreddare l’agarosio fuso a 50-60 °C, versarlo nello stampo dell’unità di elettroforesi e inserire il pettine. Lasciare solidificare. Togliere il pettine. Immergere il gel in TAE in modo che sia appena coperto (2-3 mm) con il tampone. Mettere goccioline da 3 el di tampone di caricamento su parafilm. Aggiungere 12 el del prodotto della PCR di ciascun campione, del prodotto positivo e del controllo acqua e mescolare aspirando piano con la punta della pipetta prima di caricare. I volumi stabiliti possono essere modificati per adeguarsi alla capacità dei pozzetti nel gel di agarosio. Caricare accuratamente i pozzetti del gel. Includere come riferimento un marcatore DNA appropriato in almeno un pozzetto. Collegare i fili all’alimentatore di corrente e alla cella per l’elettroforesi. Attivare il gel a 5-8 V/cm fino a quando il fronte dell’indicatore della corrente superficiale si trovi a meno di 1 cm dalla fine del gel. Spegnere l’alimentatore. Scollegare i fili dalla cella per l’elettroforesi. Rimuovere accuratamente il gel. Immergerlo in una soluzione di etidio bromuro per 30-45 minuti. N. B. : Usare guanti usa e getta ogni volta che si manipola l’etidio bromuro poiché si tratta di un potente mutageno. Decolorare in acqua distillata per 10-15 minuti. Visualizzare il (i) frammento (i) amplificato (i) di DNA con transilluminazione UV. Il prodotto PCR di Ralstonia solanacearum con primer OLI-1 e Y-2 ha una lunghezza di 288 bp. Confrontare con il marcatore DNA e con il controllo positivo. N. B. : Il controllo acqua deve essere comunque negativo. Se positivo, ripetere la prova. 4. 6. 10. Fotografare il gel se è richiesta una documentazione permanente. 4. 6. 11. Confermare l’autenticità del frammento amplificato con l’analisi di restrizione enzimatica (REA). 4. 7. 4. 7. 1. 4. 7. 2. Analisi di restrizione enzimatica (REA). Trasferire 8,5 el di prodotto della PCR (paragrafo 4. 5. 3) in una nuova microprovetta. Aggiungere 1 el di 10 × tampone enzimatico e 0,5 el di enzima di restrizione Avall. Miscelare aspirando piano nella cima della pipetta. Se rimangono gocce sulle pareti della fiala, far ruotare a impulsi in una microcentrifuga. Mantenere in incubazione per 1 ora a 37 °C. 4. 7. 3. Analizzare il frammento della PCR digerito con elettroforesi in gel di agarosio come in precedenza (paragrafo 4. 6). Interpretazione del risultato della prova PCR La prova PCR è negativa se non si evidenzia la presenza del caratteristico frammento di 288 bp, mentre il frammento è rilevato per il ceppo di controllo positivo di Ralstonia solanacearum. La prova PCR è positiva se si evidenzia il frammento di 288 bp e l’analisi REA di questo frammento dà risultati identici a quello prodotto dal ceppo di controllo positivo di Ralstonia solanacearum. 5. Isolamento selettivo in piastra (Secondo Elphinstone et al. , 1996) 5. 1. Eseguire la prova con una tecnica appropriata di diluizione in piastra, per esempio come segue: i) Preparare almeno due diluizioni decimali, per esempio 1:10 e 1:100, del sedimento risospeso nel tampone da sedimento. Trasferire con una pipetta un volume standard misurato (50-100 el) del sedimento risospeso e ciascuna diluizione su substrato selettivo SMSA modificato (appendice 7) e distribuirlo con un bastoncino di vetro sull’intera superficie del substrato. Se ritenuto utile, inseminare il sedimento risospeso con ansa da 10 el in aree successive. Arroventare alla fiamma l’ansa tra una inseminazione e l’altra. ii) Trasferire un volume standard misurato (50-100 el) del sedimento risospeso sul substrato selettivo SMSA modificato e inseminarlo con un bastoncino di vetro sull’intera superficie del mezzo. Far scorrere il bastoncino senza esporlo alla fiamma su almeno altre 2 piastre di SMSA modificato. Inseminare, con la stessa tecnica di diluizione in piastra, una sospensione di 106 cellule per ml di un ceppo razza 3, biovar 2 di Ralstonia solanacearum come controllo positivo su una serie di altre piastre di SMSA modificato. Tenere in incubazione le piastre a 28 °C. Cominciare a leggere le piastre dopo 3 giorni. Se il risultato è negativo, mantenere ancora in incubazione fino a un massimo di 6 giorni. Gli isolati virulenti di Ralstonia solanacearum sviluppano colonie di color bianco-latte, piatte, irregolari e fluide con centri distinti di colore rosso sangue che mostrano delle striature interne e dei vortici. 5. 2. 5. 3. 5. 4. Purificare le colonie a morfologia caratteristica con subcoltura su un mezzo nutritivo generale (appendice 1). 21. 8. 98 IT Gazzetta ufficiale delle Comunità europee L 235/23 5. 5. Identificare le colture pure (sezione II, paragrafo 4. 1) e confermare che le colture siano di Ralstonia solanacearum con una prova di patogenicità (sezione II, paragrafo 4. 3). Interpretazione del risultato dell’isolamento selettivo in piastra L’isolamento selettivo in piastra è negativo se non si trovano colonie dopo sei giorni o se non si trovano colonie caratteristiche di Ralstonia solanacearum, purché non si sospetti inibizione da parte di colonie di altri batteri e che nel controllo positivo trovino le caratteristiche colonie di Ralstonia solanacearum. L’isolamento in piastra è positivo se si trovano colonie caratteristiche di Ralstonia solanacearum. 6. Saggio biologico (Secondo Janse, 1988) 6. 1. 6. 2. 6. 3. 6. 4. 6. 5. 6. 