title: Komisijas Direktīva 98/73/EK (1998. gada 18. septembris), ar ko divdesmit ceturto reizi tehnikas attīstībai pielāgo Padomes Direktīvu 67/548/EEK par normatīvo un administratīvo aktu tuvināšanu attiecībā uz bīstamu vielu klasifikāciju, iepakošanu un marķēšanu Dokuments attiecas uz EEZ.

eurovoc_concepts:
classification
dangerous substance
labelling
marketing standard
packaging

text: 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 139 31998L0073 16. 11. 1998. EIROPAS KOPIENU OFICIĀLAIS VĒSTNESIS L 305/1 KOMISIJAS DIREKTĪVA 98/73/EK (1998. gada 18. septembris), ar ko divdesmit ceturto reizi tehnikas attīstībai pielāgo Padomes Direktīvu 67/548/EEK par normatīvo un administratīvo aktu tuvināšanu attiecībā uz bīstamu vielu klasifikāciju, iepakošanu un marķēšanu (Dokuments attiecas uz EEZ) EIROPAS KOPIENU KOMISIJA, IR PIEŅĒMUSI ŠO DIREKTĪVU. ņemot vērā Eiropas Kopienas dibināšanas līgumu, 1. pants ņemot vērā Padomes Direktīvu 67/548/EEK (1967. gada 27. jūnijs) par normatīvo un administratīvo aktu tuvināšanu attie- cībā uz bīstamu vielu klasifikāciju, iepakošanu un marķēšanu (1), kurā jaunākie grozījumi izdarīti ar Komisijas Direktīvu 97/69/EK (2), un jo īpaši ar tās 28. pantu, ir Ar šo direktīvu 67/548/EEK groza šādi. 1. Direktīvas I pielikumu groza šādi: tā kā Direktīvas 67/548/EEK I pielikums ietver bīstamu vielu sarakstu kopā ar klasifikācijas un marķēšanas procedūru detaļām attiecībā uz katru vielu; tā kā pašreizējās zinātniskās un tehniskās zināšanas ir parādījušas, ka bīstamu vielu saraksts šajā pielikumā būtu jāpieskaņo un jāpapildina; tā kā Direktīvas 67/548/EEK V pielikumā ir izklāstītas vielu un preparātu fizikāli ķīmisko īpašību, toksicitātes un ekotoksicitātes noteikšanas metodes; tā kā ir vajadzīgs šo pielikumu pielāgot teh- nikas attīstībai; a) šīs direktīvas I pielikuma ieraksti aizstāj attiecīgus ierakstus Direktīvas 67/548/EEK I pielikumā; b) šīs direktīvas II pielikuma ierakstus ievieto Direktīvas 67/548/EEK I pielikumā. 2. V pielikumu groza šādi: a) šīs direktīvas III A, III B un III C pielikuma tekstu pievieno Direktīvas 67/548/EEK V pielikuma A daļai; b) šīs direktīvas III D pielikuma tekstu pievieno Direktīvas 67/548/EEK V pielikuma C daļai. tā kā šajā direktīvā paredzētie pasākumi ir saskaņā ar atzinumu, ko sniegusi Komiteja, kas atbild par to, kā tehnikas attīstībai pie- lāgot direktīvas par tehnisko šķēršļu novēršanu bīstamu vielu un preparātu tirdzniecībā, 2. pants (1) OV 196, 16. 8. 1967. , 1. lpp. (2) OV L 343, 13. 12. 1997. , 19. lpp. Dalībvalstīs stājas spēkā normatīvie un administratīvie akti, kas vajadzīgi, lai vēlākais līdz 1999. gada 31. oktobrim izpildītu šo direktīvu. Dalībvalstis par to tūlīt informē Komisiju. 140 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. Kad dalībvalstis paredz šos noteikumus, tajos ietver atsauci uz šo direktīvu vai šādu atsauci pievieno to oficiālai publikācijai. Dalībvalstis nolemj, kā veikt šādas atsauces. Šī direktīva ir adresēta dalībvalstīm. 4. pants 3. pants Šī direktīva stājas spēka 20. dienā pēc tās publicēšanas Eiropas Kopienu Oficiālajā Vēstnesī. Komisijas vārdā — Komisijas locekle Ritt BJERREGAARD Briselē, 1998. gada 18. septembrī ANEXO I — BILAG I — ANHANG I — ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ I — ANNEX I — ANNEXE I — ALLEGATO I — BIJLAGE I — ANEXO I — LIITE I — BILAGA I 142 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 143 144 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 145 146 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 147 148 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 149 150 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 151 152 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 153 154 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 155 156 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 157 158 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 159 160 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 161 162 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 163 164 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 165 166 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 167 168 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 169 170 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 171 172 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 173 174 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 175 176 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 177 178 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 179 180 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 181 182 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 183 184 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 185 186 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 187 188 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 189 190 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 191 192 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 193 194 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 195 196 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 197 198 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 199 200 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 201 202 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 203 204 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 205 206 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. ANEXO II — BILAG II — ANHANG II — ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ II — ANNEX II — ANNEXE II — ALLEGATO II — BIJLAGE II — ANEXO II — LIITE II — BILAGA II 208 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 209 210 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 211 212 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 213 214 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 215 216 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 217 218 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 219 220 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 221 222 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 223 224 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 225 226 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 227 228 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 229 230 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 231 232 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 233 234 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 235 236 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 237 238 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 239 240 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 241 242 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 243 244 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 245 246 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 247 248 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 249 250 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 251 252 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 253 254 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 255 256 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 257 258 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 259 260 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 261 262 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 263 264 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 265 266 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 267 268 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 269 270 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 271 272 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 273 274 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 275 276 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 277 278 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. III A PIELIKUMS A. 18. POLIMĒRU VIDĒJĀ MOLEKULAS MASA UN MOLEKULAS MASU SADALĪJUMS 1. METODE Šī gelhromatogrāfijas metode ir ESAO (Ekonomiskās sadarbības un attīstības organizācija) TG 118 (1996) kopija. Pamatprincipi un tehniskā informācija ir 1. atsaucē. 