title: Id-Direttiva tal-Kunsill 98/57/KE ta’ l-20 ta’ Lulju 1998 dwar il-kontroll tar-Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.

eurovoc_concepts:
food inspection
fruit vegetable
plant disease
plant health control
potato
protection of plant life

text: 03/Vol. 23 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 31998L0057 21. 8. 1998 IL-ĠURNAL UFFIĊJALI TAL-KOMUNITAJIET EWROPEJ ID-DIRETTIVA TAL-KUNSILL 98/57/KE ta’ l-20 ta’ Lulju 1998 dwar il-kontroll tar-Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. 375 L 235/1 IL-KUNSILL TA’ L-UNJONI EWROPEA, Wara li kkunsidra t-Trattat li jistabbilixxi l-Komunità Ewropea, u partikolarment l-Artikolu 43 tiegħu, li Billi wieħed mill-organiżmi jagħmlu ħsara lill-patata u lit- tadam huwa dak tar-Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. , l-aġent patoġeniku tal-marda tat-taħsir kannella fil-patata u ta’ nxif batterjoloġiku fil-patata u fit-tadam; billi l-epidemiji tal- mard ikkawżati minn dan il-patoġenu seħħew f’ċerti partijiet l-infezzjoni għadhom tal-Komunità u xi ftit sorsi jeżistu; limitati ta’ Wara li kkunsidra l-proposta mill-Kummissjoni (1), Wara li kkunsidra l-Opinjoni tal-Parlament Ewropew 4 (2), Billi hemm riskju konsiderevoli għall-kultivazzjoni tal-patata u tat-tadam fil-Komunità kollha jekk ma jittieħdux il-miżuri fejn huma kkonċernati dawn il-ħxejjex, biex ikun effettivi, lokalizzat dan l-organiżmu u tiġi stabbilita d-distribuzzjoni tiegħu, biex ma jħalluhx milli jibqa’ jeżisti u jinxtered, u, jekk jinstab, biex ma jħallux il-firxa tiegħu tkompli u jkun ikkontrollat bl-għan li dan jiġi meqrud; li kkunsidra Wara Soċjali (3), l-Opinjoni tal-Kumitat Ekonomiku u l-organiżmu li jagħmel ħsara magħruf bħala Ralstonia Billi solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. kien magħruf qabel bħala Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith; billi r-Ralstonia solana- jkun cearum (Smith) Yabuuchi ġeneralment aċċettat għal dan l-organiżmu; billi d-Direttiva preżenti għandha tikkunsidra dan l-iżvilupp xjentifiku; et al. x’aktarx isir l-isem li l-produzzjoni tal-patata u tat-tadam tokkupa post Billi importanti fl-agrikoltura tal-Komunità; billi l-produzzjoni tal- patata u tat-tadam hija b’mod kostanti mhedda minn organiżmi li jagħmlu l-ħsara; Billi, permezz tal-protezzjoni tal-kultivazzjoni tal-patata u tat- tadam kontra dawn l-organiżmi li jagħmlu ħsara, mhux biss il- kapaċità produttiva għandha tinżamm iżda wkoll il-produttività agrikola għandha wkoll tiżdied; li l-miżuri protettivi biex jipprevjienu l-introduzzjoni ta’ l- Billi jagħmlu ħsara fit-territorju ta’ Stat Membru organiżmi probabbilment ikollhom biss effett limitat li kieku dawn l- organiżmi ma jkunux ikkontrollati simultanjament u metodika- fil-Komunità kollha u ma kellhomx jitħallew milli ment jixxerdu; Billi, biex ikun assigurat dan, għandhom jittieħdu ċerti miżuri fi l-Istati Membri għandhom, barra ħdan il-Komunità; billi minnhekk, jieħdu miżuri addizzjonali jew aktar stretti fejn ikun meħtieġ, sakemm ma jkunx hemm ostaklu għall-moviment tal- patata u tat-tadam fil-Komunità, ħlief għal kif inhu stabbilit s’issa fid-Direttiva tal-Kunsill 77/93/KEE tal-21 ta’ Diċembru fil- 1976 dwar Komunità ta’ jew lill- prodotti tal-pjanti u kontra l-firxa ta’ dawn fil-Komunità (4); billi miżuri bħal dawn għandhom ikunu nnotifikati lill-Istati Membri l-oħrajn u lill-Kummissjoni; il-miżuri protettivi kontra l-introduzzjoni l-organiżmi jagħmlu ħsara lill-pjanti li ta’ l-miżuri għandhom jikkunsidraw li stħarriġ uffiċjali Billi sistematiku huwa meħtieġ biex jillokalizza l-patoġenu; billi dan l-istħarriġ għandu jinkludi proċeduri ta’ spezzjoni u, meta jkun xieraq, jekk taħt ċerti ċirkustanzi ambjentali l-marda tista’ tibqa’ moħbija u mhux osservata kemm fil-pjanta tal-patata ta’ meta qed tikber u kemm f’tuberi tal-patata maħżuna, għandu jinkludi teħid ta’ kampjuni u ttestjar; billi proċeduri l-firxa tal- patoġenu fil-pjanta li qed tikber mhuwiex l-iktar fattur importanti, iżda billi l-patoġenu jista’ jinfirex bl-ilma tal-wiċċ u b’ċerti pjanti solanini selvaġġi assoċjati, u għalhekk l-irrigaz- zjoni l-ilma kkontaminat jidher li joħloq riskju għall-infezzjoni ta’ dawn il- ħxejjex; billi wkoll il-patoġenu jista’ jeżisti fix-xitwa fi pjanti tal- patata u tat-tadam li jinżergħu weħidhom (voluntiera) u dawn jistgħu jkunu sors ta’ infezzjoni billi dawn jinġarru minn staġun għall-ieħor; billi l-patoġenu jinxtered ukoll bil-kontaminazzjoni tal-patata permezz ta’ kuntatt ma’ patata infettata u permezz ta’ kuntatt mat-tagħmir tal-kultivazzjoni, tal-ħsad u t-tħaddim jew inkella kontenituri jkunu kkonta- minaw ruħhom ma’ l-organiżmu permezz ta’ kuntatt minn qabel mal-patata infettata; tal-patata u tat-tadam bl-użu ta’ tat-trasport u tal-ħażna li tal-pjanti (1) ĠU C 124, 21. 4. 1997, p. 12 u ĠU C 108, 7. 4. 1998, p. 85. (2) ĠU C 14, 19. 1. 1998, p. 34. (3) ĠU C 206, 7. 7. 1997, p. 57. (4) ĠU L 26, 31. 1. 1977, p. 20. Id-Direttiva kif l-aħħar emendata bid- Direttiva tal-Kummissjoni 98/2/KE (ĠU L 15, 21. 1. 1998, p. 34). 376 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 03/Vol. 23 titnaqqas jew ma titħalliex l-firxa tal-patoġenu tista’ Billi l-oġġetti bħal dawn; billi permezz tad-dekontaminazzjoni ta’ kwalunkwe kontaminazzjoni tal-patata taż-żriegħ tpoġġi riskju ikbar għall-firxa tal-patoġenu; b’mod simili l-infezzjoni moħbija taż-żriegħ tal-patata tpoġġi riskju akbar għall-firxa tal-patoġenu u dan jista’ ma jitħalliex bl-użu tal-patata taż-żriegħ prodotta fi programm approvat uffiċjalment meta l-patata taż-żriegħ tkun ġiet ittestjata u nstabet li hija ħielsa mill-infezzjoni; l-għarfien preżenti tal-bioloġija u l-epidemoloġija tal- Billi Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. taħt kondizzjonijiet Ewropej mhuwiex komplut u huwa antiċipat li sejjer ikun meħtieġ li f’diversi staġuni; b’mod simili it-titjib għall-proċeduri tat-test huma antiċipati fid- ta’ aktar riċerka speċjalment dwar is-sensittività u l- dawl ispeċifiċità tal-metodi tat-test biex jintgħażlu u jkunu standar- dizzati l-aħjar metodi tat-testijiet disponibbli; l-miżuri proposti jkunu riveduti tad-dettalji Billi, għad-determinazzjoni ta’ dawn il-miżuri ġenerali, kif ukoll għal dawk il-miżuri addizzjonali jew aktar stretti meħuda mill-Istati Membri biex ma titħalliex l-introduzz- joni tal-patoġenu fil-konfini tagħhom, huwa meħtieġ għall-Istati Membri li jikkooperaw mill-qrib mal-Kummissjoni fi ħdan il- Kumitat Permanenti dwar is-Saħħa tal-Pjanti (minn issa ’il quddiem imsejjaħ ‘il-Kumitat’), ADOTTA DIN ID-DIRETTIVA: Artikolu 1 Din id-Direttiva tikkonċerna l-miżuri li għandhom jittieħdu fl- Istati Membri kontra r-Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. , magħrufa qabel bħala l-Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith, (minn issa ’il quddiem imsejħa ‘l-organiżmu’), biex, fejn huma kkonċernati l-pjanti ospitanti ta’ l-organiżmu elenkat fl- (minn issa ’il quddiem imsejjaħ ‘il- Anness I tas-Sezzjoni 1, materjal tal-pjanta elenkat fil-lista’): (a) jillokalizzawh u jistabbilixxu d-distribuzzjoni tiegħu; (b) jipprevjienu għall-iskoppjar u l-firxa tiegħu; u (ċ) jekk jinstab, ma titħalliex il-firxa tiegħu u biex ikun ikkontrollat bl-għan li dan jinqered. Artikolu 2 li tal-pjanti fil-lista li tal-produzzjoni jidhru fil-lista, joriġina fil-konfini Ta’ kull sena l-Istati Membri għandhom iwettqu stħarriġ 1. uffiċjali sistematiku għall-organiżmu fuq il-materjal tal-pjanti tagħhom. Biex ikunu elenkat identifikati sorsi possibbli oħra ta’ kontaminazzjoni li jheddu l- l-Istati Membri produzzjoni għandhom jagħmlu estimi tar-riskju u, sakemm ma jkun ġie identifikat l-ebda riskju ta’ firxa tal-organiżmu matul dawk l- estimi, dawn għandhom, tal-pjanti fiż-żoni imexxu stħarriġ uffiċjali mmirat apposta għall- msemmija, organiżmu fuq pjanti oħrajn għajr dawk il-pjanti elenkati fil- lista, inkluż il-pjanti ospitanti solanini selvaġġi, kif ukoll fuq l- ilma tal-wiċċ li jew għall-bexx tal- pjanti msemmija u fuq skart likwidu li joħroġ mill-bini ta’ l- ipproċessar jew ta’ jittratta dawn il- l-ippakkjar industrijali pjanti u użat għall-irrigazzjoni jew għall-bexx tal-pjanti Il-limitu ta’ dan l-istħarriġ għandu jiġi stabbilit msemmija. jistgħu jkun ġie identifikat. L-Istati Membri skond ir-riskju li jmexxu wkoll stħarriġ uffiċjali għall-organiżmu fuq il-materjal, bħal ma huma l-medja tat-tkabbir, il-ħamrija u l-iskart solidu li joħroġ mill-bini ta’ l-ipproċessar u l-ippakkjar industrijali. jintuża għall-irrigazzjoni li L-istħarriġ uffiċjali 2. paragrafu 1 għandu jitwettaq: li hemm provvediment dwaru fil- (a) għall-materjal tal-pjanti elenkati, skond id-dettalji stabbiliti fil-punt 1 tas-Sezzjoni II, ta’ l-Anness I; u, (b) għall-pjanti ospitanti għajr dawk li hemm fil-lista, u għall- likwidu, b’konformità mal-metodi ilma inkluż l-iskart adatti u, meta jkun xieraq, għandhom jittieħdu kampjuni li jkunu sorveljati uffiċjalment, fil-laboratorju; jkunu suġġetti għal testijiet uffiċjali, jew li (ċ) meta jkun xieraq għal materjal ieħor, b’konformità mal- metodi adatti. Għal dan l-istħarriġ, dettalji oħra tal-proċeduri ta’ l-ispezzjoni u n-numru, l-oriġini, l-istratifikazzjoni u t-teħid tal-ħin għall-ġbir għandhom ikunu deċiżi mill-korpi uffiċjali tal-kampjuni responsabbli fi ħdan it-tifsira tad-Direttiva 77/93/KEE ibbażata fuq prinċipji xjentifiċi u statistiċi b’saħħithom u l-bioloġija ta’ l- organiżmu u li is- sistemi tal-produzzjoni partikolari tal-materjal tal-pjanti elenkati fil-lista u, kif l- organiżmu. jikkunsidraw fl-Istat Membru kkonċernat, ta’ pjanti ospitanti oħra ta’ inhu xieraq, l-istħarriġ uffiċjali Id-dettalji u r-riżultati sena lill-Istati Membri 3. li hemm ta’ provvediment dwaru fil-paragrafu 1 għandhom ikunu nnotifi- l-oħra u lill-Kummissjoni kati kull b’konformità mad-disposizzjonijiet tal-punt 2 tas-Sezzjoni II, ta’ l-Anness I. Dawn in-notifiki għandhom jingħataw sal-1 ta’ Ġunju ħlief għall-patata użata bħala zerriegħa mfaddla-tar- sal-1 ta’ razzett Settembru. tar-raba’ għandhom ikunu mqabbla mal-produzzjoni tas-sena ta’ qabel. Id-dettalji ta’ dawn in-notifki jistgħu jingħataw lill-Kumitat. li għaliha n-notifika għandha u tingħata għall-uċuh Id-dettalji r-riżultati 03/Vol. 23 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 377 4. Id-disposizzjonijiet b’konformità mal-proċedura Direttiva 77/93/KEE: li ġejjin għandhom ikunu adottati stabbilita fl-Artikolu 16a tad- ikunu taħt il-kontroll tagħhom u sakemm ikun ġie stabbilit li ma jkun hemm l-ebda riskju identifikabbli tal-firxa ta’ l-organiżmu; — il-metodi adatti għall-istħarriġ u t-testijiet jsiru fil- laboratorju li hemm provvediment dwarhom fil-para- grafu 2, l-ewwel subparagrafu, (b). li Id-disposizzjonijiet li ġejjin jistgħu jiġu adottati b’konfor- 5. mità mal-proċedura stabbilita fl-Artikolu 16a tad-Direttiva 77/93/KEE: — il-metodi adatti għall-istħarriġ li hemm provvediment dwarhom fil-paragrafu 2, l-ewwel subparagrafu, (c), — id-dettalji l-oħrajn ta’ l-istħarriġ li hemm provvediment dwarhom fil-paragrafu 2, it-tieni subparagrafu, bil-ħsieb li jkunu assigurati livelli kumparabbli ta’ l-assigurazzjoni bejn l-Istati Membri. Artikolu 3 L-Istati Membri għandhom jassiguraw li l-preżenza suspettata jew il-konferma ta’ l-organiżmu fit-territorju tagħhom għandha tiġi rrappurtata lill-korpi uffiċjali responsabbli tagħhom. Artikolu 4 li ta’ jsiru fil-laboratorju billi F’kull każ ta’ preżenza il-korpi uffiċjali suspettata, 1. l-Istat(i) Membru(i) kkonċernat(i) għandhom responsabbli jassiguraw it-tkomplija tat-testijiet uffiċjali, jew sorveljati b’mod uffiċjali, jintuża, għall-materjal tal- pjanti li jidhru fil-lista, il-metodu relevanti stabbilit fl-Anness II u b’konformità mal-kondizzjonijiet speċifikati fil-punt 1 ta’ l- l-oħrajn kollha, kwalunkwe metodu Anness III, ieħor approvat uffiċjalment, biex jikkonferma jew jirrifjuta l- preżenza suspettata. Fil-każ ta’ konferma, il-kriterji stabbiliti fil- punt 2 ta’ l-Anness III għandhom ikunu applikabbli. fil-każi jew, Sakemm iddum biex tkun ikkonfermata jew miċħuda l- f’kull każ ta’ 2. preżenza suspettata permezz tal-paragrafu 1, preżenza suspettata meta, jew: (i) sintomi dijagnostiċi tal-marda kkawżati mill-organiżmu jkunu dehru u għalhekk jinkiseb riżultat pożittiv mit- test(ijiet) ta’ l-istħarriġ rapidu, kif speċifikat fl-Anness II, is- sezzjoni I, il-punt 1 u s-sezzjoni II; jew, (ii) riżultat pożittiv fit-test(ijiet) ta’ l-istħarriġ kif speċifikat fl- III ikun l-Istati Membri Anness II, miksub, għandhom, b’relazzjoni mal-produzzjoni tagħhom stess: I, il-korpi uffiċjali reponsabbli il-punt 2 u s-sezzjoni is-sezzjoni ta’ (a) jipprojbixxu l-moviment tal-pjanti u t-tuberi mill-uċuh kollha li minnhom ikunu ttieħdu l-kampjuni, ħlief jekk dawn tar-raba’, mil-lottijiet jew mill-konsenji (b) jieħdu l-miżuri meħtieġa biex jidentifikaw l-oriġini tal- preżenza suspettata; (ċ) jintroduċu miżuri adatti ta’ prekawzjoni addizzjonali bbażati fuq il-livell ikkalkolat tar-riskju, partikolarment b’relazzjoni mal-produzzjoni tal-pjanti elenkati u l-moviment tal-lottijiet tal-patata taż-żriegħ għajr dawk riferiti fil-punt (a), prodotti fuq il-post tal- (a) li minnu l-kampjun riferit produzzjoni ikun ittieħed, biex jipprevjienu kwalunkwe firxa ta’ l- organiżmu. tal-materjal fil-punt l-Istat Membru li 3. F’dawk il-każi ta’ preżenza suspettata fejn ikun hemm riskju ta’ kontaminazzjoni tal-materjal tal-pjanti msemmija jew ta’ l-ilma tal-wiċċ minn jew ġewwa Stat(i) Membru(i) ieħor(oħ− fih il-preżenza suspettata tkun ġiet rajn), irrappurtata għandu javża minnufih, skond ir-riskju identifikat, id-dettalji lill-Istat(i) Membru(i) l-ieħor(l-oħra) ikkonċernat(i), u għandu jkun hemm ko-operazzjoni xierqa bejn l-Istati Membri msemmija. L-Istat(i) Membru(i) hekk kif ikunu avżati, għandhom jintroduċu mużuri ta’ prekawzjoni b’konformità mal-paragrafu 2(c) u jieħdu kwalunkwe azzjonijiet oħra, skond kif ikun xieraq, b’konfor- mità mal-paragrafi 1 u 2. suspettata msemmija