title: Smernica Rady 98/57/ES z 20. júla 1998 o potláčaní choroby Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.

eurovoc_concepts:
food inspection
fruit vegetable
plant disease
plant health control
potato
protection of plant life

text: 03/zv. 23 SK (cid:2)radn(cid:7) vestn(cid:4)k Eur(cid:5)pskej œnie 375 31998L0057 21. 8. 1998 RADA EUR(cid:1)PSKEJ (cid:2)NIE, (cid:1)RADN(cid:2) VESTN˝K EUR(cid:3)PSKYCH SPOLO¨ENSTIEV L 235/1 SMERNICA RADY 98/57/ES z 20. jœla 1998 o potlÆŁan(cid:1) choroby Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. so zrete(cid:1)om na Zmluvu o zalo(cid:3)en(cid:4) Eur(cid:5)pskeho spoloŁenstva, najm(cid:6) na jej ŁlÆnok 43, ke(cid:2)(cid:3)e jedn(cid:7)m zo (cid:1)kodliv(cid:7)ch organizmov v zemiakoch a rajŁia- koch je Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. , patogØn hnedej hniloby zemiakov a baktØriovØho v(cid:6)dnutia zemiakov a rajŁiakov ke(cid:2)(cid:3)e v niektor(cid:7)ch Łastiach spoloŁenstva vypukli choroby sp(cid:8)sobovanØ t(cid:7)mto patogØnom a e(cid:1)te stÆle existujœ niektorØ obmedzenØ zdroje nÆkazy so zrete(cid:1)om na nÆvrh Komisie (1), so zrete(cid:1)om na stanovisko Eur(cid:5)pskeho parlamentu (2), ke(cid:2)(cid:3)e, ak sa neprijmœ œŁinnØ opatrenia t(cid:7)kajœce sa zemiakov a rajŁiakov, zameranØ na zis(cid:3)ovanie pr(cid:4)tomnosti tohto orga- nizmu a jeho roz(cid:1)(cid:4)renie, na zamedzovanie jeho v(cid:7)skytu a (cid:1)(cid:4)renia a, v pr(cid:4)pade jeho zistenia, na zamedzenie jeho (cid:1)(cid:4)renia a jeho potlaŁenie s cie(cid:1)om jeho vyhubenia, bude pestovanie zemiakov a rajŁiakov v celom spoloŁenstve vystavenØ znaŁ- nØmu riziku so zrete(cid:1)om na v(cid:7)boru (3), stanovisko HospodÆrskeho a sociÆlneho ke(cid:2)(cid:3)e (cid:1)kodliv(cid:7) organizmus Ralstonia solanacearum (Smith) Yabu- uchi et al. bol v minulosti znÆmy pod nÆzvom Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith ke(cid:2)(cid:3)e Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. sa pravdepodobne stane v(cid:1)eobecne uznÆvan(cid:7)m nÆzvom tohto organizmu ke(cid:2)(cid:3)e tÆto smernica by mala zobra(cid:3) na vedomie tento vedeck(cid:7) pokrok ke(cid:2)(cid:3)e v(cid:7)roba zemiakov a rajŁiakov zauj(cid:4)ma v po(cid:1)nohospodÆr- stve spoloŁenstva v(cid:7)znamnØ postavenie ke(cid:2)(cid:3)e œrody zemiakov a rajŁiakov neustÆle ohrozujœ (cid:1)kodlivØ organizmy ke(cid:2)(cid:3)e prostredn(cid:4)ctvom ochrany pestovania zemiakov a raj- Łiakov pred tak(cid:7)mito (cid:1)kodliv(cid:7)mi organizmami by sa mala nielen udr(cid:3)iava(cid:3) v(cid:7)robnÆ kapacita, ale aj zvy(cid:1)ova(cid:3) po(cid:1)nohospo- dÆrska produktivita ke(cid:2)(cid:3)e ochrannØ opatrenia zabra(cid:4)ujœce zaneseniu (cid:1)kodliv(cid:7)ch iba obme- organizmov na œzemie Łlensk(cid:7)ch (cid:1)tÆtov by mali dzen(cid:7) œŁinok, ak by sa tieto organizmy v celom spoloŁenstve sœŁasne ich (cid:1)(cid:4)reniu a metodicky nepotlÆŁali a nezabra(cid:4)ovalo sa (1) (cid:2). v. ES C 124, 21. 4. 1997, s. 12 a (cid:2). v. ES C 108, 7. 4. 1998, s. 85. (2) (cid:2). v. ES C 14, 19. 1. 1998, s. 34. (3) (cid:2). v. ES C 206, 7. 7. 1997, s. 57. ke(cid:2)(cid:3)e s cie(cid:1)om zabezpeŁenia uvedenØho musia by(cid:3) v spoloŁen- stve prijatØ niektorØ opatrenia ke(cid:2)(cid:3)e ŁlenskØ (cid:1)tÆty musia ma(cid:3) navy(cid:1)e v pr(cid:4)pade potreby mo(cid:3)nos(cid:3) prija(cid:3) (cid:2)al(cid:1)ie alebo pr(cid:4)snej(cid:1)ie opatrenia za predpokladu, (cid:3)e t(cid:7)m nevznikne prekÆ(cid:3)ka vo(cid:1)nØmu pohybu zemiakov a rajŁiakov v spoloŁenstve, s v(cid:7)nimkou pr(cid:4)padov stanoven(cid:7)ch v smernici Rady 779/93/EHS z 21. de- cembra 1976 o ochrann(cid:7)ch opatreniach zabra(cid:4)ujœcich zane- seniu organizmov (cid:1)kodiacich rastlinÆm a rastlinn(cid:7)m v(cid:7)robkom do spoloŁenstva a ich (cid:1)(cid:4)reniu v spoloŁenstve (4) ke(cid:2)(cid:3)e opatrenia musia bra(cid:3) zrete(cid:1) na skutoŁnos(cid:3), (cid:3)e na zis(cid:3)o- vanie pr(cid:4)tomnosti patogØna sœ potrebnØ systematickØ œradnØ prieskumy ke(cid:2)(cid:3)e takØto prieskumy by mali pozostÆva(cid:3) z kon- troln(cid:7)ch postupov a, kde je to vhodnØ, aj postupov t(cid:7)kajœcich sa odberu vzoriek a testov t(cid:7)chto vzoriek, nako(cid:1)ko za ist(cid:7)ch okolnost(cid:4) dan(cid:7)ch prostred(cid:4)m m(cid:8)(cid:3)e choroba zostÆva(cid:3) latentnou a nespozorovanou v rastœcich porastoch zemiakov, ako aj v skladovan(cid:7)ch h(cid:1)uzÆch zemiakov ke(cid:2)(cid:3)e (cid:1)(cid:4)renie patogØna v rÆmci rastœcich plod(cid:4)n nie je najd(cid:8)le(cid:3)itej(cid:1)(cid:4)m faktorom, ale ke(cid:2)(cid:3)e patogØn sa m(cid:8)(cid:3)e (cid:1)(cid:4)ri(cid:3) prostredn(cid:4)ctvom povrchovej vody a niektor(cid:7)ch pridru(cid:3)en(cid:7)ch divokorastœcich (cid:1)u(cid:1)kovit(cid:7)ch rastl(cid:4)n, a preto sa zdÆ, (cid:3)e zavla(cid:3)ovanie plod(cid:4)n zemiakov a rajŁiakov zneŁistenou vodou predstavuje riziko nÆkazy t(cid:7)chto plod(cid:4)n ke(cid:2)(cid:3)e patogØn m(cid:8)(cid:3)e pre(cid:3)(cid:4)va(cid:3) zimu v divokorastœcich (samovy- siatych) rastlinÆch zemiakov a rajŁiakov a tieto m(cid:8)(cid:3)u by(cid:3) zdrojom nÆkazy prenesenej z jednej sez(cid:5)ny do nasledujœcej ke(cid:2)(cid:3)e patogØn sa taktie(cid:3) (cid:1)(cid:4)ri kontaminÆciou zemiakov stykom s nakazen(cid:7)mi zemiakmi a stykom so zariadeniami pou(cid:3)(cid:4)va- n(cid:7)mi na sadenie, zber a spracovanie alebo prepravn(cid:7)mi a skla- dovac(cid:4)mi kontajnermi, ktorØ boli kontaminovanØ dan(cid:7)m orga- nizmom stykom s nakazen(cid:7)mi zemiakmi v minulosti (4) (cid:2). v. ES L 26, 31. 1. 1977, s. 20. Smernica naposledy zmenenÆ ((cid:2). v. ES L 15, Komisie smernicou 98/2/ES a doplnenØ 21. 1. 1998, s. 34). 376 SK (cid:2)radn(cid:7) vestn(cid:4)k Eur(cid:5)pskej œnie 03/zv. 23 ke(cid:2)(cid:3)e (cid:1)(cid:4)renie patogØna mo(cid:3)no zoslabi(cid:3) alebo mu predchÆdza(cid:3) dezinfekciou t(cid:7)chto predmetov ke(cid:2)(cid:3)e akÆko(cid:1)vek takÆto konta- minÆcia sadivov(cid:7)ch zemiakov predstavuje zÆva(cid:3)nØ riziko roz(cid:1)(cid:4)renia patogØna podobnØ zÆva(cid:3)nØ riziko (cid:1)(cid:4)renia patogØna predstavuje aj latentnÆ nÆkaza sadivov(cid:7)ch zemiakov, ktorej mo(cid:3)no predchÆdza(cid:3) pou(cid:3)(cid:4)van(cid:4)m sadivov(cid:7)ch zemiakov vyrobe- n(cid:7)ch v rÆmci œradne schvÆlenØho programu, v rÆmci ktorØho boli na sadivov(cid:7)ch zemiakoch vykonanØ testy, ktorØ preukÆzali, (cid:3)e nie sœ nakazenØ ke(cid:2)(cid:3)e sœŁasnØ vedomosti t(cid:7)kajœce sa biol(cid:5)gie a epidemiol(cid:5)gie choroby Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi sœ v eur(cid:5)pskych podmienkach neœplnØ a oŁakÆva sa, (cid:3)e v prie- behu nieko(cid:1)k(cid:7)ch sez(cid:5)n bude nutnØ preskœmanie navrhovan(cid:7)ch opatren(cid:4) vzh(cid:1)adom na (cid:2)al(cid:1)(cid:4) v(cid:7)voj sa podobne oŁakÆvajœ vylep- (cid:1)enia testovacieho postupu, najm(cid:6) v oblastiach citlivosti a (cid:1)pe- cifickosti testovac(cid:4)ch met(cid:5)d, aby sa zvolili a znormalizovali optimÆlne dostupnØ testovacie met(cid:5)dy et al. ke(cid:2)(cid:3)e s cie(cid:1)om urŁi(cid:3) podrobnost(cid:4) tak(cid:7)chto v(cid:1)eobecn(cid:7)ch opat- ren(cid:4), ako aj pr(cid:4)snej(cid:1)(cid:4)ch a (cid:2)al(cid:1)(cid:4)ch opatren(cid:4) vykonÆvan(cid:7)ch Łlen- sk(cid:7)mi (cid:1)tÆtmi s cie(cid:1)om zabrÆni(cid:3) zavleŁeniu patogØna na ich œzemie je (cid:3)iadœce, aby ŁlenskØ (cid:1)tÆty œzko spolupracovali s Komisiou v rÆmci StÆleho v(cid:7)boru pre zdravie rastl(cid:4)n ((cid:2)alej iba Ðv(cid:7)bor(cid:9)), ¨lÆnok 2 ¨lenskØ (cid:1)tÆty vykonÆvajœ ka(cid:3)doroŁnØ systematickØ œradnØ 1. prieskumy pr(cid:4)tomnosti (cid:1)kodlivØho organizmu v uvedenom rastlinnom materiÆli pochÆdzajœcom z ich œzemia. ¨lenskØ (cid:1)tÆty s cie(cid:1)om identifikÆcie ostatn(cid:7)ch mo(cid:3)n(cid:7)ch zdrojov konta- minÆcie ohrozujœcich v(cid:7)robu uvedenØho rastlinnØho materiÆlu vykonajœ anal(cid:7)zu riz(cid:4)k a, pokia(cid:1) poŁas tejto anal(cid:7)zy identifikujœ riziko roz(cid:1)(cid:4)renia (cid:1)kodlivØho organizmu, vykonajœ v oblastiach produkcie uvedenØho rastlinnØho materiÆlu cielenØ œradnØ prieskumy pr(cid:4)tomnosti (cid:1)kodlivØho organizmu v rastlinÆch in(cid:7)ch, ako je uveden(cid:7) rastlinn(cid:7) materiÆl, vrÆtane burinnØho spoloŁenstva patriaceho do Łe(cid:1)ade (cid:1)u(cid:1)kovit(cid:7)ch rastl(cid:4)n, ako aj v povrchovej vode pou(cid:3)(cid:4)vanej na zavla(cid:3)ovanie alebo postreko- vanie uvedenØho rastlinnØho materiÆlu a v tekut(cid:7)ch odpadoch vypœ(cid:1)(cid:3)an(cid:7)ch z prevÆdzkov(cid:7)ch priestorov priemyselnØho spra- covania alebo balenia, v ktor(cid:7)ch sa uveden(cid:7) rastlinn(cid:7) materiÆl spracœva, pou(cid:3)(cid:4)van(cid:7)ch na zavla(cid:3)ovanie alebo postrekovanie uvedenØho rastlinnØho materiÆlu. Rozsah t(cid:7)chto cielen(cid:7)ch prie- skumov sa stanov(cid:4) v sœlade so zistenou mierou rizika. ¨lenskØ (cid:1)tÆty m(cid:8)(cid:3)u taktie(cid:3) vykonÆva(cid:3) prieskumy v(cid:7)skytu (cid:1)kodlivØho organizmu v materiÆli, ako je napr(cid:4)klad zÆhradn(cid:4)cky substrÆt, zemina a tuh(cid:7) odpad z prevÆdzkov(cid:7)ch priestorov priemysel- nØho spracovania alebo balenia. 2. (cid:2)radnØ prieskumy uvedenØ v odseku 1 sa vykonÆvajœ: a) v pr(cid:4)pade uvedenØho rastlinnØho materiÆlu v sœlade s podrobnos(cid:3)ami stanoven(cid:7)mi v bode I oddielu II pr(cid:4)lohy I a PRIJALA T(cid:2)TO SMERNICU: ¨lÆnok 1 TÆto smernica sa t(cid:7)ka opatren(cid:4), ktorØ sa majœ v Łlensk(cid:7)ch (cid:1)tÆtoch vykona(cid:3) proti chorobe Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. , v minulosti znÆmej ako Pseudomonas solana- cearum (Smith) Smith, iba Ð(cid:1)kodliv(cid:7) organizmus(cid:9)) vo vz(cid:3)ahu k hostite(cid:1)sk(cid:7)m rastlinÆm tohto organizmu uveden(cid:7)m v oddiele 1 pr(cid:4)lohy I ((cid:2)alej iba Ðuveden(cid:7) rastlinn(cid:7) materiÆl(cid:9)), s cie(cid:1)om: ((cid:2)alej a) zisti(cid:3) jeho pr(cid:4)tomnos(cid:3) a roz(cid:1)(cid:4)renie b) zamedzi(cid:3) jeho v(cid:7)skytu a (cid:1)(cid:4)reniu a c) v pr(cid:4)pade jeho zistenia, zamedzi(cid:3) jeho (cid:1)(cid:4)reniu a potlaŁi(cid:3) ho s cie(cid:1)om jeho vyhubenia. a vody b) v pr(cid:4)pade hostite(cid:1)sk(cid:7)ch rastl(cid:4)n in(cid:7)ch ako uveden(cid:7) rastlinn(cid:7) materiÆl v sœlade s vhodn(cid:7)mi met(cid:5)dami priŁom, kde je to vhodnØ, sa odobe- rajœ vzorky, ktorØ sa podrobujœ œradn(cid:7)m laborat(cid:5)rnym testom alebo laborat(cid:5)rnym testom pod œradn(cid:7)m doh(cid:1)adom tekut(cid:7)ch odpadov, vrÆtane c) v pr(cid:4)pade inØho materiÆlu v sœlade s sœlade s vhodn(cid:7)mi met(cid:5)dami. Vo vz(cid:3)ahu k t(cid:7)mto prieskumom rozhodnœ o (cid:2)al(cid:1)(cid:4)ch podrob- nostiach t(cid:7)kajœcich sa kontroln(cid:7)ch postupov a poŁtu, p(cid:8)vodu, priestorovØho rozlo(cid:3)enia a naŁasovania odberu vzoriek zodpo- vednØ œradnØ orgÆny v zmysle smernice 77/93/EHS na zÆklade vhodn(cid:7)ch vedeck(cid:7)ch a (cid:1)tatistick(cid:7)ch princ(cid:4)pov a biol(cid:5)gie orga- nizmu, prihliadajœc na konkrØtne systØmy produkcie uvede- nØho rastlinnØho materiÆlu a, pod(cid:1)a vhodnosti, ostatn(cid:7)ch hosti- te(cid:1)sk(cid:7)ch rastl(cid:4)n (cid:1)kodlivØho organizmu v pr(cid:4)slu(cid:1)nom Łlenskom (cid:1)tÆte. Podrobnosti t(cid:7)kajœce sa œradn(cid:7)ch prieskumov a ich 3. v(cid:7)sledky sa v sœlade s ustanoveniami bodu 2 oddielu II pr(cid:4)lohy I ka(cid:3)doroŁne oznamujœ ostatn(cid:7)m Łlensk(cid:7)m (cid:1)tÆtom a Komisii. Tieto oznÆmenia sa odovzdÆvajœ do 1. jœna, s v(cid:7)nimkou oznÆ- men(cid:4) t(cid:7)kajœcich sa zemiakov pou(cid:3)(cid:4)van(cid:7)ch ako pestovate(cid:1)om ponechanØ sadivovØ zemiaky, pre ktorØ sa oznÆmenia odovzdÆ- vajœ do 1. septembra. Podrobnosti a v(cid:7)sledky pre plodiny sa t(cid:7)kajœ Podrobnosti z predchÆdzajœceho o t(cid:7)chto oznÆmeniach mo(cid:3)no odovzda(cid:3) v(cid:7)boru. produkcie roka. 03/zv. 23 SK (cid:2)radn(cid:7) vestn(cid:4)k Eur(cid:5)pskej œnie 377 V sœlade s postupom stanoven(cid:7)m v ŁlÆnku 16a smernice 4. 77/93/EHS sa pr(cid:4)jmu nasledovnØ ustanovenia: b) vykona(cid:3) kroky potrebnØ na vystopovanie p(cid:8)vodu mo(cid:3)nØho v(cid:7)skytu (cid:1)kodlivØho organizmu (cid:10) vhodnØ met(cid:5)dy pre prieskumy a laborat(cid:5)rne testy stano- venØ v bode b) prvØho pododseku odseku 2. V sœlade s postupom stanoven(cid:7)m v ŁlÆnku 16a smernice 5. 77/93/EHS sa m(cid:8)(cid:3)u prija(cid:3) nasledovnØ ustanovenia: (cid:10) vhodnØ met(cid:5)dy pre prieskumy a stanovenØ v bode c) prvØho pododseku odseku 2 (cid:10) s cie(cid:1)om zabezpeŁi(cid:3) porovnate(cid:1)nØ œrovne d(cid:8)very medzi testov stanoven(cid:7)ch Łlensk(cid:7)mi (cid:1)tÆtmi, (cid:2)al(cid:1)ie podrobnosti v druhom pododseku odseku 2. ¨lÆnok 3 ¨lenskØ (cid:1)tÆty zabezpeŁia, aby sa podozrenie na v(cid:7)skyt alebo potvrdenÆ pr(cid:4)tomnos(cid:3) (cid:1)kodlivØho organizmu na ich œzem(cid:4) ohlÆsila ich pr(cid:4)slu(cid:1)n(cid:7)m zodpovedn(cid:7)m œradn(cid:7)m orgÆnom. c) zavies(cid:3) na zÆklade odhadovanej œrovne rizika (cid:2)al(cid:1)ie prime- ranØ predbe(cid:3)nØ opatrenia, najm(cid:6) vo vz(cid:3)ahu k produkcii uvedenØho rastlinnØho materiÆlu a pohybu parti(cid:4) sadivo- v(cid:7)ch zemiakov in(cid:7)ch ako t(cid:7)ch uveden(cid:7)ch v bode a), vyro- ben(cid:7)ch na mieste, z ktorØho boli odobratØ vzorky uvedenØ v bode a), s cie(cid:1)om zabrÆni(cid:3) akØmuko(cid:1)vek (cid:1)(cid:4)reniu (cid:1)kodli- vØho organizmu. 