1. 1. Ievads Tā kā polimēru īpašības ir tik dažādas, nav iespējams aprakstīt vienu atsevišķu metodi, kas precīzi izklāstītu sadalīšanas un novērtēšanas apstākļus, kuri aptvertu visus gadījumus un specifiskās īpatnības, kuras sasto- pamas polimēru sadalīšanā. Īpaši sarežģītas polimēru sistēmas bieži nepakļaujas gelhromatogrāfijai (GPC — Gel permeation chromatography). Ja GPC nevar izmantot, molekulas masu var noteikt ar citām metodēm (sk. pielikumu). Tādos gadījumos būtu jādod visa informācija par lietoto metodi un tās pamatojums. Aprakstītās metodes pamatā ir DIN (Deutsches Institut fur Normung - Vācijas valsts standartu institūts) stan- darts 55672 (1). Detalizētu informāciju par to, kā veikt eksperimentus un novērtēt datus, var atrast šajā DIN standartā. Ja eksperimenta apstākļi jāmodificē, šīs izmaiņas jāpamato. Citus standartus var izmantot, ja uz tiem dod pilnīgi visas atsauces. Šī metode apraksta polistirola paraugu ar zināmu polidispersiju izmanto- šanu kalibrēšanai un tā varbūt jāmodificē, lai būtu piemērota noteiktiem polimēriem, piem. , ūdenī šķīsto- šiem un sazarotiem polimēriem ar garām ķēdītēm. 1. 2. Definīcijas un vienības Skaitlisko vidējo molekulas masu Mn un masas vidējo molekulas masu Mw nosaka, izmantojot šādus vie- nādojumus: kur: Hi ir detektora signāla līmenis no bāzes līnijas aizturēšanas tilpumam Vi, Mi ir molekulas masa polimēra frakcijai pie aizturēšanas tilpuma Vi, n ir datu punktu skaits. Molekulu masu sadalījuma platumu, kas ir sistēmas dispersijas pakāpes mērs, nosaka attiecība Mw/Mn. 1. 3. Standartvielas Tā kā GPC ir relatīva metode, jāveic kalibrēšana. Šim nolūkam parasti izmanto lineārus polistirola standar- tus ar šauru sadalījuma diapazonu, zināmām vidējām molekulas masām Mn un Mw un zināmu molekulu masu sadalījumu. Kalibrēšanas līkni, nosakot nezināma parauga molekulas masu, var izmantot tikai tad, ja parauga un standarta sadalīšanas apstākļi ir izvēlēti identiski. Noteiktā attiecība starp molekulas masu un eluēšanas tilpumu ir ticama tikai konkrēta eksperimenta speci- fiskos apstākļos. Apstākļi vispirms ietver temperatūru, šķīdinātāju (vai šķīdinātāju maisījumu), hromatogra- fēšanas apstākļus un sadalīšanas kolonnu vai kolonnu sistēmu. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 279 Šādi noteikto molekulas masu lielumi ir relatīvi un tos apzīmē kā “polistirola ekvivalenta molekulas masas”. Tas nozīmē, ka atkarībā no uzbūves un ķīmiskām atšķirībām starp paraugu un standartu molekulu masas var lielākā vai mazākā mērā atšķirties no absolūtās vērtības. Ja lieto citus standartus, piem. , polietilengliko- lu, polietilenoksīdu, polimetilmetakrilātu, poliakrilskābi, tas būtu jāpamato. 1. 4. Testa metodes princips Izmantojot GPC metodi, var noteikt gan molekulu masu sadalījumu, gan vidējās molekulu masas (Mn un Mw). GPC ir īpaša veida šķidruma hromatogrāfija, kur paraugu sadala atbilstoši atsevišķo sastāvdaļu hidro- dinamiskiem tilpumiem (2). Sadalīšana notiek, paraugam izejot caur kolonnu, kas ir pildīta ar porainu materiālu, parasti ar organisku gelu. Mazas molekulas var iespiesties porās, bet lielas molekulas nevar. Lielo molekulu ceļš tādēļ ir īsāks, un tās pirmās tiek eluētas. Vidēji lielas molekulas iekļūst dažās no porām, tādēļ tiek eluētas vēlāk. Mazākās mole- kulas, kuru hidrodinamiskais rādiuss ir mazāks nekā gela poras, var iekļūt visās porās. Tās tiek eluētas vis- vēlāk. Ideālā situācijā sadalīšanu pilnībā nosaka molekulu lielums, bet praksē ir grūti izvairīties vismaz no dažiem absorbcijas radītiem traucējumiem. Nevienāds kolonnas pildījums un kolonnā nesorbēto vielu aiztures laiks stāvokli var padarīt vēl sliktāku (2). Noteikšanu veic, piemēram, izmantojot laušanas koeficientu vai UV absorbciju, un iegūst vienkāršu sadalī- juma līkni. Tomēr, lai faktiskās molekulas masas vērtības attiecinātu uz līkni, jākalibrē kolonna, izlaižot cauri polimērus ar zināmu molekulas masu un ideālā variantā ar aptuveni līdzīgu uzbūvi, piem. , dažādas polis- tirola standartvielas. Parasti iegūst Gausa sadalījuma līkni, dažkārt deformētu ar nelielu asti mazo molekulu masu pusē; uz šīs grafikas vertikālās ass ir eluēto vielu, kam ir dažāda molekulas masa, svara daudzumi, un uz horizontālās ass ir molekulas masas logaritms. 1. 5. Kvalitātes kritēriji Eluēšanas tilpuma atkārtojamībai (Relatīvā standarta novirze - Relative Standart Deviation: RSD) būtu jābūt labākai par 0,3 %. Analīzes vajadzīgā atkārtojamība jānodrošina ar korekciju, izmantojot iekšējo standartu, ja hromatogramma ir izrādījusies atkarīga no laika un neatbilst iepriekšminētajam kritērijam (1). Polidisper- sitāte ir atkarīga no standartu molekulu masām. Polistirola standartiem parastās vērtības ir: Mp < 2 000 2 000 ≤ Mp ≤ 106 Mp > 106 Mw/Mn < 1,20 Mw/Mn < 1,05 Mw/Mn < 1,20 (Mp ir standartvielas molekulas masa pīķa maksimuma punktā). 1. 6. Testa metodes apraksts 1. 6. 1. Polistirola standartšķīduma pagatavošana Polistirola standartus, rūpīgi maisot, izšķīdina izvēlētajā eluentā. Šķīdumus pagatavojot, jāievēro ražotāja instrukcijas. Izvēlētās standartšķīdumu koncentrācijas ir atkarīgas no dažādiem faktoriem, piem. , iešļircināmā tilpuma, šķīduma viskozitātes un jutības pret analīzes detektoru. Maksimālais iešļircināmais tilpums jāpieskaņo kolonnas garumam, lai izvairītos no pārslodzes. Parasti analītiskām sadalīšanām, izmantojot GPC ar kolon- nas izmēriem 30 cm x 7,8 mm, iešļircināmie tilpumi ir starp 40 un 100 μl. Ir iespējams izmantot lielākus tilpumus, bet tiem nevajadzētu pārsniegt 250 μl. Pirms kolonnas faktiskās kalibrēšanas jānosaka optimālā attiecība starp iešļircināmo tilpumu un koncentrāciju. 280 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 1. 6. 2. Parauga šķīduma pagatavošana Principā parauga pagatavošanai ir tādas pašas prasības. Paraugu, uzmanīgi kratot, izšķīdina piemērotā šķī- dinātājā, piem. , tetrahidrofurānā (THF). Nekādā ziņā šķīdināt nedrīkst, izmantojot ultraskaņas vannu. Ja vajag, parauga šķīdumu tīra, filtrējot caur membrānas filtru ar poru diametru starp 0,2 un 2 μm. Neizšķīdušu daļiņu klātiene jāatzīmē beigu protokolā, jo tās var rasties no augstmolekulārām vielām. Jālieto piemērota metode, lai noteiktu izšķīdušo daļiņu svara procentu. Šķīdums jāizlieto 24 stundu laikā. 1. 6. 3. Aparatūra — šķīdinātāja rezervuārs, — atgāzētājs (ja vajadzīgs), — sūknis, — impulsu dempferis (ja vajadzīgs), — iešļircināšanas sistēma, — hromatogrāfiskā kolonna, — detektors, — plūsmas mērītājs (ja vajadzīgs), — datu reģistrēšanas un apstrādes iekārta, — trauks atkritumiem. Jānodrošina, lai GPC sistēma būtu inerta pret lietojamiem šķīdinātājiem (piem. , izmantojot tērauda kapilā- rus THF šķīdinātājam). 1. 6. 