6. Usare 10 piante, di saggio (piantine suscettibili di pomodoro o di melanzana) ciascuna allo stadio di tre foglie vere. Non innaffiare le piante nelle 24 ore precedenti l’inoculazione. Distribuire 100 el di sedimento risospeso tra le piante. Inoculare il fusto tra i cotiledoni e in uno o due altri punti. Inoculare, con la stessa tecnica, 10 piantine con una sospensione di 106 cellule per ml di un ceppo di Ralstonia solanacearum di razza 3, biovar 2 come controllo negativo. Separare le piante del controllo positivo dalle altre per evitare contaminazione. Far crescere le piantine a una temperatura di 22 °C e 28 °C per quattro settimane ad alta umidità relativa con innaffiature giornaliere. Vedere se si sviluppano sintomi di collasso, epinastia, clorosi e/o rallentamento della crescita. Fare isolamenti dalle piante infettate (sezione II). Identificare le colture pure con morfologia caratteristica (sezione II, paragrafo 4. 1) e confermare le colture positive con una prova di patogenicità (sezione II, paragrafo 4. 3). Se si ritiene utile, verificare l’assenza di infezione nei lotti di piante asintomatiche usate per la prova. Rimuovere da ciascuna pianta una sezione di 1 cm di fusto a 2 cm al di sopra del punto di inoculazione. Omogeneizzare i tessuti in un tampone di macerazione. Effettuare l’isolamento per diluizione in piastra paragrafo 5. 1). Se positiva, identificare le colture con morfologia caratteristica (sezione II, paragrafo 4. 1) e confermare le colture di Ralstonia solanacearum con una prova di patogenicità (sezione II, paragrafo 4. 3). Interpretazione del risultato del saggio biologico Il saggio biologico è negativo se le piante inoculate non risultano infettate da Ralstonia solanacearum. Il saggio biologico è positivo se le piante inoculate risultano infettate da Ralstonia solanacearum. 7. Prove di arricchimento (J. G. Elphinstone et al. , 1996) 7. 1. 7. 2. 7. 3. Trasferire 100 el del sedimento di centrifuga risospeso in 3 ml del brodo SMSA modificato (appendice 7). Mantenere in incubazione per 48 ore e, comunque, non oltre 72 ore a 28 °C con il tappo della provetta non chiuso perfettamente per consentire l’aerazione. Chiudere bene il tappo e mescolare nel vortex. Prendere frazioni del liquido per la colorazione IF (la presente sezione, paragrafo 2), il saggio Elisa (la presente sezione, paragrafo 3), e/o per la PCR (la presente sezione, paragrafo 4). 8. Prova di patogenicità Si faccia riferimento a sezione II, paragrafo 4. 3. L 235/24 IT Gazzetta ufficiale delle Comunità europee 21. 8. 98 Appendice 1 Substrati nutritivi per l’isolamento e la coltura di Ralstonia solanacearum A g a r n u t r i t i v o ( N A ) Agar nutritivo (Difco) Acqua distillata 23 g 1 litro Preparare volumi da mezzo litro del terreno in matracci da 1 litro. Disciogliere gli ingredienti. Sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti. Portare a 50 °C. Versare nelle piastre. L i e v i t o p e p t o n e g l u c o s i o a g a r ( Y P G A ) Estratto di lievito (Difco) Bacto peptone (Difco) D(+) glucosio (monoidrato) Bacto Ágar (Difco) Acqua distillata 5 g 5 g 10 g 15 g 1 litro Preparare volumi da mezzo litro del terreno in matracci da 1 litro. Disciogliere gli ingredienti. Sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti. Portare a 50 °C. Versare nelle piastre. S a c c a r o s i o - p e p t o n e - a g a r ( S P A ) Saccarosio Peptone K2HPO4 MgSO47H2O Bacto Agar (Difco) Acqua distillata 20 g 5 g 0,5 g 0,25 g 15 g 1 litro Preparare volumi da mezzo litro del terreno in matracci da 1 litro. Disciogliere gli ingredienti. Se necessario, regolare a pH 7,2-7,4. Sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti. Portare a 50 °C. Versare nelle piastre. S u b s t r a t o K e l m a n a l t e t r a z o l i o Casaminoacidi (Difco) Bactopeptone (Difco) Destrosio Bacto Agar (Difco) Acqua distillata 1 g 10 g 5 g 15 g 1 litro Preparare volumi da mezzo litro del terreno in matracci da 1 litro. Disciogliere gli ingredienti. Sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti. Portare a 50 °C. Aggiungere una soluzione acquosa di cloruro di trifeniltetrazolo (Sigma), sterilizzata per filtrazione, fino a concentrazione finale di 50 mg/litro. Versare nelle piastre. 21. 8. 98 IT Gazzetta ufficiale delle Comunità europee L 235/25 Appendice 2 Materiali per la preparazione del campione T a m p o n e d i m a c e r a z i o n e : t a m p o n e f o s f a t o 5 0 m M , p H 7 , 0 Questo tampone è impiegato per la macerazione dei tessuti. Na2HPO4 KH2PO4 Acqua distillata 4,26 g 2,72 g 1 litro Disciogliere gli ingredienti e controllare il pH. Distribuire secondo opportunità. Sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti. Quando si effettua la PCR diretta, è raccomandabile aggiungere il 5 % di Polivinilpirrolinone p. m. 40 000 (PVP-40), per limitare l’effetto inibitore sull’amplificazione dovuto alla presenza delle molecole aromatiche nell’estratto. Quando si adoperano il miscelatore Waring o il procedimento di omogenizzazione Ultra Turrax per la macerazione dei coni ombelicali delle patate, si raccomanda di aggiungere un deflocculante, un antischiuma od un antiossidante. Lubrol in scaglie 0,5 g par litro Antischiuma DC al silicone 1,0 ml par litro Pirofosfato tetrasodico 1,0 g par litro Sterilizzare separatamente in autoclave. Aggiungere fino alla concentrazione desiderata. T a m p o n e p e r i l s e d i m e n t o : t a m p o n e f o s f a t o 1 0 m M , p H 7 , 2 Questo tampone va impiegato per riportare in sospensione e diluire il sedimento di centrifuga ottenuto dai coni ombelicali. Na2HPO412H2O NaH2PO42H2O Acqua distillata 2,7 g 0,4 g 1 litro Disciogliere gli ingredienti e verificare il pH. Distribuire secondo opportunità. Sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti. L 235/26 IT Gazzetta ufficiale delle Comunità europee 21. 