3. V t(cid:7)ch pr(cid:4)padoch podozrenia na v(cid:7)skyt (cid:1)kodlivØho orga- nizmu, kedy hroz(cid:4) kontaminÆcia uvedenØho rastlinnØho mate- riÆlu alebo povrchovej vody z inØho ŁlenskØho (cid:1)tÆtu(och) alebo v inom Łlenskom (cid:1)tÆte(och), oznÆmi bezodkladne Łlensk(cid:7) (cid:1)tÆt, v ktorom sa podozrenie na v(cid:7)skyt (cid:1)kodlivØho organizmu vyskytlo, v zÆvislosti od identifikovanØho rizika, podrobnosti o danom podozren(cid:4) ŁlenskØmu (cid:1)tÆtu(om) a tieto ŁlenskØ (cid:1)tÆty potom primerane spolupracujœ. ¨lensk(cid:7) (cid:1)tÆt(y), ktor(cid:7) dostane takØto oznÆmenie(ia), zavedie v sœlade s odsekom 2c) prevent(cid:4)vne opatrenia a pod(cid:1)a vhod- nosti vykonÆ v sœlade s odsekmi 1 a 2 akØko(cid:1)vek (cid:2)al(cid:1)ie kroky. v(cid:7)skyt pr(cid:4)slu(cid:1)nØmu na ¨lÆnok 4 V sœlade s postupom stanoven(cid:7)m v ŁlÆnku 16a smernice 4. 77/93/EHS sa m(cid:8)(cid:3)e prija(cid:3) takØto ustanovenie: œradnØ orgÆny pr(cid:4)slu(cid:1)nØho ZodpovednØ 1. ŁlenskØho (cid:1)tÆtu(ov) zabezpeŁia, aby sa v ka(cid:3)dom z pr(cid:4)padov podozrenia na v(cid:7)skyt (cid:1)kodlivØho organizmu vykonali œradnØ laborat(cid:5)rne testy alebo laborat(cid:5)rne testy pod œradn(cid:7)m doh(cid:1)adom, v pr(cid:4)- pade uvedenØho rastlinnØho materiÆlu za pou(cid:3)itia relevantnej met(cid:5)dy stanovenej v pr(cid:4)lohe II, v sœlade s podmienkami stanoven(cid:7)mi v bode 1 pr(cid:4)lohy III, alebo vo v(cid:1)etk(cid:7)ch ostatn(cid:7)ch pr(cid:4)padoch, akejko(cid:1)vek inej œradne schvÆlenej met(cid:5)dy, s cie(cid:1)om potvrdi(cid:3) alebo vyvrÆti(cid:3) podozrenia na v(cid:7)skyt (cid:1)kodlivØho orga- nizmu. V pr(cid:4)pade potvrdenia podozrenia sa uplat(cid:4)ujœ po(cid:3)ia- davky stanovenØ v bode 2 pr(cid:4)lohy III. (cid:10) opatrenia uvedenØ v odseku 2c). ¨lÆnok 5 2. Do rozhodnutia o potvrden(cid:4) alebo vyvrÆten(cid:4) podozrenia na v(cid:7)skyt (cid:1)kodlivØho organizmu pod(cid:1)a odseku 1, v ka(cid:3)dom pr(cid:4)pade podozrenia na v(cid:7)skyt (cid:1)kodlivØho organizmu, kedy, bu(cid:2): i) boli pozorovanØ diagnostickØ pr(cid:4)znaky choroby sp(cid:8)sobo- vanej (cid:1)kodliv(cid:7)m organizmom a boli z(cid:4)skanØ pozit(cid:4)vne v(cid:7)sledky skr(cid:4)ningov(cid:7)ch testov tak, ako sœ uvedenØ v bode 1 oddielu I a oddiele II pr(cid:4)lohy II alebo, ii) boli z(cid:4)skanØ pozit(cid:4)vne v(cid:7)sledky skr(cid:4)ningov(cid:7)ch testov tak, ako sœ uvedenØ v bode 2 oddielu I a oddiele III pr(cid:4)lohy II, 1. Ak œradnØ laborat(cid:5)rne testy alebo laborat(cid:5)rne testy pod œradn(cid:7)m doh(cid:1)adom za pou(cid:3)itia relevantnej met(cid:5)dy stanovenej v pr(cid:4)lohe II v pr(cid:4)pade uvedenØho rastlinnØho materiÆlu, alebo vo v(cid:1)etk(cid:7)ch ostatn(cid:7)ch pr(cid:4)padoch akejko(cid:1)vek inej œradne schvÆ- lenej met(cid:5)dy potvrdia pr(cid:4)tomnos(cid:3) (cid:1)kodlivØho organizmu vo vzorke odobratej v sœlade s touto smernicou, sœ zodpovednØ (cid:1)tÆtne orgÆny pr(cid:4)slu(cid:1)nØho ŁlenskØho (cid:1)tÆtu, prihliadajœc na vhodnØ vedeckØ princ(cid:4)py, biol(cid:5)giu organizmu a konkrØtne produkŁnØ, distribuŁnØ a spracovate(cid:1)skØ systØmy pou(cid:3)(cid:4)vanØ v pr(cid:4)slu(cid:1)nom Łlenskom (cid:1)tÆte pre hostite(cid:1)skØ rastliny (cid:1)kodlivØho organizmu, povinnØ: sœ zodpovednØ (cid:1)tÆtne orgÆny Łlensk(cid:7)ch (cid:1)tÆtov vo vz(cid:3)ahu k ich vlastnej produkcii povinnØ: a) v pr(cid:4)pade uvedenØho rastlinnØho materiÆlu: a) zakÆza(cid:3) pohyb rastl(cid:4)n a h(cid:1)œz zo v(cid:1)etk(cid:7)ch plod(cid:4)n, parti(cid:4) alebo zÆsielok, z ktor(cid:7)ch boli odobratØ vzorky, s v(cid:7)nimkou kedy sa tak deje pod ich doh(cid:1)adom a za predpokladu, (cid:3)e bolo stanovenØ, (cid:3)e neexistuje identifikovate(cid:1)nØ riziko (cid:1)(cid:4)renia (cid:1)kodlivØho organizmu i) zaŁa(cid:3) vy(cid:1)etrovanie s cie(cid:1)om zisti(cid:3) rozsah a prvotn(cid:7) zdroje) kontaminÆcie v sœlade s ustanoveniami pr(cid:4)lohy IV, sœŁasne s (cid:2)al(cid:1)(cid:4)mi testami v sœlade s ŁlÆnkom 4 (1) aspo(cid:4) pri v(cid:1)etk(cid:7)ch porastoch klonovo pr(cid:4)buzn(cid:7)ch sadi- vov(cid:7)ch zemiakov a 378 SK (cid:2)radn(cid:7) vestn(cid:4)k Eur(cid:5)pskej œnie 03/zv. 23 ii) oznaŁi(cid:3) za kontaminovan(cid:7) uveden(cid:7) rastlinn(cid:7) materiÆl, partiu alebo zÆsielku, z ktorej bola vzorka odobratÆ, ako aj strojovØ zariadenie, vozidlo, plavidlo, sklad Łi jeho Łas(cid:3), ktorØ boli v styku s uveden(cid:7)m infikovan(cid:7)m rastlinn(cid:7)m materiÆlom; za kontaminovanØ treba taktie(cid:3) pod(cid:1)a vhodnosti oznaŁi(cid:3) polia, jednotky rastlinnej v(cid:7)roby a miesta produkcie rastlinnØho mate- riÆlu, z ktorØho bol uveden(cid:7) rastlinn(cid:7) materiÆl zozbe- ran(cid:7) a z ktorØho bola odobratÆ vzorka; v pr(cid:4)pade vzoriek odobrat(cid:7)ch poŁas vegetaŁnØho obdobia sa za kontaminovanØ musia oznaŁi(cid:3) polia, miesta produkcie a jednotky chrÆnenej rastlinnej v(cid:7)roby, z ktor(cid:7)ch bola vzorka odobratÆ a chrÆnenØ iii) urŁi(cid:3) 1 bodu v sœlade s ustanoveniami pr(cid:4)lohy V rozsah pravdepodobnej kontaminÆcie v d(cid:8)sledku styku s uveden(cid:7)m rastlinn(cid:7)m materiÆlom v priebehu zberovej Łi pozberovej manipulÆcie, v d(cid:8)sledku spoloŁ- alebo postrekovania nØho pestovania, zavla(cid:3)ovania alebo v d(cid:8)sledku klonovej s oznaŁenou kontaminÆciou a spojitosti iii) urŁi(cid:3) pravdepodobn(cid:7) rozsah kontaminÆcie a na zÆklade oznaŁenia kontaminÆcie pod(cid:1)a bodu ii) a mo(cid:3)nØho (cid:1)(cid:4)renia (cid:1)kodlivØho organizmu vyznaŁi(cid:3) bezpeŁnostnØ pÆsmo, prihliadajœc na ustanovenia bodov 1 a 2 ii) pr(cid:4)lohy V. ¨lenskØ (cid:1)tÆty v sœlade s ustanoveniami bodu 3 pr(cid:4)lohy 2. V bezodkladne oznÆmia ostatn(cid:7)m Łlensk(cid:7)m (cid:1)tÆtom a Komisii akœko(cid:1)vek kontaminÆciu oznaŁenœ pod(cid:1)a odsekov 1a) ii) a 1c) ii), ako aj podrobnosti o vyznaŁen(cid:4) bezpeŁnostnØho pÆsma pod(cid:1)a odseku 1a) iv) a, pod(cid:1)a vhodnosti, 1c) iii). (cid:2)daje nachÆ- dzajœce sa v oznÆmen(cid:4) pod(cid:1)a tohto odseku mo(cid:3)no odovzda(cid:3) v(cid:7)boru. ¨lenskØ (cid:1)tÆty sœŁasne odovzdajœ Komisii dodatoŁnØ oznÆmenie stanovenØ v bode 4 pr(cid:4)lohy V. (cid:2)daje nachÆdzajœce sa v oznÆ- men(cid:4) pod(cid:1)a tohto pododseku sa bezodkladne odovzdajœ Łlenom v(cid:7)boru. iv) vyznaŁi(cid:3) v sœlade s ustanoveniami bodu 2 i) pr(cid:4)lohy V a na zÆklade oznaŁenia kontaminÆcie pod(cid:1)a bodu ii), urŁenia rozsahu pravdepodobnej kontaminÆcie pod(cid:1)a bodu iii) a mo(cid:3)nØho roz(cid:1)(cid:4)renia (cid:1)kodlivØho organizmu bezpeŁnostnØ pÆsmo 3. Na zÆklade oznÆmenia pod(cid:1)a odseku 2 a informÆci(cid:4) v (cid:4)om uveden(cid:7)ch zaŁnœ ostatnØ ŁlenskØ (cid:1)tÆty uvedenØ v oznÆ- men(cid:4) vy(cid:1)etrovanie v sœlade s odsekom 1 a) i) a, pod(cid:1)a vhod- i) a pod(cid:1)a vhodnosti vykonajœ (cid:2)al(cid:1)ie opatrenia nosti, 1 c) v sœlade s odsekmi 1 a 2. b) v pr(cid:4)pade plod(cid:4)n alebo hostite(cid:1)sk(cid:7)ch rastl(cid:4)n, in(cid:7)ch ako tie, ktorØ sœ uvedenØ v bode a), ak je produkcia uvedenØho rastlinnØho materiÆlu identifikovanÆ ako rizikovÆ; i) zaŁa(cid:3) vy(cid:1)etrovanie v sœlade s bodom a) i) a ¨lÆnok 6 ii) oznaŁi(cid:3) ako kontaminovanØ rastliny (cid:1)kodlivØho organizmu, z ktor(cid:7)ch bola vzorka odobratÆ a tie hostite(cid:1)skØ iii) urŁi(cid:3) v sœlade s bodom a) iii) a iv) pravdepodobnœ kontaminÆciu a vyznaŁi(cid:3) bezpeŁnostnØ pÆsmo vz(cid:3)ahu- jœce sa na produkciu uvedenØho rastlinnØho materiÆlu c) pre povrchovœ vodu (vrÆtane tekut(cid:7)ch odpadov vypœ(cid:1)(cid:3)a- n(cid:7)ch z prevÆdzkov(cid:7)ch priestorov priemyselnØho spraco- vania alebo balenia, v ktor(cid:7)ch sa uveden(cid:7) rastlinn(cid:7) materiÆl spracœva) a burinnØ spoloŁenstvo hostite(cid:1)sk(cid:7)ch rastl(cid:4)n, ktorØ patr(cid:4) do Łe(cid:1)ade (cid:1)u(cid:1)kovit(cid:7)ch, kde sa produkcia uvedenØho rastlinnØho materiÆlu identifikuje ako rizikovÆ v d(cid:8)sledku zavla(cid:3)ovania, postrekov alebo zaplaven(cid:4)m povrchovou vodou, i) zaŁa(cid:3) vy(cid:1)etrovanie vrÆtane vhodne naŁasovanØho œrad- nØho prieskumu vzoriek povrchovej vody a, v pr(cid:4)pade jeho pr(cid:4)tomnosti, burinnØho spoloŁenstva hostite(cid:1)sk(cid:7)ch rastl(cid:4)n patriacich do Łe(cid:1)ade s cie(cid:1)om stanovi(cid:3) rozsah kontaminÆcie a (cid:1)u(cid:1)kovit(cid:7)ch, ii) oznaŁi(cid:3) v primeranom rozsahu a na zÆklade v(cid:7)sledkov vy(cid:1)etrovania pod(cid:1)a bodu i) povrchovœ vodu, z ktorej boli odobratØ vzorky ako kontaminovanØ a ¨lenskØ (cid:1)tÆty nariadia 1. zÆkaz pestovania uvedenØho rastlinnØho materiÆlu, ktor(cid:7) bol pod(cid:1)a ŁlÆnku 5 (1) a) ii) ozna- Łen(cid:7) za kontaminovan(cid:7) a stanovia, (cid:3)e tento materiÆl pod doh(cid:1)adom a so sœhlasom pr(cid:4)slu(cid:1)n(cid:7)ch (cid:1)tÆtnych orgÆnov podlieha jednØmu z ustanoven(cid:4) bodu 1 pr(cid:4)lohy VI, aby bolo mo(cid:3)nØ preukÆza(cid:3), (cid:3)e viac neexistuje identifikovate(cid:1)nØ riziko (cid:2)al(cid:1)ieho (cid:1)(cid:4)renia (cid:1)kodlivØho organizmu. ¨lenskØ (cid:1)tÆty nariadia 2. zÆkaz pestovania uvedenØho rastlinnØho materiÆlu, ktor(cid:7) bol pod(cid:1)a ŁlÆnku 5 (1) a) iii) a c) iii) oznaŁen(cid:7) za pravdepodobne kontaminovan(cid:7), vrÆtane uvedenØho rastlinnØho materiÆlu, pre ktor(cid:7) bolo identifikovanØ riziko a ktor(cid:7) bol vyprodukovan(cid:7) na miestach produkcie ozna- Łen(cid:7)ch za pravdepodobne kontaminovanØ pod(cid:1)a ŁlÆnku 5 (1) a) iii) a stanovia, (cid:3)e tento materiÆl, pod doh(cid:1)adom pr(cid:4)slu(cid:1)n(cid:7)ch (cid:1)tÆtnych orgÆnov sa tak, ako je to uvedenØ v bode 2 pr(cid:4)lohy VI, vyu(cid:3)ije alebo zne(cid:1)kodn(cid:4) tak, aby bolo mo(cid:3)nØ preukÆza(cid:3), (cid:3)e viac neexistuje identifikovate(cid:1)nØ riziko (cid:2)al(cid:1)ieho (cid:1)(cid:4)renia (cid:1)kodli- vØho organizmu. 3. ¨lenskØ (cid:1)tÆty nariadia zniŁenie alebo dezinfekciu met(cid:5)- dami uveden(cid:7)mi v bode 3 pr(cid:4)lohy VI akØhoko(cid:1)vek strojovØho zariadenia, vozidiel, plavidiel, skladov Łi ich Łast(cid:4) a ak(cid:7)chko(cid:1)- vek ostatn(cid:7)ch predmetov vrÆtane obalovØho materiÆlu, ktorØ boli pod(cid:1)a ŁlÆnku 5 (1) a) ii) oznaŁenØ za kontaminovanØ, alebo ktorØ boli pod(cid:1)a ŁlÆnku 5 (1) a) iii) a c) iii) oznaŁenØ za pravde- podobne kontaminovanØ. Po dezinfekcii sa tieto predmety viac nepova(cid:3)ujœ za kontaminovanØ. 03/zv. 23 SK (cid:2)radn(cid:7) vestn(cid:4)k Eur(cid:5)pskej œnie 379 4. Bez toho, aby boli dotknutØ opatrenia vykonÆvanØ pod(cid:1)a odsekov 1, 2 a 3, nariadia ŁlenskØ (cid:1)tÆty v bezpeŁnostnom pÆsme vymedzenom pod(cid:1)a ŁlÆnku 5 (1) a) iv) a c) iii) vyko- nanie skupiny opatren(cid:4) (cid:1)pecifikovan(cid:7)ch v bodoch 4. 1 a 4. 2 pr(cid:4)lohy VI. Podrobnosti o t(cid:7)chto opatreniach sa ka(cid:3)doroŁne oznÆmia ostatn(cid:7)m Łlensk(cid:7)m (cid:1)tÆtom a Komisii. (cid:2)daje nachÆ- dzajœce sa v oznÆmen(cid:4) pod(cid:1)a tohto odseku mo(cid:3)no odovzda(cid:3) v(cid:7)boru. ¨lÆnok 9 Bez toho, aby boli dotknutØ ustanovenia smernice 77/93/EHS, m(cid:8)(cid:3)u ŁlenskØ (cid:1)tÆty pre testovacie potreby, potreby vedeckØho v(cid:7)skumu a (cid:1)(cid:1)achtite(cid:1)skØ potreby v sœlade s ustanoveniami stanoven(cid:7)mi v smernici v(cid:7)nimky z opatren(cid:4) uveden(cid:7)ch v ŁlÆnkoch 6 a 8. 95/44/EHS (1) povoli(cid:3) ¨lÆnok 7 ¨lÆnok 10 1. ¨lenskØ (cid:1)tÆty nariadia, (cid:3)e sadivovØ zemiaky musia sp(cid:5)(cid:4)a(cid:3) po(cid:3)iadavky smernice 77/93/EHS a musia pochÆdza(cid:3) z priamej l(cid:4)nie materiÆlu zemiakov z(cid:4)skanØho v rÆmci œradne schvÆle- nØho mno(cid:3)ite(cid:1)skØho programu, oznaŁenØho na zÆklade œrad- n(cid:7)ch testov alebo testov pod œradn(cid:7)m doh(cid:1)adom vykonan(cid:7)ch za pou(cid:3)itia relevantn(cid:7)ch met(cid:5)d stanoven(cid:7)ch v pr(cid:4)lohe II za nenapadnut(cid:7) (cid:1)kodliv(cid:7)m organizmom. Vy(cid:1)(cid:1)ie uvedenØ testy Łlensk(cid:7) (cid:1)tÆt vykonÆ: ¨lenskØ (cid:1)tÆty m(cid:8)(cid:3)u v pr(cid:4)pade potreby prija(cid:3) vo vz(cid:3)ahu k vlastnej produkcii (cid:2)al(cid:1)ie a pr(cid:4)snej(cid:1)ie opatrenia na potlaŁenie (cid:1)kodlivØho organizmu alebo na zabrÆnenie jeho roz(cid:1)irovaniu, pokia(cid:1) sœ tieto opatrenia v sœlade so smernicou 77/93/EHS. Podrobnosti o t(cid:7)chto opatreniach sa oznÆmia ostatn(cid:7)m Łlen- sk(cid:7)m (cid:1)tÆtom a Komisii. (cid:2)daje nachÆdzajœce sa v tomto oznÆ- men(cid:4) sa m(cid:8)(cid:3)u odovzda(cid:3) v(cid:7)boru. a) v pr(cid:4)padoch, kedy bol potvrden(cid:7) v(cid:7)skyt(y) pr(cid:4)tomnosti sadivov(cid:7)ch organizmu produkcii v jeho (cid:1)kodlivØho zemiakov; ¨lÆnok 11 i) vykonan(cid:4)m testov vy(cid:1)(cid:1)(cid:4)ch mno(cid:3)ite(cid:1)sk(cid:7)ch stup(cid:4)ov vrÆtane klonovØho v(cid:7)chodiskovØho materiÆlu a systematick(cid:7)mi testami klonov zÆkladnØho sadivovØho materiÆlu, alebo ii) v pr(cid:4)padoch, v ktor(cid:7)ch preukÆzate(cid:1)ne neexistuje (cid:3)iadna klonovÆ spojitos(cid:3), vykonan(cid:4)m testov v(cid:1)etk(cid:7)ch klonov zÆkladnØho sadivovØho materiÆlu alebo vy(cid:1)(cid:1)(cid:4)ch mno(cid:3)ite(cid:1)- sk(cid:7)ch stup(cid:4)ov vrÆtane klonovØho v(cid:7)chodiskovØho mate- riÆlu a Zmeny a doplnenia pr(cid:4)loh k tejto smernici, ktorØ bude nutnØ vykona(cid:3) v d(cid:8)sledku v(cid:7)voja vedeck(cid:7)ch alebo technick(cid:7)ch vedo- most(cid:4), sa musia prija(cid:3) v sœlade s postupom stanoven(cid:7)m v ŁlÆnku 16a smernice 77/93/EHS. V pr(cid:4)pade met(cid:5)d stanove- n(cid:7)ch v pr(cid:4)lohe II a opatren(cid:4) v odsekoch 4. 1 a 4. 2 pr(cid:4)lohy VI k tejto smernici je Komisia povinnÆ vypracova(cid:3) sprÆvu o pre- skœman(cid:4) t(cid:7)chto met(cid:5)d a opatren(cid:4) na zÆklade z(cid:4)skan(cid:7)ch skœse- nost(cid:4), priŁom sprÆvu je povinnÆ predlo(cid:3)i(cid:3) v(cid:7)boru do 1. januÆra 2002. b) v ostatn(cid:7)ch pr(cid:4)padoch, bu(cid:2) na ka(cid:3)dej rastline klonovØho v(cid:7)chodiskovØho materiÆlu, alebo na reprezentat(cid:4)vnych vzor- kÆch zÆkladnØho sadivovØho materiÆlu, alebo vy(cid:1)(cid:1)(cid:4)ch mno(cid:3)ite(cid:1)sk(cid:7)ch stup(cid:4)ov. ¨lÆnok 12 V sœlade s postupom stanoven(cid:7)m v ŁlÆnku 16a smernice 2. 