4. Iešļircināšanas un šķīdinātāja padeves sistēma Parauga šķīduma noteiktu tilpumu ievada kolonnā vai nu ar autosampleru vai ar roku precīzi noteiktā zonā. Pārāk ātra šļirces virzuļa atvilkšana vai nospiešana ar roku var radīt konstatētā molekulas masu sadalījuma maiņas. Šķīdinātāja padeves sistēmai, ciktāl tas ir iespējams, būtu jādarbojas bez impulsiem, tādēļ ideālā variantā sistēmā būtu jāiemontē impulsu dempferis. Plūsmas ātruma kārtas lielums ir 1 ml/min. 1. 6. 5. Kolonna Atkarībā no parauga, polimēru analizē, izmantojot vai nu vienu kolonnu, vai vairākas secīgas kolonnas. Tirdzniecībā ir pieejami vairāki kolonnu materiāli ar noteiktām īpašībām (piem. , poru lielumu, molekulas izmēru robežām). Sadalīšanas gela vai kolonnas garuma izvēle ir atkarīga no parauga īpašībām (hidrodina- miskie tilpumi, molekulu masu sadalījums) un sadalīšanas specifiskiem apstākļiem, piemēram, šķīdinātāja, temperatūras un plūsmas ātruma(1), (2), (3). 1. 6. 6. Teorētiskie šķīvji Sadalīšanai lietojamo kolonnu vai kolonnu apvienojumu jāraksturo ar teorētisko šķīvju skaitu. Tas ietver, ja par eluēšanas šķīdinātāju lieto THF, etilbenzola vai cita piemērota nepolāra šķīdinātāja ievadīšanu noteikta garuma kolonnā. Teorētisko šķīvju skaitu aprēķina ar šādu vienādojumu: W1/2)2 N = 5,54( Ve W)2 vai N = 16(Ve kur: N Ve ir teorētisko šķīvju skaits, ir eluēšanas tilpums pīķa maksimumā, W ir pīķa platums pie bāzes līnijas, W1/2 ir pīķa platums pusē no tā augstuma. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 281 1. 6. 7. Sadalīšanas efektivitāte Bez teorētisko šķīvju skaita, kas nosaka pīķa platumu, nozīme ir arī sadalīšanas efektivitātei, ko nosaka kali- brācijas līknes stāvums. Kolonnas sadalīšanas efektivitāti var aprēķināt no šādas sakarības: V - V e,M x e,(10M x) L 3 2] ≥ 6,0 [cm cm kur: VeM ir eluēšanas tilpums polistirolam ar molekulas masu Mx Ve(10M) ir eluēšanas tilpums polistirolam ar 10 reižu lielāku molekulas masu, L ir kolonnas šķērsgriezuma laukums. Sistēmas izšķirtspēju parasti definē šādi: R1,2 = 2 × Ve1 ‐ Ve2 W1 + W2 × 1 log10(M2/M1) kur: Ve1, Ve2 ir divu polistirola standartu eluēšanas tilpumi pīķa maksimuma punktā, W1, W2 ir pīķa platums pie bāzes līnijas, M1, M2 ir molekulas masas pīķa maksimumā (tām būtu jāatšķiras 10 reižu). Kolonnas sistēmai R vērtībai būtu jābūt lielākai par 1,7 (4). 1. 6. 8. Šķīdinātāji Visiem šķīdinātājiem jābūt augstas tīrības pakāpes (THF izmanto ar tīrības pakāpi 99,5 %). Šķīdinātāja rezer- vuāram (ja vajadzīgs, inertas gāzes atmosfērā) jābūt pietiekami lielam, lai veiktu kolonnas kalibrēšanu un vai- rākas paraugu analīzes. Pirms šķīdinātāju ievada kolonnā ar sūkni, tam jābūt atbrīvotam no gāzēm. 1. 6. 9. Temperatūras kontrole Galveno iekšējo sastāvdaļu (inžektora cilpa, kolonnas, detektors un caurules) temperatūrai jābūt konstantai un jāatbilst izvēlētajam šķīdinātājam. 1. 6. 10 Detektors Detektora uzdevums ir kvantitatīvi reģistrēt parauga, kas eluējas no kolonnas, koncentrāciju. Lai izvairītos no nevēlamas pīķu paplašināšanās, detektora šūnas ķivetes tilpumam jābūt tik mazam, cik iespējams. Tam nevajadzētu būt lielākam par 10 μl, izņemot gaismas izkliedes un viskozitātes detektorus. Detektēšanai para- sti izmanto diferenciālo refraktometriju. Tomēr, ja to prasa specifiskas parauga vai eluēšanas šķīdinātāja īpa- šības, var izmantot citu veidu detektorus, piem. , UV/VIS, IR, viskozitātes detektorus, utt. 2. DATI UN PROTOKOLI 2. 1. Dati Par detalizētiem novērtēšanas kritērijiem un prasībām, kas attiecas uz datu savākšanu un apstrādi, sk. DIN standartu (1). Katram paraugam jāizdara divi neatkarīgi eksperimenti. Tie jāanalizē atsevišķi. Mn, Mw, Mw/Mn un Mp jāsniedz katram mērījumam. Skaidri jānorāda, ka izmērītie lielumi ir relatīvi lielumi, kas ir ekvivalenti izmantoto standartvielu molekulu masām. 282 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. Pēc aiztures tilpumu vai aiztures laiku noteikšanas (ja iespējams, koriģējot ar iekšējo standartu), uz grafika atliek log Mp (Mp ir kalibrēšanas standarta pīķa maksimums)pret vienu no šiem abiem lielumiem. Uz mole- kulu masu dekādi ir vajadzīgi vismaz divi kalibrēšanas punkti, un visai kalibrēšanas līknei vajadzīgi vismaz pieci punkti, šai līknei jāietver noteiktā parauga molekulas masa. Kalibrēšanas līknes mazo molekulu masu galapunktu nosaka ar n-heksilbenzolu vai citu piemērotu izšķīdināto vielu. Skaita vidējo vai svara vidējo molekulas masu parasti nosaka, izmantojot elektronisko datu apstrādi, kas pamatojas uz formulām, kas dotas sadaļā 1. 2. Ja datus apstrādā ar roku, var izmantot ASTM D 3536-91 (3). Sadalījuma līkne jāsagatavo tabulas veidā vai līknes veidā (kā diferenciālas frekvences vai procentu no sum- mas attiecība pret log M). Grafiskajā attēlā vienai molekulu masu dekādei parasti būtu jābūt ap 4 cm platai un pīķa maksimumam jābūt ap 8 cm augstam. Integrālai sadalījuma līknei starpībai starp 0 un 100 % uz ordinātas būtu jābūt ap 10 cm. 2. 2. Testa ziņojums Testa ziņojumā jābūt šādai informācijai: 2. 2. 1. Pārbaudāmā viela — par pārbaudāmo vielu pieejamā informācija (identiskums, piedevas, piemaisījumi), — parauga apstrādes apraksts, novērojumi, problēmas. 2. 2. 2. Iekārtas — eluenta rezervuārs, inerta gāze, eluenta atgāzēšana, eluenta sastāvs, piemaisījumi, — sūknis, impulsu dempferis, iešļircināšanas sistēma, — sadalīšanas kolonnas (ražotājs, visa informācija par kolonnas raksturlielumiem, piem. , poru izmēri, sada- lītājs materiāls utt. , izmantoto kolonnu skaits, garums un sakārtojums, — kolonnas (vai to apvienojuma) teorētisko šķīvju skaits, sadalīšanas efektivitāte (sistēmas izšķirtspēja), — informācija par pīķu simetriju, — kolonnas temperatūra, temperatūras kontroles veids, — detektors (mērījumu princips, tips, ķivetes tilpums), — plūsmas mērītājs, ja to lieto (ražotājs, mērīšanas princips), — reģistrēšanas un datu apstrādes sistēma (aparatūra, programmatūra). 2. 2. 3. Sistēmas kalibrēšana — kalibrēšanas līknes konstruēšanai izmantotās metodes sīks apraksts, — informācija par šīs metodes kvalitātes kritērijiem (piem. , korelācijas koeficients, kvadrātisko kļūdu summa, utt. ), — informācija par visām ekstrapolācijām, eksperimenta procedūru, pieņēmumi un tuvinājumi novērtēša- nas un datu apstrādes laikā, — visiem mērījumiem, kas izmantoti kalibrācijas līknes konstruēšanai, jābūt dokumentētiem tabulā, kas iet- ver šādu informāciju katram kalibrācijas punktam: — parauga nosaukums, — parauga ražotājs, — standartu raksturīgās Mp, Mn, Mw un Mw/Mn vērtības, ko devis ražotājs vai kas iegūtas mērījumos, kā arī noteikšanas metožu detaļas, — iešļircinātais tilpums un iešļircinātā šķīduma koncentrācija, — kalibrēšanā izmantotā Mp vērtība, 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 283 — eluēšanas tilpums vai koriģētais aiztures laiks, kas izmērīts pīķa maksimumā, — pīķa maksimumā aprēķinātais Mp, — aprēķinātā Mp kļūda procentos un kalibrēšanas vērtība. 2. 2. 4. Novērtēšana: — novērtēšana, ņemot vērā laiku: metodes, kas izmantotas, lai nodrošinātu vajadzīgo atkārtojamību (koriģēšanas metode, iekšējais standarts, utt. ), — informācija par to, vai novērtēšana veikta pamatojoties uz eluēšanas tilpumu vai aiztures laiku, — informācija par novērtēšanas robežām, ja pīķis nav pilnībā izanalizēts, — nogludināšanas metožu apraksts, ja tādas ir lietotas, — parauga iepriekšējās apstrādes un sagatavošanas procedūras, — neizšķīdušu daļiņu klātbūtne, ja tādas ir, — iešļircinātais tilpums (μl) un iešļircinātā šķīduma koncentrācija (mg/ml), — novērojumi, kas norāda uz ietekmēm, kas rada novirzes no ideāla GPC profila, — visu testa procedūras grozījumu sīks apraksts, — detaļas par kļūdu diapazonu, — visa pārējā informācija un novērojumi, kas attiecas uz rezultātu interpretāciju. 