8. 98 Appendice 3 Materiali per il saggio IF T a m p o n e I F : s o l u z i o n e f i s i o l o g i c a t a m p o n a t a a l f o s f a t o ( P B S ) , 1 0 m M , p H 7 , 2 Questo tampone viene impiegato per la diluizione degli antisieri. Na2HPO412H2O NaH2PO42H2O NaCl Acqua distillata 2,7 g 0,4 g 8,0 g 1 litro Disciogliere gli ingredienti e verificare il pH. Distribuire secondo opportunità. Sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti. T a m p o n e I F — T w e e n Questo tampone viene impiegato per lavare i vetrini. Aggiungere lo 0,1 % di Tween 20 al tampone IF. G l i c e r o l o t a m p o n a t o a l f o s f a t o 0 , 1 M , p H 7 , 6 Questo tampone viene impiegato come fluido di montaggio sui pozzetti dei vetrini IF, per incrementare la fluorescenza Na2HPO412H2O NaH2PO42H2O Glicerolo Acqua distillata 3,2 g 0,15 g 50 ml 100 ml 21. 8. 98 IT Gazzetta ufficiale delle Comunità europee L 235/27 Appendice 4 Determinazione del livello di contaminazione nella prova IF Superficie del pozzetto (S) del vetrino multiplo per immunofluorescenza = (cid:240) D2 4 dove: D = diametro del pozzetto. Superficie del campo (s) dell’obiettivo = (cid:240) d2 4 dove: d = diametro del campo. Calcolare d misurando direttamente o mediante le seguenti formule: s = (cid:240) i2 G2 K2 × 4 dove i = coefficiente di campo (dipende dal tipo di oculare e varia da 8 a 24), K = coefficiente del microscopio (1 o 1,25), G = ingrandimento dell’obiettivo (100×, 40×, ecc. ). Dalla (2) si ricava: d = ˛W4 s (cid:240) (1) (2) (3) (4) Dalla (3): d = ˛WW4 × (cid:240) i2 G2 K2 × 4 (cid:240) = i GK Conteggiare il numero di cellule IF tipiche per campo (c). Calcolare il numero di cellule IF tipiche per pozzetto (C). C = c S s Calcolare il numero di cellule IF tipiche per ml di precipitato (N) N = C × 1 000 y × F dove y = volume del precipitato sul pozzetto, F = fattore di diluizione del precipitato. L 235/28 IT Gazzetta ufficiale delle Comunità europee 21. 8. 98 Appendice 5 Materiali per il saggio Elisa T a m p o n e d i r i c o p e r t u r a a l c a r b o n a t o ( p H 9 , 6 ) , a d o p p i a f o r z a Na2CO3 NaHCO3 Acqua distillata 6,36 g 11,72 g 1 litro Disciogliere gli ingredienti e controllare il pH. Suddividere in aliquote secondo convenienza. Sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti. Se l’estratto contiene una percentuale elevata di molecole aromatiche, si può aggiungere solfito sodico come antiossidante, fino a concentrazione dello 0,2 %. S o l u z i o n e f i s i o l o g i c a t a m p o n a t a a l f o s f a t o ( P h o s p h a t e B u f f e r e d S a l i n e , P B S ) 1 0 × , p H 7 , 4 NaCl KH2PO4 Na2HPO4. 12H2O KCl Acqua distillata 80 g 2 g 29 g 2 g 1 litro Disciogliere gli ingredienti e verificare il pH. Suddividere in aliquote secondo convenienza. Sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti. S o l u z i o n e f i s i o l o g i c a t a m p o n a t a f o s f a t o T w e e n ( P B S - T ) PBS 10 × Soluzione al 10 % di Tween 20 Acqua distillata 100 ml 5 ml 895 ml T a m p o n e b l o c c a n t e ( a n t i c o r p i ) (da preparare al momento dell’uso) PBS 10 × 10 ml Polivinilpirrolinone (44000 MWT) (PVP-44) 2 g Soluzione al 10 % di Tween 20 Polvere di latte Acqua distillata 0,5 g 0,5 g q. b. a 100 ml S o l u z i o n e s u b s t r a t o f o s f a t a s i a l c a l i n a p H 9 , 8 Dietanolammina Acqua distillata 97 ml 800 ml Mescolare e regolare a pH 9,8 con HCl concentrato. Portare a 1 litro acqua distillata. Aggiungere 0,2 g di MgCl2. Disciogliere due compresse di substrato 5 mg pasticche alla fosfatasi (Sigma) per ogni 15 ml di soluzione. 21. 8. 98 IT Gazzetta ufficiale delle Comunità europee L 235/29 Appendice 6 Materiali per la prova PCR S e q u e n z e d e i p r i m e r : primer OLI-1 59-GGGGGTAGCTTGCTACCTGCC-39 primer Y-2 59-CCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGT-39 Seal et al. (1993). Appendice 7 Materiali per l’isolamento selettivo su piastra S u b s t r a t o s e l e t t i v o S M S A (Engelbrecht, 1994, modificato da Elphinstone et al. , 1996) Terreno di base Casaminoacidi (Difco) Bactopeptone (Difco) Glicerolo Agar (Difco) Acqua distillata 1 g 10 g 5 ml 15 g 1 litro Preparare volumi da mezzo litro in matracci da 1 litro. Disciogliere gli ingredienti e verificare il pH. Se necessario, prima di sterilizzare in autoclave regolare il pH a 6,5. Su un terreno a pH. 7,0 Ralstonia solanacearum non si svilupperebbe adeguatamente. Sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti. Portare a 50 °C. Aggiungere i seguenti ingredienti (tutti di produzione Sigma), in modo da ottenere le concentrazioni finali specificate: Cristalvioletto 5 mg par litro Polimixina B solfato 100 mg par litro (circa 600 000 unità) Bacitracina (*) Cloramfenicolo Penicillina G 25 mg par litro (circa 1 250 unità) 5 mg par litro 0,5 mg par litro (circa 825 unità) Sigma P-1004 Sigma B-0125 Sigma C-3175 Sigma P-3032 Sali di tetrazolio 50 mg par litro Disciogliere gli ingredienti in etanolo al 70 % fino alle concentrazioni indicate per il volume di terreno preparato. Per disciogliere alcuni ingredienti (polimixina B e cloramfenicolo) è necessario riscaldare leggermente ed agitare. B r o d o S M S A (Elphinstone et al. , 1996), ma eliminando l’agar o i sali di tetrazolio. Preparare come per il terreno selettivo SMSA, eliminando l’agar o i sali di tetrazolio. Distribuire in porzioni da 3 ml, in provette a perdere «Universal» da 30 ml. (*) Se necessario, aumentando la concentrazione della bacitracina fino a 300 ppm si può ridurre la contaminazione da batteri saprofiti senza ridurre il recupero di Ralstonia solanacearum. L 235/30 IT Gazzetta ufficiale delle Comunità europee 21. 