tal-preżenza Id-disposizzjonijiet li ġejjin jistgħu jkunu adottati b’kon- 4. formità mal-proċedura stabbilita fl-Artikolu 16a tad-Direttiva 77/93/KEE: — il-miżuri riferiti fil-paragrafu 2(c). Artikolu 5 juża, għall-materjal jew sorveljat b’mod uffiċjali Jekk test uffiċjali li li tal-pjanti msemmija, jsir 1. f’laboratorju, il- metodu relevanti stabbilit fl-Anness II jew, jew fil-każi l-oħrajn kollha, kwalunkwe metodu ieħor approvat uffiċjalment, jikkonferma l-preżenza ta’ l-organiżmu f’kampjun meħud skond din id-Direttiva, il-korpi uffiċjali responsabbli ta’ l-Istat Membru, wara li jkunu kkunsidraw prinċipji xjentifiċi tajba, il-bioloġija il-marketing, u s- ta’ sistemi ta’ l-ipproċessar tal-pjanti ospitanti ta’ l-organiżmu f’dak l-Istat Membru, għandhom: l-organiżmu u l-produzzjoni partikolari, (a) għall-materjal tal-pjanti msemmija; (i) jistabbilixxu investigazzjoni biex ikun stabbilit il- tal-kontaminazzjoni limitu u s-sors(i) primarju(i) l-Anness IV, b’konformità mad-disposizzjonijiet permezz l- Artikolu 4(1), fuq, minn ta’ l-inqas, il-lottijiet kollha tal-patata taż-żriegħ klonalment relatata, u, testijiet oħra b’konformità ma’ ta’ ta’ 378 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 03/Vol. 23 (ii) jiddikjaraw bħala kontaminati ta’ l-materjal l-imħażen, jew l-unitajiet tal-pjanti msemmija, il-konsenji u/jew il-lottijiet li minnhom il- kampjun ikun ittieħed, u l-makkinarju, il-vetturi, ir- reċipjenti, ta’ dawn, u kwalunkwe oġġetti oħra inkluż il-materjal l- ippakkjar li jkun ġie f’kuntatt mal-materjal tal-pjanti msemmija li minnhom ikun ittieħed il-kampjun; jiddikjaraw ukoll bħala kontaminati, meta ikun xieraq, l-għalqa (jew l-għelieqi), tal-produzzjoni l-unitajiet l-uċuħ tar-raba’ u l-postijiet tal-produz- protetta ta’ zjoni li minnhom il-materjal tal-pjanti msemmija kien miġbur u li minnhom kien ittieħed il-kampjun; u għal dawk il-kampjuni li jkunu ttieħdu waqt l-istaġun tat- il- tkabbir, postijiet l- unitajiet tal-produzzjoni protetta ta’ l-uċuħ tar-raba’ li minnhom ikun ittieħed il-kampjun, u, jiddikjaraw bħala kontaminati l-għelieqi, tal-produzzjoni, u, meta jkun xieraq, l-Anness V, (iii) jistabbilixxu, b’konformità mad-disposizzjonijiet tal- punt 1 ta’ il-limitu tal-kontaminazzjoni probabbli permezz tal-kuntatt ta’ qabel jew ta’ wara l- ħsad, permezz ta’ rabtiet mal-produzzjoni, l-irrigaz- jew permezz tar-relazzjonijiet zjoni klonali mal-kontaminazzjoni iddikjarata, u, jew il-bexx, (iv) jiddemarkaw żona fuq il-bażi tad-dikjarazzjoni tal- kontaminazzjoni permezz tal-punt (ii), id-determinaz- zjoni tal-limitu tal-kontaminazzjoni probabbli taħt il- punt (iii), u l-firxa possibbli ta’ l-organiżmu, b’konfor- mità mad-disposizzjonijiet l- Anness V; tal-punt 2(i) ta’ (b) għal uċuħ tar-raba’ tal-pjanti ospitanti għajr dawk imsemmija fil-punt (a) meta l-produzzjoni tal-materjal tal- pjanti msemmija tkun identifikata li tinsab f’riskju, (i) li jistabbilixxu investigazzjoni b’konformità mal-punt (a)(i); u (ii) jiddikjaraw bħala kontaminati l-pjanti ospitanti ta’ l- organiżmu li minnhom il-kampjun ikun ittieħed; u (iii) jistabbilixxu l-kontaminazzjoni probabbli u jidde- markaw żona b’konformità mal-punti (a)(iii); u (iv), ripsettivament, tal- materjal tal-pjanti msemmija; f’relazzjoni mal-produzzjoni (ċ) għall-ilma tal-wiċċ li ta’ l-emissjonijiet jittratta l-materjal (inkużi industrijali ta’ l-ipproċessar l-iskart jew l- likwidu mill-bini ippakkjar tal-pjanti msemmija) u pjanti ospitanti solanini selvaġġi assoċjati, fejn il-produz- zjoni tal-materjal tal-pjanti msemmija tkun identifikata li hija f’riskju permezz ta’ jew it- tifqigħ ta’ l-ilma tal-wiċċ, l-irrigazzjoni, il-bexx, (iii) jistabbilixxu l-kontaminazzjoni probabbli u jidde- markaw żona fuq il-bażi tad-dikjarazzjoni tal-konta- minazzjoni taħt il-punt (ii), u l-firxa possibbli ta’ l- jikkunsidraw id-disposizzjonijiet organiżmu waqt tal-punti 1 u 2(ii) ta’ l-Anness V. li L-Istati Membri għandhom jinnotifikaw minnufih lill-Istati 2. Membri l-oħra u lill-Kummissjoni, b’konformità mad-disposiz- zjonijiet tal-punt 3 tal-Anness V, dwar kwalunkwe kontami- nazzjoni ddikjarata taħt il-paragrafi 1(a)(ii) u 1(ċ)(ii) u d-dettalji il-pargrafu 1(a)(iv) u, meta tad-demarkazzjoni tan- jkun applikabbli, Id-dettalji notifika taħt dan il-paragrafu tista’ tkun ippreżentata lill- Kumitat. taż-żona taħt taħt il-paragrafu 1(c)(iii). L-Istati Membri għandhom fl-istess ħin jissottomettu lill- Kummissjoni n-notifika addizzjonali stabbilita fil-punt 4 ta’ l- tan-notifika taħt dan is-subparagrafu Anness V. għandhom ikunu sottomessi minnufih lill-membri tal-Kumitat. Id-dettalji Bħala riżultat tan-notifika taħt il-paragrafu 2 u l-elementi 3. msemmija fiha, l-Istati Membri l-oħrajn iddettaljati fin-notifika għandhom jistabbilixxu investigazzjoni b’konformità mal-para- il-paragrafu 1(ċ)(i) u grafu 1(a)(i) u, meta jkun applikabbli, jieħdu aktar azzjoni, kif ikun xieraq, b’konformità mal- paragrafi 1 u 2. Artikolu 6 L-Istati Membri għandhom jippreskrivu li l-materjal tal- 1. pjanti msemmija u ddikjarati bħala kontaminati l- Artikolu 5(1)(a)(ii) ma jistax ikun miżrugħ u li, taħt il-kontroll u l-approvazzjoni tal-korpi uffiċjali responsabbli tagħhom, dan għandu jkun suġġett għal waħda mid-disposizzjonijiet tal- punt 1 ta’ l-Anness VI, b’tali mod li jkun stabbilit li ma jkunx hemm riskju identifikabbli tal-firxa ta’ l-organiżmu. taħt L-Istati Membri għandhom jippreskrivu li l-materjal tal- 2. pjanti msemmija u stabbiliti bħala probabbilment ikkontami- nati taħt l-Artikolu 5(1)(a) (iii) u (ċ)(iii) inkluż il-materjal tal- pjanti msemmija li għalihom ġie identifikat riskju, prodotti ta’ produzzjoni u stabbiliti bħala probabbilment f’postijiet ikkontaminati taħt jiġi miżrugħ u għandu, taħt il-kontroll tal-korpi uffiċjali respon- sabbli tagħhom, jitpoġġa għall-użu xieraq jew disponibbiltà kif speċifikat fil-punt 2 ta’ l-Anness VI, b’tali mod li jkun stabbilit li m’hemmx riskju identifikabbli tal-firxa ta’ l-organiżmu. l-Artikolu 5(1)(a)(iii), ma jkunx jista’ (i) jistabbilixxu investigazzjoni li tkun tinkludi stħarriġ uffiċjali fi żminijiet addattati fuq kampjuni ta’ l-ilma tal-wiċċ u, jekk ikunu preżenti pjanti ospitanti solanini selvaġġi, biex jistabbilixxu l-limitu tal-konta- minazzjoni; u (ii) jiddikjaraw bħala kontaminat l-ilma tal-wiċċ li minnu l-kampjun(i) kien ittieħed, sal-limitu li hu xieraq u fuq il-bażi tal-investigazzjoni permezz tal-punt (i); u jinkludu l-materjal ta’ L-Istati Membri għandhom jippreskrivu li kwalunkwe 3. makkinarju, vettura, reċipjent, maħżen, jew unitajiet ta’ dawn, u kwalunkwe oġġetti oħra li l-ippakkjar, iddikjarati bħala ikkontaminati jew stabbiliti bħala probabbilment l-Artiko- lu 5(1)(a)(iii) u (ċ)(iii), għandu jew jinqered jew ikun iddekonta- minat billi jintużaw metodi adatti kif speċifikat fil-punt 3 ta’ l- Anness VI. Wara d-dekontaminazzjoni, kwalunkwe oġġetti bħal dawn m’għandhomx jitqiesu aktar bħala kkontaminati. taħt ikkontaminati l-Artikolu 5(1)(a)(ii) taħt 03/Vol. 23 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 379 4. Mingħajr preġudizzju għall-miżuri implimentati taħt il- paragrafi 1, 2 u 3, l-Istati Membri għandhom jippreskrivu li, fiż-żona ddemarkata taħt l-Artikolu 5(1)(a)(iv) u (ċ)(iii), serje ta’ l-Anness VI, miżuri, kif għandhom ikunu implimentati. Dettalji ta’ dawn il-miżuri għandhom ikunu nnotifikati ta’ kull sena lill-Istati Membri l- oħrajn u lill-Kummissjoni. Id-dettalji ta’ din in-notifika jistgħu jiġu ppreżentati lill-Kumitat. fil-punti 4. 1 u 4. 2 ta’ speċifikat Artikolu 9 għad-disposizzjonijiet preġudizzju l-Istati Membri Mingħajr 77/93/KEE, miżuri msemmija b’konformità mad-disposizzjonijiet 95/44/KE (1) għal għanijiet xogħol fuq selezzjonijiet varjetali. tad-Direttiva jistgħu jawtorizzaw derogi mill- fl-Artikoli 6 u 8 ta’ din id-Direttiva fid-Direttiva ta’ prova jew xjentifiċi, u għal stabbiliti Artikolu 7 Artikolu 10 L-Istati Membri għandhom jippreskrivu li 1. l-patata taż- żriegħ għandha tilħaq il-kriterji tad-Direttiva 77/93/KEE u għandhom jiksbu f’linja diretta mill-patata l-materjal miksub taħt programm approvat uffiċjalment li jkun instab ħieles mill- organiżmu f’testijiet uffiċjali jew sorveljati b’mod uffiċjali billi jintuża l-metodu relevanti stabbilit fl-Anness II. It-testijiet msemmija hawn fuq għandhom isiru minn Stat Membru: jistgħu jadottaw f’relazzjoni mal-produzzjoni L-Istati Membri tagħhom stess miżuri addizzjonali jew aktar stretti, skond kif ikun meħtieġ, biex ikun miġġieled dan l-organiżmu jew biex ma jħalluhx jinfirex, sakemm dawn ikunu b’konformità mad- disposizzjonijiet tad-Direttiva 77/93/KEE. Id-dettalji ta’ dawn il-miżuri għandhom ikunu nnotifikati lill- Istati Membri l-oħrajn u lill-Kummissjoni. Id-dettalji ta’ din in- notifika jistgħu jingħataw lill-Kumitat. (a) f’każi fejn ikun ġie kkonfermat li hemm preżenza ta’ organiżmu fil-produzzjoni tagħhom tal-patata taż-żriegħ, l- Artikolu 11 (i) billi jittestjaw il-propagazzjonijiet ta’ qabel, l- għażla klonali tal-bidu u l-ittestjar sistematiku ta’ kloni ta’ żerriegħa bażika tal-patata; jew inklużi (ii) fil-każi fejn ikun ġie li m’hemm l-ebda relazzjoni klonali, bl-ittestjar tal-kloni kollha taż-żriegħ bażika tal-patata jew tal-propagazzjonijiet ta’ qabel, inkluża l-għażla klonali tal-bidu, u stabbilit (b) fil-każi l-oħra, jew fuq kull pjanta ta’ l-għażla klonali inizjali jew fuq il-kampjun rappreżentattiv taż-żriegħ bażika tal- patata jew tal-propagazzjonijiet ta’ qabel. Id-disposizzjonijiet li ġejjin jistgħu jkunu adottati b’kon- 2. formità mal-proċedura stabbilita fl-Artikolu 16a tad-Direttiva 77/93/KEE: — ir-regoli dettaljati ta’ l-applikazzjoni tal-paragrafu 1, it-tieni subparagrafu, il-punt (a), — ir-regoli li jikkonċernaw il-kampjun rappreżentattiv li hemm provvediment dwaru fil-paragrafu 1, it-tieni subpa- ragrafu, il-punt (b). Artikolu 8 ta’ l-iżvilupp ta’ Emenedi għall-Annessi għal din id-Direttiva, li għandhom isiru l-għarfien xjentifiku u tekniku, fid-dawl għandhom ikunu adottati b’konformità mal-proċedura stabbilita fl-Artikolu 16a tad-Direttiva 77/93/KEE. Fil-każ tal-metodi l- stabbiliti fl-Anness II u l-miżuri fil-paragrafi 4. 1 u 4. 2 ta’ Anness VI għal din id-Direttiva, għandu jitħejja rapport mill- Kummissjoni li fih ikunu riveduti dawn il-metodi u l-miżuri fid- l-esperjenza miksuba, u r-rapport għandu jkun dawl ippreżentat lill-Kumitat qabel l-1 ta’ Jannar 2002. ta’ Artikolu 12 L-Istati Membri għandhom iġibu fis-seħħ il-liġijiet, 1. ir- regoli u d-disposizzjonijiet amministrattivi meħtieġa biex dawn ikunu konformi ma’ din id-Direttiva b’effett mill-21 ta’ Awissu 1999. Huma għandhom jinfurmaw minnufih lill-Kummissjoni dwar dan. jadottaw dawn il-miżuri, dawn għandu Meta l-Istati Membri jkollhom referenza għal din id-Direttiva jew inkella jkunu akkumpanjati b’tali referenza fl-okkażjoni tal-pubblikazzjoni uffiċjali tagħhom. Il-metodi ta’ kif issir tali referenza għandhom ikunu adottati mill-Istati Membri. L-Istati Membri għandhom jikkomunikaw minnufih lill- 2. Kummissjoni d-disposizzjonijiet li huma jadottaw fil-qasam irregolat b’din id-Direttiva. Il-Kummissjoni għandha tinforma lill-Istati Membri l-oħrajn dwar dan. tal-liġi nazzjonali L-Istati Membri għandhom jipprojbixxu ż-żamma u l-imma- niġġjar ta’ l-organiżmu. (1) ĠU L 184, 3. 8. 1995, p. 34. Id-Direttiva kif l-aħħar emendata bid- Direttiva tal-Kummissjoni 97/46/KE (ĠU L 204, 31. 7. 1997, p. 43). 380 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 03/Vol. 23 Artikolu 13 Din id-Direttiva għandha tidħol fis-seħħ fil-jum tal-pubblikaz- zjoni tagħha fil-Ġurnal Uffiċjali tal-Komunitajiet Ewropej. Artikolu 14 Din id-Direttiva hija indirizzata lill-Istati Membri. Magħmula fi Brussel, fl-20 ta’ Lulju 1998. Għall-Kunsill Il-President W. MOLTERER 03/Vol. 23 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 381 ANNESS I SEZZJONI I Lista ta’ pjanti ospitanti tar-Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. msemmija fl-Artikolu 1 Pjanti (inklużi tuberi), apparti milli għal żerriegħa vera, tas-Sonanum tuberosum L. Pjanti, apparti milli għall-frott u ż-żerriegħa, tal-Lycopersicon lycopersicum (L. ) Karsten ex Farw. Patata Tadam SEZZJONI II Stħarriġ 1. L-istħarriġ uffiċjali riferit fl-Artikolu 2(2)(a) għandu jkun ibbażat fuq il-bioloġija ta’ l-organiżmu u s-sistemi tal- produzzjoni partikolari fl-Istati Membri kkonċernati u għandu jikkomprendi: (i) fil-każ tal-patata, — fi żmien addattat, spezzjoni viżwali ta’ l-uċuħ tar-raba’ waqt li qed jikbru, u/jew teħid ta’ kampjuni kemm taż-żriegħ u kemm ta’ patata oħra waqt l-istaġun tat-tkabbir jew li tkunu maħżuna. Dawn il-kampjuni għandhom ikunu suġġetti għal spezzjoni viżwali uffiċjali jew sorveljata uffiċjalment bil-qtugħ ta’ tuberi, u — fil-każ ta’ żerriegħa tal-patata, u meta jkun xieraq għal patata oħra, testijiet uffiċjali jew sorveljati b’mod uffiċjali f’laboratorju bl-użu tal-metodi stabbiliti fl-Anness II, (ii) fil-każ tat-tadam, — spezzjoni viżwali, fi żmien addattat, ta’ mill-inqas il-pjanti li qed jikbru u li l-frott tagħhom huwa intiż biex ikun miżrugħ mill-ġdid għall-użu professjonali. 2. In-notifika ta’ l-istħarriġ uffiċjali riferit fl-Artikolu 2(3) għandu jinkludi: (i) fil-każ ta’ stħarriġ fuq il-patata, — estimi taż-żona kollha kkultivata, f’ettari, taż-żriegħ u patata l-oħra, — stratifikazzjoni skond il-kategorija taż-żriegħ u l-għamla, u meta jkun xieraq, skond ir-reġjun, — in-numru u t-teħid tal-ħin tal-ġbir tal-kampjuni meħuda għall-ittestjar, — in-numru ta’ l-ispezzjonijiet viżwali fl-għalqa, — in-numru (u l-qies tal-kampjun) ta’ l-ispezzjonijiet viżwali fuq it-tuberi; (ii) fil-każ ta’ stħarriġ fuq, minn ta’ l-inqas, l-uċuħ tar-raba’ tal-pjanti tat-tadam li qed jikbru u intiżi biex jinżergħu mill-ġdid għall-użu professjonali, — l-estimi tan-numru totali tal-pjanti, — in-numru ta’ spezzjonijiet viżwali; (iii) fil-każ ta’ stħarriġ fuq pjanti ospitanti apparti milli għall-patata u t-tadam, inklużi l-pjanti ospitanti solanini selvaġġi, — l-ispeċi, — in-numru u l-ħin tat-teħid tal-kampjuni li jkun inġabru, — żona/xmara li minnhom ikunu ttieħdu l-kampjuni, skond kif ikun xieraq, — il-metodu ta’ l-analiżi; (iv) fil-każ ta’ stħarriġ fuq l-ilma u l-emissjonijiet ta’ skart likwidu mill-bini industrijali ta’ l-ipproċessar u ta’ l- ippakkjar, — in-numru u l-ħin tat-teħid biex jinġabru l-kampjuni, — iż-żona/ix-xmara/il-post tal-bini minn fejn ikunu ttieħdu l-kampjuni, skond kif ikun xieraq, — il-metodu ta’ l-analiżi. 