3. ATSAUCES (1) DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1. (2) Yau, W. W. , Kirkland, J. J. , and Bly, D. D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons. (3) ASTM D 3536-91, (1991). Standart Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Dis- tribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography — GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. (4) ASTM D 5296-92, (1992). Standart Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Dis- tribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. 284 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. Pielikums Polimēru skaita vidējā molekulsvara (Mn) citu noteikšanas metožu piemēri Gelhromatogrāfija (GPC) ir vispiemērotākā metode Mn noteikšanai, īpaši, ja ir pieejams standartu komplekts, kuru uzbūve ir salīdzināma ar polimēra uzbūvi. Tomēr, ja GPC izmantošanā ir praktiskas grūtības vai ir sagaidāms, ka viela neatbildīs noteicošajam Mn kritērijam (kas jāapstiprina), tad ir pieejamas alternatīvas metodes, piemēram: 1. No molekulu skaita atkarīgo īpašību izmantošana 1. 1. Ebulioskopija/krioskopija: ietver šķīdinātāja viršanas punkta paaugstinājuma (ebulioskopija) vai sasalšanas tem- peratūras pazeminājuma (krioskopija) mērīšanu, kad šķīdinātājam ir pievienots polimērs. Metode pamatojas uz to, ka izšķīdušā polimēra ietekme uz šķidruma vārīšanās/sasalšanas temperatūru ir atkarīga no polimēra molekulas masas (1), (2). Piemērojamība: Mn < 20 000. 1. 2. Tvaika spiediena pazeminājums: ietver izvēlētā standartšķidruma tvaika spiediena mērījumus pirms un pēc zināmu polimēra daudzumu pievienošanas (1), (2). Piemērojamība: Mn < 20 000 (teorētiski; praktiski tomēr metodes vērtība ir ierobežota). 1. 3. Membrānas osmometrija: pamatojas uz osmozes principu, t. i. , šķīdinātāja molekulu tieksmi iet cauri puscaurlai- dīgām membrānām no atšķaidītāka uz koncentrētāku šķīdumu, lai sasniegtu līdzsvaru. Šķīdinātāja iešana caur membrānu rada spiediena starpību, kas ir atkarīga no polimēra koncentrācijas un molekulu masas (1), (3), (4). Pielietojamība: Mn ir starp 20 000 un 200 000. 1. 4. Tvaika fāzes osmometrija: saistīta ar tīra šķīdinātāja aerosola iztvaikošanas ātruma salīdzināšanu ar vismaz trīs aerosolu, kas satur polimēru dažādās koncentrācijās, iztvaikošanas ātrumu (1), (5), (6). Pielietojamība: Mn < 20 000. 2. Gala grupu analīze Lai izmantotu šo metodi, jāzina gan polimēra vispārējā uzbūve, gan ķēdes noslēdzošās grupas (kam jābūt atšķi- ramām no galvenā skeleta, piemēram, ar KMR metodi vai ar titrēšanu/derivatizāciju). Polimēra gala grupu mole- kulārās koncentrācijas noteikšana var noskaidrot molekulu masu lielumu (7), (8), (9). Piemērojamība: Mn līdz 50 000 (ticamība samazinās, palielinoties molekulu masai). ATSAUCES (1) Billmeyer, F. W. Jr. , (1984). Textbook of Polymer Science, 3rd Edn. , John Wiley, New York. (2) Glover, C. A. , (1975). Absolute Colligative Property Methods. Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I, P. E. Slade, Jr. ed. Marcel Dekker, New York. (3) ASTM D 3750-79 (1979) Standart Practice for Determination of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Membrane Osmometry. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. (4) Coll, H. (1989). Membrane Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A. R. Cooper ed. , J. Wiley and Sons, pp. 25 to 52. (5) ASTM 3592-77, (1977). Standard Recommended Practice for Determination of Molecular Weight by Vapour Pres- sure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 285 (6) Morris, C. E. M. , (1989). Vapour Pressure Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A. R. Cooper ed. , J. Wiley and Sons. (7) Schroder, E. , Muller, G. , and Arndt, K-F. , (1989). Polymer Characterisation, Carl Hanser Verlag, Munich. (8) Garmon R. G. , (1975). End-Group Determinations, Chapter 3. In: Polymer Molecular Weights, Part I, P. E. Slade, Jr. ed. Marcel Dekker, New York. (9) Amiya, S. , et al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, 2139-2146. 286 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. III B PIELIKUMS A. 19. MAZU MOLEKULU MASU SATURS POLIMĒROS 1. METODE Šī gelhromatogrāfijas metode ir OECD TG 119 (1996) kopija. Pamatprincipi un sīkāka tehniskā informā- cija ir dota atsaucēs. 1. 1. Ievads Tā kā polimēru īpašības ir tik dažādas, ir neiespējami aprakstīt vienu metodi, kas precīzi izklāstītu sadalī- šanas un novērtēšanas apstākļus, kas aptvertu visas iespējamības un īpatnības, kādas sastopamas polimēru sadalīšanā. Jo īpaši ar gelhromatogrāfiju (GPC) bieži nav analizējamas sarežģītas polimēru sistēmas. Ja GPC nav izmantojama, molekulas masu var noteikt ar citām metodēm (sk. pielikumu). Tādos gadījumos būtu jāsniedz visas izmantotās metodes detaļas un pamatojums. Šeit aprakstītā metode pamatojas uz DIN standartu 55672 (1). Sīki izstrādāta informācija, kā veikt ekspe- rimentus un kā izvērtēt datus, ir atrodama šajā DIN standartā. Ja nepieciešams mainīt eksperimenta apstāk- ļus, šīs izmaiņas jāpamato. Citus standartus var izmantot, ja dod visas atsauces. Šeit aprakstītā metode kali- brēšanai izmanto polistirola paraugus ar zināmu polidispersitāti un tā varbūt jāmodificē, lai tā atbilstu noteiktiem polimēriem, piem. , ūdenī šķīstošiem un sazarotiem polimēriem ar garu ķēdi. 1. 2. Definīcijas un vienības Maza molekulas masa nosacīti ir definēta kā molekulas masa, kas mazāka par 1 000 daltoniem. Skaita vidējo molekulas masu Mn un svara vidējo molekulas masu Mw nosaka, izmantojot šādus vienādo- jumus: kur: Hi ir detektora signāla līmenis, skaitot no bāzes līnijas, aiztures tilpumam Vi Mi ir polimēra frakcijas molekulas masa ar aiztures tilpumu Vi un n ir datu punktu skaits. Molekulu masu sadalījuma līknes platumu, kas ir sistēmas dispersitātes mērs, nosaka attiecība Mw/Mn. 1. 3. Standartvielas Tā kā GPC ir relatīva metode, jāizdara kalibrēšana. Parasti šim nolūkam izmanto lineāras uzbūves polisti- rola standartvielas ar zināmām molekulu masām Mn un Mw un ar šauru masu sadalījuma diapazonu. Nezi- nāma parauga molekulas masas noteikšanai šo kalibrācijas līkni var izmantot tikai tad, ja sadalīšanas apstākļi paraugam un standartvielām ir izvēlēti identiski. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 287 Noteiktā molekulu masu un eluēšanas tilpuma sakarība ir ticama tikai konkrēta eksperimenta specifiskos apstākļos. Šie apstākļi, pirmkārt, ietver temperatūru, šķīdinātāju (vai šķīdinātāju maisījumu), hromatogra- fēšanas apstākļus un sadalīšanas kolonnu vai kolonnu sistēmu. Šādi noteiktās parauga molekulu masas ir relatīvi lielumi un tos apzīmē kā “polistirola ekvivalentās mole- kulu masas”. Tas nozīmē, ka atkarībā no uzbūves un ķīmiskajām atšķirībām starp paraugu un standartiem molekulu masas lielākā vai mazākā mērā var atšķirties no absolūtajiem lielumiem. Ja izmanto citus stan- dartus, piem. , polietilenglikolu, polietilenoksīdu, polimetilmetakrilātu, poliakrilskābi, iemesls būtu jāpama- to. 1. 