8. 98 Bibliografia Buddenhagen, I. W. ; Sequeira, L. and Kelman, A. , 1962, Description of races in Pseudomonas solanacearum. Phytopathology 52, 726. Cook, D. ; Elizabeth B. and Sequeira L. , 1989. Genetic diversity of Pseudomonas solanacearum: detection of restriction fragment length polymorphism with DNA probes that specify virulence and hypersensitive respons. Molecular Plant-Microbe Interactions 2, 113-121. Dinesen I. G. and DeBoer, S. H. , 1995. Extraction of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus from composite samples of potato tubers. American Potato Journal 72, 133-142. Elphinstone, J. G. ; Hennessy, J. ; Wilson, J. and Stead, D. E. , 1996. Sensitivity of different methods for the detection of Pseudomonas solanacearum (Smith)Smith in potato tuber extracts. EPPO Bulletin 26. Engelbrecht, M. C. , 1994. Modification of a semi-selective medium for the isolation and quantification of Pseudomonas solanacearum. ACIAR Bacterial Wilt Newsletter 10, 3-5. Hayward, A. C. , 1964. Characteristics of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 27, 265-277. Hayward, A. C. , 1994. Systematic and phylogeny of Pseudomonas solanacearum and related bacteria. In: Bacterial Wilt: the disease and its causative agent, Pseudomonas solanacearum (eds. A. C. Hayward and G. L. Hartman) CAB International Oxford, 127-135. Janse, J. D. , 1988. A detection method for Pseudomonas solanacearum in symptomless potato tubers and some data on its sensitivity and specificity. EPPO Bulletin 18, 343-351. Janse, J. D. , 1991. Infra- and intraspecific classification of Pseudomonas solanacearum strains using whole cell fatty acid analysis. 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Robinson-Smith, A. ; Jones, P. ; Elphinstone, J. G. and Forde, S. M. D. , 1995. Production of antibodies to Pseudomonas solanacearum, the causative agent of bacterial wilt. Food and Agricultural Immunology 7, 67-79. Seal, S. E. ; Jackson, L. A. ; Young, J. P. W. and Daniels, M. J. , 1993. Differentiation of Pseudomonas solanacearum, P. syzygii, P. picketti and the blood disease bacterium by partial 16S rRNA sequencing: construction of oligonucleotide primers for sensitive detection by polymerase chain reaction. Journal of General Microbiology 139, 1587-1594. Smith, J. J. ; Offord, L. C. ; Holderness, M. and Saddler, G. S. , 1995. Genetic diversity of Burkholderia solanacearum (synonym Pseudomonas solanacearum) race 3 in Kenya. Applied and Environmental Micro- biology 61, 4262-4268. Stead, D. E. , 1992a. Techniques for detecting and identifying plant pathogenic bacteria. In: Techniques for rapid detection of plant pathogens (eds. J. M. Duncan and L. Torrance). 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Per ogni presenza sospetta per la quale le prove di screening, eseguite secondo il metodo appropriato di cui all’allegato II nel caso del materiale vegetale elencato, oppure, in tutti gli altri casi, secondo un qualunque altro metodo ufficialmente approvato, abbiano dato un risultato positivo, di cui si attende la conferma o la smentita attraverso l’applicazione completa del metodo stesso, è necessario mantenere e conservare in condizioni adeguate, fino al termine delle prove: — ove possibile, la partita o parte di essa (da cui è stato prelevato il campione) nel suo imballaggio originale, con l’etichetta, — ove possibile, la parte rimanente dei campioni, — ogni estratto residuo ed ogni ulteriore materiale (es. : vetrini di immunofluorescenza) preparato in vista delle prove di screening, ed inoltre: — tutta la documentazione. 2. Qualora venga confermata la presenza dell’organismo nocivo, è necessario mantenere e conservare in condizioni adeguate, per almeno un mese dalla procedura di notifica di cui all’articolo 5, paragrafo 2: — il materiale di cui al paragrafo 1, — un campione del materiale infetto di pomodoro o melanzana infetto inoculato con il tubero o con l’estratto, se del caso, ed inoltre: — la coltura isolata dell’organismo nocivo. L 235/32 IT Gazzetta ufficiale delle Comunità europee 21. 8. 