77/93/EHS mo(cid:3)no prija(cid:3) tieto ustanovenia: (cid:10) podrobnØ pravidlÆ uplat(cid:4)ovania bodu a) druhØho podod- seku odseku 1, (cid:10) pravidlÆ t(cid:7)kajœce sa reprezentat(cid:4)vnych vzoriek uveden(cid:7)ch v bodu b) druhØho pododseku odseku 1. ¨lenskØ (cid:1)tÆty uvedœ do uŁinnosti zÆkony, 1. inØ prÆvne predpisy a sprÆvne opatrenia potrebnØ na dosiahnutie sœladu s touto smernicou s œŁinnos(cid:3)ou od 21. augusta 1999. Bezod- kladne o tom informujœ Komisiu. Pri prij(cid:4)man(cid:4) t(cid:7)chto opatren(cid:4) v nich ŁlenskØ (cid:1)tÆty uvedœ odkaz na tœto smernicu alebo spoja tak(cid:7)to odkaz s ich œradn(cid:7)m uverejnen(cid:4)m. Met(cid:5)dy tvorby tak(cid:7)chto odkazov ustanovia Łlen- skØ (cid:1)tÆty. ¨lÆnok 8 2. ¨lenskØ (cid:1)tÆty bezodkladne oznÆmia Komisii zÆkladnØ ustanovenia vnœtro(cid:1)tÆtneho prÆva, ktorØ prijmœ v oblasti upra- venej touto smernicou. Komisia o tom bude informova(cid:3) ostatnØ ŁlenskØ (cid:1)tÆty. ¨lenskØ (cid:1)tÆty zakÆ(cid:3)u dr(cid:3)bu a manipulÆciu so (cid:1)kodliv(cid:7)m orga- nizmom. (1) (cid:2). v. ES L 184, 3. 8. 1995, s. 34. Smernica naposledy zmenenÆ alebo doplnenÆ smernicou Komisie 97/46/ES ((cid:2). v. ES L 204, 31. 7. 1997, s. 43). 380 SK (cid:2)radn(cid:7) vestn(cid:4)k Eur(cid:5)pskej œnie 03/zv. 23 ¨lÆnok 13 V Bruseli 20. jœla 1998 TÆto smernica nadobœda œŁinnos(cid:3) d(cid:4)om jej uverejnenia v (cid:1)radnom vestn(cid:2)ku Eur(cid:3)pskych spoloŁenstiev. TÆto smernica je adresovanÆ Łlensk(cid:7)m (cid:1)tÆtom. ¨lÆnok 14 Za Radu predseda W. MOLTERER 03/zv. 23 SK Úradný vestník Európskej únie 381 PRÍLOHA I ODDIEL I Zoznam hostiteľských rastlín Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. uvedený v článku 1 Rastliny druhu Sonanum tuberosum L. (vrátane hľúz), okrem semien Rastliny druhu Lycopersicon lycopersicum (L. ) Karsten ex Farw. , okrem plodov a semien zemiak rajčiak ODDIEL II Prieskumy 1. Úradné prieskumy uvedené v článku 2 (2) a) sa zakladajú na biológii príslušného organizmu a konkrétnych produkčných systémoch členských štátov a pozostávajú z: i) v prípade zemiakov, — vizuálnych kontrol porastov počas vhodných období a/alebo odoberania vzoriek sadivových, ako aj ostat- ných druhov zemiakov počas vegetačného obdobia alebo zo skladov. Na týchto vzorkách sa potom rezom hľúz vykonajú úradné vizuálne kontroly alebo vizuálne kontroly pod úradným dohľadom — v prípade sadivových zemiakov a, kde je to vhodné, ostatných druhov zemiakov, úradných laboratórnych testov alebo laboratórnych testov pod úradným dohľadom, prostredníctvom metódy stanovenej v prílohe II, ii) v prípade rajčiakov, — vizuálnych kontrol, počas vhodných období, aspoň tých porastov, ktoré sú určené na ďalšiu výsadbu s cieľom profesionálneho použitia. 2. Oznámenia o úradných prieskumoch uvedené v článku 2 (3) obsahujú: i) v prípade prieskumov zemiakov: — odhad celkovej vysadenej plochy pre sadivové a ostatné zemiaky v hektároch, — rozvrstvenie podľa kategórií sadivových zemiakov a konzumných zemiakov a, kde je to vhodné, podľa regiónov, — počet vzoriek odobratých na testovanie a termín ich odobratia — počet vizuálnych kontrol v teréne, — počet vizuálnych kontrol hľúz (a veľkosť odobratých vzoriek) ii) v prípade prieskumov aspoň tých porastov rajčiakov, ktoré sú určené na ďalšiu výsadbu s cieľom profesionál- neho použitia: — odhad celkového počtu rastlín, — počet vizuálnych kontrol iii) v prípade prieskumov hostiteľských rastlín iných ako zemiaky a rajčiaky vrátane burinného spoločenstva patriaceho do čeľade ľuľkovitých: — druhy, — počet odobratých vzoriek a termín ich odobratia, — oblasť alebo, podľa vhodnosti, rieka pôvodu vzoriek, — metóda rozboru iv) v prípade prieskumov vody a tekutých odpadov vypúšťaných z prevádzkových priestorov priemyselného spracovania alebo balenia: — počet odobratých vzoriek a termín ich odobratia, — oblasť, rieka, alebo, podľa vhodnosti, miesto prevádzkových priestorov pôvodu vzoriek, — metóda rozboru. 382 SK Úradný vestník Európskej únie 03/zv. 23 PRÍLOHA II TESTOVACIA SCHÉMA PRE DIAGNOSTIKU, URČOVANIE PRÍTOMNOSTI A IDENTIFIKÁCIU RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL. Predložená schéma popisuje rozličné postupy používané pri: ROZSAH TESTOVACEJ SCHÉMY i) diagnostike baktériovej hnedej hniloby v hľuzách zemiakov a baktériového vädnutia v rastlinách zemiakov a raj- čiakov ii) určovaní prítomnosti Ralstonia solanacearum vo vzorkách hľúz zemiakov iii) identifikácii Ralstonia solanacearum. V dodatkoch sú uvedené podrobnosti týkajúce sa prípravy testovacích materiálov, t. roztokov, činidiel. j. živných pôd, pufrov a iných OBSAH: ODDIEL I: Aplikácia testovacej schémy 1. Diagnostika hnedej hniloby v hľuzách zemiakov a baktériového vädnutia v rastlinách zemiakov a rajčiakov. 9 9 2. Určovanie prítomnosti a identifikácia Ralstonia solanacearum vo vzorkách hľúz zemiakov. 11 ODDIEL II: Diagnostika hnedej hniloby v hľuzách zemiakov a baktériového vädnutia v rastlinách zemiakov a rajčiakov 1. Príznaky. 2. Skríningové testy. 3. Izolácia baktérií. 4. Potvrdzovacie testy. ODDIEL III: Určovanie prítomnosti a identifikácia Ralstonia solanacearum vo vzorkách hľúz zemiakov 1. Príprava vzorky na test. 2. Imunofluorescenčný (IF) test. 3. Test ELISA (Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay). 4. Polymerázová reťazová reakcia (test PCR™). 5. Selektívny platňový rozter. 6. Biotest. 7. Obohacovacie testy. 8. Test patogenity. Dodatok 1 Živné pôdy pre izoláciu a kultiváciu Ralstonia solanacearum. Dodatok 2 Materiály pre prípravu vzoriek. Dodatok 3 Materiály pre test IF. Dodatok 4 Určenie stupňa kontaminácie pri teste IF. Dodatok 5 Materiály pre test ELISA. Dodatok 6 Materiály pre test PCR. Dodatok 7 Materiály pre selektívny platňový rozter a obohacovacie testy. Bibliografia. 13 13 13 14 14 17 17 18 20 20 22 23 23 23 24 25 26 27 28 29 29 30 03/zv. 23 SK Úradný vestník Európskej únie 383 ODDIEL I APLIKÁCIA TESTOVACEJ SCHÉMY 1. Diagnostika hnedej hniloby v hľuzách zemiakov a baktériového vädnutia v rastlinách zemiakov a rajčiakov Tento testovací postup je určený pre hľuzy zemiakov s príznakmi typickými pre hnedú hnilobu alebo vzbudzujúcimi podozrenie na hnedú hnilobu a pre rastliny zemiakov a rajčiakov s príznakmi typickými pre baktériové vädnutie alebo vzbudzujúcimi podozrenie na baktériové vädnutie. Skladá sa zo skríningového testu, izolácie patogéna z nakazeného cievneho pletiva na diagnostickom médiu a, v prí- pade pozitívneho výsledku, identifikácie kultúry ako Ralstonia solanacearum. Znázornenie vývojovým diagramom 384 SK Úradný vestník Európskej únie 03/zv. 23 Odkazy z vývojového diagramu vyššie: (1) Popis príznakov sa nachádza v oddiele II. 1. (2) Skríningové testy uľahčujú predbežnú diagnostiku. Vhodné sú tieto testy: — Skríningový test výtoku slizu z cievnych zväzkov stonky (oddiel II. 2), — Test prítomnosti granúl poly-ß-hydroxybutyrátu (oddiel II. 2) — Test IF (oddiel III. 2) — Test ELISA (oddiel III. 3) — Test PCR (oddiel III. 4) (3) Hoci je izolácia patogéna z rastlinného materiálu s typickými príznakmi prostredníctvom zrieďovacích rozterov priama, zakladanie kultúr môže v pokročilých štádiách nákazy zlyhať. Saprofytické baktérie, ktoré rastú v odum- retom pletive, môžu v izolačnom médiu patogén prerásť alebo inhibovať. Ak je test izoláciou negatívny, ale príz- naky choroby sú typické, je nutné izoláciu opakovať, najlepšie testom selektívnym platňovým rozterom. (4) Spoľahlivá identifikácia Ralstonia solanacearum sa dosiahne minimálne jedným testom uvedeným v oddiele II. 4. 1 v kombinácii s testom patogenity (oddiel II. 4. 3). Charakterizácia kmeňa je nepovinná, ale odporúča sa pre každý nový prípad. 03/zv. 23 SK Úradný vestník Európskej únie 385 2. Určovanie prítomnosti a identifikácia Ralstonia solanacearum vo vzorkách hľúz zemiakov Tento testovací postup je určený pre určovanie prítomnosti latentných infekcií hľúz zemiakov prostredníctvom jedného alebo viacerých (preferovaná možnosť) skríningových testov, ktoré sa, v prípade ich pozitívneho výsledku, dopĺňajú o izoláciu patogéna v prípade izolácie typických kolónií nasleduje identifikácie kultúry ako Ralstonia solanacearum. Znázornenie vývojovým diagramom 386 SK Úradný vestník Európskej únie 03/zv. 23 Odkazy z vývojového diagramu vyššie: (1) V e ľ k o s ť v z o r k y Štandardná veľkosť vzorky je 200 hľúz. Postupy však možno bez problémov aplikovať na vzorkách menších ako 200 hľúz. (2) S k r í n i n g o v é t e s t y Jediný test nemusí byť dostatočne citlivý alebo spoľahlivý na to, aby sa ňou dala vo vzorke zistiť Ralstonia solanacearum. Preto sa odpo- rúča viac testov, pričom tieto testy by sa mali podľa možností zakladať na rozdielnych biologických princípoch. (3) I m u n o f l u o r e s c e n č n ý ( I F ) t e s t Test IF je osvedčený skríningový test. Je preto výhodný v porovnaní s ostatnými testami, ktoré ešte nie sú plne vyvinuté alebo uznané za osvedčené. Používa sa pre mnohé iné karanténne baktérie, napr. Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Pri použití parametrov odčítavania hodnôt špecifikovaných v rámci tejto metódy ide o citlivý test (prah citlivosti 103-104 buniek na ml peletu zemiakového extraktu). Kritickým faktorom podmieňujúcim spoľahlivosť výsledku testu je kvalita antiséra. Prípustné je výhradne antisérum s vysokým titrom (najmenej 2000 pre surové antisérum) a všetky testy musia byť vykonané na úrovni titra antiséra alebo zriedenia pod úroveň titra. Uprednostňuje sa nepriama metóda. Priamu metódu možno použiť, ak úroveň citlivosti a špecifickosť testu zodpovedá nepriamej metóde. Test IF má výhodu subjektívneho výkladu morfológie sfarbenia buniek a intenzity fluorescencie, ktorý poskytuje informácie o špeci- fickosti reakcie. Krížové reakcie vyvolané sérologicky príbuznými baktériami s morfológiou buniek Ralstonia solanacearum z pôdy alebo pletív zemiakov sú bežné. Test IF možno použiť ako jediný skríningový test, v prípadoch keď existuje podozrenie na krížové reakcie, by sa mal vykonať ďalší skríningový test, založený na rozdielnom biologickom princípe. V takýchto prípadoch je najvhodne- jším testom selektívny platňový rozter. (4) S e l e k t í v n y p l a t ň o v ý r o z t e r Pri použití modifikovanej živnej pôdy SMSA a metodológie testu uvedenej v rámci tejto metódy ide o citlivý a selektívny test prítomnosti Ralstonia solanacearum. Výsledok je k dispozícii 3 až 6 dní po príprave vzorky. Patogén sa získa priamo z kultúry a možno ho ihneď identifikovať. Využitie plného potenciálu testu si vyžaduje obozretnú prípravu pupkových koncov hľúz tak, aby sa zamedzila prítomnosť druhotných baktérií nachádzajúcich sa v hľuzách zemiakov, ktoré v živnej pôde konkurujú Ralstonia solana- cearum a môžu ovplyvniť vývoj patogéna. Niektoré kmene môžu rásť nedokonalo, nakoľko zložky živnej pôdy môžu ovplyvniť cieľový organizmus. Taktiež je potrebná opatrnosť pri odlišovaní Ralstonia solanacearum od ostatných baktérií, ktoré môžu narásť v živnej pôde. Selektívny platňový rozter možno použiť ako jediný test za predpokladu, že v prípadoch, kedy existuje podozrenie na inhibíciu Ralstonia solanacearum inými baktériami na platniach a výsledok testu je negatívny, vzorka sa preskúša iným testom, ktorá potvrdí alebo vyvráti pôvodnú diagnózu. V takýchto prípadoch je najvhodnejším testom test IF. (5) T e s t E L I S A Test ELISA je vo všeobecnosti menej citlivý ako test IF (prah citlivosti 104-105 buniek na ml peletu zemiakového extraktu). Test nie je nákladný a je rýchly, je ale vo všeobecnosti náchylnejší na falošné pozitívne (krížové reakcie) a negatívne (inhibícia fenolovými mole- kulami v zemiakovom extrakte) výsledky. Požiadavky na špecifičnosť antiséra sú mimoriadne vysoké. Test ELISA nemožno používať ako jediný skríningový test. (6) T e s t P C R Test PCR potenciálne umožňuje veľmi citlivú detekciu, hoci býva ľahko inhibovaná zložkami extraktov z rastlín alebo hľúz, dôsledkom čoho sú falošné negatívne výsledky. Niektoré odrody zemiakov obsahujú viacero inhibítorov ako iné. Je teda potrebné tieto inhibítory odstrániť. Inhibíciu možno zredukovať zriedením, tým sa však zriedia aj populácie Ralstonia solanacearum. Počas všetkých krokov prípravy vzorky a testu sa musí venovať veľká pozornosť tomu, aby sa zabránilo kontaminácii, nakoľko jej dôsledkom sú falošné pozitívne výsledky. Falošné pozitívne výsledky môžu nastať aj v dôsledku homológnych sekvencií iných organizmov. Z týchto dôvodov nemožno priamy test PCR používať ako jediný skríningový test. (7) O b o h a c o v a c í t e s t Inkubovaním vzoriek peletov zo zemiakového extraktu v poloselektívnej živnej pôde, ako je napríklad modifikovaný živný roztok SMSA, sa umožňuje množenie Ralstonia solanacearum. Čo je však možno ešte dôležitejšie, takouto inkubáciou sa riedia potenciálne inhibítory testov ELISA alebo PCR. Ralstonia solanacearum v obohatenom živnom roztoku tak možno zistiť testami IF, ELISA a PCR. Tvorbu priameho rozteru z obohatených živných roztokov neodporúčame. Tieto obohacovacie metódy zatiaľ neboli dostatočne odskúšané a otestované. Sú na tomto mieste začlenené, pretože majú kvalitný potenciál. Vzhľadom na relatívne malé skúsenosti ich však nemožno používať ako jediné metódy určovania prítomnosti. (8) B i o t e s t Biotest sa používa na izoláciu Ralstonia solanacearum z peletov zemiakového extraktu prostredníctvom selektívneho obohatenia v hostiteľskej rastline a možno ju aplikovať na rastliny rajčiaku a baklažánu. Test si vyžaduje optimálne inkubačné podmienky tak, ako sú uvedené v rámci tejto metódy. Baktérie inhibujúce Ralstonia solanacearum v živnej pôde SMSA do tohto testu najpravdepodob- nejšie zasahovať nebudú. (9) P o t v r d z o v a c í t e s t ( y ) Spoľahlivá identifikácia čistej kultúry Ralstonia solanacearum sa dosiahne aspoň jedným z testov uvedených v oddiele II. 4. 1 v kombi- nácii s testom patogenity (oddiel II. 4. 