4. Testa metodes princips Ar GPC var noteikt gan parauga molekulu masu sadalījumu, gan vidējās molekulu masas (Mn, Mw). GPC ir īpaša veida šķidrumu hromatogrāfija, kas paraugu sadala atbilstīgi atsevišķo sastāvdaļu hidrodinamiskiem tilpumiem (2). Sadalīšana notiek, paraugam ejot caur kolonnu, kas ir pildīta ar porainu materiālu, parasti ar organisku gelu. Mazas molekulas var iekļūt porās, kamēr lielas molekulas tur neiekļūst. Lielo molekulu ceļš tādēļ ir īsāks un tās eluējas pirmās. Vidēji lielas molekulas iekļūst dažās porās un eluējas vēlāk. Vismazākās molekulas, kuru vidējais hidrodinamiskais rādiuss ir mazāks par gela porām, var iekļūt visās porās. Tās eluējas visvēlāk. Ideālā gadījumā sadalīšanu pilnībā nosaka molekulu lielums, bet praksē ir grūtu izvairīties vismaz no dažām traucējošām absorbcijas ietekmēm. Nevienāds kolonnas pakojums un kolonnā nesorbēto vielu aiztures laiks var stāvokli vēl pasliktināt (2). Detektēšanu veic, piem. , izmantojot laušanas koeficientu vai UV absorbciju, un iegūst vienkāršu sadalījuma līkni. Lai uz līkni attiecinātu faktiskos molekulu masu lielumus, tomēr jākalibrē kolonna, caur to laižot poli- mērus ar zināmu molekulas masu un ideālā gadījumā ar aptuveni līdzīgu uzbūvi, piem. , dažādus polistirola standartus. Parasti iegūst Gausa sadalījuma līkni, kas dažkārt ir izkropļota ar nelielu asti mazo molekulu masu pusē. Līknes vertikālā koordinātu ass rāda dažādu eluēto molekulu, kam ir atšķirīgas molekulu masas, svara daudzumus un horizontālā ass rāda molekulu masas logaritmu. Mazu molekulu masu saturu izrēķina no šīs līknes. Aprēķins precīzs var būt tikai tad, ja vielas ar mazām molekulu masām izturas tāpat kā polimērs kopumā. 1. 5. Kvalitātes kritēriji Eluēšanas tilpuma atkārtojamībai (relatīvajai standartnovirzei - Relative Standard Deviation: RSD) būtu jābūt labākai par 0,3 %. Analīzei vajadzīgo atkārtojamību jānodrošina, koriģējot ar iekšējo standartu, ja hroma- togramma ir novērtēta kā atkarīga no laika un neatbilst iepriekš minētajam kritērijam (1). Polidispersitāte ir atkarīga no standartvielu molekulu masām. Polistirola standartu gadījumā parastie lielumi ir: Mp < 2 000 2 000 ≤ Mp ≤ 106 Mp > 106 Mw/Mn < 1,20 Mw/Mn < 1,05 Mw/Mn < 1,20 (Mp ir standartvielas molekulas masa pīķa maksimumā). 1. 6. Testa metodes apraksts 1. 6. 1. Polistirola standartšķīdumu pagatavošana Polistirola standartvielas izšķīdina izvēlētajā eluentā, rūpīgi maisot. Gatavojot šķīdumus, jāievēro ražotāja norādījumi. 288 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. Izvēlētās standartvielu koncentrācijas ir atkarīgas no vairākiem faktoriem, piem. , iešļircināmā tilpuma, šķī- duma viskozitātes un analīzes detektora jutības. Maksimālais iešļircināmais tilpums jāpieskaņo kolonnas garumam, lai izvairītos no pārslodzes. Parasti, izmantojot GPC, ja kolonnas izmēri ir 30 cm x 7,8 mm, iešļir- cināmie tilpumi analītiskām sadalīšanām ir starp 40 un 100 μl. Ir iespējams izmantot lielākus tilpumus, bet tiem nevajadzētu pārsniegt 250 μl. Pirms kolonnas faktiskās kalibrēšanas jānosaka optimālā attiecība starp iešļircināmo tilpumu un koncentrāciju. 1. 6. 2. Parauga šķīduma pagatavošana Principā, tās pašas prasības attiecas uz parauga šķīduma sagatavošanu. Paraugu izšķīdina piemērotā šķīdi- nātājā, piem. , tetrahidrofurānā (THF), uzmanīgi kratot. Nekādā ziņā paraugu nedrīkst šķīdināt, izmantojot ultraskaņu. Ja vajadzīgs, parauga šķīdumu tīra caur membrānas filtru ar poru izmēriem starp 0,2 un 2 μm. Neizšķīdušo daļiņu klātbūtne jāatzīmē gala protokolā, jo tās var būt radušās vielu, kam ir lielāka molekulu masa, klātbūtnes dēļ. Būtu jāizmanto piemērota metode, lai noteiktu neizšķīdušo daļiņu svara procentus. Šķīdumi būtu jāizlieto 24 stundu laikā. 1. 6. 3. Korekcija uz piemaisījumu un piedevu saturu Vielu ar M < 1 000 satura korekcija uz klātesošiem nepolimēru specifiskiem komponentiem (piem. , pie- maisījumiem vai piedevām) parasti ir nepieciešama, ja vien izmērītais saturs jau nav mazāks par 1 %. To veic ar GPC eluāta vai polimēra šķīduma tiešo analīzi. Gadījumos, kad eluāta šķīdums pēc iznākšanas no kolonnas ir pārāk atšķaidīts tālākai analīzei, tas jāsakon- centrē. Var būt vajadzīgs eluātu ietvaicēt līdz sausam un vēlreiz atšķaidīt. Eluāta koncentrēšana jāveic apstāk- ļos, kas nodrošina, ka eluātā nenotiek nekādas pārmaiņas. Eluāta apstrāde pēc GPC posma ir atkarīga no kvantitatīvai noteikšanai izmantojamās metodes. 1. 6. 4. Aparatūra GPC iekārtai ir šādas galvenās sastāvdaļas: — šķīdinātāja rezervuārs, — eluenta atgāzētājs (ja vajadzīgs), — sūknis, — impulsu dempferis (ja vajadzīgs), — iešļircināšanas sistēma, — hromatogrāfijas kolonnas, — detektors, — plūsmas mērītājs (ja vajadzīgs), — datu reģistrācijas un apstrādes sistēma, — trauks atkritumiem. Jānodrošina, lai GPC sistēma būtu inerta attiecībā uz lietojamiem šķīdinātājiem (piem. , lietojot tērauda kapi- lārus THF šķīdinātājam). 1. 6. 5. Iešļircināšanas un šķīdinātāja padeves sistēma Parauga šķīduma noteiktu daudzumu ievada kolonnā, vai nu izmantojot autosampleru, vai ar roku precīzi noteiktā zonā. Ja, ievadot ar roku, šļirces virzuli atvelk vai nospiež pārāk ātri, tas var mainīt novērojamo molekulu masu sadalījumu. Šķīdinātāja padeves sistēmai, cik iespējams, būtu jābūt bez impulsiem, ideālā gadījumā tajā būtu jābūt impulsu dempferim. Plūsmas ātruma kārtas lielums ir 1 ml/min. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 289 1. 6. 6. Kolonna Atkarībā no parauga polimēru analizē, izmantojot vai nu vienu kolonnu, vai vairākas secīgi savienotas kolonnas. Pārdošanā ir pieejami vairāki kolonnu materiāli ar noteiktām īpašībām (piem. , poru lielumu, izslēgšanas robežas). Sadalītāja gela vai kolonnas garuma izvēle ir atkarīga no parauga īpašībām (hidrodi- namiskais tilpums, molekulu masu sadalījums) un no specifiskiem sadalīšanas apstākļiem, piemēram, šķī- dinātāja, temperatūras un plūsmas ātruma (1), (2), (3). 1. 6. 7. Teorētiskie šķīvji Sadalīšanai izmantotā kolonna vai kolonnu apvienojums jāraksturo ar teorētisko šķīvju skaitu. Ja par eluē- šanas šķīdinātāju lieto THF, tas ietver etilbenzola vai citas piemērotas nepolāras vielas šķīduma ievadīšanu zināma garuma kolonnā. Teorētisko šķīvju skaitu aprēķina ar šādiem vienādojumiem: W1/2)2 N = 5,54( Vc W)2 vai N = 16(Vc kur: N Vc ir teorētisko šķīvju skaits, ir eluētais tilpums pīķa maksimuma punktā, W ir pīķa platums pie bāzes līnijas, W1/2 ir pīķa platums pusē no augstuma. 1. 6. 8. Sadalīšanas efektivitāte Papildus teorētisko šķīvju skaitam, kas ir lielums, kurš nosaka joslas platumu, nozīme ir arī sadalīšanas efek- tivitātei, ko nosaka kalibrēšanas līknes stāvums. Kolonnas sadalīšanas efektivitāti izrēķina no šādas sakarī- bas: V -V eM x e(10M x) L 3 2] ≥ 6,0[cm cm kur: VeMx ir polistirola ar molekulas masu Mx eluētais tilpums, Ve(10 Mx) ir polistirola ar 10 reižu lielāku molekulas masu eluētais tilpums, L ir kolonnas šķērsgriezuma laukums. Sistēmas izšķirtspēju parasti nosaka šādi: R1,2 = 2 × Ve1- Ve2 W1+ W2 × 1 log10(M2/M1) kur: Ve1 un Ve2 ir divu polistirola standartu eluēšanas tilpumi pīķa maksimumā, W1 un W2 ir pīķa platumi pie bāzes līnijas, M1 un M2 ir molekulu masas pīķu maksimumos (tām būtu jāatšķiras 10 reižu). Kolonnu sistēmas R lielumam būtu jābūt lielākam par 1,7 (4). 1. 6. 9. Šķīdinātāji Visiem šķīdinātājiem jābūt augstas tīrības (THF lieto ar tīrības pakāpi 99,5 %). Šķīdinātāja rezervuāram (ja vajadzīgs, inertas gāzes atmosfērā) jābūt pietiekami lielam, lai veiktu kolonnas kalibrēšanu un vairākas paraugu analīzes. Šķīdinātājs jāatbrīvo no gāzēm, pirms to ar sūkni pievada kolonnai. 290 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 1. 6. 