98 ALLEGATO IV Gli accertamenti di cu all’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto i), comprendono i seguenti elementi, se del caso: i) luoghi di produzione, — dove sono o sono state coltivate patate in relazione clonale con patate risultate infette dall’organismo nocivo, — dove sono o sono stati coltivati pomodori che provengono dalla stessa fonte dei pomodori risultati infetti dall’organismo nocivo, — dove sono o sono stati coltivati patate o pomodori posti sotto controllo ufficiale per sospetta presenza dell’organismo nocivo, — dove sono o sono stati coltivati patate in relazione clonale con patate coltivate in luoghi di produzione sospetti di infestazione da parte dell’organismo nocivo, — dove vengono coltivate patate o pomodori e che sono ubicati in vicinanza di luoghi di produzione infestati, compresi quelli dove vengono condivisi attrezzature di produzione e impianti, sia diretta- mente, sia attraverso un imprenditore comune, — dove l’irrigazione o l’irrorazione siano praticate con acque superficiali originarie di qualunque fonte confermata o sospetta di infestazione da parte dell’organismo nocivo, — che per l’irrigazione o l’irrorazione condividono acque superficiali di qualsiasi origine con luoghi di produzione dove l’infestazione da parte dell’organismo nocivo è confermata o sospetta, — che sono inondati o sono stati inondati con acque superficiali confermate o sospette di infestazione da parte dell’organismo nocivo, e ii) acque superficiali impiegate per l’irrigazione, l’irrorazione o l’inondazione di uno o più terreni o luoghi di produzione dove l’infestazione da parte dell’organismo nocivo è confermata. 21. 8. 98 IT Gazzetta ufficiale delle Comunità europee L 235/33 ALLEGATO V 1. La determinazione dell’entità della contaminazione probabile di cui all’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto ii) e lettera c), punto iii), comprende i seguenti elementi, se del caso: — materiale vegetale elencato coltivato in un luogo di produzione dichiarato contaminato ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto ii); — luogo o luoghi di produzione che abbiano un collegamento nel ciclo produttivo con il materiale vegetale elencato dichiarato contaminato ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto ii), compresi quelli dove vengono condivisi macchinari e dispositivi di produzione direttamente o attraverso un imprenditore comune; — materiale vegetale elencato prodotto in un luogo o nei luoghi di produzione di cui al precedente trattino, o presenti in tale luogo o luoghi di produzione durante il periodo in cui il materiale vegetale elencato dichiarato contaminato ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto ii), era presente nei luoghi di produzione di cui al primo trattino; — magazzini adibiti alla manipolazione del materiale vegetale elencato proveniente dai luoghi di produzione di cui sopra; — macchinari, veicoli, contenitori, magazzini, o relative parti, e qualsiasi altro oggetto, compresi i materiali d’imballaggio, che possano essere venuti a contatto con il materiale vegetale elencato dichiarato contaminato ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto ii); — materiale vegetale elencato immagazzinato o entrato in contatto con una qualsiasi delle strutture o degli oggetti elencati nel precedente trattino prima della pulizia e della disinfezione di tali strutture od oggetti; — dopo gli accertamenti e gli esami di cui all’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto i), nel caso delle patate, tuberi o piante con una relazione clonale parentale o collaterale e, nel caso dei pomodori, piante con la stessa fonte del materiale vegetale elencato dichiarato contaminato ai sensi dell’arti- colo 5, paragrafo 1, lettera a), punto ii), e per le quali, malgrado abbiano dato risultati negativi nei test per l’individuazione dell’organismo nocivo, risulti che la contaminazione sia probabile per legami di carattere clonale; — luogo o luoghi di produzione del materiale vegetale elencato al precedente trattino; — luogo o luoghi di produzione di materiale vegetale elencato, che per l’irrigazione o l’irrorazione impiegano acque dichiarate contaminate ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera c), punto ii); — materiale vegetale elencato prodotto in appezzamenti inondati con acque superficiali confermate essere infestate dall’organismo nocivo. 2. La determinazione della potenziale disseminazione ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto iv) e lettera c), punto iii), tiene conto dei seguenti elementi: i) nei casi di cui all’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto iv): — vicinanza di altri luoghi di produzione in cui è coltivato il materiale vegetale elencato, — produzione e utilizzo comuni di scorte di tuberi-seme di patate, — luoghi di produzione che per l’irrigazione o l’irrorazione del materiale vegetale elencato impiegano acque superficiali, nei casi in cui esiste od è esistito un rischio di fughe di acque superficiali o di inondazione dal luogo o dai luoghi di produzione dichiarati contaminati ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto ii); ii) nei casi in cui le acque superficiali sono state dichiarate contaminate ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera c), punto ii); — luogo o luoghi di produzione del materiale vegetale elencato adiacenti alle acque superficiali dichiarate contaminate, o a rischio di inondazione, — bacini di irrigazione separati associati alle acque superficiali dichiarate contaminate. L 235/34 IT Gazzetta ufficiale delle Comunità europee 21. 8. 