382 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 03/Vol. 23 L-ISKEMA TAT-TEST GĦAD-DIANJOSI, IS-SEJBA U L-IDENTIFIKAZZJONI TAR-RALSTONIA SOLANA- CEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL. ANNESS II L-ISKOP TA’ L-ISKEMA TAT-TEST L-iskema hawn ippreżentata tiddeskrivi d-diversi proċeduri involuti fil-: (i) dianjosi tat-tħassir kannella fit-tuberi tal-patata u t-tinxif batterjoloġiku fil-pjanti tal-patata u tat-tadam; (ii) id-determinazzjoni tar-Ralstonia solanacearum f’kampjuni ta’ tuberi tal-patata; (iii) l-identifikazzjoni tar-Ralstonia solanacearum. Fl-Appendiċi, soluzzjonijiet, ir-reaġenti. id-dettalji huma pprovduti għat-tħejjija tal-materjali tat-test, i. e. il-medja tat-tkabbir, l-ilqugħ, is- WERREJ: SEZZJONI I: Applikazzjoni ta' l-Iskema tat-Test 1. Dianjosi tat-tħassir kannella fit-tuberi tal-patata u ta' l-inxif batterjoloġiku fil-patata u fit- tadam pjanti. 2. Determinazzjoni u identifikazzjoni tar-Ralstonia solanacearumf'kampjuni tat-tuberi tal-patata SEZZJONI II: Dianjosi tat-tħassir kannella fit-tuberi tal-patata u tnixxif batterjoloġiku fil-patata u fit-tadam 1. Sintomi. 2. It-test(ijiet) mgħaġġel ta'l-analiżi. 3. Il-proċedurata' l-iżolament. 4. It-test(ijiet)talkonferma. SEZZJONI III: Determinazzjoni u identifikazzjoni tar-Ralstonia solanacearumf'kampjuni ta' tuberi tal-patata 1. Il-preparazzjonital-kampjun għat-test. 2. It-testta' l-immunoflorexxenza (IF). 3. It-testta' l-ELISA (Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay). 4. It-testtal-PCRTM(Polymerase Chain Reaction). 5. Testgħalkisi selettiv. 6. It-testtal-bioassay. 7. It-testijietta' arrikkiment. 8. Ittesttalpatoġeniċità. Appendiċi 1 Medja nutrittiva għall-iżolament u l-kultura tar-Ralstonia solanacearum. Appendiċi 2 Materjali għall-preparazzjoni tal-kampjun. Appendiċi 3 Materjali għat-test ta' l-IF. Appendiċi 4 Determinazzjoni tal-livell tal-kontaminazzjoni fit-test ta' l-IF. Appendiċi 5 Materjali għat-test ta' l-ELISA. Appendiċi 6 Materjali għat-test tal-PCR. Appendiċi 7 Materjali għat-test(ijiet) tal-kisi u arrikkiment selettiv. Referenzi. 9 9 11 13 13 13 14 14 17 17 18 20 20 22 23 23 23 24 25 26 27 28 29 29 30 03/Vol. 23 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 383 SEZZJONI I APPLIKAZZJONI GĦALL-ISKEMA TAT-TEST 1. Id-dianjosi tat-tħassir kannella fit-tuberi tal-patata u l-inxif batterjoloġiku fil-patata u fit-tadam Il-proċedura tat-test hija intiża għal tuberi tal-patata b’sintomi tipiċi jew suspettużi tat-tħassir kannella u għall-pjanti tal-patata u tat-tadam li jkollhom sintomi tipiċi jew suspettużi ta’ nxif batterjoloġiku. Dan jinvolvi test ta’ l-analiżi ħafifa, l-iżolament tal-patoġenu miċ-ċelloli vaskulari infettati fuq medja diagnostiċi u, fil-każ ta’ riżultat pożittiv, l-identifikazzjoni tal-kultura bħala Ralstonia solanacearum. Preżentazzjoni tal-flow chart 384 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 03/Vol. 23 Referenzi għall-flowchart: (1) Id-deskrizzjoni tas-sintomi hija pprovduta fis-sezzjoni II. 1. (2) Testijiet ta’ analiżi mħaffa li jiffaċilitaw dianjosi preżuntiva. It-testijiet adatti huma: — It-test ta’ l-għażla taċ-ċelloli vaskulari prinċipali (is-sezzjoni II. 2), — It-test għall-gerbubi tal-poly-ß-hydroxybutyrate (is-sezzjoni II. 2), — It-test ta’ l-IF (is-sezzjoni III. 2), — It-test ta’ l-ELISA (is-sezzjoni III. 3), — It-test tal-PCR (is-sezzjoni III. 4). (3) Għalkemm l-iżolament tal-patoġenu mill-materjal tal-pjanta b’sintomi tipiċi bid-diluzzjoni tal-kisi huwa wieħed ċar, il-kultura tista’ tonqos minn stadji avvanzati ta’ l-infezzjoni. Il-batterja saprofitiċi li jikbru fuq ċelluli morda jistgħu jikbru aktar milli suppost jew inkella jinibixxu l-patoġenu fuq il-medja ta’ l-iżolament. Jekk it-test ta’ l-iżolament ikun wieħed negattiv, iżda s-sintomi tal-mard ikunu tipiċi, mela l-iżolament għandu jkun ripetut, preferibbilment b’test ta’ kisi selettiv. (4) L-identifikazzjoni ta’ min jorbot fuqha ta’ kultura pura tar-Ralstonia solanacearum tinkiseb b’minn ta’ l-inqas wieħed mit-testijiet elenkata fis-sezzjoni II. 4. 1 flimkien mat-test tal-patoġeniċità (is-sezzjoni II. 4. 3). Il-karatterizzazzjoni ta’ l-iggruppjar hija diskrezzjonali iżda rakkomandabbli għal kull każ ġdid. 03/Vol. 23 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 385 2. Id-determinazzjoni u l-identifikazzjoni tar-Ralstonia solanacearum f’kampjuni ta’ tuberi tal-patata Il-proċedura hija intiża għad-determinazzjoni ta’ l-infezzjonijiet moħbija fit-tuberi tal-patata permezz ta’ test wieħed jew, preferibbilment, aktar minn wieħed tad-determinazzjoni li, jekk ikunu pożittivi, ikunu kkumplimentati bl-iżolament tal-patoġenu; dawn ikunu segwiti, fil- każ ta’ l-iżolament tal-kolonji tipiċi, mill-identifikazzjoni tal-kultura pura bħala Ralstonia solanacearum. Preżentazzjoni tad-disinn tal-flow-chart 386 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 03/Vol. 23 Referenzi tal-flowchart: (1) t a l - k a m p j u n I l - q i e s Il-qies standard huwa 200 tuberi. B’dana kollu, il-proċedura tista’ tkun applikata konvenjentement għal kampjuni b’inqas minn 200 tuberi. (2) T e s t ( i j i e t ) t a d - d e t e r m i n a z z j o n i Test wieħed jista’ ma jkunx sensittiv jew ta’ min jorbot fuqu biżżejjed biex tinstab ir-Ralstonia solanacearum fil-kampjun. Għalhekk, aktar minn test wieħed huwa rakkomandabbli u dawn it-testijiet għandhom preferibbilment ikunu bbażati fuq prinċipji bioloġiċi differenti. (3) (4) (5) (6) t a ’ l - i m m u n o f l o r e x x e n z a ( I F ) I t - t e s t It-test ta’ l-IF huwa test tad-determinazzjoni stabbilit sew. Dan huwa vantaġġjuż fuq oħrajn li għadhom ma ġewx żviluppati sewwa jew inkella validati. It-test jintuża għal ħafna batterja statutorja oħra, e. g. Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Bil-parametri tal- qari speċifikati b’dan il-metodu, dan it-test isir wieħed sensittiv (b’livell ta’ sensittività ta’ 103-104 ċelloli għal kull ml ta’ tgerbubi ta’ estratt tal-patata). Il-fattur kritiku għas-serħan fuq ir-riżultat tat-test hija l-kwalità ta’ l-antiserum. L-antiserum b’titru għoli biss (minumu ta’ 2000 għall- antiserum mhux maħdum) ikun aċċettabbli u t-testijiet kollha għandhom isiru fit-titru ta’ l-antiserum jew f’diluzzjoni waħda taħt it- titru. Il-metodu indirett huwa aktar preferut. Il-metodu dirett jista’ jkun applikat jekk it-test ikollu livell ta’ sensittività u speċifiċità ekwivalenti għal dak tal-metodu indirett. It-test ta’ l-IF għandu l-vantaġġ ta’ l-interpretazzjoni suġġettiva tal-morfoloġija tal-grupp taċ-ċelloli u ta’ l-intensità tal-florexxenza li jipprovdu l-informazzjoni dwar l-ispeċifiċità tar-reazzjoni. Kontro-reazzjonijiet b’batterji relatati seroloġikament mill-ħamrija jew assoċjati maċ-ċelloli tal-patata b’morfoloġija ta’ ċelloli tar-Ralstonia solanacearum huma komuni. It-test IF jista’ jintuża bħala test ta’ determinazzjoni waħdu għalkemm f’każi meta l-kontro-reazzjonijiet ikunu suspettati għandu jsir test addizzjonali ta’ determinazzjoni bbażat fuq prinċipju bioloġiku differenti. F’każi bħal dawn il-kisi selettiv huwa l-aktar test addattat. s e l e t t i v identifikat mill-ewwel. Għall-esplojtazzjoni sħiħa tal-potenzjal tiegħu, I l - k i s i Bil-medja SMSA modifikata u bil-metodolġija ta’ l-ittestjar speċifikata f’dan il-metodu, dan huwa test sensittiv u selettiv għar-Ralstonia solanacearum. Ir-riżultat ikun disponibbli 3-6 ijem wara t-tħejjija tal-kampjun. Il-patoġenu jinkiseb direttament fil-kultura u jkun jista’ jiġi it-test jeħtieġ preparazzjoni tajba tat-trufijiet biex tkun evitata batterja sekondarja assoċjata mat-tuberu tal-patata li tkun kompetitur mar-Ralstonia solanacearum fuq il-medja u tista’ taffettwa l-iżvilupp tal-patoġenu. Ċerti gruppi jistgħu jikbru b’mod bagħtut hekk kif il-komponenti tal-medja jistgħu jaffettwaw l-organiżmu tal- mira. Hija meħtieġa attenzjoni wkoll biex tkun iddifferenzjata r-Ralstonia solanacearum minn batterji oħra li jistgħu jiżviluppaw fuq il- medja. Il-kisi selettiv jista’ jintuża bħala test tad-determinazzjoni waħdu sakemm f’każi fejn l-inibizzjoni tar-Ralstonia solanacearum minn batterja oħra fuq il-pjanċi tkun issuspettata u r-riżultat negattiv tat-test jinkiseb jekk il-kampjun ikun ittestjat mill-ġdid bl-użu ta’ test differenti biex jikkonferma jew jinnega d-dianjosi. F’każi bħal dawn, it-test IF huwa l-iktar test addattat. t a ’ l - E L I S A I t - t e s t It-test ta’ l-ELISA huwa ġeneralment inqas sensittiv mill-IF (b’livell ta’ sensittivita ta’ 104-105 ċelloli għal kull ml ta’ gerbubi ta’ l-estratt tal-patata). It-test huwa rħis u mgħaġġel iżda ġeneralment aktar vulnerabbli għal riżultati pożittivi (kontro-reazzjonijiet) u negattivi (inibizzjoni permezz ta’ molekuli fenoliċi fl-estratt tal-patata) foloz. Il-kriterji għall-ispeċifiċità ta’ l-antiserum huma għoljin ħafna. It- test ELISA ma jistax jintuża waħdu bħala test tad-determinazzjoni. t a l - P C R I t - t e s t Il-PCR għandu potenzjal għal determinazzjoni sensittiva ħafna għalkemm it-test huwa inibit minnufih mill-komponenti ta’ l-estratt tal- pjanta jew tat-tuberu li jagħti riżultati negattivi foloz. Ċertu speċi ta’ patata li jeżistu b’mod naturali ikollhom aktar inibituri minn oħrajn. Huwa għalhekk meħtieġ li jitneħħew dawn l-inibituri. L-inibizzjoni tista’ titnaqqas bid-diluzzjoni, iżda l-popolazzjonijiet tar- Ralstonia solanacearum huma wkoll dilwiti. Għandha tingħata attenzjoni kbira fl-istadji kollha tat-tħejjija u ta’ l-ittestjar tal-kampjun jiġu mill- biex tkun evitata kontaminazzjoni omoloġija sekwenzjali ta’ determinazzjoni. li tista’ twassal għal riżultati pożittivi foloz. Riżultati pożittivi foloz jistgħu wkoll il-PCR dirett ma jistax jintuża waħdu bħala test l-oħrajn. Għal dawn ir-raġunijiet l-organiżmi ta’ (7) T e s t t a ’ l - a r r i k k i m e n t L-inkubazzjoni tal-kampjuni tal-gerbubi ta’ l-estratt tal-patata fi brodu semi-selettiv, bħalma hu dak tal-SMSA immodifikat, tippermetti l-multiplikazzjoni tar-Ralstonia solanacearum. Aktar importanti x’aktarx, dan jiddiljutja inibituri potenzjali tat-test ELISA jew PCR. Ralstonia solanacearum fi brodu ta’ l-arrikkiment tista’ għalhekk tkun iddeterminata bl-IF, ELISA u l-PCR. Aħna ma nirrakkomandawx li l-kisi dirett isir minn brodu arrikkit. Dawn il-metodi ta’ l-arrikkiment ma ġewx ippruvati u ttestjati kompletament. Dawn ġew inklużi hawn għaliex għandhom potenzjal tajjeb. Iżda, minħabba n-nuqqas relattiv ta’ l-esperjenza dwarhom, dawn ma jistgħux jintużaw weħidhom bħala metodi ta’ determinazzjoni. (8) t a l - b i o a s s a y I t - t e s t It-test tal-bioassay jintuża għall-iżolament tar-Ralstonia solanacearum minn gerbubi ta’ l-arrikkiment selettiv fi pjanta ospitanti u jista’ jsir fuq il-pjanti tat-tadam jew tal-brunġiel. It-test jeħtieġ kondizzjonijiet tajbin ta’ l-inkubazzjoni kif speċifikat f’dan il-metodu. Batterji li huma inibitorji għar-Ralstonia solanacearum fuq il-medja ta’ l-SMSA probabbilment ma joħolqu l- ebda interferenza f’dan it-test. l-estratt tal-patata permezz ta’ (9) T e s t ( i j i e t ) t a ’ k o n f e r m a L-identifikazzjoni ta’ min jorbot fuqha ta’ kultura pura tar-Ralstonia solanacearum tinkiseb permezz ta’ wieħed mit-testijiet elenkati fis- iżda II. 4. 3. ). sezzjoni rakkomandabbli għal kull każ ġdid. II. 4. 1. flimkien ma’ test ta’ patoġeniċità (is-sezzjoni l-igruppjar hija diskrezzjonali Il-karatterizzazzjoni ta’ 03/Vol. 23 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 387 SEZZJONI II DIANJOSI TAT-TAĦSIR KANNELLA FIT-TUBERI TAL-PATATA U TA’ L-INXIF BATTERJOLOĠIKU FIL-PJANTI TAL-PATATA U TAT-TADAM 1. 1. 1. Is-sintomi I s - s i n t o m i f i l - p a t a t a Il-pjanta tal-patata. L-ewwel stadju ta’ l-infezzjoni huwa l-inxif tal-weraq lejn in-naħa ta’ fuq tal-pjanta f’temperaturi għoljin matul il-jum isir irriversibbli u jikkawża l-mewt tal-pjanta. Iċ-ċelloli vaskulari fi zkuk maqtugħa b’riakkwist matul il-lejl. L-inxif, b’mod mgħaġġel, trasversalment minn pjanti mnixxfa jistgħu jsiru kannella u tnixxija qiesha ħalib toħroġ minn ġol-wiċċ maqtugħ jew tista’ tkun faċilment espressa jekk din tkun mgħaffġa. Meta z-zokk maqtugħ jitpoġġa vertikalment fl-ilma, ħjut ta’ materja tat-tgħakkir joħorġu minn ġo l- għoqod vaskulari. It-tuberu tal-patata. It-tuberi tal-patata għandhom jinqatgħu trasversalment qrib it-tarf ta’ l- infezzjoni jikkonsisti f’nuqqas ta’ kulur isfar ileqq għal kannella ċar tad-dawra vaskulari li minnha toħroġ tnixxija qisha krema safranija b’mod spontanju wara ftit minuti jew meta tkun applikata pressjoni ġentili bis-swaba fuq il-qoxra ħdejn il-wiċċ maqtugħ. Aktar tard, in- nuqqas ta’ kulur vaskulari jsir kannella aktar distint u n-nekrosi tista’ testendi fiċ-ċelloli parenkimatiċi. Fi stadji avvanzati, l-infezzjoni toħroġ ’il barra mit-tarf ta’ l-għarqub u l-għajnejn li jistgħu jirriżultaw fi ħsarat kemmxejn fondi ta’ lewn ħamrani-kannella fuq ir-rita li minnha tista’ tnixxi l-batterja, u li allura tikkawża l-partiċelli tal-ħamrija biex dawn jeħlu magħha. l-għarqub (= stolon). L-ewwel stadju ta’ 1. 2. S i n t o m i f i l - ħ a m r i j a Il-pjanta tad-tadama. L-ewwel sintomu li jidher hija d-dehra midbiela ta’ l-iżgħar weraq. Permezz ta’ kondizzjonijiet ambjentali favorevoli għall-patoġenu (bit-temperatura tal-ħamrija tkun madwar 25 °C b’umdità saturata), it-tgħawwiġ u l-inxif ta’ ġenb wieħed jew tal-pjanta sħiħa jkomplu fi ftit ġranet li jwasslu biex il-pjanta sħiħa tispiċċa. Permezz ta’ kondizzjonijiet inqas favorevoli (bit-temperatura tal-ħamrija tkun taħt il-21 °C) numru kbir ta’ għeruq barranin jistgħu jiżviluppaw fuq iz-zokk. Huwa possibbli li jkun osservat kurdun pjuttost idellek tul iz-zokk li dan ikun xiehda tan-nekrosi fis-sistema vaskulari. Meta z-zokk jinqata’ trasversalment iċ-ċelloli vaskulari taz-zokk, li jkunu ta’ lewn kannella mitfi, joħorġu taqtiriet ta’ tnixxija bajda jew safra ta’ batterji. 