3). Charakterizácia kmeňa je nepovinná, ale odporúča sa pre každý nový prípad. 03/zv. 23 SK Úradný vestník Európskej únie 387 Diagnostika hnedej hniloby v hľuzách zemiakov a baktériového vädnutia v rastlinách zemiakov a rajčiakov ODDIEL II 1. 1. 1. Príznaky P r í z n a k y n a z e m i a k o c h Rastlina zemiaka. V rannom štádiu nákazy listy vädnú vo vrchnej časti rastliny pri vysokých teplotách počas dňa, pričom cez noc sa zotavia. Vädnutie sa rýchlo stane nezvratným a jeho dôsledkom je odumretie rastliny. Cievne zväzky priečne rozrezaných stoniek zvädnu- tých rastlín môžu zhnednúť a z povrchu rezu sa vylučuje mliečny slizovitý exkrét – buď samovoľne, alebo ho možno stlačením ľahko vytlačiť. Ak sa odrezaná stonka umiestni zvislo do vody, z cievnych zväzkov vytekajú vlákna slizu. Hľuza zemiaka. Hľuzy zemiaka sa musia rozrezať priečne, blízko pupkového (stolónového) konca. Ranné štádium nákazy sa prejavuje sklo- vito žltým až svetlo hnedým sfarbením cievnych zväzkov, z ktorých sa začne vylučovať svetlosmotanový slizovitý exkrét – buď spontánne po niekoľkých minútach, alebo vyvinutím jemného tlaku palcami na šupu blízko povrchu rezu. Neskôr sa cievne sfarbenie zmení na zreteľ- nejšie hnedé a odumieranie pletiva sa môže rozšíriť na parenchymatózne pletivo. V pokročilých štádiách nákaza postupuje smerom od pupkového konca a očiek, výsledkom čoho môžu byť červenkasto hnedé, mierne vtlačené lézie na šupe, z ktorých sa môže vylučovať baktériový sliz, ktorý spôsobuje prilínanie častíc zeminy. 1. 2. P r í z n a k y n a r a j č i a k u Rastlina rajčiaka. Prvým viditeľným príznakom je ochabnutý vzhľad najmladších listov. Za podmienok priaznivých pre patogény (teplota pôdy 25 °C, nasýtená vlhkosť vzduchu), nasleduje do niekoľkých dní epinastia a vädnutie jednej strany rastliny alebo celej rastliny, čo má za následok jej celkový kolaps. Za menej priaznivých podmienok (teplota pôdy pod 21 °C) sa na stonke môže vyvinúť veľký počet postran- ných výhonkov. Pozdĺž stonky možno pozorovať slizovitý pás, ktorý svedčí o odumieraní cievneho systému. Pri priečnom reze stonky sfarbené hnedé cievne zväzky vylučujú kvapky hustého bieleho alebo žltkastého baktériového slizu. 2. Skríningové testy Skríningové testy uľahčujú predbežnú diagnostiku. Použite jeden alebo viacero z týchto testov: Skríningový test stonky Prítomnosť Ralstonia solanacearum vo vädnúcich stonkách zemiaka alebo rajčiaku možno stanoviť nasledujúcimi jednoduchým predbežným testom: Odrežte stonku v úrovni nad zeminou. Umiestnite povrch rezu do kade s vodou. O malú chvíľu začnú z cievnych zväzkov samovoľne vytekať vlákna baktériového slizu. Žiadne iné baktérie spôsobujúce nákazu cievnych zväzkov v rastlinách zemiaka alebo rajčiaka nespôso- bujú takýto fenomén. Určovanie prítomnosti granúl poly-ß-hydroxybutyrátu Granule PHB v bunkách Ralstonia solanacearum sa zviditeľňujú sfarbením prostredníctvom nílskej modrej A alebo sudánskej čiernej B. Pripravte si buď rozter slizovitého exkrétu, alebo suspendovaného pletiva na podložné mikroskopické sklíčko, alebo pripravte 48 hodinovú kultúru na živných pôdach YPGA, alebo SPA (dodatok 1). Pripravte si pozitívny kontrolný rozter kmeňa biovaru-2/rasy-3 a, ak to považu- jete za užitočné, negatívny kontrolný rozter heterologného kmeňa. Nechajte vyschnúť. Prejdite spodnou stranou sklíčka niekoľkokrát rýchlo ponad plameň, pokiaľ sa rozter nezafixuje. T e s t n í l s k o u m o d r o u 1. Zalejte zafixovaný rozter 1 % vodným roztokom nílskej modrej. Inkubujte 10 minút pri teplote 55 °C. 2. Nechajte odtiecť farbiaci roztok. Krátko opláchnite pod jemne tečúcou vodou. Odstráňte nadbytočnú vodu pijavým papierom. 3. Zalejte rozter 8 % vodným roztokom kyseliny octovej. Inkubujte 1 minútu pri laboratórnej teplote. 4. Umyte pod jemne tečúcou vodou. Odsajte vodu jemným pijavým papierom. 5. Opätovne zvlhčite kvapkou vody. Zakryte krycím sklíčkom. 6. Preskúmajte sfarbený rozter epifluorescenčným mikroskopom pri vlnovej dĺžke 450 nm a olejovej imerzii pri zväčšení 1:1000. Všímajte si sýtooranžovú fluorescenciu granúl PHB. Pozorujte taktiež za bežného svetla a uistite sa, či sú granule vnútrobunkové a či morfológia buniek zodpovedá Ralstonia solanacearum. 388 SK Úradný vestník Európskej únie 03/zv. 23 T e s t s u d á n s k o u č i e r n o u 1. Fixovaný rozter sa zaleje 0,3 % roztokom sudánskej čiernej B v 70 % etanole. Inkubuje sa pri laboratórnej teplote počas 10 minút. 2. Roztok farbiva sa nechá odtiecť. Rozter sa potom krátko oplachuje pod tečúcou vodou. Prebytočná voda sa odsaje pijavým papierom. 3. Rozter sa nakrátko ponorí do xylolu. Po vytiahnutí sa opäť osuší pijavým papierom. Pozor! Xylol je zdraviu škodlivá látka! Nevyhnutne sa musí pracovať v digestore! 4. Rozter sa zaleje 0,5 % (hmotnosť/objem) vodným roztokom safranínu a nechá sa počas 10 sekúnd stáť pri laboratórnej teplote. Pozor! Safranín je zdraviu škodlivá látka! Nevyhnutne sa musí pracovať v digestore! 5. Rozter sa opláchne pod slabo tečúcou vodou. Osuší sa pijavým papierom. Priloží sa krycie sklíčko. 6. Sfarbený rozter sa pozoruje ako preparát v mikroskope s prechádzajúcim svetlom, s olejovou imerziou pri zväčšení 1:1000. Granule PHB v bunkách Ralstonia solanacearum sú modro-čierno sfarbené. Bunkové steny majú farbu ružovo červenú. I n é t e s t y Z iných testov sú vhodnými Test IF (oddiel III. 2), test ELISA (oddiel III. 3) a test PCR (oddiel III. 4). 3. 3. 1 3. 2 3. 3 3. 4 Postup pri izolácii Odoberie sa slizovitý exkrét alebo časť diskolorovaného pletiva z cievnych zväzkov zemiakovej hľuzy alebo z cievnych pletív stonky rastliny zemiaka alebo rajčiaka. Urobí sa suspenzia v malom objeme sterilnej destilovanej vody alebo v 50 mM fosfátovom pufri, ktorý sa nechá 5 až 10 minút stáť. Zo suspenzie sa pripravia minimálne dve desatinné riedenia (1/10 a 1/100), v prípade potreby aj viacero. Štandardizovaný objem suspenzie a jednotlivých riedení prenesieme na univerzálnu živnú pôdu (NA, YPGA a SPA, dodatok 1) a/alebo na Kelmanovo tetrazóliové médium (dodatok 1) a/alebo na selektívnu živnú pôdu SMSA (dodatok 7). Riedenia rozotrieme na platne s pou- žitím primeranej metódy. Vhodné je pripraviť si samostatné platne z každej použitej živnej pôdy so zriedenou kultúrou bunkovej suspenzie biovaru-2/rasy-3 kmeňa Ralstonia solanacearum ako pozitívnu kontrolu. Platne sa nechajú inkubovať pri teplote 28 °C počas 3 dní. Pri pomalom raste je možné dobu inkubácie predĺžiť na 6 dní, pričom sa však kolónie baktérií v živnej pôde SMSA často stávajú atypickými a odumierajú. Na univerzálnych živných substrátoch virulentné izoláty Ralstonia solanacearum vytvárajú perlovobiele, ploché, nepravidelné a fluidné kolónie, často s charakteristickými špirálkami. Na Kelmanovom tetrazóliovom médiu vytvárajú virulentné izoláty Ralstonia solanacearum typické krémovo sfarbené, ploché, nepravidelné fluidné kolónie s krvavo červeno zafarbeným stredom. Nevirulentné formy Ralstonia solanacearum naproti tomu vytvárajú maslovité, tmavočervené kolónie. V živnej pôde SMSA vytvárajú virulentné izoláty Ralstonia solanacearum mliečnobiele, ploché, nepravidelné a fluidné kolónie s krvavo červeno zafarbeným stredom. Nevirulentné formy Ralstonia solanacearum vytvárajú v živnej pôde SMSA kolónie menej fluidné, ktoré sú úplne ružové až červené. 3. 5 Kolónie s charakteristickou morfológiou sa subkultivujú až do čistej kultúry na niektorej univerzálnej živnej pôde. Je potrebné vyhnúť sa pravidelnému preočkovávaniu, ktoré by mohlo viesť až k strate virulencie. 4. Potvrdzovacie testy 4. 1. Identifikácia Ralstonia solanacearum Čisté kultúry Ralstonia solanacearum sa identifikujú minimálne jedným z nasledujúcich postupov: V y ž i v o v a c i e a e n z y m a t i c k é t e s t y Upozornenie: Do každého použitého testu je nutné zahrnúť vhodné kontrolné kmene. 03/zv. 23 SK Úradný vestník Európskej únie 389 Vždy sú buď prítomné, alebo chýbajú nasledujúce univerzálne fenotypové vlastnosti Ralstonia solanacearum: fluorescenčné pigmenty inklúzie PHB oxidačno-fermentačný (O/F) test kataláza oxidáza podľa Kovácsa redukcia dusičnanov využitie citránov rast pri 40 Code en erreur: 8eJC rast v 1 % roztoku NaCl rast v 2 % roztoku NaCl arginin-dihydroláza skvapalnenie želatíny hydrolýza škrobu hydrolýza aezulínu produkcia levánu – + O+/F– + + + + – + – – – – – – Živné pôdy a metódy podľa Lelliott & Stead (1987) T e s t I F Pripraví sa suspenzia s hustotou 106 buniek na 1 ml z testovanej kultúry a kontrolného kmeňa (kontrolných kmeňov). Pripraví sa rad dvojnásobných riedení antiséra. Použije sa IF metódu (oddiel III. 2). IF titer kultúry musí zodpovedať IF titru pozitívnej kontroly. E L I S A t e s t Pripraví sa suspenzia s hustotou >106 buniek na 1 ml z testovanej kultúry a kontrolného kmeňa (kontrolných kmeňov). Použije sa metóda ELISA (oddiel III. 3). Extinkčná hodnota kultúry musí zodpovedať extinkčnej hodnote pozitívnej kontroly. P C R t e s t Pripraví sa suspenzia s hustotou 106 na 1 ml z testovanej kultúry a kontrolného kmeňa (kontrolných kmeňov). Použije sa metóda PCR (oddiel III. 4). PCR produkt kultúry musí mať rovnakú veľkosť a rovnaký vzor reštrikčnej analýzy enzýmov (REA), ako má produkt pozi- tívnej kontroly. F l u o r e s c e n č n á h y b r i d i z á c i a i n - s i t u ( F I S H ) Pripraví sa suspenzia s hustotou 106 na 1 ml z testovanej kultúry a kontrolného kmeňa (kontrolných kmeňov). Použije sa metóda FISH (van Beuningen et al. , 1995) s PCR primerom OLI-1 (Seal et al. 1993). Kultúra musí vykazovať rovnakú reakciu ako pozitívna kontrola. P r o f i l á c i a b i e l k o v í n Denaturované bielkoviny celých buniek sú rozdelené polyakrylamidovou gélovou elektroforézou (PAGE) (Stead, 1992a). P r o f i l á c i a m a s t n ý c h k y s e l í n ( F A P ) Kultúra a pozitívna kontrola sa nechajú rásť 48 hodín pri teplote 28 °C na tryptikázovej sójovej živnej pôde s použitím metódy FAP (Fatty acid profilling) (Jasen 1991; Stead 1992a, Stead 1992b). Profil kultúry sa musí zhodovať s profilom pozitívnej kontroly. Charakteristickými mastnými kyselinami za daných podmienok sú: 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH a 18:1 2OH. 4. 2. Charakteristika kmeňa Charakterizácia kmeňa nie je povinná, doporučuje sa ale uskutočniť ju pre každý nový prípad s použitím aspoň jedného z nasledujúcich testov: — 390 SK Úradný vestník Európskej únie 03/zv. 23 U r č e n i e b i o v a r u Ralstonia solanacearum sa člení na biovary, a to podľa schopnosti vytvárať z troch hexózových alkoholov a troch cukrov kyseliny (Hayward, 1964 & 1994): Využitie: — maltózy — laktózy — celobiózy — manitolu — sorbitolu — dulcitolu 1 – – – – – – 2 + + + – – – Biovar 3 + + + + + + 4 – – – + + + 5 + + + + – – Ďalšími testami sa dá biovar 2 rozčleniť na subfenotypy (Hayward, 1994): použitie trehalózy použitie inozitolu použitie D-ribózy pektolytická aktivita U r č e n i e r á s biovar 2 biovar 2-A biovar 2-T – + – nízka + – – nízka + + + vysoká Určenie rasy (Buddenhagen et al. , 1962) sa vykoná na základe testov patogenity na rastlinách rajčiaka alebo baklažánu, na rastlinách tabaku a taktiež hypersenzitívnou reakciou (HR) na listoch tabaku (Lozano & Sequiera, 1970): Reakcia na: rastlinách rajčiakov/baklažánu rastlinách tabaku listoch tabaku 1 vädnutie vädnutie nekróza (48 hodín) a vädnutie (7-8 dní) rasa (*) 2 žiadna reakcia žiadna reakcia HR (12-24 hodín) 3 vädnutie žiadna reakcia chloróza (za 2-8 dní) (*) Rasa 4 (patogénna na zázvorovníku a niektorých ďalších hostiteľoch) a rasa 5 (patogénna iba na moruši) nie sú v tejto tabuľke zahrnuté. Určenie rasy testom patogenity alebo testom hypersenzitívnej reakcie tabaku nemusí byť príliš spoľahlivé a miesto toho sa dá na prísluš- nosť k rase usudzovať podľa biovaru a pôvodného hostiteľa. Kultúru možno ďalej charakterizovať týmito znakmi: Genómová peptidová mapa Molekulárne odlíšenie kmeňov v rámci komplexu Ralstonia solanacearum sa dá vykonať analýzou RFLP (Cook et al. , 1989). Repetitívnou sekvenciou PCR (REP-, ERIC- & BOX-PCR (Louws et al. , 1995; Smith et al. , 1995). 4. 3. Test patogenity Tento test je zameraný na potvrdenie správnosti určenia Ralstonia solanacearum a na vyhodnotenie virulencie kultúr, identifikovaných ako Ralstonia solanacearum. Z kultúry a pozitívneho kontrolného kmeňa sa pripraví inokulum s hustotou 106 buniek na 1 ml. Potom sa naočkuje 5 – 10 rastlín rajčiaka alebo baklažánu, a to najlepšie v štádiu tretieho pravého listu alebo v neskoršom štádiu (oddiel III. 6). Dĺžka kultivácie je dva týždne pri teplotách 22 °C až 28 °C a vysokej relatívnej vzdušnej vlhkosti. Denne zavlažujte. Pozor treba dávať na výskyt vädnutia a/alebo epinastií, chloróz a zakrpatievania rastlín. Z rastlín, ktoré vykazujú charakteristické príznaky sa pripravia nasledujúcim postupom izoláty: — zo stonky sa vo výške asi 2 cm nad miestom očkovania odoberie pletivo. — odobraté pletivo sa rozotrie a suspenduje v sterilnej destilovanej vode alebo v 50 mM fosfátovom pufri, potom sa suspenzia rozotrie na platne, inkubuje a potom sa vyhodnotí výskyt typických kolónií Ralstonia solanacearum. 03/zv. 23 SK Úradný vestník Európskej únie 391 URČOVANIE PRÍTOMNOSTI A IDENTIFIKÁCIA RALSTONIA SOLANACEARUM VO VZORKÁCH HĽÚZ ZEMIAKOV Upozornenie: Štandardná veľkosť vzorky je 200 hľúz. Postup je však vhodný i pre vzorky s menej ako 200 hľuzami. ODDIEL III 1. Príprava vzorky pre test Upozornenie: Pelet zemiakového extraktu, získaný týmto postupom sa dá použiť i pre detekciu baktérie Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Možnosti úpravy pred testom, pokiaľ je to vhodné: i) Vzorku nechajte inkubovať 2 týždne pri teplote 25 – 30 °C, aby sa podporilo pomnoženie malých populácií Ralstonia solanacearum; ii) Hľuzy očistite pod tečúcou vodou vhodným dezinfekčným a čistiacim prostriedkom a nechajte ich na vzduchu vyschnúť. 1. 