98 3. I dati contenuti nella notifica di cui all’articolo 5, paragrafo 2, primo comma, comprendono: — la data di segnalazione della presenza sospetta ai sensi dell’articolo 4 e le date del campionamento e della conferma della presenza dell’organismo nocivo ai sensi dell’articolo 5, secondo i casi; — una descrizione degli elementi relativi alla dichiarazione di contaminazione e alla delimitazione della zona. 4. I dati contenuti nella notifica supplementare di cui all’articolo 5, paragrafo 2, secondo comma, comprendono: — per ogni spedizione o partita di patate dichiarate contaminate, i certificati prescritti dagli articoli 7 e 8 della direttiva 77/93/CEE, il numero di passaporto o il numero di registrazione dei produttori di patate, dei depositi collettivi e dei centri di spedizione, secondo i casi; — per ogni spedizione o partita di piante di pomodoro dichiarate contaminate, i certificati di cui agli articoli 7 o 8 della direttiva 77/93/CEE ed il numero di passaporto, conformemente all’elenco di cui all’allegato V, parte A, sezione I, paragrafo 2. 2, della direttiva 77/93/CEE; — la denominazione varietale e la categoria per le scorte di tuberi-seme di patate e, ove possibile, in tutti gli altri casi; — ogni altra informazione eventualmente richiesta dalla Commissione sulla confermata comparsa della malattia. 21. 8. 98 IT Gazzetta ufficiale delle Comunità europee L 235/35 ALLEGATO VI 1. Con riferimento all’articolo 6, paragrafo 1, le disposizioni sono: — incenerimento, o — utilizzo, per l’alimentazione animale, previo idoneo trattamento termico, tale che non sussista alcun rischio di sopravvivenza dell’organismo nocivo, o — interramento profondo in un luogo di smaltimento dove non sussistano rischi di infiltrazione del terreno agricolo o di contatti con sorgenti d’acqua che potrebbero essere usate per l’irrigazione del terreno agricolo, o — destinazione alla trasformazione industriale, attraverso la consegna diretta ed immediata a stabilimenti dotati di apposite strutture ufficialmente approvate per l’eliminazione dei rifiuti, che corrispondano alle disposizioni dell’allegato VII della presente direttiva, o — altre misure, sempre che sia stato accertato che non esiste alcun rischio identificabile di disseminazione dell’organismo nocivo; tali misure debbono essere immediatamente notificate alla Commissione e agli altri Stati membri. 2. L’utilizzazione o l’eliminazione idonee del materiale vegetale elencato di cui all’articolo 6, paragrafo 2, da effettuarsi sotto il controllo degli organismi ufficiali competenti dello Stato o degli Stati membri interessati, prevedendo uno scambio di informazioni fra gli organismi ufficiali tale da assicurare la costanza di tale controllo, e l’approvazione da parte degli organismi ufficiali competenti degli Stati membri dove le patate sono imballate o trattate in relazione agli impianti destinati all’eliminazione dei rifiuti di cui al primo e secondo trattino, comprendono: i) per i tuberi di patata: — il loro impiego quali patate da conservazione destinate al consumo, purché vengano imballati in luoghi provvisti di adeguati impianti di eliminazione dei rifiuti, in imballaggi pronti per la consegna diretta e l’utilizzazione senza necessità di reimballaggio, e siano destinati alla consegna e all’utilizzazione dirette, o — il loro impiego quali patate da conservazione destinate alla trasformazione industriale e consegnate direttamente e immediatamente ad uno stabilimento dotato di adeguate strutture per l’eliminazione dei rifiuti e la desinfezione, o — altri impieghi o forme di eliminazione, sempre che sia accertato che non esiste alcun rischio identificabile di disseminazione dell’organismo nocivo, e fatta salva l’approvazione di detti organismi ufficiali competenti. Tali misure devono essere notificate immediatamente alla Commissione e agli altri Stati membri; ii) per altre parti di piante, compresi gli steli e i cascami del fogliame: — la distruzione, o — altre forme di impiego o di eliminazione, sempre che sia accertato che non esiste alcun rischio identificabile di disseminazione dell’organismo nocivo; queste misure sono notificate alla Commissione e agli altri Stati membri. 3. 4. I metodi adeguati per la decontaminazione degli oggetti di cui all’articolo 6, paragrafo 3 consistono nella pulizia e, se del caso, nella disinfezione, in modo da escludere qualsiasi rischio identificabile di disseminazione dell’organismo nocivo, e sono applicati sotto la sorveglianza degli organismi ufficiali competenti degli Stati membri. La serie di misure che gli Stati membri debbono applicare entro le zone delimitate identificate ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto iv), e lettera c), punto iii), cui si fa riferimento nell’articolo 6, paragrafo 4, comprendono: 4. 1. nei casi in cui i luoghi di produzione sono stati dichiarati contaminati ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto ii): a) in un campo o unità di produzione protetta del vegetale dichiarati contaminati ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto ii), L 235/36 IT Gazzetta ufficiale delle Comunità europee 21. 8. 