2. It-testijiet ta’ l-analiżi rapida It-testijiet ta’ l-analiżi rapida jiffaċilitaw dianjosi preżuntiva. Uża wieħed jew aktar mit-testijiet li ġejjin: It-test tat-tixqieq taz-zokk Il-preżenza tar-Ralstonia solanacearum fiz-zkuk tal-patata u tat-tadam li qed jinxfu tista’ tkun evalwata permezz tat-test preżuntiv u sempliċi li ġej: Aqta’ z-zokk eżattament mal-livell tal-ħamrija. Poġġi l-wiċċ maqtugħ f’reċipjent mimli bl-ilma. Ftit wara, ħjut ta’ materja batterjali toħroġ spontanjament mill-għoqod vaskulari. Kwalunkwe batterja oħra li tikkawża infezzjoni batterjali fil-pjanti tal-patata u tat-tadam ma turix dan il-fenomenu. L-identifikazzjoni tal-granuli tal-poly-ß-hydroxybutyrate (PHB) Il-granuli tal-PHB fiċ-ċelloli tar-Ralstonia solanacearum ikunu jidhru bl-ikkulurir ta’ l-ikħal tan-Nile A, jew bl-iswed tas-Sudan B. Jew tipprepara kampjun tat-tnixxija jew taċ-ċellola sospiża fuq ħġieġa tal-mikroskopju jew inkella tipprepara kampjun ta’ kultura ta’ 48 siegħa fuq il-YPGA jew l-SPA (l-Appendiċi 1). Ipprepara kampjuni ta’ kontroll pożittiv tal-grupp biovar2/razza 3 u, jekk ikun kkunsidrat meħtieġ, kampjun ta’ kontroll negattiv ta’ grupp eterologu. Ħalli jinxef. Għaddi l-wiċċ ta’ taħt tal-ħġieġa diversi drabi malajr minn ġo fjamma sakemm il-kampjun isir fiss. I t - t e s t t a ’ l - i k ħ a l t a n - N i l e (1) Għarraq il-kampjun fiss b’1 % ta’ soluzzjoni b’soluzzjoni akweja ta’ l-ikħal tan-Nile A. Inkuba għal 10 minuti f’temperatura ta’ 55 °C. (2) Nixxef kompletament is-soluzzjoni tat-trattament. Laħlaħ bil-mod taħt ilma ġieri tal-vit. Neħħi l-ilma żejjed b’karta strazza. (3) Għarraq il-kampjun bi 8 % ta’ aċidu aċetiku mħallat bl-ilma. Inkuba għal minuta f’temperatura ambjentali. (4) Laħlaħ bil-mod taħt ilma ġieri tal-vit. Nixxef fuq karta strazza. (5) Erġa’ xarrab b’qatra ilma. Għatti bi ħġieġa bħala għatu. (6) Eżamina l-kampjun trattat b’mikroskopju epiflorexxenti f’450 nm taħt immersjoni ta’ żejt b’magnifikazzjoni ta’ 1 000. Osserva għal florexxenza ta’ lewn oranġjo ċar ta’ granuli tal-PHB. Osserva wkoll taħt dawl normali biex tassigura li l-granuli jkunu intraċellulari u l-morfoloġija taċ-ċellola tkun tipika tar-Ralstonia solanacearum. 388 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 03/Vol. 23 I t - t e s t t a ’ l - i s w e d t a s - S u d a n (1) Għarraq il-kampjun fiss b’0,3 % ta’ soluzzjoni ta’ iswed tas-Sudan B fi 70 % ethanol. Inkuba għal 10 minuti f’temperatura ambjentali. (2) Nixxef is-soluzzjoni tat-trattament. Laħlaħ ftit fl-ilma tal-vit. Neħħi l-ilma żejjed. Neħħi l-ilma żejjed b’karta strazza. (3) Għaddas ftit il-kampjun fil-xylol. Ħalli jinxef fuq karta strazza. Attenzjoni! Xylol huwa prodott perikoluż. Aħdem f’kabinett tad-duħħan. (4) Għarraq il-kampjun bi 0,5 % (w/v) ta’ safranin akweju u ħalli għal 10 sekondi f’temepratura ambjentali. Attenzjoni! Is-Safranin huwa prodott perikoluż. Aħdem f’kabinett tad-duħħan. (5) Laħlaħ bil-mod taħt l-ilma ġieri tal-vit. Ħalli jinxef fuq karta strazza. Agħmel l-għatu tal-ħġieġ. (6) Eżamina l-kampjun trattat b’mikroskopju tad-dawl li juża dawl trasmess taħt immersjoni ta’ żejt b’magnifikazzjoni ta’ 1 000. Il-granuli tal-PHB fiċ-ċelloli tar-Ralstonia solanacearum ikunu ikħal-suwed. Il-ħajt taċ-ċelloli jkollu tbajja’ roża. T e s t i j i e t o ħ r a j n Testijiet oħra ta’ l-analiżi li huma addattati huma t-test IF (is-sezzjoni III. 2), it-test ELISA (is-sezzjoni III. 3) u t-test PCR (is-sezzjoni III. 4). 3. 3. 1 3. 2 3. 3 3. 4 Proċedura ta’ l-iżolament Neħħi tnixxijiet jew sezzjonijiet taċ-ċellola mingħajr lewn mid-dawra vaskulari fit-tuberu tal-patata jew mill-ispag vaskulari fiz-zokk tal- pjanti tal-patata u tat-tadam. Żomm f’volum żgħir ta’ ilma distillat sterili jew f’50 mM ta’ fosfatiku bħala barriera. Ħalli għal bejn 5-10 minuti fuq il-bank. Ipprepara serje ta’ dilwizzjonijiet deċimali tas-sospensjoni, e. g. 1/10 u 1/100 jew aktar skond kif ikun ikkunsidrat xieraq. Ittrasferixxi volum standard tas-sospensjoni u d-dilwizzjonijiet għal fuq medja nutrittiva ġenerali (NA, YPGA u SPA, l-Appendiċi 1) u/jew għal fuq il-medja Kelman’s tetrazolium (l-Appendiċi 1) u/jew għal fuq il-medja selettiva SMSA (l-Appendiċi 7). Ifrex jew immarka b’teknika adatta tal-kisi tad-dilwizzjoni. Jekk ikun ikkunsidrat meħtieġ, ipprepara pjanċi separati ta’ kull medja użata b’kultura ta’ sospensjoni ta’ ċellola dilwita ta’ grupp infettiv ħafna ta’ biovar 2/silta 3 tar-Ralstonia solanacearum bħala kontroll pożittiv. Inkuba l-pjanċi għal tlett ijiem f’temperatura ta’ 28 °C. L-inkubazzjoni tista’ tieħu sa sitt ijiem jekk it-tkabbir ikun bil-mod, iżda l-kolonji tal-pjanċi tal-SMSA ħafna drabi jsiru atipiċi u jmutu. Fuq il-medja ta’ nutrijient ġenerali, fdalijiet infettivi tar-Ralstonia solanacearum jiżviluppaw kolonji jagħtu fil-lewn bajdani, ċatti, irregolari u fluwidali, ħafna drabi b’sepali karatteristiċi. Fuq il-medja Kelman’s tetrazolium, kolonji tipiċi ta’ fdalijiet infettivi tar-Ralstonia solanacearum ikunu kremużi, ċatti, irregolari u fluwidali b’sepali ħamranin lewn id-demm, fin-nofs. Forom infettivi tar-Ralstonia solanacearum jiżviluppaw kolonji li għandhom is-sura ta’ butir u jkunu ħomor ħafna. Fuq il-medja SMSA, kolonji tipiċi ta’ fdalijiet infettivi tar-Ralstonia solanacearum ikunu bojod ħalib, ċatti, irregolari u fluwidali b’kolorazzjoni ħamranija lewn id-demm, fiċ-ċentru. Forom infettivi tar-Ralstonia solanacearum jiżviluppaw kolonji inqas fluwidali li jkunu kompletament bejn ir-roża u l-aħmar fuq il-medja ta’ l-SMSA. 3. 5 Ippurifika l-kolonji li jkollhom morfolġija karatteristika b’sub-kultura fuq medja ta’ nutrijent ġenerali. Evita s-sub-kulturament regolari li jista’ jwassal għal telf fl-infettività. 4. Test(ijiet) ta’ konferma 4. 1. L-identifikazzjoni tar-Ralstonia solanacearum Identifika kulturi puri tar-Ralstonia solanacearum permezz ta’ waħda minn dawn il-proċeduri: T e s t i j i e t n u t r i t t i v i u e n ż i m a t i ċ i Nota: Inkludi gruppi ta’ kontroll addattati f’kull test użat. 03/Vol. 23 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 389 Lewnijiet florexxenti Inklużjonijiet PHB Test ta’ l-ossidazzjoni/fermentazzjoni (O/F) - + O+/F- Katalasi Kovac’s oxidase Tnaqqis tan-nitrat Utilizzar taċ-ċitrat Tkabbir f’40 Code en erreur: 8eJC Tkabbir f’1 % NaCl Tkabbir fi 2 % NaCl Arginine dihydrolase Likwifikazzjoni tal-ġelatina Idroliżi tal-lamtu Idroliżi ta’ l-aesulina Produzzjoni tal-levan + + + + - + - - - - - - Medja u metodi li hemm provvediment dwarhom fil-Lelliott & Stead (1987) I t - t e s t I F Ipprepara sospensjoni ta’ 106 ċelloli għal kull ml mill-kultura u l-grupp(i) ta’ kontroll. Ipprepara serje u dilwizzjonijiet doppji ta’ antiserum. Applika l-proċedura IF (is-sezzjoni III. 2). It-titru ta’ l-IF tal-kultura għandu jkun ekwivalenti għal dak tal-kontroll pożittiv. l- I t - t e s t E L I S A Ipprepara sospensjoni ta’ >106 ċelloli għal kull ml mill-kultura u l-grupp(i) ta’ kontroll. Applika l-proċedura ta’ l-ELISA (is-sezzjoni III. 3). Il- valur ta’ l-ELISA tal-kultura għandu jkun ekwivalenti għal dak tal-kontroll pożittiv. I t - t e s t P C R Ipprepara sospensjoni ta’ 106 ċelloli għal kull ml mill-kultura u l-grupp(i) ta’ kontroll. Applika l-proċedura tal-PCR (is-sezzjoni III. 4). Il- prodott tal-PCR tal-kultura għandu jkollu l-istess qies u ristrettiv ta’ l-analiżi ta’ l-enżimi ristrettiva (REA) bħal dak tal-kontroll pożittiv. I b r i d a z z j o n i f l o r e x x e n t i i n - s i t u ( F I S H ) Ipprepara sospensjoni ta’ 106 ċelloli għal kull ml mill-kultura u l-grupp(i) ta’ kontroll. Applika l-proċedura FISH (van Beuningen et al, 1995) bil-primer OLI-1 PCR (Seal et al, 1993). Il-kultura għandha turi l-istess reazzjoni bħall-kontroll pożittiv. I l - p r o f i l i k a r t a l - p r o t e i n a Ċelloli sħaħ denaturati ta’ protejina jiġu separati bil-polyacrylamide gel electrophoresis - PAGE (Stead, 1992a). I l - p r o f i l i k a r t a ’ l - a ċ i d u x a ħ m i ( F A P ) Kabbar il-kultura u l-grupp ta’ kontroll pożittiv għal 48 siegħa f’temperatura ta’ 28 °C fuq trypticase soy agar u applika l-proċedura tal-FAP (Janse, 1991; Stead, 1992a; Stead, 1992b). Il-profil tal-kultura għandu jkun identiku għal dak tal-kontroll pożittiv. Taħt il-kondizzjonijiet speċifikati, l-aċidi xaħmija karatteristiċi jkunu 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH u 18:1 2OH. 4. 2. Karatterizzazzjoni tal-grupp Il-karatterizzazzjoni tal-grupp hija diskrezzjonali iżda rakkomandabbli għal kull każ ġdid li juża minn ta’ linqas wieħed minn dawn li ġejjin:- 390 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 03/Vol. 23 I d - d e t e r m i n a z z j o n i t a l - b i o v a r Utilizzazzjoni ta’: — maltosju — laktosju — ċellobiosju — mannitol — sorbitol — dulċitol Utilizzazzjoni ta’ trehalose Utilizzazzjoni ta’ inositol Utilizzazzjoni ta’ D-ribose Attività pektolitika I d - d e t e r m i n a z z j o n i t a r - r a z z a Reazzjoni fil-: — pjanti tat-tadam/brinġiel — Pjanti tat-tabakk — Weraq tat-tabakk 1 - - - - - - 2 + + + - - - Biovar 3 + + + + + + 4 - - - + + + 5 + + + + - - biovar 2 biovar 2-A biovar 2-T - + - baxxa 1 titbiel titbiel nekrosi(48 siegħa) utit- biel (7—8 ijiem) + - - baxxa Razza (1) 2 + + + għolja 3 l-ebda reazzjoni l-ebda reazzjoni HR (12—24 siegħa) titbiel l-ebda reazzjoni klorożi (2—8 ijiem) (1) Ir-razza 4 (patoġeniċità fuq il-ġinġer u ftit ospitanti oħra) u r-razza 5 (patoġeniċità fuq iċ-ċawsli biss) mhumiex inklużi. Il-karatterizzazzjoni tar-razza bit-test tal-patoġeniċità jew b’dak ta’ fuqhom u għalhekk din tista’ tkun dedotta mill-biovar u l-ospitanti naturali ta’ l-oriġini. l-ipersensittività tat-tabakk jistgħu ma jkunux wisq ta’ min jorbot Il-kultura tista’ tkun ukoll karatterizzata bil-: I t - t e ħ i d t a ’ f i n g e r p r i n t i n g ġ e n o m i k u Id-divrenzazzjoni molekulari tal-gruppi fil-kumpless Ralstonia solanacearum tista’ ssir bil-: l-analiżi RFLP (Cook et al, 1989) Sekwenza repetittiva tal-PCR REP-, ERIC- & BOX-PCR (Louws et al, 1995; Smith et al, 1995) 4. 3. It-test tal-patoġeniċità Dan it-test huwa għall-konferma tad-dianjosi tar-Ralstonia solanacearum u għall-estimi ta’ l-infettività tal-kulturi identifikati bħala Ralstonia solanacearum. Ipprepara inokulu ta’ 106 ċelloli għal kull ml mill-kultura u mis-siltiet ta’ kontroll pożittiv. Inokula 5-10 pjanti tat-tadam jew tal-brinġiel li preferibbilment ikunu fit-tielet stadju ġenwin tal-werqa jew aktar qodma (is-sezzjoni III, 6. ). Inkuba għal ġimagħtejn f’temperatura ta’ 22 °C-28 °C u f’umdità relattivament għolja billi xxarrabhom kuljum. Osserva għal xi titbil u/jew tidwir, klorożi, nuqqas ta’ żvilupp. Iżola mill-pjanti sintomatiċi kif ġej: — Neħħi sezzjoni taċ-ċelloli miz-zokk 2 ċm ’il fuq mill-punt ta’ l-inokulazzjoni. — Farrak u ssospendi f’volum żgħir ta’ ilma distillat sterili jew f’50 mm ta’ fosfatiku bħala barriera. Imbagħad poġġi fuq pjanċa, inkuba, u ċċekkja għal kolonji tipiċi tar-Ralstonia solanacearum. 03/Vol. 23 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 391 ID-DETERMINAZZJONI U L-IDENTIFIKAZZJONI TAR-RALSTONIA SOLANACEARUM F’KAMPJUNI TAT-TUBERI TAL-PATATA Nota: Il-qies standard tal-kampjun huwa ta’ 200 tuberu. Iżda, il-proċedura tista’ tkun applikata konvenjentement għal kampjuni b’inqas minn 200 tuberu. SEZZJONI III 1. Il-preparazzjoni tal-kampjun għat-test Nota: Il-gerbubi ta’ l-estratt tal-patata li jinkiseb b’din il-proċedura jista’ jintuża wkoll għad-determinazzjoni tal-Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Għażliet ta’ qabel it-test jekk ikunu kkunsidrati bħala ta’ użu: (i) Inkuba l-kampjun f’temperatura ta’ bejn il-25-30 °C għal ġimgħatejn biex tinkoraġġixxi l-multiplikazzjoni tal-popolazzjonijiet baxxi tar-Ralstonia solanacearum. (ii) Aħsel it-tuberi taħt l-ilma ġieri b’diżinfettanti u deterġenti addattati. Nixxef it-tuberi fl-arja. Neħħi bi skalpell jew sikkina tal-ħaxix nodfa u ddiżinfettati, il-ġilda tat-tarf ta’ l-għarqub tat-tuberu biex iċ-ċelloli vaskulari jkunu jidhru. B’attenzjoni aqta’ biċċa qalba konikali żgħira (b’dijametru ta’ 3-5 mm) taċ-ċellola vaskulari fit-tarf ta’ l-għarqub. Żomm l-ammont taċ- ċellola mhux-vaskulari kemm jista’ jkun fl-iżgħar limitu possibbli. Ipproċessa kull wieħed mit-tuberi fil-kampjun. Nota: Eżami viżwali tat-tuberi (is-Sezzjoni II. 1) jista’ jsir f’dan l-istadju. Warrab kwalunkwe tuberu b’sintomi jew taħsir sever u ttestja separatament (is-sezzjoni II). Iġbor t-truf tal-għarqub f’kontenitur magħluq. Preferibilment, it-trufijiet ta’ l-għarqub għandhom ikunu pproċessati mill-ewwel. Jekk dan ma jkunx possibbli, aħżinhom għal mhux aktar minn 24 siegħa jew, f’temperatura ta’ 4 °C, għal mhux aktar minn 72 siegħa. Ipproċessa t-truf ta’ l-għarqub b’waħda minn dawn il-proċeduri: (i) Ittrasferixxi t-truf ta’ l-għarqub f’kontenitur addattat. Żid volum suffiċjenti ta’ barriera ta’ maċerazzjoni (l-Appendiċi 2) biex tgħatti t-truf ta’ l-għarqub. Farrak it-truf ta’ kompleta. Evita l-omoġenizzazzjoni eċċessiva. l-għarqub f’Waring Blender jew permezz ta’ Ultra Thurrax sakemm tkun għadha kif inkisbet l-omoġenizzazzjoni 1. 1 1. 2 1. 3 Ħalli l-maċerat jgħum għal 15-30-il minuta. (ii) Ittrasferixxi t-truf ta’ l-għarqub f’kontenitur addattat. Żid volum suffiċjenti ta’ barriera ta’ maċerazzjoni biex tgħatti t-truf ta’ l-għarqub. Poġġi l-kontenitur fuq rotary shaker. Inkuba għal bejn 50-100 rpm għal 4 sigħat f’temperatura ta’ 20 °C-22 °C jew bejn 16-24 siegħa f’4 °C. (iii) Ittrasferixxi t-truf ta’ l-għarqub f’borża ta’ maċerazzjoni b’saħħitha u li tużaha darba biss (e. g. borża tat-tip Stomacher b’qisien 105 mm × 150 mm, radjazzjoni sterili). Farrak it-truf ta’ l-għarqub b’attenzjoni b’għodda addatta, e. ż. martell, sakemm tinkiseb l-omoġenizzazzjoni kompleta. Żid volum suffiċjenti ta’ barriera ta’ maċerazzjoni biex tgħatti t-truf ta’ l-għarqub. Ħalli l-maċerat joqgħod għal 15-30-il minuta. 