1 Čistým, dezinfikovaným skalpelom alebo zeleninovým nožom odstráňte šupku hľuzy na jej pupkovom konci tak, aby bolo vidieť cievne pletivo. Z cievneho pletiva na pupkovom konci každej hľuzy opatrne vyrežte na jej pupkovom konci malý kužeľovitý kúsok (3-5 mm v priemere). Pritom je potrebné dbať súčasne o to, aby sa vyrezalo čo najmenej necievnych pletív. Vykonajte na každej hľuze vo vzorke. Upozornenie: V tejto fáze môžete hľuzy dôkladne vizuálne prehliadnuť (oddiel II. 1). Hľuzy vykazujúce symptómy alebo silnú hnilobu je potrebné vyradiť a skúmať oddelene (oddiel II). 1. 2 Pupkové konce hľuzy umiestnite do uzatvorenej nádoby. Vzorka by mala byť urýchlene spracovaná. Pokiaľ to nie je možné, nemala by byť skladovaná dlhšie ako 24 hodín alebo pri teplote 4 °C dlhšie ako 72 hodín. 1. 3 Pupkové konce hľúz spracujete jedným z nasledujúcich postupov: i) Pupkové konce hľúz vložte do vhodnej nádoby. Pridajte dostatočný objem maceračného pufru (dodatok 2), aby boli pupkové konce hľúz prikryté. Kúsky hľúz v mixéri Waring Blender alebo Ultra Turrax homogenizujeme. Je však potrebné zabrániť príliš silnej homogenizácii. Macerát nechajte 15 – 30 minút lúhovať. ii) Pupkové konce hľúz vložte do vhodnej nádoby. Pridajte dostatočný objem maceračného pufru, aby boli pupkové konce hľúz prekryté. Nádobu umiestnite do rotačnej trepačky. Inkubujte pri 50 – 100 otáčkach za minútu počas 4 hodín pri teplote 20 °C/22 °C alebo počas 16 – 24 hodín pri teplote 4 °C. iii) Pupkové konce hľúz vložte do pevného jednorazového maceračného vrecúška (napr. Stomacher s rozmermi 105x150 mm a sterilizo- vaného ožiarením). Pupkové konce hľúz rozmeľnite vhodným nástrojom, napr. kladivom, až do ich úplnej homogenizácie. Pridajte dostatočné množstvo maceračného pufru, aby boli pupkové konce hľúz prekryté. Macerát nechajte 15 – 30 minút odstáť. 1. 4 Z takto pripravených pupkových koncov hľúz sa baktérie extrahujú niektorým z nasledujúcich postupov: i) Macerát opatrne nalejte do centrifugačnej skúmavky, tuhý zvyšok pritom ponechajte v nádobe alebo vrecúšku. Ak je zliaty macerát kalný, potom odstreďujte pri teplote pod 10 °C počas 10 minút pri odstredivej sile nie väčšej ako 180 g. Zliaty macerát alebo supernatant z prvého odstreďovania odstreďte počas 15 minút pri 7000 g alebo 10 minút pri 10 000 g pri teplote pod 10 °C. Supernatant vylejte tak, aby sme neporušili vzniknutý pelet. ii) Macerát prefiltrujte cez filtračný systém so šírkou pórov 40 – 100 µm. Filtráciu je pritom nutné posilniť vákuovým čerpadlom. Filtrát zhromaždite v centrifugačnej skúmavke. Filtrát premyte maceračným pufrom. Filtrát odstreďte počas 15 minút pri 7 000 g alebo 10 minút pri 10 000 g pri teplote pod 10 °C. Supernatant vylejte tak, aby sme neporušili vzniknutý pelet. 392 SK Úradný vestník Európskej únie 03/zv. 23 1. 5 Pelet resuspendujte v 1 ml peletového pufru (dodatok 2). Rozdeľte na dva rovnaké diely a každý z nich nalejte do jednej mikroskúmavky. Pre test používajte len jednu mikroskúmavku. Zvyšok tohoto extraktu skladujte počas testovania pri teplote 4 °C. Do druhej mikroskúmavky prilejte 10-25 % sterilný glycerín. Pretrepte. Skladujte pri teplote –18 °C (niekoľko týždňov) alebo pri teplote – 70 °C (niekoľko mesiacov). 2. Test IF Použite antisérum Ralstonia solanacearum, najlepšie rasa3/biovar 2. Určite titer u suspenzie s hustotou 106 buniek na ml homologického kmeňa Ralstonia solanacearum s vhodným zriedením konjugátu fluorescenčného isothiokyanátu (FITC) podľa doporučenia výrobcu. Surové sérum by malo mať titer IF minimálne 1: 2000. Použite viacobjektové podložné sklíčko najlepšie s 10 jamkami s minimálnym priemerom 6 mm. Na každé podložné sklíčko naneste kontrolu konjugátu FITC. Ak pracujete s veľkým množstvom podložných sklíčok, môžete vynechať kontrolu s fosfátovým pufrom (PBS). Test by však mal byť opakovaný s kontrolou PBS, ak v kontrole FITC nenájdete žiadnu pozitívnu bunku. Osobitne pripravte kontrolné pozitívne podložné sklíčko so suspenziou s hustotou 106 buniek na mililiter niektorého kmeňa Ralstonia solanacearum príslušnej rasy a biovaru. V každej sérii testovaní musí byť použité jedno podložné sklíčko. 2. 1 Podložné sklíčka pripravte jedným z nasledujúcich postupov: i) Pri pelete s relatívne malým obsahom škrobu: 2. 2 2. 3 Odmeraný štandardný objem (15 µl je postačujúci pre jamku s priemerom 6 mm – pri väčších jamkách je potrebné použiť zodpoveda- júci väčší objem resuspendovaného peletu) naneste pipetou na rad jamiek. Ďalší rad môže byť použitý ako duplikát alebo pre druhú vzorku, ako je znázornené na obr. 1. ii) Pri iných peletoch: Pripravte desatinné riedenia, to značí 1/10, 1/100 a 1/1000 resuspendovaného peletu v peletovom pufri. Odmeraný štandardný objem (15 µl je postačujúci pre jamku s priemerom 6 mm – pri väčších jamkách je potrebné použiť zodpovedajúci väčší objem) resuspendo- vaného peletu a z každého zriedenia naneste pipetou na rad jamiek. Ďalší rad môže byť použitý ako duplikát alebo pre druhú vzorku, ako je znázornené na obr. 2. Kvapky nechajte vyschnúť. Baktériové bunky fixujte na podložnom sklíčku buď zahriatím, flambovaním, alebo 95 % etanolom. Postup pri IF i) Pri príprave podložného sklíčka podľa 2. 1 i): Pripravte sadu dvojnásobných zriedení antiséra v pufri IF (dodatok 3): 1/4 titra (T/4), 1/2 titra (T/2)l, titer T a dvojnásobok titra (2T). ii) Pri príprave podložného sklíčka podľa 2. 1 ii): Pripravte pracovné riedenia antiséra v pufri IF. Pracovné riedenie je riedenie antiséra s optimálnou špecifickosťou a normálne má polo- vicu hodnoty titra. Obrázok 1 Príprava podložného sklíčka postupom podľa 2. 1 i) a 2. 3 i) 03/zv. 23 SK Úradný vestník Európskej únie 393 Obrázok 2 Príprava podložného sklíčka postupom podľa 2. 1 ii) a 2. 3 ii) 2. 3. 1 Všetky podložné sklíčka vyložte na vlhké hodvábne papiere. Všetky testovacie jamky pokryte riedeniami antiséra. Na pole FITC naneste fosfátový pufor PBS. Objem antiséra nanášaný na políčka musí zodpovedať objemu naneseného extraktu. 2. 3. 2 Nechajte zakryté počas 30 minút pri laboratórnej teplote. 2. 3. 3 2. 3. 4 Kvapky antiséra opatrne straste z podložného sklíčka a podložné sklíčka opatrne opláchnite pufrom IF. Preplachujte 5 minút v roztoku IF-pufri-Tween a potom 5 minút v pufri IF (dodatok 3). Prebytočnú vlhkosť starostlivo odstráňte. Podložné sklíčka položte na vlhké hodvábne papiere. Testovacie jamky a jamku s FITC pokryte riedením konjugátu FITC použitým pre stanovenie titra. Objem konjugátu, nanášaný na jamky musí zodpovedať objemu aplikovaného antiséra. 2. 3. 5 Nechajte zakryté počas 30 minút pri laboratórnej teplote. 2. 3. 6 2. 3. 7 Kvapky konjugátu opatrne sklepte z podložného sklíčka. Opláchnite a prepláchnite rovnako ako v bode 2. 3. 3. Prebytočnú vlhkosť staro- stlivo odstráňte. Na každú jamku napipetujte 5 až 10 µm 0,1 M glycerolu pufrovaného fosfátom (dodatok 3) alebo inú podobnú kryciu kvapalinu a pri- ložte krycie sklíčko. 2. 4 Hodnotenie testu IF Podložné sklíčka prehliadnite pod epifluorescenčným mikroskopom s filtrami vhodnými pre excitáciu FITC, pod olejovou imerziou pri zväčšení 500 – 1000 x. Každé políčko mikroskopicky prehliadnite vo dvoch navzájom kolmých priemeroch a taktiež po obvode. Najprv prehliadnite podložné sklíčka s pozitívnou kontrolou. Bunky musia jasne fluoreskovať a byť plne sfarbené. Upozornenie: Pri odlišnom sfarbení je potrebné test opakovať. Vyhodnotenie podložných sklíčok s testovanými vzorkami. Najprv preskúmajte preparáty z hľadiska absencie fluoreskujúcich buniek v jamkách s kontrolou FITC. Fluoreskujúce bunky v kontrolnej jamke FITC ukazujú na nešpecifickú väzbu konjugátu, na autofluore- scenciu alebo na kontamináciu. Upozornenie: Ak dôjdete k tomuto záveru, je potrebné test opakovať. V testovacích jamkách pozorujte silne fluoreskujúce bunky s charakteristickou morfológiou Ralstonia solanacearum. Intenzita fluorescencie musí zodpovedať pozitívnemu kontrolnému kmeňu pri rovnakom riedení antiséra. Na bunky s neúplným zafarbením alebo so slabou fluo- rescenciou neberte ohľad, iba ak by bolo takýchto buniek prítomných veľmi mnoho (pozri vyhodnotenie výsledkov testov IF). Vyhodnotenie výsledkov testu IF i) Ak nie sa nájdu silne fluoreskujúce bunky s charakteristickou morfológiou, test IF je negatívny. ii) Ak sa nájdu jasne fluoreskujúce bunky s charakteristickou morfológiou, je potrebné určiť priemerný počet buniek na mikroskopickom poli a ten prepočítať na jeden mililiter (hodnota N) resuspendovaného peletu (dodatok 4). Hustotu baktérií v hodnote asi 103 buniek na jeden mililiter resuspendovaného peletu možno považovať za hranicu detekcie testu IF: — pri vzorkách s N > 103 buniek na 1 ml resuspendovaného peletu sa výsledok testu IF hodnotí ako pozitívny; — pri vzorkách s N > 103 buniek na 1 ml resuspendovaného peletu sa výsledok testu IF môže hodnotiť ako pozitívny. 394 SK Úradný vestník Európskej únie 03/zv. 23 iii) Ak je zistený vysoký počet (>105 buniek na 1 mililiter) s neúplne alebo slabo fluoreskujúcimi bunkami pri titre antiséra, treba usku- točniť druhý test: — buď test na základe niektorého iného biologického princípu, alebo — opakovaný test IF, buď s druhým antisérom, alebo s desaťnásobným zriedením peletu. 3. Test ELISA Podľa Robinsona-Smitha et al. , 1995 Použite antisérum pre Ralstonia solanacearum, najlepšie k rase 3 biovaru 2. Titer stanovte v suspenzii s hustotou 106 na 1 ml buniek homologického kmeňa Ralstonia solanacearum. Doporučuje sa používať mikrotitračné doštičky NUNC-Polysorb. Test by mal zahŕňať negatívnu kontrolu zemiakového extraktu a kontrolu fosfátového pufru (PBS). Ako pozitívnu kontrolu použite suspenziu s hustotou > 106 buniek na 1 ml z kmeňa vhodnej rasy/biovaru Ralstonia solanacearum. Test uskutočnite rovnako ako pri vzorke/vzorkách, ale oddelene od vzoriek na mikrotitračnej doštičke. 3. 1 Do mikroskúmavky odpipetujte 100 – 200 µl resuspendovaného peletu. 3. 2 3. 3 3. 4 3. 5 3. 6 3. 7 3. 8 3. 9 Obsah mikroskúmavky zahrievajte pri teplote 100 °C štyri minúty. Potom mikroskúmavku položte na ľad. Pridajte alikvótny objem dvojnásobne silného uhličitanového krycieho pufru (dodatok 5) a premiešame. Do najmenej dvoch jamiek mikrotitračnej doštičky umiestnite vždy po 100 µl zmesi. Inkubujte jednu hodinu pri teplote 37 °C alebo cez noc pri teplote 4 °C. Extrakty z jamiek celkom odstráňte. Jamky vymyte trikrát fosfátovým pufrom (PBS) s Tweenom (dodatok 5), pričom by posledný premý- vací roztok mal v jamkách zostať aspoň 5 minút. Pripravte vhodné riedenie antiséra Ralstonia solanacearum v blokačnom (protilátkovom) pufri (dodatok 5). Do jamiek umiestnite po 100 µl riedeného antiséra. Inkubujte pri teplote 37 °C jednu hodinu. Antisérum z jamiek celkom odstráňte. Jamky vymyte rovnakým spôsobom, ako je opísané vyššie (3. 4). Pripravte vhodné riedenie konjugátu alkalickej fosfatázy v blokačnom pufri. Do jamiek umiestnite po 100 µl riedeného konjugátu. Inkubujte pri teplote 37 °C jednu hodinu. Konjugát z jamiek celkom odstráňte. Jamky vymyte rovnakým, vyššie opísaným spôsobom (3. 4, 3. 6). Pripravte substrátový alkalický roztok fosfatázy (dodatok 5). Pipetujte po 100 µl do jamiek. Uchovajte v tme pri laboratórnej teplote 30 až 60 minút. 3. 10 Absorbanciu odčítajte pri vlnovej dĺžke 409 nm. Vyhodnotenie výsledkov testu ELISA: Výsledok testu ELISA je negatívny vtedy, ak je optická hustota (OD) vzorky < 2 x OD negatívnej kontroly. Výsledok testu ELISA je pozitívny vtedy, ak je optická hustota (OD) vzorky > 2 x OD negatívnej kontroly. 4. Test PCR Podľa Seal et al. , 1993. Upozornenie: Pri všetkých krokoch prípravy vzorky aj všetkých ostatných činnostiach pri PCR sa musia používať špičky pipiet s filtrom. Ako pozitívnu kontrolu pripravte suspenziu kmeňa Ralstonia solanacearum rasy-3/biovaru-2 s hustotou 106 buniek na 1 ml. Test pri tejto kontrole uskutočnite úplne rovnakým postupom ako pri vzorke/vzorkách. 4. 1 Odpipetujte 100 µl resuspendovaného peletu do mikroskúmavky. Alternatívne možno pipetovať 90 µl resuspendovaného peletu do mikroskúmavky, ktorá obsahuje 10 µl 0,5 M NaOH. Miešame opako- vaným prevracaním mikroskúmavky. 03/zv. 23 SK Úradný vestník Európskej únie 395 4. 2 4. 3 4. 4 Zahrievajte 4 minúty pri teplote 100 °C. Mikroskúmavku potom ihneď premiestnite na ľad. Pripravte minimálne dve decimálne riedenia, napr. 1/10 a 1/100 alebo v prípade potreby viacnásobné v sterilizovanej, destilovanej vode alebo ultračistej vode (UPW). V sterilnej skúmavke pripravte reakčnú zmes pre PCR (dodatok 6) pridaním nasledujúcich zložiek v tomto poradí: Pre reakčný objem 50 µl: Zložka Množstvo Konečná koncentrácia Sterilná alebo ultračistá voda voda, destilovaná voda 30,8 až 33,8 µl 10 x PCR pufor d-ATP d-CTP d-GTP d-TTP Primer OLI-l (20 µM) Primer Y-2 (20 µM) Taq-polymeráza (5 U/µl) 5,0 µl 1,0 µl 1,0 µl 1,0 µl 1,0 µl 2,5 µl 2,5 µl 0,2 µl 1 x 0,2 mM 0,2 mM 0,2 mM 0,2 mM 1 µM 1 µM 1,0 U Celkový objem 45 až 48 µl Pre viac reakcií: Je treba vypočítať množstvo každej zložky pre požadovaný počet reakcií. Zložky zmiešajte a 45 až 48 µl zmesi umiestnite do sterilných skúmaviek na PCR. Skúmavky s reakčnou zmesou PCR položte na ľad. Pre reakčný objem 25 µl: Množstvo zložiek zodpovedajúcim spôsobom zmenšite. 4. 5 Amplifikácia PCR 4. 5. 1 Nepovinne: Skúmavky s povarenou vzorkou a pozitívnou kontrolou odstreďte na pulznej centrifúge. Do skúmaviek s reakčnou zmesou PCR pridajte v uvedenom poradí 2 – 5 µl vzorky/vzoriek, vodnú kontrolu a pozitívnu kontrolu. Skúmavky postavte do ohrievacieho bloku termocykléru DNA. 4. 5. 2 Spustite nasledujúci program: 1 cyklus: i) 2 minúty pri teplote 96 °C: (denaturácia matrice); 50 cyklov: ii) 20 sekúnd pri teplote 94 °C: (denaturácia), iii) 20 sekúnd pri teplote 68 °C: (pripájanie primerov), iv) 30 sekúnd pri teplote 72 °C: (predlžovanie kópie); 1 cyklus: v) 10 minút pri teplote 72 °C: (ďalšie predlžovanie kópie); 1 cyklus: vi) uchovávať pri teplote 4 °C. Upozornenie: Tieto parametre sa vzťahujú na teplotný cyklér Perkin Elmer 9600. Pri iných termocykléroch je prípadne nutná vrstva mine- rálneho oleja v reakčnej skúmavke PCR a/alebo zmena trvania kroku ii), iii) a iv) v amplifikačnom profile. 