10. Temperatūras kontrole Svarīgāko iekšējo sastāvdaļu (inžektora cilpas, kolonnu, detektora un cauruļu) temperatūrai būtu jābūt kon- stantai un atbilstošai izvēlētajam šķīdinātājam. 1. 6. 11. Detektors Detektoram kvantitatīvi jāreģistrē no kolonnas eluētā parauga koncentrācija. Lai izvairītos no nevajadzīgas pīķa paplašināšanās, detektora šūnas ķivetes tilpumam vajadzētu būt pēc iespējas mazākam. Tam nevaja- dzētu būt lielākam par 10 μl, izņemot gaismas izkliedes un viskozitātes detektorus. Parasti detektēšanai izmanto diferenciālo refraktometriju. Tomēr, ja tas vajadzīgs parauga vai eluēšanas šķīdinātāja specifisko īpašību dēļ, var izmantot citu veidu detektorus, piem. , UV/VIS, IR, viskozitātes detektorus utt. 2. DATI UN PROTOKOLĒŠANA 2. 1. Dati Detalizētus izvērtēšanas kritērijus un prasības, kas attiecas uz datu savākšanu un apstrādi, sk. DIN stan- dartā (1). Katram paraugam jāizdara divi neatkarīgi eksperimenti. Tie jāanalizē atsevišķi. Visos gadījumos ir būtiski svarīgi iegūt arī tukšo mēģinājumu datus tādos pašos apstākļos kā veikta parauga analīze. Skaidri jānorāda, ka izmērītie lielumi ir relatīvi lielumi, kas ir ekvivalenti lietotā standarta molekulu masām. Pēc aiztures tilpumu vai aiztures laiku noteikšanas (iespējams, koriģējot ar iekšējo standartu) log Mp lielu- mus (Mp ir kalibrēšanas standarta pīķa maksimuma vērtība) atliek grafikā pret vienu no minētajiem lielu- miem. Vajadzīgi vismaz divi kalibrēšanas punkti uz molekulu masas dekādi, visai līknei vajadzīgi vismaz pieci kalibrēšanas punkti, kam būtu jāietver parauga noteiktā molekulas masa. Kalibrēšanas līknes zemāko molekulu masu galapunktu nosaka ar n-heksilbenzolu vai citu piemērotu nepolāru izšķīdināmo vielu. Līk- nes daļu, kas atbilst molekulu masām zem 1 000, nosaka un, ja vajadzīgs, koriģē attiecībā uz piemaisīju- miem un piedevām. Eluēšanas līknes parasti izvērtē ar elektronisko datu apstrādi. Skaitļojot ar roku, var konsultācijai izmantot ASTM D 3536-91(3). Ja kolonnā ir aizturēts kāds nešķīstošs polimērs, tā molekulas masa varētu būt lielāka par šķīstošo frakciju molekulas masu un, ja to neņem vērā, zemo molekulu masu saturu novērtē pārāk augstu. Pielikumā dotas vadlīnijas, kā koriģēt zemo molekulu masu saturu uz nešķīstoša polimēra klātbūtni. Sadalījuma līkne jāsagatavo tabulas vai zīmējuma veidā (diferenciālais biežums vai procenti no summas pret log M). Attēlojot grafiski, vienai molekulu masas dekādei būtu jābūt ap 4 cm platai un pīķa maksimumam būtu jābūt ap 8 cm augstam. Integrālajām sadalījuma līknēm starpībai uz ordinātas starp 0 un 100 % vaja- dzētu būt ap 10 cm. 2. 2. Testa ziņojums Testa ziņojumā jāietver šāda informācija: 2. 2. 1. Pārbaudāmā viela — pieejamā informācija par analizējamo vielu (identiskums, piedevas, piemaisījumi), — parauga apstrādes apraksts, novērojumi, problēmas. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 291 2. 2. 2. Iekārtas — eluenta rezervuārs, inerta gāze, eluenta atgāzēšana, eluenta sastāvs, piemaisījumi, — sūknis, impulsu dempferis, inžektora sistēma, — sadalīšanas kolonnas (ražotājs, visa informācija par kolonnas raksturlielumiem, piem. , poru izmēri, sadalīšanas materiāls utt. , izmantoto kolonnu skaits, garums un sakārtojums), — kolonnas (vai to apvienojuma) teorētisko šķīvju skaits, sadalīšanas efektivitāte (sistēmas izšķirtspēja), — informācija par pīķu simetriju, — kolonnas temperatūra, temperatūras kontroles veids, — detektors (mērījumu princips, tips, ķivetes tilpums), — plūsmas mērītājs, ja to lieto (ražotājs, mērīšanas princips), — reģistrēšanas un datu apstrādes sistēma (aparatūra, programmatūra). 2. 2. 3. Sistēmas kalibrēšana — kalibrēšanas līknes konstruēšanai izmantotās metodes sīks apraksts, — informācija par šīs metodes kvalitātes kritērijiem (piem. , korelācijas koeficients, kvadrātisko kļūdu summa, utt. ) — informācija par visām ekstrapolācijām, eksperimenta procedūru, novērtēšanas un datu apstrādes laikā izdarītie pieņēmumi un tuvinājumi — visiem mērījumiem, kas izmantoti kalibrācijas līknes konstruēšanai, jābūt dokumentētiem tabulā, kas ietver šādu informāciju katram kalibrācijas punktam: — parauga nosaukums, — parauga ražotājs, — standartu raksturīgās Mp, Mn, Mw un Mw/Mn vērtības, ko devis ražotājs vai kas iegūtas mērījumos, kā arī noteikšanas metožu detaļas, — iešļircinātais tilpums un iešļircinātā šķīduma koncentrācija, — kalibrēšanā izmantotā Mp vērtība, — eluēšanas tilpums vai koriģētais aiztures laiks, kas izmērīts pīķa maksimumā, — pīķa maksimumā aprēķinātais Mp, — aprēķinātā Mp kļūda procentos un kalibrēšanas vērtība. 2. 2. 4. Informācija par polimēra saturu ar zemu molekulas masu — analīzē izmantoto metožu apraksts un veids, kā eksperimenti veikti, — informācija par vielu ar mazu molekulas masu procentuālo daudzumu (svars/svars) attiecībā uz visu paraugu. — informācija par piemaisījumiem, piedevām un citu vielu, kas nav polimēri, saturu svara procentos attie- cībā uz visu paraugu. 2. 2. 5. Novērtēšana: — novērtēšana, ņemot vērā laiku: visas metodes, kas izmantotas, lai nodrošinātu vajadzīgo atkārtojamību (koriģēšanas metode, iekšējais standarts, utt. ), — informācija par to, vai novērtēšana veikta pamatojoties uz eluēšanas tilpumu vai aiztures laiku, — informācija par novērtēšanas robežām, ja aparatūra pīķi nav pilnīgi izanalizējusi, — nogludināšanas metožu apraksts, ja tādas ir lietotas, 292 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. — parauga pirmapstrādes un pirmsagatavošanas procedūras, — neizšķīdušu daļiņu klātbūtne, ja tādas ir, — iešļircinātais tilpums (μl) un iešļircinātā šķīduma koncentrācija (mg/ml), — novērojumi, kas norāda uz ietekmēm, kas rada novirzes no ideāla GPC profila, — visu analīzes procedūras grozījumu sīks apraksts, — detaļas par kļūdu diapazonu, — cita informācija un novērojumi, kas attiecas uz rezultātu interpretāciju. 3. ATSAUCES (1) DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1. (2) Yau, W. W. , Kirkland, J. J. , and Bly, D. D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons. (3) ASTM D 3536-91, (1991). Standart Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Dis- tribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography – GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. (4) ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Dis- tribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 293 Pielikums Norādījumi mazmolekulāru vielu satura koriģēšanai nešķīstoša polimēra klātbūtnē Ja paraugā ir klāt nešķīstošs polimērs, tad GPC analīzes laikā rodas masas zudums. Nešķīstošo polimēru neatgrieze- niski aiztur kolonnā vai uz parauga filtra, bet parauga šķīstošā daļa iziet cauri kolonnai. Ja polimēra laušanas koefi- cienta inkrementu (dn/dc) var novērtēt vai izmērīt, var novērtēt kolonnā zudušo parauga masu. Šajā gadījumā izdara korekciju, izmantojot ārējo kalibrēšanu ar standartmateriāliem, kam ir zināma koncentrācija un dn/dc, lai nokali- brētu refraktometra atbildes signālu. Turpmāk minētajā piemērā ir izmantots polimetilmetakrilāta (pMMA) standarts. Ārējā kalibrēšanā, lai veiktu akrilpolimēru analīzi ar GPC metodi, analizē zināmas koncentrācijas pMMA standartšķī- dumu tetrahidrofurānā un iegūtos datus izmanto, lai atrastu refraktometra konstanti saskaņā ar vienādojumu: K = R/(C × V × dn/dc), kur: K R C V dn/dc Ir laušanas koeficienta inkrements pMMA šķīdumam tetrahidrofurānā (ml/mg). ir refraktometra konstante (mikrovoltsekundes/ml), ir atbildes signāls uz pMMA standartu (mikrovoltsekundes), ir pMMA standarta koncentrācija (mg/ml), Ir iešļircināmais tilpums (ml) PMMA standartam raksturīgi ir šādi dati: R C = 2 937 891 = 1,07 mg/ml = 0,1 ml V dn/dc = 9 x 10-5 ml/mg. Iegūto K vērtību 3,05 × 1011 izmanto, lai aprēķinātu detektora teorētisko atbildes signālu, ja 100 % no iešļircinātā polimēra ir eluēts caur detektoru. 