1. 4 Estratta l-batterji mit-truf ta’ l-għarqub ipproċessati b’waħda minn dawn il-proċeduri li ġejjin: (i) Ferragħ il-maċerat bil-mod f’tubu ta’ ċentrifugu waqt li tħalli l-fdalijiet f’kontenitur jew f’borża. imsaħħab, iċċentrifuga f’mhux aktar minn 180 g għal 10 minuti f’temperatura taħt il-10 °C. Jekk il-maċerat imferragħ ikun Iċċentrifuga l-maċerat imferragħ, jew is-supernatant mill-ewwel stadju taċ-ċentifugazzjoni, f’7 000 g għal 15-il minuta jew f’10 000 g għal 10 minuti f’temperatura taħt il-10 °C. Armi s-supernatant mingħajr ma tiddisturba l-gerbubi. (ii) Iffiltra l-maċerat permezz ta’ sistema ta’ filtrazzjoni b’qies ta’ pori ta’ 40-100µm. Qawwi l-filtrazzjoni bl-użu ta’ pompa tal-vakum. Iġbor il-filtrat f’tubu ta’ ċentrifugu. Aħsel il-filtru bil-barriera tal-maċerazzjoni. Iċċentrifuga l-filtrat f’7 000 g għal 15-il minuta jew f’10 000 g għal 10 minuti f’temperatura taħt l-10 °C. Warrab is-supernatant mingħajr ma tiddisturba l-gerbubi. 392 1. 5 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 03/Vol. 23 Issospendi għal darb’oħra l-gerbubi fil-barriera tal-gerbubi ta’ 1 ml (l-Appendiċi 2). Aqsam f’żewġ partijiet egwali u ttrasferixxi kull parti għal ġo ċilindru żgħir tal-ħġieġ. Uża ċilindru żgħir tal-ħġieġ wieħed għall-ittestjar. Ikkonserva l-bqija ta’ l-estratt f’temperatura ta’ 4 °C matul it-test. Żid 10-25 % (v/v) ta’ gliċerol sterili mal-mini-ċilindru l-ieħor. Vortex. Aħżen f’temperatura ta’ - 18 °C (ġimgħat) jew f’temperatura ta’ - 70 °C (xhur). 2. It-test IF Uża l-antiserum għar-Ralstonia solanacearum, preferibbilment għal razza 3/biovar 2. Stabbilixxi t-titru fuq sospensjoni ta’ 106 ċelloli għal kull ml mill-grupp omoloġeju tar-Ralstonia solanacearum b’diluzzjoni addattata tal-konjugat skond ir- rakkomandazzjonijiet tal-fabbrikant. L-antiserum mhux misjur għandu jkollu titru ta’ IF ta’ mill-inqas 1:2000. l-isothiocyanate (FITC), ta’ Uża multiwell slides tal-mikroskopju preferibbilment b’10 twieqi ta’ mill-inqas 6 mm ta’ dijametru. Inkludi kontroll ta’ konjugat tal-FITC fuq kull ħġieġa tat-test. It-test għandu jiġi ripetut b’kontroll ta’ PBS inkluż jekk xi ċellola pożittiva tkun ġiet osservata fil-kontroll FITC. Ipprepara l-ħġieġ tal-kontroll pożittiv separati b’sospensjoni ta’ 106 ċelloli għal kull ml minn grupp tar-razza/biovar addattata tar-Ralstonia solanacearum. Uża ħġieġa waħda f’kull sett ta’ testijiet. 2. 1 Ipprepara l-ħġieġ tat-test b’waħda minn dawn il-proċeduri li ġejjin: (i) għal gerbubi bi ftit lamtu relattiv: 2. 2 2. 3 Bil-pipetta kejjel volum standard (15 µl huwa adatt għal tieqa b’dijametru ta’ 6 mm - żid il-volum għal twieqi akbar) tal-gerbubi sospiżi mill-ġdid fuq filliera ta’ twieqi. Il-filliera li jibqa’ tista’ tintuża bħala duplikat jew għat-tieni kampjun kif ippreżentat fil-Figura 1. (ii) Għal gerbubi l-oħrajn: Ipprepara diluzzjonijiet deċimali, viz. 1/10, 1/100 u 1/1000 tal-gerbubi sospiżi mill-ġdid fil-barriera tal-gerbubi. Bil-pipetta kejjel volum standard (15 µl huwa suffiċjenti għal tieqa b’dijametru ta’ 6 mm - żid il-volum għal twieqi akbar) tal-gerbubi sospiżi mill-ġdid u kull diluzzjoni fuq filliera ta’ twieqi. Il-filliera li jifdal tista’ tintuża bħala duplikat jew għal tieni kampjun kif ippreżentat fil-Figura 2. Ħalli l-qtar jinxfu. Waħħal iċ-ċelloli tal-batterja mal-ħġieġa jew bis-sħana, jew fuq fjamma jew ma’ 95 % ethanol. Il-proċedura IF (i) Skond il-preparazzjoni tal-ħġieġa tat-test fi 2. 1 (i): Ipprepara sett ta’ diluzzjonijiet doppji ta’ l-antiserum fil-barriera IF (l-Appendiċi 3): ¼ tat-titru (T/4), ½ tat-tiru (T/2), it-titru (T) u d-doppju tat-tritu (2T). (ii) Skond il-preparazzjoni tal-ħġieġa tat-test fi 2. 1 (ii): Ipprepara d-diluzzjoni tat-tħaddim (WD) ta’ speċifiċità u normalment tkun in-nofs tat-titru. l-antiserum fil-barriera IF. Id-diluzzjoni tat-tħaddim hija dik ta’ l-antiserum bl-aħjar Figura 1 Preparazzjoni tal-ħġieġa tat-test skond il-2. 1 (i) u 2. 3 (i) 03/Vol. 23 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 393 Figura 2 Preparazzjoni tal-ħġieġa tat-test skond il-2. 1 (ii) u 2. 3 (ii) 2. 3. 1 Irranġa l-ħġieġ fuq karta strazza mxarrba. Għatti t-twieqi tat-test bid-diluzzjoni(jiet) ta’ l-antiserum. Applika l-PBS fuq it-twieqi tal-FITC. Il-volum ta’ l-antiserum applikat fuq it-twieqi għandu jkun ekwivalenti għall-volum ta’ l-estratt applikat. Inkuba taħt għatu għal 30 minuta f’temperatura ambjentali. Ħawwad il-qtar ta’ l-antiserum lil hinn mil-ħġieġa u laħlaħ il-ħġieġ b’attenzjoni bil-barriera tal-IF. Aħsel għal ħames minuti fil-IF barriera- Tween u wara għal ħames minuti fil-barriera ta’ l-IF (l-Appendiċi 3). Neħħi b’attenzjoni l-umdità żejda. Irranġa l-ħġieġ fuq karta strazza niedja. Għatti t-twieqi tat-test u t-tieqa tal-FITC bid-diluzzjoni tal-konjugat tal-FITC użat sabiex jistabbilixxi t-titru. Il-volum tal-konjugat applikat fuq it-twieqi għandu jkun identiku għall-volum ta’ l-antiserum applikat. Inkuba taħt għatu għal 30 minuta f’temperatura ambjentali. Ħawwad il-qtar tal-konjugat lil hinn mil-ħġieġa. Laħlaħ u aħsel bħal qabel (2. 3. 3). Neħħi b’attenzjoni l-umdità żejda. Bil-pipetta itfa’ 5-10 µl 0,1 M ta’ fosfat tal-gliċerina bil-barriera (phosphate-buffered glycerol) (l-Appendiċi 3) jew montant ieħor fuq kull tieqa u applika l-ħġieġa ta’ l-għatu. 2. 3. 2 2. 3. 3 2. 3. 4 2. 3. 5 2. 3. 6 2. 3. 7 2. 4 Il-qari tat-test IF Eżamina l-ħġieġ tat-test b’magnifikazzjoni ta’ bejn 500-1000. Skannja t-twieqi tul żewġ dijametri f’angoli perpendikulari u madwar il-perimetru. taħt mikroskopju epiflorexxenti b’filtri addatti għall-eċċitazzjoni l-FITC, taħt ta’ immersjoni taż-żejt Ivverifika l-ewwel ħġieġa ta’ kontroll pożittiv. Iċ-ċelloli għandhom ikunu ċari u florexxenti u kompletament imtabbgħin. Nota: It-test għandu jkun ripetut jekk it-tbajja’ jkunu jiddefferixxu mit-tip normali. Aqra l-ħġieġ tat-test. L-ewwel osserva għal xi nuqqas taċ-ċelloli ta’ florexxenza fit-twieqi tal-kontroll ta’ l-FITC. Iċ-ċelloli florexxenti fil- kontroll ta’ l-FITC jindikaw irbit mhux speċifiku tal-konjugat, awtoflorexxenza jew kontaminazzjoni: Nota: Irrepeti t-test jekk ikun osservat dan. Osserva għal ċelloli ċari florexxenti b’morfoloġija karatteristika tar-Ralstonia solanacearum fit-twieqi tat-test. L-intensità tal-florexxenza għandha tkun ekwivalenti għall-grupp ta’ kontroll pożittiv fl-istess diluzzjoni ta’ l-antiserum. Ċelloli bi tbajja’ mhux kompluti jew bi florexxenza dgħajfa għandhom jiġu skartati, kemm-il darba jkun hemm ħafna ċelloli (ara l-interpretazzjoni tar-riżultat tat-test IF). L-interpretazzjoni tar-riżultat tat-test IF: (i) Jekk ma jinstabux ċelloli ċari florexxenti b’morfoloġija karatteristika, mela t-test IF huwa wieħed negattiv. (ii) Jekk jinstabu ċelloli ċari u florexxenti b’morfoloġija karatteristika, mela stabbilixxi n-numru medju ta’ ċelloli għal kull qasam tal- mikroskopju u kkalkola n-numru ta’ ċelloli (N) għal kull ml ta’ gerbubi sospiżi mill-ġdid (l-Appendiċi 4). Popolazzjoni ta’ madwar 103 ċelloli għal kull ml ta’ gerbubi sospiżi mill-ġdid huwa kkunsidrat bħala l-limitu ta’ sejbien għat-test IF, — għal kampjuni b’N > 103 ċelloli għal kull ml ta’ gerbubi sospiżi mill-ġdid, it-test IF huwa meqjus bħala pożittiv, — għal kampjuni b’N > 103 ċelloli għal kull ml ta’ gerbubi sospiżi mill-ġdid, it-test IF jista’ jkun meqjus bħala pożittiv. 394 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 03/Vol. 23 (iii) Jekk numru kbir (> 105 ċelloli għal kull ml) ta’ ċelloli florexxenti mhux kompleti jew dgħajfa jkunu jidhru fit-titru ta’ l-antiserum, għandu jsir it-tieni test: — jew test ibbażat fuq prinċipju bioloġiku differenti, jew — jiġi ripetut it-test IF, jew bit-tieni antiserum jew b’diluzzjoni għaxar darbiet aktar tal-biċċiet żgħar. 3. It-test ELISA Ibbażat fuq Robinson-Smith et al. , 1995 Uża l-antiserum għar-Ralstonia solanacearum, preferibbilment għar-razza 3/biovar 2. Stabbilixxi t-titru fuq sospensjoni ta’ 106 cells għal kull ml minn grupp omoloġeju tar-Ralstonia solanacearum. L-użu tal-pjanċi NUNC-Polysorb microtitre huwa rakkomandat. Inkludi kontroll ta’ l-estratt negattiv tal-patata u wieħed ta’ phosphate buffered saline (PBS). Uża sospensjoni ta’ > 106 ċelloli għal kull ml minn grupp tar-razza/biovar addattata tar-Ralstonia solanacearum bħala l-kontroll pożittiv. Ittestja f’manjiera identika bħall-kampjun(i) iżda separati sewwa mill-kampjuni li jkunu fuq il-pjanċa mikrotitra. Bil-pipetta itfa’ 100-200 µl tal-gerbubi sospiżi mill-ġdid f’tubu żgħir tal-ħġieġ. Saħħan għal 4 minuti f’temperatura ta’ 100 °C. Neħħi l-mikro-tubu u poġġi fuq is-silġ. Żid volum egwali ta’ carbonate coating buffer ta’ saħħa doppja (l-Appendiċi 5). Vortex. Applika 100 µl alikwoti għal kull wieħed ta’ minn ta’ l-inqas żewġ qigħat tal-pjanċa mikrotitra. Inkuba għal siegħa f’temperatura ta’ 37 °C jew matul il-lejl f’4 °C. Neħħi l-estratti minn ġol-qigħat. Aħsel il-qigħat tliet darbiet bil-PBS-Tween (l-Appendiċi 5), waqt li tħalli l-aħħar soluzzjoni tal-ħasil fil- qigħat għal minn ta’ l-inqas ħames minuti. Ipprepara d-diluzzjoni adatta ta’ diluzzjoni ta’ l-antiserum għal ġol-qigħat. l-antiserum tar-Ralstonia solanacearum f’barriera ta’ l-ibblokkar (l-Appendiċi 5). Applika 100 µl tad- Inkuba għal siegħa f’37 °C. Neħħi l-antiserum minn ġol-qigħat. Aħsel il-qigħat bħal qabel (3. 4). Ħejji d-diluzzjoni adatta tal-konjugat tal-fosfatase ta’ l-alkalina fil-barriera ta’ l-ibblokkar. Applika 100 µl tad-diluzzjoni tal-konjugat fil- qigħat. Inkuba għal siegħa f’37 °C. Neħħi l-konjugat mill-qigħat. Aħsel il-qigħat bħal qabel (3. 4 u 3. 6). Ħejji s-soluzzjoni tas-substrata tal-fosfatase ta’ l-alkalina (l-Appendiċi 5). Applika 100 µl għal ġol-qigħat. Inkuba bejn 30 minuta sa siegħa fid-dlam f’temperatura ambjentali. 3. 1 3. 2 3. 3 3. 4 3. 5 3. 6 3. 7 3. 8 3. 9 3. 10 Aqra l-assorbità f’409 nm. L-interpretazzjoni tat-test ELISA: It-test ELISA jkun negattiv jekk id-densità ottika (OD) tal-kampjun tkun 2 × OD tal-kontroll negattiv. It-test ELISA jkun posittiv jekk id-densità ottika (OD) tal-kampjun tkun 2 × OD tal-kontroll negattiv. 4. It-test PCR Ibbażat fuq Seal et al. , 1993 Nota: Matul l-istadji kollha tal-preparazzjoni tal-kampjun għandhom jintużaw ponot tal-pipetta bil-filtru magħhom u manipulazzjonijiet oħra li jinvolvu l-PCR. Ħejji sospensjoni ta’ 106 cellola għal kull ml minn grupp ta’ razza 3/biovar 2 tar-Ralstonia solanacearum bħala l-kontroll pożittiv. Ittestja f’manjiera identika bħall-kampjun(i). 4. 1 Bil-pipetta itfa’ 100 µl tal-gerbubi sospiżi mill-ġdid f’mikro-tubu. Alternattivament, ripetutament taqleb il-mikro-tubu. ittrasferixxi 90 µl tal-gerbubi sospiżi mill-ġdid għal ġo mikro-tubu li jkollu 10 µl ta’ 0,5M NaOH. Ħawwad billi 03/Vol. 23 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 395 4. 2 4. 3 4. 4 Saħħan għal erba’ minuti f’100 °C. Neħħi t-tubu u għamlu minnufih fuq is-silġ. Ħejji minn ta’ l-inqas żewġ diluzzjonijiet deċimali, e. g. 1/10 u 1/100 jew aktar, jekk ikun ikkunsidrat bħala ta’ użu, f’ilma distillat sterili jew ultra pur (UPW). Ħejji t-taħlita tar-reazzjoni PCR (l-Appendiċi 6) f’tubu sterili billi żżid il-komponenti li ġejjin fl-ordni li ġejja: Għal volum ta’ reazzjoni ta’ 50 el: Komponent Kwantità Konċentrazzjonifinali Ilma distillat sterili jew ultra pur 10×PCR Barriera d-ATP d-CTP d-GTP d-TTP Primer OLI-1 (20 eM) Primer Y-2 (20 eM) Taq polymerase (5U/el) 30,8 el—33,8 µl 5,0 µl 1,0 µl 1,0 µl 1,0 µl 1,0 µl 2,5 µl 2,5 µl 0,2 µl Volum totali 45 µl—48 µl Għal aktar reazzjonijiet: 1× 0,2 mM 0,2 mM 0,2 mM 0,2 mM 1 µM 1 µM 1,0 U Ikkalkola l-kwantità ta’ kull komponent għan-numru tar-reazzjonijiet meħtieġa. Ħallat il-komponenti u ttrasferixxi 45 µl-48 µl tat-taħlita f’tubi sterili PCR. Żomm it-tubi bit-taħlita tar-reazzjoni PCR fuq is-silġ. Għal volumi ta’ reazzjoni ta’ 25 µl: Naqqas il-komponenti kif suppost. L-amplifikazzjoni PCR Voluntarja: Iċċentrifuga b’taħbit regolari t-tubi bil-kampjun jagħli u l-kontroll pożittiv. Żid, fl-ordni speċifikata, 2-5 µl tal-kampjun(i), kontroll ta’ l-ilma u kontroll pożittiv ġot-tubi li jkun hemm fihom it-taħlita tar-reazzjoni PCR. Poġġi t-tubi fil-blokka tas-sħana tad-DNA thermal cycler. Ħaddem dan il-programm li ġej: Ċiklu wieħed ta’: (i) 2 minuti f’96 °C:: denaturazzjoni tal-mudell (i) 50 ċiklu ta’ (ii) (ii) 20 sekonda f’94 °C:: denaturazzjoni (iii) (iii) 20 sekonda fi 68 °C:: tagħti t-tempra lill-primers (iv) 30 sekonda fi 72 °C:: estensjoni tal-kopja (iv) Ċiklu ta’: (v) 10 minuti fi 72 °C:: aktar estensjoni (v) Ċiklu ta’: (vi) żomm f’4 °C 4. 5 4. 5. 1 4. 5. 2 Nota: Dawn il-parametri huma għal Perkin Elmer 9600. Ċikli termali oħra jistgħu jkunu jeħtieġu kisja ta’ żejt minerali fit-tubi tar-reazzjoni PCR u/jew modifikazzjoni ta’ kemm idumu l-istadji (ii), (iii) u (iv) fil-profil ta’ l-amplifikazzjoni. 4. 5. 3 Neħħi f’temperatura ta’ -18 °C għal perjodu itwal. t-tubi mit-thermal cycler. Analizza l-prodott PCR. Jekk ma jsirx mill-ewwel, aħżen it-tubi f’4 °C għall-użu fl-istess jum jew 4. 6 Analiżi tal-prodott PCR Il-fdalijiet PCR jiġu identifikati bil-ġelettroferesi ta’ l-agarose u l-immarkar bl-ethidium bromide. 4. 6. 1 Ħejji ġelatina ta’ l-agarose addattata billi bil-mod twassal biex l-agarose jagħli fil-barriera tris-acetate-electrophoresis (TAE). 396 4. 6. 2 4. 6. 3 4. 6. 4 4. 6. 5 4. 6. 6 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 03/Vol. 23 Kessaħ l-agarose maħlul f’temperatura ta’ bejn il-50-60 °C, ferragħ fil-forma ta’ l-unità ta’ l-elettroferiżi u daħħal il-moxt. Ħalli s-soluzzjoni ssir solida. Neħħi l-moxt. Għarraq il-ġelatina fit-TAE biex tkun mgħottija (2-3 mm) bil-barriera. Poġġi 3 µl taqtiriet ta’ loading buffer fuq il-parafilm. Żid 12µl tal-prodott tal-PCR jew mill-kampjuni, il-kontroll pożittiv jew inkella l-kontroll ta’ l-ilma u ħallat b’aspirazzjoni ġentili fil-ponta tal-pipetta qabel il-mili. Il-volumi mogħtija jistgħu jinbidlu biex ikunu konformi mal- kapaċità tal-qigħat fil-ġelatina ta’ l-agarose. Imla b’attenzjoni l-qigħat tal-ġelatina. Inkludi għar-referenza marka ta’ DNA adatta f’minn ta’ l-inqas qiegħa waħda. Orbot il-wires mas-sistema tad-dawl u mat-tagħmir ta’ l-elettrofereżi. Mexxi l-ġelatina għal 5-8 V/cm sakemm il-parti ta’ quddiem tat- tracking indicator tkun f’mhux aktar minn 1 ċm ’il bogħod mit-tarf tal-ġelatina. 