4. 5. 3 Skúmavky vyberte z termocykléru. Analyzujeme produkt PCR. Pokiaľ sa to nedá uskutočniť hneď, uložte skúmavky pre použitie v tom istom dni pri teplote 4 °C a pre použitie o dlhší čas ich skladujte pri teplote –18 °C. 4. 6 Analýza produktu PCR Fragmenty PCR sa detekujú agarózovou gélovou elektroforézou a sfarbením ethidiumbromidom. 4. 6. 1 Pripravte vhodný agarózový gél tak, že agarózu opatrne povarte v elektroforetickom tris-octanovom pufre (TAE). 396 4. 6. 2 4. 6. 3 4. 6. 4 4. 6. 5 4. 6. 6 SK Úradný vestník Európskej únie 03/zv. 23 Rozvarenú agarózu ochlaďte na teplotu asi 50-60 °C, naplňte ňou gélovú nalievaciu komoru elektroforetickej aparatúry a nasaďte hrebeň. Roztok nechajte stuhnúť. Hrebeň vyberte. Gél ponoríme do pufru TAE tak, aby bol pokrytý vrstvou pufru silnou asi 2-3 mm. Na parafilm naneste kvapku nanášacieho pufru s objemom 3 µl. Pridajte 12 µl produktu PCR zo vzoriek, z pozitívnej kontroly alebo vodnej kontroly a pred naplnením zamiešame jemným odsatím do špičky pipety. Uvedené objemy sa môžu v závislosti na kapacite jamiek v agarózovom géle upraviť. Jamky v géle opatrne naplňte. Do najmenej jednej jamky umiestnite pre porovnanie príslušný markér DNA. Elektroforetickú aparatúru pripojte k napájaciemu zdroju. Elektroforézu vykonajte pri hodnotách 5 až 8 V. cm-1, pokiaľ sa čelo značeného indikátoru nebude nachádzať vo vzdialenosti do 1 cm od konca gélu. 4. 6. 7 Vypnite prívod prúdu do elektroforetickej aparatúry. Gél opatrne vyberte a nechajte ho 30 – 45 minút presycovať roztokom ethidiumbromidu. 4. 6. 8 4. 6. 9 Upozornenie: Pri manipulácii s ethidiumbromidom, ktorý je silno mutagénnou látkou, používajte vždy jednorazové rukavice! Farbivo z gélu vymyte v destilovanej vode 10 až 15 minút. Zosilnený(é) fragmenty DNA zviditeľnite ultrafialovou transilumináciou. Produkt PCR Ralstonia solanacearum s primermi OLI-1 a Y-2 má dĺžku 288 párov báz. Porovnajte s markérom DNA a s pozitívnou kontrolou. Upozornenie: Vodná (= negatívna) kontrola musí byť v každom prípade negatívna. Ak by vychádzala ako pozitívna, musí sa test opakovať. 4. 6. 10 Gél možno z dokumentačných dôvodov vyfotografovať. 4. 6. 11 Pravosť zosileného fragmentu potvrdíme analýzou reštrikčných fragmentov (REA). 4. 7 4. 7. 1 4. 7. 2 Analýza reštrikčným enzýmom (REA) 8,5 µl PCR produktu (4. 5. 3) umiestnite do novej mikroskúmavky. Pridajte 1 µl 10x enzýmového pufru a 0,5 µl reštrikčného enzýmu Avall. Miešajte jemným fúkaním do špičky pipety. Ak na stenách mikroskúmavky zostávajú kvapôčky, vzorku pulzným spôsobom odstreďte v mikroodstredivke. Inkubujte asi hodinu pri teplote 37 °C. 4. 7. 3 Digerovaný fragment PCR analyzujte ako predtým (4. 6) agarózovou gélovou elektroforézou. Vyhodnotenie výsledkov testu PCR: Test PCR je negatívny, ak nebol dokázaný charakteristický fragment 288 bp fragment a tento fragment bol pritom detekovaný u pozitív- neho kontrolného kmeňa Ralstonia solanacearum. Test PCR je pozitívny, ak bol dokázaný 288 bp fragment a analýza REA ukazuje, že amplifikovaný fragment je identický s pozitívnym kontrolným kmeňom Ralstonia solanacearum. 5. Selektívny platňový test Podľa Elphinstona et al. , 1996 5. 1 Test sa vykoná vhodnou zrieďovacou platňovou technikou rozterov, napríklad: i) Pripravte minimálne dve desatinné riedenia, t. j. 1/10 a 1/100 alebo viac riedení resuspendovaného peletu v peletovom pufri. Odme- raný štandardný objem (50 až 100 µl) resuspendovaného peletu a každého riedenia napipetujte na modifikovanú selektívnu živnú pôdu SMSA (dodatok 7) a sklenou tyčinkou rozprestrite po celej ploche živnej pôdy. Ak sa to ukáže ako účelné, je treba 10 µl očkom vykonať zrieďovací rozter resuspendovaného peletu. Medzi roztermi sterilizovať očko plameňom. ii) Odmeraný štandardný objem (50 až 100 µl) resuspendovaného peletu naneste na modifikovanú selektívnu živnú pôdu SMSA a sklenou tyčinkou rozotrite na najmenej dve ďalšie platne s modifikovaným substrátom SMSA. 5. 2 5. 3 Rovnakou zrieďovacou platňovou technikou rozteru naneste suspenziu virulentného kmeňa Ralstonia solanacearum rasa 3/biovar 2 s hustotou 106 buniek v 1 ml ako pozitívnu kontrolu na sadu samostatných platní s modifikovanou živnou pôdou SMSA. Platne nechajte inkubovať pri teplote 28 °C. Po 3 dňoch vykonajte prvú kontrolu platní. Pri negatívnom náleze nechajte inkubovať ďalej, až do 6 dní. Virulentné izoláty Ralstonia solanacearum vytvárajú mliečno biele, ploché, nepravidelné a fluidné kolónie, ktorých stred je červeno až purpurovo sfarbený s prúžkami alebo špirálkami. 5. 4 Kolónie s charakteristickou morfológiou preveďte preočkovaním do čistej kultúry v univerzálnej živnej pôde (dodatok 1). 03/zv. 23 SK Úradný vestník Európskej únie 397 5. 5 Čisté kultúry identifikujeme (oddiel II, 4. 1) a kultúry Ralstonia solanacearum potvrďte testom patogenity (oddiel II, 4. 3. ). Vyhodnotenie výsledkov testu selektívneho platňového rozteru: Test selektívneho platňového rozteru je negatívny, ak sa po šiestich dňoch nedajú izolovať žiadne kolónie baktérií, alebo ak nie sú izolo- vané žiadne charakteristické kolónie Ralstonia solanacearum, za predpokladu, že sa nepredpokladá inhibícia kolóniami iných baktérií a že v pozitívnych kontrolách neboli nájdené charakteristické kolónie Ralstonia solanacearum. Test selektívneho platňového rozteru je pozitívny, ak boli izolované charakteristické kolónie Ralstonia solanacearum. 6. 6. 1 6. 2 6. 3 6. 4 6. 5 6. 6 7. 7. 1 7. 2 7. 3 8. Biotest Podľa Janseho 1988, Pre každú vzorku je potrebné použiť 10 testovacích rastlín náchylných semenáčikov rajčiaka (odr. Money Maker) alebo baklažánu (odr. Black Beauty) v štádiu tretieho listu. Testované rastliny pred očkovaním 24 hodín nepolievať. 100 µl resuspendovaného peletu rozdeľte na testované rastliny. Inokulujte stopku medzi pošvami na jednom alebo viacerých ďalších miestach. Rovnakou technikou naočkujte 10 semenáčov suspenziou virulentného kmeňa Ralstoniasolanacearum rasa 3/biovar 2 s hustotou 106 buniek v 1 ml ako pozitívnu kontrolu a peletovým pufrom ako negatívnu kontrolu. Aby sa predišlo krížovej kontaminácii, oddeľte pozi- tívne kontrolné rastliny od ostatných. Testované rastliny nechajte ďalej rásť pri teplotách 22 až 28 °C a pri vysokej relatívnej vzdušnej vlhkosti až do 4 týždňov. Denne rastliny polievame. Sledujte prítomnosť príznakov vädnutia, epinastie, chlorózy a/alebo zakrpatenia. Z infikovaných rastlín urobte izoláciu (oddiel II). Identifikujte čisté kultúry s charakteristickou morfológiou (oddiel II, 4. 1) a kultúry Ralstonia solanacearum potvrdíme testom patogenity (oddiel II, 4. 3). V prípade potreby preskúmajte, či tie testované rastliny, ktoré nevykazujú žiadne príznaky infekcie, neboli infikované. Z každej testovanej rastliny odoberte 2 cm nad miestom naočkovania 1 cm dlhý úsek stonky. Odobraté časti pletív homogenizujeme v maceračnom pufri. Vykonajte test zrieďovacou platňovou technikou (oddiel III, 5. 1). V prípade pozitívneho nálezu identifikujte čisté kultúry s charakteri- stickou morfológiou (oddiel II, 4. 1) a pozitívne kultúry potvrďte vykonaním testu patogenity (oddiel II, 4. 3). Vyhodnotenie výsledkov biotestu: Výsledok biotestu je negatívny, ak rastliny nie sú infikované Ralstonia solanacearum, za predpokladu, že prítomnosť baktérií Ralstonia sola- nacearum bola zistená v pozitívnych kontrolách. Výsledok biotestu je pozitívny, ak sú infikované testované rastliny baktériami Ralstonia solanacearum. Obohacovací test Podľa J. G. Elphinstona et al. , 1996 100 µl resuspendovaného peletu preneste do 3 ml modifikovanej živnej pôdy SMSA (dodatok 7). Nechajte inkubovať 48 hodín, v žiadnom prípade však nie dlhšie ako 72 hodín, pri teplote 28 °C, a to pri odkrytom uzávere skúmavky, aby sa zabezpečilo vetranie. Skúmavku uzavrite viečkom a pretrepete. Rozdeliť množstvo pre test IF (tento oddiel, bod 2), pre test ELISA (tento oddiel, bod 3) a/alebo test PCR (tento oddiel, bod 4). Test patogenity Pozri oddiel II, 4. 3. 398 SK Úradný vestník Európskej únie 03/zv. 23 Dodatok 1 Živné pôdy pre izoláciu a kultiváciu Ralstonia solanacearum Ž i v ná p ôda (NA ) Živná pôda (Difco) Destilovaná voda 23 g 1 l V 1-litrovej banke pripravte 0,5 litra živnej pôdy. Zložky rozpustite. Sterilizujte 15 minút v autokláve pri teplote 121 °C. Ochlaďte na 50 °C. Rozlejte na platne. K v a sn i č no-pe ptónovo-g lu kózová ži vná pôda (YPGA) Kvasničný extrakt (Difco) Baktopeptón (Difco) Monohydrát D (+) glukózy Baktoagar (Difco) Destilovaná voda V 1 l banke pripravte 0,5 litra živnej pôdy. Zložky rozpustite. Sterilizujte 15 minút v autokláve pri teplote 121 °C. Ochlaďte na 50 °C. Rozlejte na platne. Sac har ózo-p e ptónová ži v ná pôda (SPA ) Sacharóza Peptón K2HPO4 MgSO4. 7 H2O Baktoagar (Difco) Destilovaná voda 5 g 5 g 10 g 15 g 1 l 20 g 5 g 0,5 g 0,25 g 15 g 1 l V 1-litrovej banke pripravte 0,5 litru živnej pôdy. Látky rozpustite. V prípade potreby upravte pH na 7,2 - 7,4. Sterilizujte 15 minút v autokláve pri teplote 121 °C. Ochlaďte na 50 °C. Rozlejte na platne. K e lmanov o te tra zóliov é mé di u m Kyseliny kazmínové (Difco) Baktopeptón (Difco) Dextróza Baktoagar (Difco) Destilovaná voda 1 g 10 g 5 g 15 g 1 l V 1-litrovej banke pripravte 0,5 litra objemu média. Zložky rozpustite. Sterilizujte 15 minút v autokláve pri teplote 121 °C. Ochlaďte na 50 °C. Pridajte filtrom sterilizovaný vodný roztok trifenyl-tetrazoliumchloridu (Sigma) až do dosiahnutia konečnej koncentrácie 50 mg. l-1. Rozlejte na platne. 03/zv. 23 SK Úradný vestník Európskej únie 399 Dodatok 2 Materiál na prípravu vzoriek M a c e r ač ný p u for: 50 mM f osfátov ý pu f or , p H 7, 0 Tento pufor sa používa pre macerovanie pletív. Na2HPO4 KH2PO4 Destilovaná voda 4,26 g 2,72 g 1 l Zložky rozpustite a skontrolujte pH. Podľa potreby vykonajte alikvotáciu. Sterilizujte v autokláve počas 15 minút pri teplote 121 °C. Pri vykonávaní priameho PCR-testu sa doporučuje pridanie 5 % polyvinylpyrolidon MWT (PVP-40), aby sa znížil rozsah inhibície amplifikácie aromatickými molekulami v extrakte. Pri použití homogenizačných metód pomocou Waring Blender alebo Ultra Turrax na maceráciu vykrojeného pletiva zemiaka sa doporučuje pridanie deflokulačného prostriedku, prostriedku proti tvorbe peny alebo antioxidantu. Lubrolové vločky Protipenivý DC-silikón Tetrapyrofosfát sodný 0,5 g. l-1 1,0 ml. l-1 1,0 g. l-1 Autoklávujte oddelene. Pridávajte až do dosiahnutia žiadanej koncentrácie. Pele tov ý pu for : 10 mM fosfor e čn a nov ý p uf or, p H 7, 2 Tento pufor sa používa na resuspendovanie a riedenie peletu, získaného z pupkových koncov zemiakových hľúz. Na2HPO4. 12 H2O KH2PO4. 2 H2O Destilovaná voda 2,7 g 0,4 g 1 l Zložky rozpustite a skontrolujte pH. Podľa potreby vykonajte alikvotáciu. Sterilizujte v autokláve počas 15 minút pri teplote 121 °C. 400 SK Úradný vestník Európskej únie 03/zv. 23 Dodatok 3 Materiál pre test IF Puf or IF : 10 mM r oz tok u ch lor i du sodn éh o p u fr ova né ho fosfá tom (PB S ), pH 7, 2 Tento pufor sa používa pre narieďovanie antiséra. Na2HPO4. 12 H2O KH2PO4. 2 H2O NaCl Destilovaná voda 2,7 g 0,4 g 8,0 g 1 l Látky rozpustite a skontrolujte pH. Podľa potreby vykonajte alikvotáciu. Sterilizujte v autokláve počas 15 minút pri teplote 121 °C. Pufor IF – T w e en Tento pufor sa používa na umytie podložných sklíčok. K pufru IF sa pridáva 0,1 % Tween. 0, 1 M g ly c e rí n pu fr ov a ný f osfá tom, pH 7, 6 Tento pufor sa používa na zvýšenie fluorescencie ako krycia tekutina na políčkach podložného sklíčka IF. Na2HPO4. 12 H2O NaH2PO4. 2 H2O Glycerol Destilovaná voda 3,2 g 0,15 g 50 ml 100 ml 03/zv. 23 SK Úradný vestník Európskej únie 401 (1) (2) (3) (4) Dodatok 4 Stanovenie stupňa kontaminácie v teste IF Plocha S jedného poľa na podložnom sklíčku s viacerými jamkami: ¼ πD2 4 pričom D = priemer poľa. Plocha s poľa objektívu: ¼ πd2 4 kde d = priemer poľa objektívu. Hodnotu d stanovte buď priamym meraním alebo na základe nasledujúcich vzorcov: s ¼ π i 2 G2K2 ×4 kde: i = koeficient poľa (závisí na type okuláru mikroskopu a môže mať hodnotu od 8 do 24), K = tubusový koeficient (1 alebo 1,25); G = (100-násobné, 40-násobné a pod. ) zväčenie objektívu. Zo vzťahu (2): r d ¼ ﬃﬃﬃﬃﬃ 4s π Zo vzťahu (3): v u u t ﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃ 4 × πi2 G2K2 × 4 d ¼ ¼ i GK π Zistite počet typických fluoreskujúcich buniek v jednom poli c. Vypočítajte počet typických fluoreskujúcich buniek v celom poli C. C ¼ c S s Vypočítajte počet typických fluoreskujúcich buniek na jeden ml peletu (N). N ¼ C × 1 000 × F y kde y = objem peletu na poli podložného sklíčka; F = zrieďovací faktor peletu. 402 SK Úradný vestník Európskej únie 03/zv. 23 Dodatok 5 Materiál pre test ELISA D v o j n á s o b n ý u h l i č i t a n o v ý p o v l a k o v ý p u f o r , p H 9 , 6 Na2CO3 NaHCO3 Destilovaná voda 6,36 g 11,72 g 1 l Zložky rozpustite a zmerajte pH. Podľa potreby vykonajte alikvotáciu. Sterilizujte v autokláve 15 minút a teplote 121 °C. Ak extrakt obsahuje vysoký podiel aromatických molekúl, možno pridať siričitan sodný s konečnou koncentráciou 0,2 % ako antioxidant. 1 0 x r o z t o k c h l o r i d u s o d n é h o p u f r o v a n é h o f o s f á t o m ( P B S ) , p H 7 , 4 NaCl KH2PO4 Na2HPO4. 