98 i) — per almeno i quattro anni di coltivazione successivi a quello in cui la contaminazione è stata dichiarata, — si attuano interventi intesi ad eliminare le piante spontanee di patata o di pomodoro e le altre piante ospiti dell’organismo nocivo, comprese le solanacee selvatiche, e — è vietato mettere a dimora: — tuberi o tuberi-seme di patate — piante o semi di pomodoro — tenendo conto della biologia dell’organismo nocivo: — altre piante ospiti — pianta della specie Brassica, per le quali è stato individuato il rischio di presenza dell’organismo nocivo — colture per le quali esiste un rischio identificabile di disseminazione dell’organismo nocivo; — nel primo periodo di raccolta delle patate o dei pomodori che segue il periodo indicato al trattino precedente, ed a condizione che il terreno sia risultato esente da piante spontanee di patata e di pomodoro e da altre piante ospiti, comprese le solanacee selvatiche, per almeno due anni vegetativi consecutivi precedenti alla messa a dimora: — nel caso delle patate, sono messi a dimora soltanto tuberi-seme ufficialmente certificati per la produzione di patate da conservazione, e — si procede ad accertamenti ufficiali come precisato all’articolo 2, paragrafo 1; — nel periodo di raccolta delle patate o dei pomodori successivo a quello indicato al trattino precedente, e in seguito ad un appropriato ciclo di rotazione, nel caso delle patate sono messi a dimora esclusivamente tuberi-seme ufficialmente certificati per la produzione a scopo sia di conservazione che di semina; nel caso delle patate e dei pomodori viene effettuato un accertamento ufficiale come precisato all’articolo 2, paragrafo 1, oppure ii) nei cinque anni vegetativi successivi a quello in cui la contaminazione è stata dichiarata, — si attuano interventi atti ad eliminare le piante spontanee di patata e di pomodoro e le altre piante ospiti dell’organismo nocivo, comprese le solanacee selvatiche, — per i primi tre anni l’appezzamento viene messo e tenuto a maggese completo, oppure a cereali conformemente al rischio identificato, oppure a pascolo permanente, effettuando frequenti falciature a raso, oppure è adibito a pascolo intensivo, oppure ad erba per la produzione di sementi, e nei due anni successivi viene piantato con piante che non ospitano l’organismo nocivo e non comportano rischio identificato di sopravvivenza o dissemina- zione dell’organismo nocivo, — nel primo periodo di raccolta delle patate o dei pomodori successivo a quello indicato al trattino precedente: — nel caso delle patate, sono messi a dimora esclusivamente tuberi-semi ufficialmente certificati per la produzione a scopo di semina o di conservazione, ed è effettuato un accertamento ufficiale come precisato nell’articolo 2, paragrafo 1; b) negli altri appezzamenti: — nell’anno di coltivazione successivo a quello della contaminazione dichiarata: — è vietato mettere a dimora tuberi o piante di patata, od altre piante ospiti dell’organismo nocivo, e vengono attuati interventi per eliminare le piante spontanee di patata e di pomodoro nonché altre piante ospiti, comprese le solanacee selvatiche, secondo i casi; — nel caso dei tuberi di patata, per la produzione di patate da conservazione vengono messi a dimora esclusivamente tuberi-seme ufficialmente certificati, a condizione che gli organismi ufficiali competenti ritengano che il rischio di piante spontanee di patate e di pomodori e di 21. 8. 98 IT Gazzetta ufficiale delle Comunità europee L 235/37 altre piante ospiti dell’organismo nocivo, comprese le solanacee selvatiche, sia stato eliminato. La coltivazione in fase vegetativa viene ispezionata al momento appropriato, e sulle piante spontanee di patata viene effettuata la ricerca dell’organismo nocivo; inoltre, per le patate, i tuberi debbono essere soggetti ad ispezione dopo il raccolto; — nel primo anno di coltivazione successivo a quello di cui al primo trattino: — nel caso delle patate, per la produzione di tuberi-seme o di patate da conservazione vengono messi a dimora esclusivamente tuberi-seme ufficialmente certificati; — almeno per il secondo anno di coltura successivo a quello di cui al primo trattino: — nel caso delle patate, per la produzione di patate da seme o da conservazione vengono messi a dimora esclusivamente tuberi-seme ufficialmente certificati ovvero tuberi-seme coltivati sotto controllo ufficiale e derivanti da tuberi-seme ufficialmente certificati; — in ciascuno degli anni di coltura di cui ai precedenti trattini, vengono prese misure per eliminare le piante spontanee di patata e di pomodoro ed altre piante ospiti dell’organismo nocivo, comprese le solanacee selvatiche, e viene effettuato un accertamento ufficiale come precisato all’articolo 2, paragrafo 1 e, nel caso in cui dei tuberi-seme vengano messi a dimora in vista della produzione di patate da seme, viene effettuato un controllo sui tuberi; c) non appena è avvenuta la dichiarazione di contaminazione ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto ii), ed in ognuno degli anni vegetativi successivi, fino al primo periodo incluso di raccolta possibile delle patate o dei pomodori nell’appezzamento o negli appezzamenti dichiarati contaminati, come specificato alla lettera a): — tutti i macchinari e le strutture di magazzinaggio sul luogo di produzione e associati al ciclo produttivo di patate o di pomodori sono opportunamente puliti e, se del caso, disinfettati con i metodi adeguati, conformemente al punto 3; — per prevenire la disseminazione dell’organismo nocivo, sono effettuati controlli ufficiali sui programmi di irrigazione ed irrorazione, che possono arrivare al divieto; d) nelle unità di produzione protetta dichiarate contaminate ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto ii), allorché è possibile sostituire completamente il substrato colturale: — è vietato mettere a dimora tuberi-seme o piante di patata, od altre piante ospiti