4. 6. 7 Itfi l-kurrent. Iddiskonnettja l-wires mill-unità ta’ l-elettrofereżi. B’attenzjoni neħħi l-ġelatina. Għarraq f’soluzzjoni ta’ ethidium bromide għal 30-45 minuta. Nota: Ilbes ingwanti disposable il-ħin kollu meta tuża l-ethidium bromide li huwa mutaġenu qawwi ħafna! Żomm fl-ilma distillat għal 10-15-il minuta. Agħmel il-fdal(ijiet) tad-DNA mkabbra viżibbli bi transilluminazzjoni ta’ UV. Il-prodott tal-PCR tar-Ralstonia solanacearum bil-primer issettjat OLI-1 u Y-2 huwa twil 288 bp. Iċċekkja kontra l-marker tad-DNA u kontra l-kontroll pożittiv. Nota: Il-kontroll ta’ l-ilma għandu jkun negattiv f’kull każ. Jekk ikun pożittiv, irrepeti t-test. Ħu ritratt tal-ġelatina jekk ikun rekord permanenti tkun meħtieġa. Ikkonferma l-awtentiċità tal-fdal imkabbar bl-analiżi ta’ l-enżima ta’ ristrezzjoni (REA). L-Analiżi ta’ l-Enżima ta’ Restrizzjoni (REA) Ittrasferixxi 8,5µl mill-prodott tal-PCR (4. 5. 3) għal ġo mikro-tubu ġdid. Żid1 µl ta’ 10 × barriera ta’ l-enżima u 0,5 µl ta’ l-enżima ta’ restrizzjoni Ava II. Ħawwad b’aspirazzjoni bil-mod fil-ponta tal-pipetta. f’mikroċentrifugu. Inkuba għal siegħa f’37 °C. Jekk jibqgħu xi qtar fuq il-ħitan tat-tubu, iċċentrifuga b’taħbit regolari 4. 6. 8 4. 6. 9 4. 6. 10 4. 6. 11 4. 7 4. 7. 1 4. 7. 2 4. 7. 3 Analizza l-fdal tal-PCR iddiġerit bl-elettrofereżi ta’ l-agarose bħal qabel (4. 6). L-interpretazzjoni tar-riżultat tat-test PCR: It-test PCR ikun negattiv jekk il-fdal karatteristiku 288 bp ma jinstabx u l-fdal solanacearum. jinstab għall-grupp ta’ kontroll pożittiv tar-Ralstonia It-test tal-PCR ikun pożittiv jekk il-framment 288 bp jinstab u l-analiżi REA tal-fdal amplifikat tkun identika mal-grupp ta’ kontroll pożittiv tar-Ralstonia solanacearum. 5. It-test tal-kisi selettiv Ibbażat fuq Elphinstone et al. , 1996 5. 1 Agħmel it-test b’teknika addattata ta’ kisi ta’ diluzzjoni, e. g. : (i) Ipprepara minn ta’ l-inqas żewġ diluzzjonijiet deċimali, viz. 1/10 u 1/100 jew aktar, jekk ikun ikkunsidrat ta’ użu, tal-gerbubi sospiżi mill-ġdid f’barriera tal-gerbubi. Bil-pipetta kejjel volum standard (50-100 µl) tal-gerbubi sospiżi mill-ġdid u kull diluzzjoni fuq medja selettiva tas-SMSA modifikata (l-Appendiċi 7) u ifrex b’virga tal-ħġieġ fuq il-wiċċ kollu tal-medja. Jekk ikun meqjus ta’ użu, agħmel ukoll strixxa ta’ diluzzjoni ta’ 10 µl bil-gerbubi sospiżi mill-ġdid. Poġġi fuq fjamma l-ingassa bejn l- istrixxi. (ii) Ittrasferixxi volum standard imkejjel (50-100 µl) ta’ gerbubi sospiżi mill-ġdid fuq medja selettiva ta’ SMSA modifikata u ifrex b’virga tal-ħġieġ fuq il-wiċċ kollu tal-medja. Mexxi l-virga f’linja dritta mingħajr nar fuq minn ta’ l-inqas żewġ pjanċi ta’ SMSA modifikata. Applika, bl-istess teknika tal-kisi tad-diluzzjoni, sospensjoni ta’ 106 ċelloli għal kull ml minn grupp infettiv tar-razza 3/biovar 2 tar- Ralstonia solanacearum bħala kontroll pożittiv fuq sett ta’ pjanċi separati ta’ SMSA modifikata. Inkuba l-pjanċi fi 28 °C. Ibda aqra l-pjanċi wara tlett ijiem. Jekk negattiv, inkuba għal sitt ijiem. Kolonji ta’ fdalijiet infettivi tar-Ralstonia solanacearum ikunu bojod lewn il-ħalib, ċatti, irregolari u fluwidali b’kolorazzjoni ħamranija lewn id-demm fiċ-ċentru u juru strixxi jew ċrieki interni. Ippurifika l-kolonji b’morfoloġija karatteristika bis-subkulturament fuq medja ta’ nutrijent ġenerali (l-Appendiċi 1). 5. 2 5. 3 5. 4 03/Vol. 23 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 397 5. 5 Identifika kulturi puri (is-sezzjoni II, 4. 1) u kkonferma l-kulturi tar-Ralstonia solanacearum b’test tal-patoġeniċità (is-sezzjoni II, 4. 3). L-interpretazzjoni tar-riżultat tat-test tal-kisi selettiv: It-test tal-kisi selettiv ikun wieħed negattiv jekk l-ebda kolonji ta’ batterji ma jkunu ġew iżolati wara sitt ijiem jew jekk l-ebda kolonji karatteristiċi tar-Ralstonia solanacearum ma jkunu ġew iżolati, sakemm ma tkunx ġiet suspettata l-ebda inibizzjoni minn kolonji ta’ batterja oħra u li l-kolonji karatteristiċi tar-Ralstonia solanacearum ikunu nstabu fil-kontrolli pożittivi. It-test tal-kisi selettiv ikun wieħed pożittiv jekk kolonji karatteristiċi tar-Ralstonia solanacearum ikunu ġew iżolati. It-test tal-bioassay Ibbażat fuq Janse, 1988. Uża 10 pjanti tat-test taż-żriegħ suxxettibbli tat-tadam jew tal-brinġiel li jkunu fit-tielet stadju veru tal-weraq għal kull kampjun. Issaqqix il- pjanti tat-test għal 24 siegħa qabel l-inokulazzjoni. Ifrex 100 µl ta’ gerbubi sospiżi mill-ġdid bejn il-pjanti tat-test. Inokula fiz-zokk bejn il-kotiledoni u f’post ieħor jew aktar. Inokula, bl-istess teknika, 10 żerrigħat b’sospensjoni ta’ 106 ċelloli għal kull ml minn grupp infettiv ta’ biovar 2/razza 3 tar-Ralstonia solanacearum bħala l-kontroll pożittiv u bil-barriera tal-gerbubi bħala l-kontroll negattiv. Issepara l-pjanti tal-kontroll pożittiv mill-pjanti l- oħra biex tkun evitata kontro-kontaminazzjoni. Kabbar aktar il-pjanti tat-test għal erba’ ġimgħat f’temperatura ta’ bejn it-22 °C-28 °C u f’umdità relattivament għolja b’tisqija kuljum. Osserva għal tgħawwiġ, epinażità, klorożi u/jew nuqqas ta’ tkabbir. Iżola minn pjanti infettati (is-sezzjoni II). Identifika kulturi puri b’morfoloġija karatteristika (is-sezzjoni II. 4. 1) u kkonferma l-kulturi tar- Ralstonia solanacearum b’test tal-patoġeniċità (is-sezzjoni II. 4. 3). Jekk ikun meqjus ta’ użu, ivverifika n-nuqqas ta’ infezzjoni fil-gruppi tal-pjanti tat-test li juru indikazzjoni ta’ l-infezzjoni. Neħħi minn kull pjanta tat-test sezzjoni taz-zokk ta’ 1 ċm, minn 2 ċm ’il fuq mill-punt ta’ l-inokulazzjoni. B’dana kollu omoġenizza ċ-ċelloli f’barriera ta’ maċerazzjoni. Agħmel kisi tad-diluzzjoni (is-sezzjoni III. 5. 1). Jekk pożittiv, identifika kulturi puri b’morfoloġija karatteristika (is-sezzjoni II. 4. 1) u kkonferma l-kulturi tar-Ralstonia solanacearum bit-test tal-patoġeniċità (is-sezzjoni II. 4. 3). L-interpretazzjoni tar-riżultat tat-test tal-bioassay: It-test tal-bioassay ikun wieħed negattiv jekk il-pjanti solanacearum tkun indentifikata fil-kontrolli pożittivi. It-test tal-bioassay ikun wieħed pożittiv jekk il-pjanti tat-test ikunu infettati bir-Ralstonia solanacearum. tat-test ma jkunux infettati bir-Ralstonia solanacearum, u sakemm ir-Ralstonia It-testijiet ta’ l-arrikkiment Ibbażati fuq Elphinstone et al. , 1996 Ittrasferixxi 100 µl tal-gerbubi sospiżi mill-ġdid fi 3ml ta’ likwidu ta’ SMSA modifikat (l-Appendiċi 7). Inkuba għal 48 siegħa, u f’kull każ għal mhux aktar minn 72 siegħa, fi 28 °C bit-tapp tat-tubu jkun imdaħħal b’mod ħafif biex jippermetti l-arja. Issikka t-tapp u għamel il-vortex. Alikwot għat-test IF (din is-sezzjoni, 2. ), it-test ELISA (din is-sezzjoni, 3. ) u/jew it-test PCR (din is-sezzjoni, 4. ). It-test tal-patoġeniċità Irreferi għas-Sezzjoni II. 4. 3. 6. 6. 1 6. 2 6. 3 6. 4 6. 5 6. 6 7. 7. 1 7. 2 7. 3 8. 398 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 03/Vol. 23 Appendiċi 1 Medja ta’ nutrijent għall-iżolament u l-kultura tar-Ralstonia solanacearum In- Nu tri je nt A g ar (N A) In-Nutrijent Agar (Difco) Ilma distillat 23 g 1 litru Ipprepara ½ litru volumi ta’ medja f’reċipjenti ta’ litru l-wieħed. Ħoll l-ingredjenti. Sterilizza permezz ta’ tifriq awtomatiku f’temperatura ta’ 121 °C għal 15-il minuta. Kessaħ għal 50 °C. Ferragħ il-pjanċi. Y eas t- Pep t one-Gluco se-Agar (YPG A) Estratt ta' ħmira (Difco) Bacto Peptone (Difco) D(+) Glucose (monohydrate) Bacto Agar (Difco) Ilma distillat 5 g 5 g 10 g 15 g 1 litru Ipprepara ½ litru volumi ta’ medja f’reċipjenti ta’ litru l-wieħed. Ħoll l-ingredjenti. Sterilizza permezz ta’ tifriq awtomatiku f’temepratura ta’ 121 °C għal 15-il minuta. Kessaħ għal 50 °C. Ferragħ il-pjanċi. S u c r o s e P e p t o n e A g a r (SPA) Sukrosju Peptone K2HPO4 MgSO4###7H2O Bacto Agar(Difco) Ilma distillat 20 g 5 g 0,5 g 0,25 g 15 g 1 litru Ipprepara ½ litru volumi ta’ medja f’reċipjenti ta’ litru l-wieħed. Ħoll l-ingredjenti. Jekk ikun meħtieġ aġġusta għal pH 7,2-7,4. Sterilizza permezz ta’ tifriq awtomatiku f’temperatura ta’ 121 °C għal 15-il minuta. Kessaħ għal 50 °C. Ferragħ il-pjanċi. Il-medja K elm a n ’s t e t r a z o li um Aċidi Casamino (Difco) Bacto Peptone (Difco) Dekstrosju Bacto Agar (Difco) Ilma distillat 1 g 10 g 5 g 15 g 1 litru Ipprepara ½ litru volumi ta’ medja f’reċipjenti ta’ litru l-wieħed. Ħoll l-ingredjenti. Sterilizza permezz ta’ tifriq awtomatiku f’temperatura ta’ 121 °C għal 15-il minuta. Kessaħ għal 50 °C. Żid soluzzjoni bl-ilma sterilizzat b’filtru ta’ triphenyl tetrazolium chloride (Sigma) biex tikseb konċentrazzjoni finali ta’ 50 mg għal kull litru. Ferragħ il-pjanċi. 03/Vol. 23 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 399 Appendiċi 2 Materjali għat-tħejjija tal-kampjun B a r ri e ra ta l- ma ċ er a z zj oni : 50 mM ba r r i e r a p ho phat e, p H 7, 0 Din il-barriera tintuża għall-maċerazzjoni taċ-ċelloli. Na2HPO4 KH2PO4 Ilma distillat 4,26 g 2,72 g 1 litru Ħoll l-ingredjenti u vverifika l-pH. Alikwota skond kif meqjus xieraq. Sterilizza permezz ta’ tifriq awtomatiku f’temperatura ta’ 121 °C għal 15-il minuta. Iż-żieda ta’ 5 % polyvinylpyrrolidone-40000 MWT (PVP-40) hija rakkomandata meta jsir it-test dirett tal-PCR biex titnaqqas l-inċidenza ta’ l-inibizzjoni ta’ l-amplifikazzjoni minn molekuli aromatiċi fl-estratt. Iż-żieda ta’ deflokkulent, aġent għal kontra r-ragħwa jew anti-ossidant, hija rakkomandata bl-użu ta’ Waring Blender jew inkella bil-proċedura ta’ l-omoġenizzazzjoni Ultra Turrax għall-maċerazzjoni tal-qlub taċ-ċelloli tal-patata. Qxur tal-lubrol DC silikon ta' kontra r-ragħwa Tetrasodiumpyrophosphate 0,5 g għal kull litru 1,0 ml għal kull litru 1,0 g għal kull litru Ofroq separatament. Żid sal-konċentrazzjoni mixtieqa. B a r ri e ra ta l- g e r bu bi : 10 m M ba rr i er a ta l-f osfa t, p H 7, 2 Din il-barriera tintuża għas-sospensjoni mill-ġdid u d-diluzzjoni ta’ l-għarqub tal-patata u l-gerbubi. Na2HPO4-12H2O NaH2PO4-2H2O Ilma distillat 2,7 g 0,4 g 1 litru Ħoll l-ingredjenti u ċċekkja l-pH. Alikwota skond kif ikun meqjus xieraq. Sterilizza b’tifriq awtomatiku f’temperatura ta’ 121 °C għal 15-il minuta. 400 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 03/Vol. 23 Appendiċi 3 Materjali għat-test IF IF -ba rr i e ra : 10 mM b a r ri e ra sa li na ta l-f osfa t (PB S/ B SF ) p H 7, 2 Din il-barriera tintuża għad-diluzzjoni ta’ l-antisera. Na2 HPO4-12 H2O NaH2 PO4-2 H2O NaCl Ilma distillat 2,7 g 0,4 g 8,0 g 1 litru Ħoll l-ingredjenti u vverifika l-pH. Alikwota skond kif ikun ikkunsidrat xieraq. Sterlizza b’tifriq awtomatiku f’temperatura ta’ 121 °C għal 15-il minuta. IF -ba rr i e ra -Tween Din il-barriera tintuża għall-ħasil tal-ħġieġ. Żid 0,1 % ta’ Tween 20 mal-barriera IF. 0 , 1 M Pho s p hat e b uffer ed g lyc er o l pH 7,6 Din il-barriera tintuża bħal fluwidu montat fuq it-twieqi tal-ħġieġa IF biex iżżid il-florexxenza. Na2 HPO4-12 H2O NaH2 PO4-2 H2O Gliċerina Ilma distillat 3,2 g 0,15 g 50 ml 100 ml 03/Vol. 23 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 401 Appendiċi 4 Id-determinazzjoni tal-livell tal-kontaminazzjoni fit-test IF Il-medda tal-wiċċ (S) tat-tieqa ta’ ħġieġa b’ħafna tikek ¼ πD2 4 meta D = id-dijametru tat-tieqa Il-medda tal-wiċċ tal-kamp oġġettiv ¼ πd2 4 meta d = id-dijametru tal-kamp oġġettiv Ikkalkola d jew b’qies dirett jew mill-formuli li ġejjin: s ¼ π i 2 G2K2 ×4 meta i = koeffiċjent tal-kamp (jiddependi fuq it-tip okulari u jvarja minn 8 sa 24), K = il-koeffiċjent tat-tubu (1 sa 1,25), G = magnifikazzjoni ta’ 100x, 40x eċċ. oġġettiva. minn (2) r d ¼ ﬃﬃﬃﬃﬃ 4s π (1) (2) (3) (4) minn (3) v u u t d ¼ ﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃ 4 × πi2 G2K2 × 4 ¼ i GK π Għodd in-numru ta’ ċelloli florexxenti tipiċi għal kull kamp (c). Ikkalkula n-numru ta’ ċelloli florexxenti tipiċi għal kull tieqa (C). C ¼ c S s Ikkalkula n-numru ta’ ċelloli florexxenti tipiċi għal kull ml ta’ gerbuba (N) N ¼ C × 1000 y × F meta y = il-volum tal-gerbuba fuq it-tieqa, F = il-fattur tad-diluzzjoni tal-gerbuba. 402 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 03/Vol. 23 Appendiċi 5 Materjali għat-test ELISA B a r r i e r a t a l - k a r b o n a t t a ’ s a ħ ħ a d o p p j a , p H 9 , 6 Na2CO3 NaHCO3 Ilma distillat 6,36 g 11,72 g 1 litru Ħoll l-ingredjenti u vverifika l-pH. Alikwota skond kif ikun meqjus xieraq. Sterlizza b’tifriq awtomatiku f’temperatura ta’ 121 °C għal 15-il minuta. Sulfat tas-sodju f’konċentrazzjoni finali ta’ 0,2 % jista’ jiżdied bħala anti-ossidant jekk l-estratt ikollu frazzjoni għolja ta’ molekuli aromatiċi. 1 0 × B a r r i e r a S a l i n a t a l - F o s f a t ( P B S / B S F ) , p H 7 , 4 NaCl KH2PO4 Na2HPO4 – 12H2O KCl Ilma distillat 80 g 2 g 29 g 2 g 1 litru Ħoll l-ingredjenti u vverifika l-pH. Alikwotta skond kif meqjus xieraq. Sterilizza b’tifriq awtomatiku f’temperatura ta’ 121 °C għal 15-il minuta. B a r r i e r a S a l i n a t a l - F o s f a t - T w e e n ( B S F - T ) 10×BSF 10 % Tween 20 Ilma distillat 100 ml 5 ml 895 ml B a r r i e r a t a ’ l - i b b l o k k a r ( a n t i b o d y ) ( g ħ a n d h a t k u n i p p r e p a r a t a f r i s k a ) 10×BSF 10 ml Polyvinylpyrrolidone-44000 (PVP-44) MWT 10 % Tween 20 Trab tal-ħalib Ilma distillat 2,0 g 0,5 g 0,5 g sa 100 ml S o l u z z j o n i t a ’ s u b s t r a t t a ’ l - a l k a l i n a f o s f a t i k a p H 9 , 8 Diethanolamine Ilma distillat 97 ml 800 ml Ħawwad u aġġusta għal pH 9,8 b’HCI konċentrat. Imla sa litru b’ilma distillat. Żid 0,2 g MgCl2. Ħoll żewġ pilloli ta’ substrat fosfatiku tal-ħames mg (Sigma) għal kull 15 ml ta’ soluzzjoni. 03/Vol. 23 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 403 Appendiċi 6 Materjali għat-test PCR S e k w e n z a t a ’ l - o l i g o n u c l e o t i d e p r i m e r Primer OLI-1 59-GGGGGTAGCTTGCTACCTGCC-39 Primer Y-2 Għall-materjali ara Seal et al (1993). 