12 H2O KCl Destilovaná voda 80 g 2 g 29 g 2 g 1 l Zložky rozpustite a zmerajte pH. Podľa potreby vykonajte alikvotáciu. Sterilizujte v autokláve 15 minút a teplote 121 °C. R o z t o k c h l o r i d u s o d n é h o „ T w e e n “ p u f r o v a n ý f o s f á t o m ( P B S - T ) 10x PBS 10 % Tween 20 Destilovaná voda B l o k a č n ý p u f o r ( m u s í s a p o u ž i ť č e r s t v ý ) 10x PBS Polyvinylpropyrolidon 44000 MWT (PVP-44) 10 % Tween 20 Sušené mlieko 100 ml 5 ml 895 ml 10 ml 2,0 g 0,5 g 0,5 g Doplniť destilovanou vodou do 100 ml S u b s t r á t o v ý r o z t o k a l k a l i c k e j f o s f a t á z y , p H 9 , 8 Diethanolamín Destilovaná voda 97 ml 800 ml Zmiešajte a koncentrovanou HCl ustálime na pH 9,8. Doplňte destilovanou vodou na objem 1 litra. Pridajte 0,2 g MgCl2. V každých 15 ml roztoku rozpustite dve 5 mg tablety substrátovej fosfatázy (Sigma) 03/zv. 23 SK Úradný vestník Európskej únie 403 Dodatok 6 Materiál pre test PCR S e k v e n c i a o l i g o n u k l e o t i d o v ý c h p r i m e r o v Primer OLI-1 5’ – GGGGGTAGCTTGCTACCTGCC – 3’ Primer Y-2 Potrebné chemikálie pozri Seal et al. , 1993. 5’ – CCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGT – 3’ Dodatok 7 Materiál pre rozterový selektívny test a pre obohacovací test Selektívny substrát SMSA Podľa Engelbrecht, 1994, modifikované podľa Elphingstona et al. , 1996 Základný substrát: kazeínový hydrolyzát/Difco) baktopeptón (Difco) glycerol živná pôda (Difco) destilovaná voda 1 g 10 g 5 ml 15 g 1 l V litrovej banke pripravte 0,5 l substrátu. Zložky rozpustite a skontrolujte hodnotu pH. V prípade potreby pred autoklávovaním ustálte hodnotu pH na 6,5. Pri pH nad 7,0 nerastie Ralstonia solanacearum na tomto substráte dobre. Sterilizujte v autokláve 15 minút pri teplote 121 °C. Ochlaďte na 50 °C. Pre dosiahnutie konečných koncentrácií pridajte nasledujúce zložky (všetky od firmy Sigma): kryštálová violeť polymixín-B-sulfát bacitracín (*) chloramfenikol penicilín-G tetrazóliové soli 5 mg. l-1 100 mg. l-1 25 mg. l-1 5 mg. l-1 0,5 mg. l-1 50 mg. l-1 (cca 600 000 jednotiek) (cca 1250 jednotiek) (cca 825 jednotiek) Sigma P-1004 Sigma P-0125 Sigma C-3175 Sigma P-3032 Zložky rozpustite v 70 % etanole na koncentrácie, uvedené pre objem pripravovanej živnej pôdy. Niektoré, ako je napr. polymixín alebo chloramfenikol, je potrebné pritom ľahko zahriať a pretrepať. Živná pôda SMSA Podľa Elphinstona et al. , 1996 Príprava ako pri selektívnom substráte SMSA, ale bez živnej pôdy alebo tetrazóliových solí. Naplňte alikvotné množstvo 3 ml do 30 ml jednorázovej univerzálnej skúmavky. (*) V prípade potreby možno kontamináciu saprofytickými baktériami znížiť zvýšením koncentrácie bacitracínu na 300 ppm, bez toho, že by tým bolo negatívne ovplyvnené izolovanie Ralstonia solanacearum. 404 SK Úradný vestník Európskej únie 03/zv. 23 BIBLIOGRAFIA Buddenhagen, I. W. ; Sequeira, L. Kelman, A. 1962. Description of races in Pseudomonas solanacearum, Phytopathology 52, 726. Cook, D. ; Elizabeth, B. ; Sequeira, L. 1989. Genetic diversity of Pseudomonas solanacearum: detection of restriction fragment length polymorphism with DNA probes that specify virulenceand hypersensitive response. Molecular Plant-Microbe Interactions 2, 113-121. TEXT MISSING Elphistone, J. G. ; DeBoer, S. H. 1995. Extraction of Clavibacter michiganensis, subsp. sepedonicus from composite samples of potato tubers. American Potato Journal 72, 133-142. Engelbrecht, M. C. 1994. Modification of a semiselective medium for the isolation and quantification of Pseudomonas solanacearum. ACIAR Bacterial Wilt Newsletter 10, 3-5. Hayward, A. C. 1994. Characteristics of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 27, 265-277. Hayward, A. C. 1994 Systematic and phylogeny of Pseudomonas solanacearum and related bacteria. In: Bacterial Wilt: the disease and its causative agent, Pseudomonas solanacearum (eds. A. C. Hayward and G. I. hartman) CAB International Oxford, 127-135. Janse, J. D. 1988. A detection method for Pseudomonas solanacearum in symptom less potato tubers and some data on its sensitivity and specificity. EPPO Bulletin 18, 343-351. Janse, J. D. 1991. Infra- and intraspecific classification of Pseudomonas solanacearum strains using whole cell fatty acid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14, 335-345. Kelman, A. 1954. The relationship of pathogenicity in Pseudomonas solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium. Phytopathology 64, 293-695. Lelliot, R. A. and Stead, D. E. 1987. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. (T. E. Preece ed. ) Blackwell Scientific Publications, Oxford. 216 p. Louws, F. J. ; Fullbright, D. W. ; Stephens, C. T. and De Bruijn, F. J. 1995. Differentiation of genomic structure by rep-PCR fingerprinting to rapidly classify Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Phytopathology 85, 528-536. Lozano, J. C. ; Sequeira, L. 1970. Differentiation of races of Pseudomonas solanacearum by a leaf infiltration technique. Phytopatology 60, 836. Mirza, M. S. ; Rademaker, J. W. L. ; Janse, J. D. ; Akkermans, A. D. L. 1993. Specific 16S ribosomal RNA targeted oligonucleotide probe against Clavibacter michiganensis, subsp. sepedonicus. Canadian Journal of Micro- biology 39, 1029-1034. Robinson-Smith, A. ; Jones, P. ; Elphistone, J. G. ; Forde, S. M. D. 1995. Production of antibodies to Pseudo- monas solanacearum, the causative agent of bacterial wilt. Food and Agricultural Imunology 7, 67-79. Seal, S. E. ; Jackson, L. A. ;Young, J. P. W. ; Daniels, M. J. 1993. Differentiation of Pseudomonas solanacearum, P. syzygii, P. pickettii and the blood disease bacterium by partial 16S rRNA sequencing: construction of oligo- nucleotide primers for sensitive detection by polymerase chain reaction. Journal of General Microbiology 139, 1587-1594. Smith, J. J. ; Offord, L. C. ; Holderness, M. and Saddler, G. S. 1995. Genetic diversity of Burkholderia solana- ceraum (synonym Pseudomonas solanacearum) race 3 in Kenya. Applied and Environmental Microbiology 61, 4262-4268. Stead, D. E. 1992a. Techniques for detecting and identifying plant pathogenic bacteria. In: Techniques for rapid detection of plant pathogens (eds. J. M. Duncan and L. Torrance). Blackwell Scientific Publications, Oxford, 76-111. Stead, D. E. 1992b. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42, 281-295. Van Beuningen, A. ; Derks, H. and Janse, J. D. 1995 Detection and identification of Clavibacter michiga- nensis, subsp. sepedonicus with specific attention to fluorescent in-situ hybridisation (FISH) using a 16S rRNA targeted oligonucleotide probe. Züchtungsforschung 2, 266-269. 03/zv. 23 SK Úradný vestník Európskej únie 405 PRÍLOHA III 1. Ak existuje podozrenie na výskyt, pri ktorom skríningové testy vykonané pre uvedený rastlinný materiál podľa postupov prílohy II a pre všetky ostatné prípady podľa akejkoľvek inej úradne schválenej metódy priniesli pozitívne výsledky, počas čakania na dokončenie uvedenej metódy a na potvrdenie alebo vyvrátenie výskytu sa do dokončenia tejto metódy zadrží a zachová: — podľa možnosti, partia (z ktorej bola odobratá vzorka) alebo jej časť, v pôvodnom balení s etiketou, — podľa možnosti, zvyšná časť vzoriek, — zvyšné extrakty a ďalší materiál upravený na vykonanie skríningových testov, napr. podložné sklíčka pre imuno- fluorescenčný test a — všetky príslušné doklady. 2. V prípade potvrdenia výskytu škodlivého organizmu by sa počas najmenej jedného mesiaca po skončení oznamova- cieho konania podľa článku 5 (2) mal zadržať a zachovať: — materiál uvedený v odseku 1 tejto prílohy, — vzorka infikovaného materiálu z rajčiaka alebo baklažánu naočkovaná, podľa vhodnosti, extraktom z hľuzy alebo rastlín a — izolovaná kultúra patogéna. 406 SK Úradný vestník Európskej únie 03/zv. 23 PRÍLOHA IV Vyšetrovanie uvedené v článku 5(1)a)i) sa v jednotlivých prípadoch týka: i) miest produkcie: — kde sa pestujú alebo sa pestovali zemiaky, ktoré sú klonovo príbuzné so zemiakmi, pri ktorých sa dokázalo napadnutie škodlivým organizmom, — kde sa pestujú alebo sa pestovali rajčiaky pochádzajúce z rovnakého zdroja ako rajčiaky, pri ktorých bolo doká- zané napadnutie škodlivým organizmom, — kde sa pestujú alebo sa pestovali rajčiaky alebo zemiaky, ktoré boli z dôvodu podozrenia na výskyt škodlivého organizmu podrobené úradnému dohľadu, — kde sa pestujú alebo sa pestovali zemiaky, ktoré sú klonovo príbuzné so zemiakmi, ktoré boli pestované na miestach produkcie, pri ktorých bolo dokázané napadnutie škodlivým organizmom, — kde sa pestujú alebo sa pestovali rajčiaky alebo zemiaky a ktoré ležia v susedstve napadnutých produkčných miest vrátane tých, kde boli priamo alebo prostredníctvom spoločného zmluvného partnera zdieľané poľnohospo- dárske stroje, alebo zariadenia, — na ktorých bola na zavlažovanie alebo postrekovanie používaná povrchová voda zo zdrojov, pri ktorých bola dokázaná kontaminácia škodlivým organizmom alebo pri ktorých existuje podozrenie na kontamináciu škodlivým organizmom, — na ktorých bola na zavlažovanie alebo postrekovanie používaná povrchová voda zo zdrojov používaných aj miestami produkcie, pri ktorých bola dokázaná kontaminácia škodlivým organizmom alebo pri ktorých existuje podozrenie na kontamináciu škodlivým organizmom, — ktoré sú zaplavené alebo boli zaplavené povrchovými vodami, pri ktorých sa ukázalo, že sú kontaminované škodlivým organizmom, alebo pri ktorých existuje podozrenie na kontamináciu škodlivým organizmom a ii) povrchovej vody používanej na zavlažovanie alebo postrek poľa/polí a miesta/miest produkcie, pri ktorých bola dokázaná kontaminácia škodlivým organizmom alebo ktorá tieto polia a miesta produkcie zaplavila. 03/zv. 23 SK Úradný vestník Európskej únie 407 1. Pri stanovovaní rozsahu pravdepodobnej kontaminácie podľa článku 5 (1) a) iii) a 5 (1) c) iii) sa podľa relevantnosti prihliada na: PRÍLOHA V — uvedený rastlinný materiál pestovaný na mieste produkcie, ktoré bolo podľa článku 5 (1) a) ii) označené za konta- minované, — miestoa) produkcie s produkčným prepojením na uvedený rastlinný materiál označený podľa článku 5 (1) a) ii) za kontaminovaný vrátane miest, ktoré priamo alebo prostredníctvom spoločného zmluvného partnera zdieľali výrobné vybavenie alebo zariadenia, — uvedený rastlinný materiál, ktorý bol pestovaný na mieste(ach) produkcie uvedenom v predchádzajúcej zarážke, alebo bol prítomný na takomto mieste(ach) produkcie v čase, kedy na tomto mieste produkcie bol prítomný uvedený rastlinný materiál, ktorý bol podľa článku 5 (1)a)ii) označený za kontaminovaný, — sklady, v ktorých sa manipulovalo s uvedeným rastlinným materiálom z vyššie uvedených miest produkcie, — všetky strojové zariadenia, vozidlá, lode, skladovacie priestory alebo ich časti a akékoľvek iné predmety vrátane obalového materiálu, ktoré mohli prísť do styku s uvedeným rastlinným materiálom, ktorý bol podľa článku 5 (1) a) ii) označený za kontaminovaný, — akýkoľvek rastlinný materiál, ktorý bol v styku so zariadeniami alebo objektmi uvedenými v predchádzajúcej zarážke alebo v nich bol uskladnený pred ich dezinfekciou alebo vyčistením, — v dôsledku vyšetrovania a testov podľa článku 5 (1) a) i), v prípade zemiakov, tie hľuzy alebo rastliny, ktoré majú súrodenecký alebo rodičovský klonový pomer k uvedenému rastlinnému materiálu, ktorý bol podľa článku 5 (1) a) ii) označený za kontaminovaný a v prípade rajčiakov tie rastliny, ktoré pochádzajú z rovnakého osiva ako daný uvedený rastlinný materiál a pri ktorých sa i v prípade negatívneho výsledku skúmania prítomnosti pato- géna na základe klonovej príbuznosti kontaminácia zdá byť pravdepodobnou; — miesto(a) produkcie uvedeného rastlinného materiálu spomínaného v predchádzajúcej zarážke, — miesto(a) produkcie uvedeného rastlinného materiálu, na ktorom sa na zavlažovanie alebo postrek používala voda, ktorá bola podľa článku 5 (1) c) ii) označená za kontaminovanú, — uvedený rastlinný materiál vyprodukovaný na poliach, ktoré boli zaplavené povrchovou vodou, v ktorej bolo dokázané zamorenie škodlivým organizmom. 2. Pri stanovovaní možného šírenia škodlivého organizmu podľa článku 5 (1) a) iv) a 5 (1) c) iii) sa prihliada na: i) v prípadoch podľa článku 5 (1) a) iv): — blízkosť k iným miestam produkcie, na ktorých sa uvedený rastlinný materiál pestuje, — bežnú produkciu a použitie porastov sadivových zemiakov, — miesta produkcie, na ktorých sa uvedený rastlinný materiál zavlažuje alebo postrekuje povrchovou vodou v prípadoch, keď existuje alebo existovalo nebezpečenstvo odplavenia povrchovej vody alebo zaplavenia povrchovou vodou z miest produkcie, ktoré boli podľa článku 5 (1) a) ii) označené za kontaminované; ii) v prípadoch, kedy bola povrchová voda označená za kontaminovanú podľa článku 5 (1) c) ii): — miesto(a) produkcie, kde sa uvedený rastlinný materiál pestuje bezprostredne vedľa povrchovej vody označenej ako kontaminovanú alebo ktoré môže byť touto povrchovou vodou zaplavené, — každú samostatnú zavlažovaciu nádrž, ktorá je spojená s povrchovou vodou označenou za kontaminovanú. 408 SK Úradný vestník Európskej únie 03/zv. 23 3. Medzi podrobnosti oznámenia uvedeného v prvom pododseku článku 5 (2) patrí: — dátum oznámenia podozrenia na výskyt podľa článku 4 a dátumy odberu vzoriek a, podľa vhodnosti, potvrdenia prítomnosti škodlivého organizmu podľa článku 5, — opis označenej kontaminácie a vymedzenia bezpečnostného pásma. 4. Medzi podrobnosti dodatočného oznámenia uvedeného v druhom pododseku článku 5 (2) patrí: — pre každú zásielku alebo partiu zemiakov označenú za kontaminovanú, osvedčenia podľa článkov 7 a 8 smernice 77/93/EHS, číslo pasu rastlinného materiálu alebo, podľa vhodnosti, registračné číslo producenta zemiakov, zber- ného skladu a zasielateľského centra, — pre každú zásielku alebo partiu rajčiakov označenú za kontaminovanú, osvedčenia podľa článkov 7 a 8 smernice 77/93/EHS a číslo pasu rastlinného materiálu v súlade so zoznamom uvedeným v oddiele 1. 2. 2 časti A prílohy V k smernici 77/93/EHS, — názov odrody a kategórie sadív v prípade porastov sadivových zemiakov a podľa možnosti i v ostatných prípa- doch, — iné údaje týkajúce sa potvrdeného výskytu škodlivého organizmu, ktoré môže požadovať Komisia. 