dell’organismo nocivo, comprese le piante e i semi di pomodoro, a meno che l’unità sia stata sottoposta a misure sotto controllo ufficiale intese ad eliminare l’organismo nocivo ed a rimuovere tutto il materiale vegetale elencato ospite, comprendente almeno il cambiamento completo del sub- strato colturale nonché la pulizia, e, se del caso, la disinfezione dell’unità di produzione e di tutte le attrezzature, e purché gli organismi ufficiali competenti abbiano successivamente autorizzato la produzione di patate o pomodori; — la produzione di patate si effettua a partire da tuberi-seme ufficialmente certificati, o da microtuberi o piantine ottenute da fonti controllate; — per prevenire la disseminazione dell’organismo nocivo, vengono attuati secondo necessità controlli ufficiali sui programmi di irrigazione ed irrorazione, che possono arrivare al divieto. 4. 2. All’interno della zona delimitata, fatti salvi gli interventi previsti al punto 4. 1, gli Stati membri: a) immediatamente dopo la contaminazione dichiarata, e per almeno tre periodi vegetativi: aa) nei casi in cui la zona delimitata è stata determinata ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto iv): — garantiscono il controllo, attraverso i propri organismi ufficiali responsabili, delle imprese dove viene effettuata la coltivazione, il magazzinaggio o la manipolazione dei tuberi di patata o dei pomodori, nonché delle imprese che gestiscono su base contrattuale i macchinari occorrenti, — esigono la pulizia, e se del caso, la disinfezione dei macchinari e dei magazzini presenti in tali imprese, utilizzando i metodi adeguati specificati al punto 3, L 235/38 IT Gazzetta ufficiale delle Comunità europee 21. 8. 98 — esigono l’impiego esclusivo di semi certificati o semi coltivati sotto controllo ufficiale per tutte le colture di patata comprese in tale zona, e l’esecuzione di prove dopo il raccolto di tuberi-seme di patate coltivati in luoghi di produzione dichiarati probabilmente contami- nati ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto iii), — esigono che la manipolazione dei tuberi-seme di patata raccolti sia separata da quella delle patate da consumo in tutte le imprese della zona, — eseguono gli accertamenti ufficiali di cui all’articolo 2, paragrafo 1, ab) nei casi in cui le acque superficiali sono state dichiarate contaminate ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera c), punto ii), ovvero incluse fra i fattori di una possibile disseminazione dell’organismo nocivo conformemente all’allegato V, punto 2: — procedono ad accertamenti annuali ai momenti appropriati, comprendenti il prelievo di campioni di acque superficiali e delle eventuali piante ospiti solanacee nelle sorgenti d’acqua in causa, nonché esami eseguiti in conformità: — dei metodi appropriati di cui all’allegato II, per il materiale vegetale elencato; — di qualsiasi altro metodo approvato ufficialmente negli altri casi; — per prevenire la disseminazione dell’organismo nocivo, attuano controlli sui programmi di irrigazione ed irrorazione, che possono arrivare al divieto d’impiego dell’acqua dichiarata contaminata ai fini dell’irrigazione e dell’irrorazione del materiale vegetale elencato e, se del caso, di altre piante ospiti; questo divieto può essere riveduto sulla base dei risultati dell’accertamento annuale di cui sopra; — nei casi in cui gli scarichi di reflui sono contaminati, effettuano controlli ufficiali sull’eliminazione dei rifiuti derivanti da stabilimenti industriali di trasformazione o imballaggio che manipolano il materiale vegetale elencato; b) stabiliscono se del caso un programma volto a sostituire tutte le scorte di tuberi-seme di patata entro un lasso di tempo adeguato. 21. 8. 98 IT Gazzetta ufficiale delle Comunità europee L 235/39 ALLEGATO VII Per ovviare al rischio di disseminazione dell’organismo nocivo, gli impianti ufficialmente approvati di eliminazione dei rifiuti di cui all’allegato VI, paragrafo 1, quarto trattino debbono conformarsi alle seguenti disposizioni: i) gli scarti di lavorazione delle patate e dei pomodori (comprese le patate scartate, le bucce di patata e i pomodori scartati) nonché ogni altro rifiuto solido collegato alle patate e ai pomodori, deve essere eliminato in uno dei modi seguenti: — interramento profondo in un luogo di smaltimento dove non sussistano rischi di infiltrazione del terreno agricolo o di contatti con sorgenti d’acqua che potrebbero essere usate per l’irrigazione del terreno agricolo. I rifiuti sono trasportati direttamente al sito in condizioni di confinamento tali che non sussistano rischi di perdite dei rifiuti; o — incenerimento; ii) reflui di lavorazione: prima dell’eliminazione, i reflui liquidi contenenti solidi in sospensione sono sottoposti a procedimenti di filtrazione o di sedimentazione destinati ad allontanare tali solidi. I solidi stessi debbono essere eliminati come indicato al comma i). I reflui sono quindi: — riscaldati a una temperatura minima di 70 °C per almeno 30 minuti prima di essere eliminati, oppure — altrimenti eliminati, previa approvazione ufficiale e sotto controllo ufficiale, in modo da escludere il rischio di contatto fra i rifiuti e il terreno agricolo o sorgenti di acqua che potrebbe essere utilizzata per irrigare terreni agricoli. I particolari in merito sono notificati agli altri Stati membri ed alla Commissione