59-CCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGT-39 Appendiċi 7 Materjali għall-kisi selettiv u t-testijiet ta’ l-arrikkiment Il-medja selettiva tal-SMSA (Engelbrecht, 1994) kif modifikata minn Elphinstone et al, 1996 iżda jneħħi l-agar u l-imluħ tat- tetrazolium. Il-medja ta’ Basal Aċidi Casamino (Difco) Bacto peptone (Difco) Gliċerina Agar (Difco) Ilma distillat 1 g 10 g 5 ml 15 g 1 litru Ipprepara ½ litru volumi ta’ medja f’reċipjenti ta’ litru l-wieħed. l-ingredjenti u vverifika l-pH. Aġġusta l-pH, Ħoll solanacearum ma tikbirx sewwa fuq il-medja f’pH > 7,0. Sterilizza permezz ta’ tifriq awtomatiku f’temperatura ta’ 121 °C għal 15-il minuta. Kessaħ għal 50 °C. Żid l-ingredjenti li ġejjin (kollha mis-Sigma) biex tikseb il-konċentrazzjonijiet finali speċifikati: Kristall Vjola jekk ikun meħtieġ, għal 6,5 qabel it-tifriq awtomatiku. Ralstonia Sulfat tal-polymixin B Bacitracin (*) Chloramphenicol Penicillin-G L-imluħ tat-tetrazolium 5 mg għal kull litru 100 mg għal kull litru 25 mg għal kull litru 5 mg għal kull litru 0,5 mg għal kull litru 50 mg għal kull litru (madwar 600000 unit) Sigma P-1004 (madwar 1250 unit) Sigma B-0125 Sigma C-3175 (madwar 825 unit) Sigma P-3032 Ħoll l-ingredjenti f’70 % etanol għall-konċentrazzjonijiet mogħtija għall-volum ta’ medja ppreparata. Xi ftit ingredjenti, viz. polymixin B u chloramphenicol jeħtieġu xi ftit sħana u taħwid. Il-brodu SMSA (Elphinstone et al. , 1996) Ipprepara bħallikieku għal medja selettiva SMSA iżda neħħi l-agar. Amministra fi tliet ml alikwoti ġo tubi universali ta’ użu ta’ darba biss ta’ 30 ml l-wieħed. 404 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 03/Vol. 23 Referenzi Buddenhagen, I. W. ; Sequeira, L. u Kelman, A. 1962. Description of races in Pseudomonas solanacearum. Phyto- pathology 52, 726. Cook, D. ; Elizabeth B. u Sequeira L. , 1989. Genetic diversity of Pseudomonas solanacearum: detection of restriction fragment length polymorphism with DNA probes that specify virulence and hypersensitive respons. Molecular Plant- Microbe Interactions 2, 113-121. Dinesen I. G. u DeBoer, S. H. 1995. Extraction of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus from composite samples of potato tubers. American Potato Journal 72, 133-142. Elphinstone, J. G. ; Hennessy, J. ; Wilson, J. and Stead, D. E. 1996. Sensitivity of different methods for the detection of Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith in potato tuber extracts. EPPO Bulletin 26. Engelbrecht, M. C. 1994. Modification of a semi-selective medja for the isolation and quantification of Pseudomonas solanacearum. ACIAR Bacterial Wilt Newsletter 10, 3-5. Hayward, A. C. 1964. Characteristics of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 27, 265-277. Hayward, A. C. 1994. Systematic and phylogeny of Pseudomonas solanacearum and related bacteria. Fil: Bacterial Wilt: the disease and its causative agent, Pseudomonas solanacearum (eds. A. C. Hayward u G. L. Hartman) CAB International Oxford, 127-135. Janse, J. D. 1988. A detection method for Pseudomonas solanacearum in symptomless potato tubers and some data on its sensitivity and specificity. EPPO Bulletin 18, 343-351. Janse, J. D. 1991. Infra- and intraspecific classification of Pseudomonas solanacearum strains using whole cell fatty acid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14, 335-345. Kelman, A. 1954. The relationship of pathogenicity in Pseudomonas solanacearum to colony appearance on a tetra- zolium media. Phytopathology 64, 293-695. Lelliot, R. A. u Stead, D. E. , 1987. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. (T. F. Preece ed. ) Black- well Scientific Publications, Oxford. 216 pp. Louws, F. J. ; Fulbright, D. W. ; Stephens, C. T. u De Bruijn, F. J. , 1995. Differentiation of genomic structure by rep- PCR fingerprinting to rapidly classify Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Phytopathology 85, 528-536. Lozano, J. C. and Sequeira, L. , 1970. Differentiation of races of Pseudomonas solanacearum by a leaf infiltration. Phytopathology 60, 838. Mirza, M. S. ; Rademaker, J. W. L. ; Janse, J. D. u Akkermans, A. D. L. 1993, Specific 16S ribosomal RNA targeted oligonucleotide probe against Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Canadian Journal of Microbiology 39, 1029-1034. Robinson-Smith, A. ; Jones, P. ; Elphinstone, J. G. u Forde, S. M. D. , 1995. Products of antibodies to Pseudomonas solanacearum, the causative agent of bacterial wilt. Food and Agricultural Immunology 7, 67-79. Seal, S. E. ; Jackson, L. A. ; Young, J. P. W. u Daniels, M. J. , 1993. Differentiation of Pseudomonas solanacearum, P. syzygii, P. picketti and the blood disease bacterium by partial 16S rRNA sequencing: construction of oligonucleotide primers for sensitive detection by polymerase chain reaction. Journal of General Microbiology 139, 1587-1594. Smith, J. J. ; Offord, L. C. ; Holderness, M. and Saddler, G. S. , 1995. Genetic diversity of Burkholderia solanacearum (synonym Pseudomonas solanacearum) race 3 in Kenya. Applied and Environmental Microbiology 61, 4262-4268. Stead, D. E. , 1992a. Techniques for detecting and identifying plant pathogenic bacteria. Fil: Techniques for rapid detection of plant pathogens (eds. J. M. Duncan and L. Torrance). Blackwell Scientific Publications, Oxford, 76-111. Stead, D. E. , 1992b. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42, 281-295. Van Beuningen, A. ; Derks, H. u Janse J. D. , 1995. Detection and identification of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus with special attention to fluorescent in-situ hybridisation (FISH) using a 16S rRNA targeted oligonucleo- tide probe. Züchtungsforschung 2, 266-269. 03/Vol. 23 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 405 ANNESS III 1. Għal kull preżenza suspettata li għaliha jkun ġie identifikat riżultat pożittiv fit-test(ijiet) ta’ l-iscreening skond, għall- l-oħrajn kollha, kwalunkwe materjal tal-pjanti msemmija, tal-metodu relevanti stabbilit fl-Anness II jew, fil-każi metodu ieħor approvat uffiċjalment, u l-konferma jew ir-rifjut bit-tkomplija tal-metodu msemmi tkun mistennija, għandu jkun hemm iż-żamma u l-konservazzjoni addattata tal-: — kull meta jkun possibbli, il-lott, jew parti minnu (li minnu l-kampjun ikun ittieħed) fl-ippakkjar oriġinali bit- tikketta, — kull meta jkun possibbli, il-parti li tibqa’ tal-kampjun, — kwalunkwe estratt li jifdal u l-materjal addizzjonali ppreparat għat-test(ijiet) ta’ l-iscreening e. g. il-ħġieġa ta’ l- immunoflorexxenza, u, — id-dokumentazzjoni kollha relevanti, sakemm ikun hemm it-tkomplija tal-metodu msemmi. 2. Fil-każ ta’ konferma ta’ l-organiżmu, għandu jkun hemm iż-żamma u l-konservazzjoni xierqa tal-: — il-materjal speċifikat fil-paragrafu 1, u — il-kampjun tal-materjal infettat tat-tadama jew tal-brinġiela inokulati bit-tuberu jew bl-estratt tal-pjanta, meta xieraq, u — il-koltura iżolata tal-organiżmu, sa minn ta’ l-inqas xahar wara l-proċedura tan-notifika permezz ta’ l- Artikolu 5(2). 406 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 03/Vol. 23 ANNESS IV L-elementi fl-investigazzjoni riferiti fl-Artikolu 5(1)(a)(i) għandhom jinkludu meta jkun relevanti: (i) il-postijiet tal-produzzjoni, — il-patata li qed tikber jew li kibret, li tkun relatata klonalment għal dik li tkun instabet li hija infettata bl- organiżmu, — it-tadam li qed jikber jew li kiber li jkun mill-istess sors bħal dak li jinstab infettat bl-organiżmu, — il-patata jew it-tadam li qed jikber jew li kiber, jkun tpoġġa taħt kontroll uffiċjali minħabba l-preżenza li suspettata ta’ l-organiżmu, — il-patata li qed tikber jew li kibret, li tkun relatata klonalment għal dik li tkun tkabbret f’postijiet ta’ produzzjoni li jkunu nstabu infestati bl-organiżmu, — il-patata jew it-tadam li qed jikbru u li jinstabu fil-viċinanzi tal-postijiet tal-produzzjoni infestati, inklużi dawk li jaqsmu bejniethom tagħmir u faċilitajiet direttament jew permezz ta’ kuntrattur komuni, — l-użu ta’ l-ilma tal-wiċċ għall-irrigazzjoni jew għall-bexx minn kwalunkwe sors ikkonfermat jew issuspettat li jkun infestat bl-organiżmu, — l-użu ta’ l-ilma tal-wiċċ għall-irrigazzjoni jew għall-bexx minn sorsi użati b’mod komuni ma’ postijiet tal- produzzjoni kkonfermati jew issuspettati li huma infestati bl-organiżmu, — mgħarrqa bl-ilma tal-wiċċ ikkonfermat jew issuspettat li hu infestat bl-organiżmu; u, (ii) l-ilma tal-wiċċ użat għall-irrigazzjoni jew għall-bexx ta’, jew li jkun għarraq l-għalqa (l-għelieqi) jew il-post(ijiet) tal- produzzjoni, ikkonfermati li huma infestati bl-organiżmu. 03/Vol. 23 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 407 1. L-elementi fid-determinazzjoni tal-limitu tal-kontaminazzjoni probabbli permezz ta’ l-Artikolu 5(1)(a)(iii) u 5(1)(ċ)(iii), għandhom jinkludu meta jkun relevanti: ANNESS V — il-materjal tal-pjanti msemmija mkabbra f’post ta’ produzzjoni deskritt bħala kontaminat permezz ta’ l- Artikolu 5(1)(a)(ii), — il-post(ijiet) tal-produzzjoni b’rabta mal-produzzjoni tal-materjal tal-pjanti msemmija deskritt(i) bħala kontaminati jaqsmu bejniethom it-tagħmir tal-produzzjoni u l-faċilitajiet inklużi dawk li permezz ta’ l-Artikolu 5(1)(a)(ii), direttament jew permezz ta’ kuntrattur komuni, — il-materjal tal-pjanti msemmija prodotti fil-post(ijiet) tal-produzzjoni riferiti fil-vers ta’ qabel, jew preżenti f’dawn il-post(ijiet) tal-produzzjoni matul il-perjodu meta l-materjal tal-pjanti msemmija u deskritti bħala kontaminati permezz ta’ l-Artikolu 5(1)(a)(ii), kien preżenti fil-postijiet tal-produzzjoni riferiti fl-ewwel vers, — imħażen li jimmaniġġjaw il-materjal tal-pjanti msemmija mill-postijiet tal-produzzjoni li ssemmew fuq, — kwalunkwe makkinarju, vetturi, reċipjenti, imħażen, jew unitajiet ta’ dawn, u kwalunkwe oġġetti oħra inkluż il- li seta’ ġie f’kuntatt mal-materjal tal-pjanti msemmija u deskritti bħala kkontaminati l-ippakkjar, materjal ta’ permezz ta’ l-Artikolu 5(1)(a)(ii), — kwalunkwe materjal tal-pjanti msemmija li ġew maħżuna, jew li ġew f’kuntatt ma’, kwalunkwe strutturi oġġetti elenkati fil-vers ta’ qabel, qabel ma jkun seħħ it-tindif u d-diżinfettar ta’ dawn l-istrutturi jew oġġetti, jew — bħala riżultat ta’ l-investigazzjonijiet u l-ittestjar permezz ta’ l-Artikolu 5(1)(a)(i), fil-każ tal-patata, dawk it-tuberi jew il-pjanti b’relazzjoni klonali fraternali jew parentali mal-, u fil-każ tat-tadam, dawk il-pjanti bl-istess sors bħal, l-Artikolu 5(1)(a)(ii) u li għalih, il-materjal għalkemm dawn setgħu irriżultaw fin-negattiv għall-organiżmu, jidher li l-kontaminazzjoni tkun waħda probabbli permezz ta’ relazzjoni klonali, tal-pjanta msemmija u deskritt bħala kkontaminat permezz ta’ — il-post(ijiet) tal-produzzjoni tal-materjal tal-pjanti msemmija riferiti fil-vers ta’ qabel, — il-post(ijiet) tal-produzzjoni tal-materjal tal-pjanti msemmija li jużaw ilma għall-irrigazzjoni jew għall-bexx li ġie deskritt bħala kkontaminat permezz ta’ l-Artikolu 5(1)(ċ)(ii), — il-materjal tal-pjanti msemmija prodotti f’għelieqi mgħarrqa bl-ilma tal-wiċċ ikkonfermat li huwa infestat bl- organiżmu. 2. Id-determinazzjoni tal-firxa possibbli permezz ta’ l-Artikolu 5(1)(a)(iv) u 5(1)(ċ)(iii) għandha tinkludi: (i) f’każi li jidħlu taħt l-Artikolu 5(1)(a)(iv), konsiderazzjoni ta’ dawn l-elementi li ġejjin, — il-qrubija tal-postijiet oħrajn tal-produzzjoni li jkabbru l-materjal tal-pjanti msemmija, — il-produzzjoni komuni u l-użu ta’ ħażniet tal-patata taż-żriegħ, — il-postijiet tal-produzzjoni tal-pjanti msemmija fil-każi meta jkun hemm jew kien hemm riskju ta’ ħarba ta’ l-ilma tal-wiċċ minn, jew għarqien ta’, post(ijiet) tal-produzzjoni deskritti bħala kkontaminati permezz ta’ l-Artikolu 5(1)(a)(ii); jużaw ilma tal-wiċċ għall-irrigazzjoni jew għall-bexx tal-materjal li (ii) fil-każi meta l-ilma tal-wiċċ ġie deskritt bħala kkontaminat permezz ta’ l-Artikolu 5(1)(c)(ii): — il-post(ijiet) tal-produzzjoni li f’riskju li jegħrqu bl-ilma tal-wiċċ deskritt bħala kkontaminat, jipproduċu l-materjal tal-pjanti msemmija li jinsabu maġenb, jew li huma — kwalunkwe ħawt ta’ l-irrigazzjoni diskreta assoċjata ma’ l-ilma tal-wiċċ deskritt bħala kkontaminat. 408 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 03/Vol. 23 3. Id-dettalji tan-notifika riferita fl-ewwel subparagrafu ta’ l-Artikolu 5(2) għandhom jinkludu: — id-data tar-rappurtaġġ tal-preżenza ssuspettata permezz ta’ l-Artikolu 4 u d-dati ta’ meta jkunu ttieħdu l-kampjuni u tal-konferma tal-preżenza ta’ l-organiżmu permezz ta’ l-Artikolu 5, meta jkun xieraq, — id-deskrizzjoni ta’ l-elementi tal-kontaminazzjoni deskritta u d-demarkazzjoni taż-żona. 4. Id-dettalji tan-notifika addizzjonali riferita fit-tieni subparagrafu ta’ l-Artikolu 5(2) għandu jinkludi: — għal kwalunkwe konsenja tal-patata jew tal-lott deskritt bħala kkontaminat, iċ-ċertifikati preskritti fl-Artikoli 7 u l- in-numru tal-passaport jew in-numru tar-reġistrazzjoni tal-produtturi tal-patata, 8 tad-Direttiva 77/93/KEE, imħażen kollettivi u ċ-ċentri tad-dispaċċ, skond kif ikun xieraq, — għal kwalunkwe konsenja tal-pjanti tat-tadam jew tal-lott deskritt bħala kkontaminat, iċ-ċertifikati preskritti fl- Artikoli 7 jew 8 tad-Direttiva 77/93/KEE u n-numru tal-passaport, b’konformità mal-lista li hemm fl-Anness V, il-Parti A, is-Sezzjoni I. 2. 2 tad-Direttiva 77/93/KEE, — l-isem tal-varjetà u l-kategorija tal-ħażniet tal-patata taż-żriegħ, u meta jkun possibbli fil-każi l-oħrajn kollha, — kwalunkwe informazzjoni oħra li għandha x’taqsam ma’ l-epidemija kkonfermata skond kif il-Kummissjoni tkun tesiġi. 