03/zv. 23 SK Úradný vestník Európskej únie 409 PRÍLOHA VI 1. Ustanovenia, na ktoré sa odvoláva článok 6 (1) sú: — spálenie, alebo — použitie ako krmivo pre zvieratá po tepelnom spracovaní, ktoré vylučuje nebezpečenstvo prežitia škodlivého organizmu, alebo — hlboké zahrabanie materiálu do skládok, pri ktorých neexistuje žiadne riziko priesaku na poľnohospodársky využívané plochy alebo do povrchovej vody, ktoré sa využívajú na zavlažovanie poľnohospodárskej pôdy, alebo — priemyselné spracovanie priamym a okamžitým dodaním do spracovateľského závodu vybaveného úradne schvá- lenými zariadeniami na zneškodňovanie odpadov, ktoré spĺňajú ustanovenia stanovené v prílohe VII k tejto smernici, alebo — iné opatrenia, ak preukázateľne neexistuje žiadne riziko šírenia škodlivého organizmu takéto opatrenia sa bezod- kladne oznámia Komisii a ostatným členským štátom. 2. Za vhodné využitie alebo zneškodnenie uvedeného rastlinného materiálu podľa článku 6 (2) pod dohľadom zodpo- vedných orgánov príslušných členských štátov pri vzájomnom informovaní zodpovedných orgánov s cieľom zabez- pečenia takéhoto dohľadu v ktoromkoľvek okamihu a so súhlasom zodpovedného orgánu členského štátu, v ktorom sa zemiaky majú baliť alebo spracovávať v zariadeniach na zneškodňovanie odpadu uvedených v prvej a druhej zarážke, sa považuje: i) v prípade zemiakových hľúz: — využitie ako trhové konzumné zemiaky balené na miestach vybavených vhodnými zariadeniami na zneškod- ňovanie odpadu, pripravené na okamžitú expedíciu a použitie bez potreby ďalšieho prebaľovania a určené na takúto priamu expedíciu a použitie, alebo — využitie ako trhové zemiaky pre priemyselné spracovanie, určené na priamu a okamžitú dodávku do spraco- vateľského zariadenia vybaveného vhodným zariadením na zneškodňovanie odpadu, alebo — iné využitie alebo zneškodnenie, ak preukázateľne neexistuje žiadne rozpoznateľné riziko šírenia škodlivého organizmu a po schválení uvedenými zodpovednými orgánmi. Takéto opatrenia sa bezodkladne ohlasujú Komisii a ostatným členským štátom. ii) v prípade iných častí rastlín vrátane stoniek a listového odpadu: — zničenie, alebo — iné využitie alebo zneškodnenie, ak preukázateľne neexistuje žiadne rozpoznateľné nebezpečenstvo šírenia škodlivého organizmu. Takéto opatrenia sa bezodkladne ohlasujú Komisii a ostatným členským štátom. 3. Vhodné metódy dezinfekcie predmetov uvedených v článku 6 (3), s ktorými prišiel nakazený materiál do styku, zahŕňajú vyčistenie a podľa vhodnosti dezinfekciu tak, aby bolo zabezpečené, že neexistuje žiadne rozpoznateľné riziko šírenia škodlivého organizmu, pričom toto opatrenie musí byť vykonané pod dohľadom zodpovedných orgánov členských štátov. 4. Do skupiny opatrení, ktoré musia členské štáty vykonať v bezpečnostnom pásme vymedzenom podľa článku 5 (1) a) iv) a c) iii) patria: 4. 1. V prípadoch, v ktorých boli miesta produkcie vyhlásené za kontaminované podľa článku 5 (1) a) ii): a) na poli alebo v jednotke chránenej rastlinnej produkcie, ktorá bola podľa článku 5(1) a) ii) označená za kontaminovanú, buď 410 SK Úradný vestník Európskej únie 03/zv. 23 i) minimálne počas štyroch rokov nasledujúcich po roku označenia kontaminácie: — opatrenia na potláčanie samovýsadby/samovýsevu rastlín zemiakov a rajčiakov, ako aj iných hostiteľ- ských rastlín škodlivého organizmu vrátane burinného spoločenstva patriaceho do čeľade ľuľkovitých; a — vynechanie výsadby/výsevu: — hľúz zemiakov alebo rastlín zemiakov, — rastlín rajčiakov alebo osiva rajčiaka, — prihliadajúc na biológiu škodlivého organizmu, — iných hostiteľských rastlín škodlivého organizmu, — rastlinných druhov z rodu Brassica, pri ktorých preukázateľne existuje riziko prežívania škodli- vého organizmu, — plodín, pri ktorých preukázateľne existuje riziko šírenia škodlivého organizmu; — v prvom vegetačnom období zemiakov a rajčiakov nasledujúcom po období uvedenom v predchá- dzajúcej zarážke a za podmienky, že pole bolo minimálne počas dvoch pestovateľských rokoch pred rokom vysadenia bez rastlín zemiakov alebo rajčiakov vyrastených zo samovýsadby/samovýsevu, ako i bez iných hostiteľských rastlín vrátane burinného spoločenstva patriaceho do čeľade ľuľkovitých, — v prípade zemiakov, pestovanie iba z úradne certifikovaného sadiva zemiakov určeného výlučne pre produkciu konzumných zemiakov a — vykonanie úradného prieskumu vrátane testov podľa článku 2 (1), — vo vegetačnom období zemiakov a rajčiakov nasledujúcom po vegetačnom období uvedenom v pred- chádzajúcej zarážke pri dodržaní vhodného osevného postupu, v prípade zemiakov, pestovanie iba z úradne certifikovaného sadiva zemiakov buď s cieľom produkcie sadivových zemiakov, alebo produkcie konzumných zemiakov a v prípade zemiakov a rajčiakov vykonanie úradného prieskumu podľa článku 2 (1) alebo ii) počas piatich pestovateľských rokov nasledujúcich po roku označenia pozemkov za kontaminované: — opatrenia na odstránenie samovýsadby/samovýsevu rastlín zemiakov a rajčiakov, ako i iných hostiteľ- ských rastlín škodlivého organizmu vrátane burinného spoločenstva patriaceho do čeľade ľuľkovitých a — počas prvých troch rokov tohto obdobia buď čierny úhor, alebo pestovanie obilnín podľa zisteného rizika alebo trvalá pastvina s častým kosením alebo intenzívnym spásaním alebo pestovanie tráv s cieľom získania semennej produkcie, po ktorých nasledujú dva roky pestovania nehostiteľských rastlín, ktoré preukázateľne nepredstavujú žiadne riziko prežitia alebo šírenia škodlivého organizmu, — v prvom vegetačnom období zemiakov a rajčiakov nasledujúcom po období uvedenom v predchá- dzajúcej zarážke, — v prípade zemiakov pestovanie iba z úradne certifikovaného sadiva zemiakov, a to buď s cieľom produkcie sadivových zemiakov, alebo konzumných zemiakov, a vykonanie úradného prieskumu vrátane testov podľa článku 2 (1); b) na iných poliach: — v pestovateľskom roku nasledujúcom po roku vyhlásenia pozemkov za — kontaminované: buď vynechanie výsadby zemiakových hľúz, alebo rastlín, alebo iných hostiteľských rastlín škodlivého organizmu, ako i opatrenia na odstránenie samovýsadby/samovýsevu rastlín zemiakov a rajčiakov, ako i iných hostiteľských rastlín škodlivého organizmu vrátane burinného spoločenstva patriaceho do čeľade ľuľkovitých; — v prípade zemiakových hľúz vysádzať iba z úradne certifikovaného sadiva zemiakov výlučne s cieľom produkcie konzumných zemiakov za predpokladu, že zodpovedné orgány súhlasia s tým, že boli eliminované riziká predstavované rastlinami zemiakov a rajčiakov zo samovýsadby/samovýsevu ako inými hostiteľskými rastlinami škodlivého organizmu vrátane burinného spoločenstva patriaceho do i čeľade ľuľkovitých. Porast sa vo vhodných termínoch kontroluje a v prípade rastlín zemiakov zo samovýsadby sa vykonávajú testy na prípadnú prítomnosť škodlivého organizmu; v prípade zemiakov sa navyše kontrolujú i zozbierané hľuzy; 03/zv. 23 SK Úradný vestník Európskej únie 411 — počas prvého pestovateľského roku nasledujúceho po pestovateľskom roku uvedenom v predchádzajúcej zarážke, — v prípade zemiakov vysádzať výlučne úradne certifikované sadivo zemiakov s cieľom produkcie sadi- vových zemiakov alebo konzumných zemiakov, — minimálne počas druhého pestovateľského roka nasledujúceho po pestovateľskom roku, uvedenom v predchádzajúcej zarážke, — v prípade zemiakov, vysádzať výlučne úradne certifikované sadivo zemiakov alebo sadivo, ktoré bolo vypestovaná pod úradným dohľadom z úradne certifikovaného sadiva zemiakov, a to s cieľom produkcie sadivových zemiakov alebo konzumných zemiakov, — v každom z pestovateľských rokov uvedených v predchádzajúcej zarážke, opatrenia na odstránenie rastlín zo samovýsadby/samovýsevu rajčiakov a zemiakov, ako i ďalších hostiteľských rastlín škodlivého organizmu vrátane burinného spoločenstva patriaceho do čeľade ľuľkovitých a vykonanie úradného pries- kumu vrátane testov podľa článku 2 (1) a v prípade, že sa vysádzajú hľuzy zemiakov pre produkciu sadiva, vykonanie testov hľúz; c) ihneď po vyhlásení pozemkov za kontaminované podľa článku 5 1) a) ii) a v každom nasledujúcom pestova- teľskom roku až do prvého prípustného pestovania zemiakov alebo rajčiakov na poli označenom za konta- minované podľa odseku a): — riadne vyčistenie a, podľa vhodnosti, dezinfekcia všetkých strojov a skladovacích zariadení nachádzajú- cich na mieste produkcie, ktoré sa používajú pri produkcii zemiakov alebo rajčiakov podľa bodu 3, — úradné kontroly zavlažovacích a postrekových programov, vrátane, podľa potreby, vyhlásenia zákazu zavlažovania a postrekov, s cieľom zabrániť šíreniu škodlivého organizmu; d) v jednotke chránenej produkcie rastlín, ktorá bola podľa článku 5 1) a) ii) označená za kontaminovanú a pri ktorej je možná úplná výmena pestovateľského substrátu, — vynechanie výsadby zemiakových hľúz alebo rastlín zemiakov alebo iných hostiteľských rastlín škodlivého organizmu vrátane rastlín rajčiakov, a výsevu semien rajčiakov dovtedy, pokiaľ sa príslušná prevádzková jednotka pod úradným dozorom nepodrobí opatreniam na zničenie škodlivého organizmu a na odstrá- nenie všetkého materiálu hostiteľských rastlín vrátane minimálne jednej úplnej výmeny pestovateľského substrátu, vyčistenia a, podľa potreby, dezinfekcie uvedenej jednotky a všetkých zariadení a pokiaľ nebude potom zodpovednými orgánmi udelený súhlas na pestovanie rajčiakov a zemiakov a — v prípade produkcie zemiakov, použitie úradne certifikovaného sadiva zemiakov, minihľúz alebo meristé- mových kultúr, ktoré pochádzajú z testovaných zdrojov a — úradné kontroly zavlažovacích a postrekových programov vrátane, podľa potreby, vyhlásenia zákazu zavlažovania a postrekov, s cieľom zabrániť šíreniu škodlivého organizmu. 4. 2 Bez toho, aby boli dotknuté opatrenia uvedené v bode 4. 1, sú členské štáty vo vymedzenej bezpečnostnej zóne povinné: a) ihneď a minimálne počas troch pestovateľských rokov nasledujúcich po roku vyhlásenia príslušných pozemkov za kontaminované: (aa) v prípadoch, kedy bola bezpečnostná zóna vymedzená podľa článku 5 1) a) iv): — vyžadovať, aby zodpovedné orgány vykonávali dozor nad prevádzkami, ktoré pestujú, skladujú alebo manipulujú so zemiakmi alebo rajčiakmi, ako aj nad prevádzkami, ktoré na zmluvnom základe obsluhujú strojové zariadenia používané pri produkcii zemiakov a rajčiakov, — vyžadovať čistenie a podľa vhodnosti, dezinfekciu strojových zariadení a skladov týchto podnikov vhodným spôsobom stanoveným v bode 3, 412 SK Úradný vestník Európskej únie 03/zv. 23 — vyžadovať, aby v takejto bezpečnostnej zóne boli všetky porasty zemiakov vysádzané výlučne z úradne certifikovaného sadiva alebo aby bolo používané sadivo vypestované pod úradným dozorom a aby sadivové zemiaky, ktoré boli pestované na miestach produkcie, ktoré boli podľa článku 5 1) a) iii) označené ako pravdepodobne napadnuté, boli po zbere testované, — vyžadovať, aby sa vo všetkých podnikoch nachádzajúcich sa v bezpečnostnej zóne oddelene mani- pulovalo so zozbieranými sadivovými zemiakmi a so zemiakmi určenými na konzumáciu; — vykonať úradný prieskum podľa článku 2 (1), (ab) v prípadoch, kedy bola povrchová voda označená za kontaminovanú pod článku 5 1) c) ii), alebo kedy sa na povrchovú vodu prihliada pri stanovovaní možného šírenia škodlivého organizmu podľa bodu 2 prílohy V, — vykonanie každoročného prieskumu vo vhodnom čase vrátane odberu vzoriek povrchovej vody a vhodných hostiteľských rastlín z čeľade ľuľkovitých v dotyčných zdrojoch vody a testov v súlade s: — pre uvedený rastlinný materiál, relevantnou metódou stanovenou v prílohe II, alebo — v ostatných prípadoch, akoukoľvek inou úradne schválenou metódou, — zaviesť úradné kontroly programov zavlažovania a postrekovania vrátane vyhlásenia zákazu zavlažo- vania a postrekovania uvedeného rastlinného materiálu a, podľa vhodnosti, iných hostiteľských rastlín vodou označenou za kontaminovanú s cieľom zabrániť šíreniu škodlivého organizmu. Takýto zákaz možno potom zvážiť na základe výsledkov uvedeného každoročného prieskumu, — zaviesť v prípade kontaminácie odpadových vôd úradné kontroly zneškodňovania odpadových vôd z prevádzkových priestorov podnikov priemyselného spracovania a balenia, ktoré manipulujú s uvedeným rastlinným materiálom; b) zriadiť podľa potreby program obnovy všetkých sadivových zemiakov počas primeraného časového obdobie. 03/zv. 23 SK Úradný vestník Európskej únie 413 PRÍLOHA VII Úradne povolené zariadenia na zneškodňovanie odpadov podľa štvrtej zarážky odseku 1 prílohy VI musia dodržiavať nasledujúce ustanovenia, aby sa vylúčilo riziko šírenia škodlivého organizmu: i) odpady zo spracovania zemiakov a rajčiakov (vrátane vyhodených zemiakov, zemiakových šupiek a rajčiakov) ako i iné tuhé odpady spojené s rajčiakmi a zemiakmi musia byť zneškodňované nasledujúcim spôsobom: — hlbokým zahrabaním materiálu do skládok, pri ktorých neexistuje žiadne nebezpečenstvo priesaku na poľno- hospodársky využívané plochy alebo do zdrojov vôd, ktoré by mohli byť využívané na zavlažovanie poľnohospo- dárskej pôdy. Odpad sa musí byť privezť priamo na skládku a byť izolovaný tak, aby sa vylúčilo nebezpečenstvo straty odpadu cestou, alebo — spálením ii) tekutý spracovateľský odpad: pred zneškodnením treba tekutý odpad, ktorý obsahujú nerozpustené látky, prefiltrovať alebo zaviesť do usadzovacej nádrže, aby sa odpad zbavil nerozpustených látok. Tuhé látky, ktoré z tohto procesu vzídu sa musia zneškodniť postupom uvedeným v pododseku (i). Tekutý odpad sa potom buď: — pred vypustením zahreje počas minimálne 30 minút na teplotu minimálne 70 °C, alebo — v súlade s úradným povolením a pod úradným dohľadom inak zneškodní tak, aby sa vylúčilo riziko, že odpad príde do styku s poľnohospodárskou pôdou alebo vodnými zdrojmi, ktoré by sa mohli používať na zavlažovanie poľnohospodárskej pôdy. Podrobnosti o zneškodnení sa oznámia ostatným členským štátom a komisii