294 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. III C PIELIKUMS A. 20. POLIMĒRU ŠĶĪŠANA/EKSTRAKCIJA ŪDENĪ 1. METODE Aprakstītā metode ir ESAO TG 120 (1997) pārskatītās versijas kopija. Sīkāku tehnisku informāciju sk. atsaucē (1). 1. 1. Ievads Dažiem polimēriem, tādiem kā emulsiju polimēri, var būt vajadzīgs sākotnējs sagatavošanas darbs, pirms var izmantot turpmāk aprakstīto metodi. Šo metodi nevar izmantot šķidriem polimēriem un polimēriem, kas analīzes apstākļos reaģē ar ūdeni. Ja metodi izmantot nav praktiski vai nav iespējams, šķīšanu/ekstrakciju var pētīt ar citām metodēm. Tādos gadījumos jādod pilnīgas izmantotās metodes detaļas un pamatojums. 1. 2. Standartvielas Nav. 1. 3. Testa metodes princips Polimēru šķīšanu/ekstrakciju ūdens vidē nosaka, izmantojot kolbas metodi (sk. A. 6 šķīdība ūdenī, kolbas metode), kas ir modificēta, kā aprakstīts turpmāk. 1. 4. Kvalitātes kritēriji Nav. 1. 5. Testa metodes apraksts 1. 5. 1. Iekārtas Metodei ir vajadzīgas šādas iekārtas: — sasmalcināšanas ierīce, piem. , smalcinātājs, lai veidotu zināma lieluma daļiņas, — kratītājs ar temperatūras kontroles iespējām, — membrānas filtru sistēma, — piemērots ķīmiskais aprīkojums, — standartizēti sieti. 1. 5. 2. Parauga sagatavošana Reprezentatīvs paraugs vispirms jāsamazina līdz daļiņu izmēriem 0,125 un 0,25 mm, izmantojot piemē- rotus sietus. Parauga stabilizēšanai vai sasmalcināšanas procesam var būt vajadzīga dzesēšana. Sveķiem līdzīgus materiālus var sasmalcināt šķidrā slāpekļa temperatūrā (1). Ja frakcija ar vajadzīgā lieluma daļiņām nav iegūstama, jārīkojas tā, lai daļiņu lielumu samazinātu tik lielā mērā, cik tas iespējams, un rezultāts jāprotokolē. Ziņojumā jānorāda, kā sasmalcinātais paraugs ir glabāts pirms testa. 1. 5. 3. Procedūra Trīs paraugus, kas satur pa 10 g analizējamās vielas, nosver katru savā traukā, kam ir stikla aizbāžņi, un katrā traukā pievieno 1 000 ml ūdens. Ja rīcība ar 10 g polimēra izrādās neizpildāma, jāizmanto nākošais lielākais daudzums, ar ko var rīkoties, un attiecīgi jāpieskaņo ūdens tilpums. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 295 Traukus cieši noslēdz un pēc tam krata 20 °C temperatūrā. Jālieto kratīšanas vai maisīšanas ierīce, kas var darboties konstantā temperatūrā. Pēc 24 stundām katra trauka saturu centrifugē vai nofiltrē un ar piemē- rotu analītisku metodi nosaka polimēra daudzumu dzidrajā ūdens fāzē. Ja ūdens fāzei piemērotas analīti- skas metodes nav pieejamas, tad kopējo šķīdību/ekstrahējamību var noteikt no filtrēšanas atlikuma vai cen- trifugēto nogulšņu sausā atlikuma. Parasti ir nepieciešams kvantitatīvi atšķirt piemaisījumus un piedevas, no vienas puses, un vielas ar mazu molekulas masu, no otras puses. Nosakot gravimetriski, ir arī svarīgi izdarīt tukšo mēģinājumu bez anali- zējamās vielas, lai ņemtu vērā novirzes, kas rodas eksperimenta procedūras dēļ. Polimēru šķīdību/ekstrahējamību ūdenī pie 37 °C un pH 2 un pH 9 var noteikt tāpat, kā ir aprakstīts eks- perimenta izpildei pie 20 °C. Vajadzīgās pH vērtības var sasniegt, vai nu pieliekot piemērotus buferšķīdu- mus vai piemērotas skābes vai bāzes, piem. , sālsskābi, etiķskābi, nātrija vai kālija hidroksīdu (analīžu kva- litātes), vai NH3. Atkarībā no izmantotās analīžu metodes būtu jāizdara viens vai divi testi. Ja ir pieejamas pietiekami spe- cifiskas metodes ūdens fāzes tiešai analīzei uz polimēra komponentu, viens tests, kā aprakstīts iepriekš, ir pietiekams. Ja tādas metodes nav pieejamas un polimēra šķīdības/ekstrahējamības noteikšana ir ierobežota ar netiešu analīzi, nosakot ūdens ekstrakta kopējo oglekļa saturu (Total Organic Carbon Content – TOC), tad tomēr būtu jāveic papildus analīze. Šo papildus analīzi būtu jāveic arī trešoreiz, lietojot 10 reizes mazāku polimēra paraugu un to pašu ūdens daudzumu, kas lietots pirmajā testā. 1. 5. 4. Analīze 1. 5. 4. 1. Te s t s , k o v e i c a r v i e n a l i e l u m a p a r a u g u Var būt pieejamas metodes polimēra komponentu tiešai analīzei ūdens fāzē. Alternatīvi, var apsvērt arī izšķīdušo/ekstrahēto polimēru komponentu netiešo analīzi, nosakot kopējo šķīstošo daļu saturu un koriģējot uz nepolimēru specifiskiem komponentiem. Ūdens fāzes analīze kopējā polimēru saturu noteikšanai ir iespējama: vai nu ar pietiekami jutīgu metodi, piem. : — TOC, izmantojot noārdīšanu ar persulfātu vai dihromātu līdz CO2 un sekojošu noteikšanu, izmanto- jotIR vai ķīmisko analīzi, — atomu absorbcijas spektrometriju (AAS) vai ar tās induktīvi saistīto plazmas (ICP) emisijas ekvivalento metodi silīciju un metālus saturošiem polimēriem, — UV absorbcijas vai spektrofluorimetriju arilpolimēriem, — LC-MS (šķidrumu hromatogrāfija-masspektometrija) paraugiem ar mazu molekulas masu, vai ūdens ekstraktu iztvaicējot vakuumā līdz sausam atlikumam un atlikumu analizējot ar spektroskopi- skām metodēm (IR, UV utt. ) vai ar AAS/ICP analīzi. Ja ūdens fāzes analīzi nevar izdarīt tieši, ūdens ekstraktu būtu jāekstrahē ar šķīdinātāju, kas nejaucas ar ūde- ni, piem. , hloru saturošiem ogļūdeņražiem. Šķīdinātāju pēc tam iztvaicē un atlikumu analizē, lai noteiktu attiecīgā polimēra saturu, kā iepriekš minēts. Visu to komponentu saturs, kas identificēti kā piemaisījumi vai piedevas, jāatņem, lai noteiktu paša polimēra šķīdības/ekstrahēšanas pakāpi. Ja klāt ir relatīvi lieli šādu vielu daudzumi, var būt vajadzīgs atlikumam izdarīt, piemēram, HPLC vai GC analīzi, lai atšķirtu klātesošo monomēru un no monomēriem atvasinātu vielu piemaisījumus tā, lai varētu noteikt šo pēdējo vielu īsto saturu. Dažos gadījumos var būt pietiekami, ja organisko šķīdinātāju vienkārši iztvaicē līdz sausam un sauso atli- kumu nosver. 296 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 1. 5. 4. 2. Ana l ī z e p a r a u g a d i v i e m d a ž ā d i e m l i e l u m i e m Visus ūdens ekstraktus analizē, lai noteiktu TOC. Gravimetrisko noteikšanu izdara neizšķīdušai/neizekstrahētai parauga daļai. Ja pēc katra trauka satura cen- trifugēšanas vai filtrēšanas polimēra atlikums paliek pielipis pie trauka sienām, trauks jāskalo ar filtrātu, līdz no trauka ir notīrītas jebkādas redzamas daļiņas. Pēc tam filtrātu vēlreiz centrifugē vai filtrē. Atlikumu, kas palicis uz filtra vai centrifugēšanas caurulītē, žāvē vakuumā 40 °C temperatūrā un nosver. Žāvē līdz kon- stantam svaram. 2. DATI 2. 1. Viena lieluma parauga analīze Jāuzrāda atsevišķie rezultāti katrai no trim kolbām un vidējie lielumi, kas izteikti masas vienībās šķīduma tilpumā (parasti mg/l) vai masas vienībās uz polimēra masas vienību (parasti mg/g). Bez tam jāuzrāda arī parauga masas zudums (ko aprēķina kā izšķīdušās vielas masas dalījumu ar sākotnējā parauga masu). Jāiz- rēķina relatīvās standartnovirzes (RSD — relative standart deviation). Jādod arī atsevišķie skaitļi par kopējo analizējamo paraugu (polimērs + svarīgākās piedevas utt. ) un pašu polimēru (t. i. , pēc šādu piedevu satura atskaitīšanas). 2. 