03/Vol. 23 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 409 1. B’referenza għall-Artikolu 6(1) id-disposizzjonijiet għandhom ikunu: ANNESS VI — inċinerazzjoni, jew — l-użu ta’ l-għalf għall-annimali wara trattament tas-sħana b’tali mod li ma jkun hemm l-ebda riskju li l-organiżmu jibqa’ jgħix, jew — dfin fil-fond, f’sit ta’ disponiment li fih ma jkun hemm l-ebda riskju li dan jispiċċa f’art agrikola u jew ikun hemm kuntatt ma’ sorsi ta’ l-ilma li jistgħu jintużaw għall-irrigazzjoni ta’ l-art agrikola, jew — il-proċessar industrijali permezz ta’ kuntatt dirett u t-tqassim immedjat għal impjant ta’ l-ipproċessar li jkollu l- faċilitajiet ta’ disponiment ta’ skart approvati uffiċjalment li jkunu konformi mad-disposizzjonijiet stabbiliti fl- Anness VII ta’ din id-Direttiva, jew — miżuri oħrajn, sakemm ikun ġie stabbilit li ma jkun hemm l-ebda riskju identifikabbli tal-firxa tal-organiżmu; dawn il-miżuri għandhom ikunu nnotifikati immedjatament lill-Kummissjoni u lill-Istati Membri l-oħrajn. 2. L-użu jew id-disponiment addattat tal-materjal tal-pjanti msemmija riferiti għalih fl-Artikolu 6(2), taħt il-kontroll tal- korpi uffiċjali responsabbli ta’ l-Istat(i) Membru(i) kkonċernat(i), b’komunikazzjoni xierqa bejn il-korpi uffiċjali responsabbli biex ikun assigurat il-ħin kollu tal-kontroll u l-approvazzjoni mill-korp uffiċjali responsabbli ta’ l-Istat Membru fejn il-patata għandha tkun ippakkjata jew ipproċessata f’dak li għandhom x’jaqsmu l-faċilitajiet tad- disponiment ta’ l-iskart riferiti fl-ewwel u t-tieni vers, għandu jkun: (i) Għat-tuberi tal-patata, — l-użu bħala patata għall-bejgħ intiża għall-konsum u ppakkjata f’postijiet li jkollhom faċilitajiet addattati ta’ disponiment ta’ l-iskart, u lesta għat-tqassim dirett u l-użu mingħajr ippakkjar mill-ġdid, u intiża għal dan it- tqassim dirett u l-użu, jew — l-użu bħala patata għall-bejgħ u intiża għall-ipproċessar industrijali, u intiża għat-tqassim dirett u immedjat għall-impjant ta’ l-ipproċessar li jkollu faċilitajiet addattati ta’ disponiment ta’ l-iskart, jew — xi ftit użu jew disponiment ieħor, sakemm ikun ġie stabbilit li ma jkun hemm l-ebda riskju identifikabbli tal- firxa ta’ l-organiżmu, u suġġett għall-approvazzjoni tal-korpi uffiċjali responsabbli. Dawn il-miżuri għandhom ikunu nnotifikati minnufih lill-Kummissjoni u lill-Istati Membri l-oħrajn. (ii) għall-partijiet l-oħra tal-pjanti inkluż iz-zokk u l-fdalijiet tal-faxxina, — il-qerda, jew — xi użu jew disponiment ieħor, sakemm ikun ġie stabbilit li ma jkun hemm l-ebda riskju identifikabbli tal-firxa ta’ l-organiżmu; dawn il-miżuri għandhom ikunu nnotifikati minnufih lill-Kummissjoni u lill-Istati Membri l- oħrajn. 3. Il-metodi adatti għad-dekontaminazzjoni ta’ l-oġġetti riferiti fl-Artikolu 6(3) għandhom ikunu t-tindif u, fejn xieraq, id-diżinfettar, b’tali mod li ma jkun hemm l-ebda riskju identifikabbli tal-firxa ta’ l-organiżmu, u għandhom ikunu applikati taħt is-sorveljanza tal-korpi uffiċjali responsabbli ta’ l-Istati Membri. 4. Din is-sensiela ta’ miżuri li għandhom ikunu implimentati mill-Istati Membri fi ħdan iż-żona(i) ddemarkat(i) stabbiliti taħt l-Artikolu 5(1)(a)(iv) u (ċ)(iii) u riferiti fl-Artikolu 6(4) għandhom jinkludu: 4. 1. Fil-każi ta’ Artikolu 5(1)(a)(ii): fejn il-postijiet tal-produzzjoni jkunu ġew iddikjarati bħala kkontaminati permezz ta’ l- (a) f’għalqa jew f’unità tal-produzzjoni ta’ l-uċuħ tar-raba’ protetta, iddikjarata bħala kkontaminata permezz ta’ l-Artikolu 5(1)(a)(ii), jew 410 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 03/Vol. 23 (i) matul minn ta’ l-inqas l-erba’ snin tat-tkabbir wara l-kontaminazzjoni ddikjarata, — għandhom jittieħdu miżuri biex ikunu eliminati pjanti volontarji tal-patata u tat-tadam kif ukoll pjanti ospitanti oħra ta’ l-organiżmu inkluż il-ħaxix solanaċeu, u — dawn li ġejjin m’għandhomx ikunu kkultivati: — tuberi jew pjanti tal-patata, — pjanti u żerriegħa tat-tadam, — billi tittieħed kunsiderazzjoni tal-bioloġija ta’ l-organiżmu, — il-pjanti ospitanti l-oħrajn, — il-pjanti ta’ l-ispeċi tal-Brassica, li għalihom ikun hemm riskju identifikabbli ta’ l-għixien ta’ l-organiżmu, — l-uċuħ tar-raba’ li għalihom hemm riskju identifikabbli tal-firxa ta’ l-organizmu; — fl-ewwel staġun tal-kultivazzjoni tal-patata jew tat-tadam wara l-perjodu speċifikat fil-vers ta’ qabel, u bil-kondizzjoni li l-għalqa tkun instabet ħielsa minn pjanti volontarji tal-patata u tat-tadam kif ukoll minn pjanti ospitanti oħrajn inkluż il-ħaxix solanin għal minn ta’ l-inqas is-sentejn konsekuttivi tal-kultivazzjoni qabel iż-żergħa, — - fil-każ tal-patata, patata taż-żriegħ attestata uffiċjalment għandha tkun ikkultivata biss għall- produzzjoni tal-bejgħ u, — għandu jsir stħarriġ uffiċjali inklużi testijiet, kif spjegat fid-dettal fl-Artikolu 2(1), — fl-istaġun tal-kultivazzjoni tal-patata u tat-tadam wara dak imsemmi fil-vers ta’ qabel u wara ċiklu ta’ rotazzjoni xieraq, fil-każ ta’ patata taż-żriegħ attestata uffiċjalment, din għandha titkabbar jew għaż-żerriegħa jew għall-bejgħ, u fil-każ tal-patata u tat-tadam għandu jsir stħarriġ uffiċjali kif spjegat fid-dettal fl-Artikolu 2(1); jew (ii) matul il-ħames snin tat-tkabbir wara dak tal-kontaminazzjoni ddikjarata, — għandhom jittieħdu miżuri biex ikunu eliminati pjanti volontarji tal-patata u tat-tadam kif ukoll pjanti ospitanti oħrajn ta’ l-organiżmu inkluż il-ħaxix solanin, u — l-għalqa għandha tkun stabbilita u miżmuma matul l-ewwel tliet snin jew, f’serħan jew, biċ-ċereali jew f’għalf intesiv jew, jew, f’mergħa permanenti bi qtugħ frekwenti skond ir-riskju identifikat, għall-ħaxix tal-produzzjoni taż-żriegħ, segwit minn kultivazzjoni fis-sentejn ta’ wara bi pjanti mhux ospitanti ta’ l-organiżmu li għalihom m’hemm l-ebda riskju identifikabbli ta’ l-għixien jew tal-firxa ta’ l-organiżmu, — fl-ewwel staġun tat-tkabbir tal-patata u tat-tadam wara l-perjodu speċifikat fil-vers ta’ qabel, — fil-każ tal-patata, patata taż-żriegħ attestata uffiċjalment għandha titkabbar jew għaż-żerriegħa jew għall-bejgħ, u għandu jsir stħarriġ uffiċjali inkużi testijiet, kif spjegat fid-dettal fl-Artikolu 2(1); (b) f’għelieqi oħrajn: — fis-sena tat-tkabbir wara l-kontaminazzjoni ddikjarata: — jew li l-ebda tuberi jew pjanti tal-patata, jew inkella pjanti ospitanti oħra tal-organiżmu għandhom ikunu miżrugħa, u għandhom jittieħdu l-miżuri biex ikunu eliminati l-pjanti volontarji tal-patata u tat-tadam u l-pjanti ospitanti l-oħrajn inkluż ħaxix solanin skond kif ikun xieraq, jew — fil-każ ta’ tuberi tal-patata, il-patata taż-żriegħ attestata uffiċjalment tista’ tiġi mkabbra għall-bejgħ biss, bil-kondizzjoni li l-korpi uffiċjali responsabbli jkunu sodisfatti li r-riskji ta’ pjanti volontarji tal- patata u tat-tadam u l-pjanti ospitanti l-oħrajn ta’ l-organiżmu inkluż il-ħaxix solanin, ikunu ġew eliminati. L-uċuħ tar-raba’ li qed jikbru għandhom ikunu spezzjonati fi żminijiet adatti u l-pjanti volontarji tal-patata għandhom ikunu ttestjati għall-organimżu; apparti minnhekk, għall-patata, it- tuberi maħsuda għandhom ikunu spezzjonati; 03/Vol. 23 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 411 — għall-ewwel sena tat-tkabbir wara dik speċifikata fl-ewwel vers, — fil-każ tal-patata biss patata taż-żriegħ attestata uffiċjalment għandha titkabbar kemm għaż- żerriegħa jew għall-bejgħ, — għal minn ta’ l-inqas it-tieni sena tat-tkabbir wara dik ta’ l-ewwel vers, — fil-każ tal-patata biss il-patata taż-żriegħ attestata uffiċjalment jew il-patata taż-żriegħ mkabbra taħt kontroll uffiċjali minn patata taż-żriegħ attestata uffiċjalment għandha tkun imkabbra kemm għaż- żerriegħa jew għall-bejgħ, — f’kull waħda mis-snin tat-tkabbir imsemmija fil-vrus ta’ qabel għandhom jittieħdu l-miżuri biex ikunu eliminati pjanti volontarji tal-patata u tat-tadam u l-pjanti ospitanti l-oħrajn ta’ l-organiżmu inkluż il- ħaxix solanin, u għandu jsir stħarriġ uffiċjali kif spjegati fid-dettal fl-Artikolu 2(1), u fil-każi fejn il- patata taż-żriegħ tkun imkabbra għall-produzzjoni taż-żriegħ għandhom isiru t-testijiet fuq it-tuberi; (ċ) immedjatament wara d-dikjarazzjoni tal-kontaminzzjoni permezz ta’ l-Artikolu 5(1)(a)(ii) u f’kull waħda mis-snin tat-tkabbir ta’ wara sal-, u jinkudi, l-ewwel staġun tat-tkabbir permissibbli tal-patata jew tat-tadam fl-għalqa iddikjarata bħala kkontaminata, kif spjegat fid-dettal fil-paragrafu (a): — il-makkinarju u l-faċilitajiet tal-ħażna kollha fuq il-post tal-produzzjoni u involuti fil-produzzjoni tal- patata u tat-tadam għandhom jiġu mnaddfa u, meta jkun xieraq, iddiżinfettati bl-użu ta’ metodi adatti, kif speċifikat fil-punt 3, — għandhom ikunu introdotti kif xieraq kontrolli uffiċjali fuq il-programmi ta’ l-irrigazzjoni u l-bexx, inkluża l-projbizzjoni ta’ dawn, biex tkun evitata l-firxa ta’ l-organiżmu; (d) f’unità tal-produzzjoni protetta ta’ l-uċuħ tar-raba’ iddikjarat bħala kkontaminat permezz ta’ l- Artikolu 5(1)(a)(ii) meta sostituzzjoni kompleta tal-medja tat-tkabbir tkun possibbli, — l-ebda tuberi jew pjanti tal-patata, jew pjanti ospitanti oħra ta’ l-organiżmu inklużi tat-tadam u taż- żerriegħa m’għandhom jitkabbru kemm-il darba l-unità msemmija ma kinitx suġġetta għal miżuri l-organiżmu u biex jitneħħa l-materjal kollu tal-pjanti uffiċjali ospitanti, inkluż, minn ta’ l-inqas, il-bidla kompleta fil-medja tat-tkabbir u fil-ħasil u, fejn xieraq, id- l-approvazzjoni għall- diżinfettar ta’ produzzjoni tal-patata jew tat-tadam mill-korpi uffiċjali responsabbli, u l-unità riferita u t-tagħmir kollu, u li wara tkun ingħatat ta’ sorveljanza biex ikun eliminat — għall-produzzjoni tal-patata, din il-produzzjoni għandha tkun minn patata taż-żriegħ attestata uffiċjalment, jew minn mini-tuberi jew mikro-pjanti li jkunu ġejjin minn sorsi ttestjati, — għandhom ikunu introdotti kif xieraq kontrolli uffiċjali fuq il-programmi ta’ l-irrigazzjoni u l-bexx, inkluża l-projbizzjoni ta’ dawn, biex tkun evitata l-firxa ta’ l-organiżmu. 4. 2 4. 2. Fiż-żona demarkata, mingħajr preġudizzju għall-miżuri spjegati għandhom: fid-dettal taħt 4. 1, l-Istati Membri (a) immedjatament, u għal minn ta’ l-inqas tliet snin tat-tkabbir, wara l-kontaminazzjoni ddikjarata: (aa) (aa) fil-każi meta ż-żona demarkata tkun ġiet stabbilita permezz ta’ l-Artikolu 5(1)(a)(iv), — jassiguraw sorveljanza mill-korpi uffiċjali responsabbli tagħhom fuq il-postijiet tat-tkabbir, tal-ħażna l-opreat tal-makkinarju u l-immaniġġjar ta’ tuberi tal-patata jew tat-tadam, flimkien mal-bini ta’ għall-produzzjoni tal-patata jew tat-tadam, — jesiġu t-tindif u, meta xieraq, id-diżinfettar tal-makkinarju u ta’ l-imħażen f’din il-proprjeta, bl-użu ta’ metodi addattati, kif speċifikat taħt il-punt 3, 412 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 03/Vol. 23 — jesiġu t-tkabbir biss ta’ żerriegħa attestata jew ta’ żerriegħa mkabbra taħt kontroll uffiċjali għall- uċuħ tar-raba’ kollha tal-patata fiż-żona demarkata, u l-ittestjar wara l-ħsad tal-patata taż-żriegħ li tkun tkabbret l-Artiko- lu 5(1)(a)(iii), stabbiliti bħala probabbilment ikkontaminati permezz ta’ f’postijiet — jesiġu l-immaniġġjar separat ta’ ħażniet ta’ żerriegħa tal-patata maħsuda minn dik intiża għall-bejgħ fil-bini kollu li jkun hemm fiż-żona, — imexxu stħarriġ uffiċjali kif spjegat fid-dettal fl-Artikolu 2(1), (ab) (ab) fil-każi ta’ fejn l-ilma tal-wiċċ ikun ġie ddikjarat bħala kontaminat permezz ta’ l-Artikolu 5(1)(ċ)(ii) jew inkluż fl-elementi għall-firxa possibbli ta’ l-organiżmu b’konformità mal-Anness V, il-punt 2, — iwettqu ta’ kull sena u fi żminijiet addattati stħarriġ, inkluż it-teħid ta’ kampjuni, ta’ l-ilma tal-wiċċ u tal-pjanti solanini ospitanti addattati li jkun hemm fis-sorsi relevanti ta’ l-ilma u ta’ l-ittestjar b’ konformità mal- — għall-materjal tal-pjanti msemmija, il-metodu relevanti stabbilit fl-Anness II, jew — fil-każi l-oħrajn, kwalunkwe metodu ieħor approvat uffiċjalment, — jintroduċu kontrolli uffiċjali fuq il-programmi ta’ l-irrigazzjoni u l-bexx, inkluża l-projbizzjoni fuq l- użu ta’ l-ilma iddikjarat bħala kontaminat għas-saqwi u għall-bexx tal-materjal tal-pjanti msemmija, u, meta xieraq, l-organiżmu. Din il- projbizzjoni tista’ tiġi riveduta fuq il-bażi tar-riżultati miksuba fl-imsemmi stħarriġ annwali, l-oħrajn biex tkun evitata l-firxa ta’ tal-pjanti ospitanti — fil-każi meta emissjonijiet ta’ l-iskart likwidu jkunu kkontaminati, jintroduċu kontrolli uffiċjali fuq id-disponiment ta’ l-ilma mill-bini industrijali ta’ l-ipproċessar jew ta’ l-ippakkjar li jkun jimmaniġġja l-materjal tal-pjanti msemmija; (b) jistabbilixxu programm, meta jkun xieraq, għas-sostituzzjoni tal-ħażniet kollha tal-patata taż-żriegħ matul perjodu xieraq ta’ żmien. 03/Vol. 23 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 413 ANNESS VII Il-faċilitajiet uffiċjali tad-disponiment ta’ konformi mad-disposizzjonijiet li ġejjin b’tali mod li jkun evitat ir-riskju tal-firxa ta’ l-organiżmu: (i) l-iskart ta’ l-ipproċessar tal-patata u tat-tadam (inkluż il-qxur mormija tal-patata u tat-tadam) u kwalunkwe skart ir-raba’ vers, għandhom ikunu l-iskart riferiti fl-Anness VI, il-paragrafu 1, solidu ieħor assoċjat mal-patata u mat-tadam għandu jew, — jindifen fil-fond f’sit ta’ disponiment li fih ma jkun hemm l-ebda riskju li dan jista’ jispiċċa f’art agrikola jew jiġi jittieħed f’kuntatt mas-sorsi direttament lejn is-sit taħt kondizzjonijiet ta’ konteniment li ma jwasslu għall-ebda riskju ta’ telf ta’ l-iskart, jew jistgħu jintużaw għall-irrigazzjoni l-art agrikola. L-iskart l-ilma li jista’ ta’ ta’ — inċinerazzjoni; (ii) l-ipproċessar ta’ l-iskart likwidu: qabel id-disponiment, l-iskart likwidu li jkollu solidi sospiżi fih għandu jkun iffiltrat jew jitħalla joqgħod biex jitneħħew dawn is-solidi. Dawn is-solidi għandhom jintremew kif stabbilit fis-subparagrafu (i). L-iskart likwidu għandu mbagħad ikun jew: — imsaħħan għal minimu ta’ 70 °C matul minn ta’ l-inqas 30 minuta, qabel ir-rimi, jew — inkella jiġi dispost, suġġett għal approvazzjoni uffiċjali u taħt il-kontroll uffiċjali, b’tali mod li ma jkun hemm l- jistgħu jintużaw għall- jiġi f’kuntatt ma’ art agrikola jew ma’ sorsi ta’ ebda riskju li irrigazzjoni ta’ l-art agrikola. Id-dettalji dwar dan għandhom ikunu nnotifikati lill-Istati Membri l-oħrajn u lill- Kummissjoni. l-iskart jista’ l-ilma li