2. Divu dažādu parauga lielumu analīze Jāsniedz divu trīskārt atkārtotu eksperimentu TOC lielumi ūdens ekstraktiem un katra eksperimenta vidē- jais lielums, kas izteikts masas vienībās šķīduma tilpumā (parasti mgC/l), kā arī masas vienības uz sākot- nējā parauga masu (parasti mgC/g). Ja nav atšķirību starp rezultātiem lielai un mazai parauga/ūdens attiecībai, tas var norādīt, ka ekstrahējamie komponenti tiešām ir ekstrahējušies. Tādā gadījumā parasti tiešā analīze nav vajadzīga. Jādod atsevišķās atlikumu masas un tās jāizsaka procentos no paraugu sākotnējām masām. Katram ekspe- rimentam jāizrēķina vidējie lielumi. Starpības starp 100 % un atrastajiem procentiem ir šķīstošās un eks- trahējamās vielas procentuālais daudzums sākotnējā paraugā. 3. ZIŅOJUMI 3. 1. Testa ziņojums Testa ziņojumā jābūt šādai informācijai: 3. 1. 1. Pārbaudāmā viela — pieejamā informācija par analizējamo vielu (identitāte, piedevas, piemaisījumi, vielu saturs ar mazu molekulas masu). 3. 1. 2. Eksperimenta apstākļi — izmantoto procedūru un eksperimenta apstākļu apraksts, — analīzes un detektēšanas metožu apraksts. 3. 1. 3. Rezultāti — šķīdība/ekstrahējamība mg/l; atsevišķie un vidējie lielumi ekstrakcijas analīzēm dažādos šķīdinātājos, atsevišķi uzdodot polimēru saturu un piemaisījumus, piedevas utt. , — polimēra šķīdība/ekstrahējamība mg/g, — ūdens ekstraktu TOC lielumi, izšķīdušās vielas svars un izrēķinātie procenti, ja tie ir mērīti, 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 297 — katra parauga pH, — informācija par tukšos mēģinājumos iegūtiem lielumiem, — ja vajadzīgs, norādes uz analizējamā parauga nestabilitāti testa un analīzes procesā, — visa informācija, kas ir svarīga rezultātu interpretācijai. 4. ATSAUCES (1) DIN 55733 (1976) Zerkleinung von Kunststofferzeugnissen fur Prufzwecke. 298 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. III D PIELIKUMS C. 13. BIOKONCENTRĀCIJA: ZIVJU ANALĪZE CAURPLŪDES APSTĀKĻOS 1. METODE Biokoncentrācijas metode ir OECD TG 305 (1996) kopija. 1. 1. Ievads Šī metode apraksta procedūru vielu biokoncentrēšanas potenciāla raksturošanai zivīs caurplūdes apstāk- ļos. Kaut arī caurplūdes testu režīmam noteikti jādod priekšroka, pieļaujami ir arī pusstatiski režīmi ar noteikumu, ka ir izpildīti ticamības kritēriji. Metode ir pietiekami detalizēta, lai veiktu testus, tomēr dodot pietiekamu brīvību, lai eksperimenta plānu piemērotu konkrētu laboratoriju apstākļiem un pārbaudāmo vielu raksturīgo īpašību dažādībai. Vistica- māk ir, ja to izmanto stabilām organiskām vielām ar log Pow lielumiem starp 1,5 un 6,0 (1), bet to var izmantot arī superlipofīlām vielām (ar log Pow > 6,0). Biokoncentrācijas koeficienta (BCF – bioconcentration factor) iepriekšēja novērtēšana dažkārt norāda, ka KB šādām superlipofīlām vielām, iespējams, ir lielāks nekā stacionāra stāvokļa biokoncentrācijas koeficienta (BCFSS) lielums, kas ir sagaidāms no laboratorijas ekspe- rimentiem. Iepriekšēju biokoncentrācijas koeficienta novērtējumu organiskām vielām ar log Pow vērtībām ap 9,0 var iegūt, izmantojot Binteina vienādojumu (2). Parametri, kas raksturo biokoncentrēšanas poten- ciālu, ir uzņemšanas ātruma konstante (k1), attīrīšanās ātruma konstante (k2) un BCFSS. Ūdens un zivju paraugu analīzi var atvieglot ar radioaktīviem izotopiem iezīmētas pārbaudāmās vielas un tās var izmantot, lai noteiktu, vai jāizdara degradācijas identifikācija un kvantitatīvā noteikšana. Ja mēra kopējo radioaktīvo atlikumu (piemēram, sadedzinot vai solubilizējot audus), tad BCF pamatojas uz izejas savienojumu, aizturētiem metabolītiem un arī uz asimilēto oglekli. BCFS pamatojas uz kopējo radioaktīvo atlikumu, tādēļ to nevar tieši salīdzināt ar BCF, kas ir iegūts vienīgi izejas savienojuma specifiskā ķīmiskā analīzē. Lai noteiktu BCF, pamatojoties uz izejas savienojumu, pētījumos ar radioaktīvi iezīmētām vielām var izmantot zivju attīrīšanās procedūras un vajadzības gadījumā var raksturot galvenos metabolītus. Anali- zējot un identificējot atlikumu audos, ir iespējams arī apvienot zivju metabolisma pētījumus ar biokon- centrēšanas pētījumiem. 1. 2. Definīcijas un vienības Biokoncentrēšana/bioakumulēšana ir pārbaudāmās vielas koncentrācijas pieaugums organismā/ uz tā (tā noteiktos audos) attiecībā pret pārbaudāmās vielas koncentrāciju apkārtējā vidē. Biokoncentrēšanas koeficients (BCF, jeb KB) jebkurā laikā šīs akumulēšanas testa uzņemšanas fāzē ir pārbau- dāmās vielas koncentrācija zivī vai uz tās, vai noteiktos tās audos (Cf kā μg/g (ppm)) dalīta ar šīs vielas kon- centrāciju apkārtējā vidē Cw kā μg/g (ppm)) Stacionāra stāvokļa biokoncentrēšanas koeficients (BCFSS, jeb KB) būtiski nemainās ilgākā laikā, ja pārbaudāmās vielas koncentrācija apkārtējā vidē šajā laikā ir konstanta. Stacionāra stāvokļa plato ir sasniegts tad, (ja atliek grafikā pārbaudāmās vielas koncentrāciju zivīs (Cf) pret laiku) kad līkne kļūst paralēla laika asij un trīs secīgas Cf analīzes paraugiem, kas ņemti vismaz divu dienu intervālos, savā starpā sakrīt vismaz ± 20 % robežās un starp trim paraugu ņemšanas posmiem nav būtisku atšķirību. Analizējot apvienotus paraugus, ir vajadzīgas vismaz četras sekojošas analīzes. Pārbaudāmajām vielām, ko uzņem lēni, piemērotāki intervāli ir septiņas dienas. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 299 Biokoncentrēšanas koeficienti, kas aprēķināti tieši no kinētiskajām ātruma konstantēm (k1/k2) tiek saukti par kinētiskajiem koncentrēšanas koeficientiem, BCFk. Oktanola-ūdens sadalījuma koeficients (Pow) ir ķīmiskā savienojuma šķīdības oktanolā attiecība pret tā šķīdību ūdenī līdzsvara stāvoklī (metode A. 8), ko apzīmē arī ar Kow. Logaritmu no Pow izmanto kā ķīmiskās vielas biokoncentrēšanas ūdens organismos potenciāla rādītāju. Iedarbības, jeb uzņemšanas fāze ir laiks, kad zivis ir pakļautas ķīmiskās vielas iedarbībai. Uzņemšanas ātruma konstante (k1) ir skaitlisks lielums, kas uzrāda pārbaudāmās vielas koncentrācijas palie- linājuma ātrumu zivīs vai uz tām (vai specifiskos to audos), ja zivis ir pakļautas šīs ķīmiskās vielas iedar- bībai (k1 izsaka dienās- 1). Pēciedarbības jeb attīrīšanās (zušanas) fāze ir laiks pēc pārbaudāmo zivju pārnešanas no vides, kas satur pār- baudāmo vielu, vidē, kas to nesatur; šajā laikā tiek pētīta zivju attīrīšanās no vielas (jeb tīrais vielas zudums). Attīrīšanās (zuduma) ātruma konstante (k2) ir skaitlisks lielums, kas rāda pārbaudāmās vielas koncentrācijas samazināšanos pārbaudāmajās zivīs (vai specifiskos to audos) pēc pārbaudāmo zivju pārnešanas no vides, kas satur pārbaudāmo vielu, vidē, kas to nesatur (k2 izsaka dienās- 1). 1. 3. Testa metodes princips Tests sastāv no divām fāzēm: iedarbības (uzņemšanas) un pēciedarbības (attīrīšanās) fāzes. Uzņemšanas fāzes laikā uz vienas sugas atsevišķām zivju grupām iedarbojas vismaz ar divām pārbaudāmās vielas kon- centrācijām. Pēc tam zivis pārnes vidē, kas nesatur pārbaudāmo vielu, lai notiktu attīrīšanās fāze. Attīrīša- nās fāze ir vienmēr vajadzīga vienmēr, izņemot, ja uzņemšanas fāze ir bijusi nenozīmīga (piem. , BCF ir mazāks par 10). Pārbaudāmās vielas koncentrāciju zivīs/ uz tām (vai specifiskos to audos) kontrolē abās pārbaudes fāzēs. Papildus divām pārbaudes koncentrācijām identiskos apstākļos, izņemot, to ka nav klāt pārbaudāmā viela, tur zivju kontroles grupu, lai iespējamās negatīvās ietekmes, kas novērojamas biokon- centrēšanas testā, attiecinātu uz attiecīgo kontroles grupu un iegūtu pārbaudāmās vielas fona koncentrā- cijas. Uzņemšanas fāzi turpina 28 dienas, ja vien netiek parādīts, ka līdzsvars ir sasniegts agrāk. Uzņemšanas fāzes ilgumu un laiku līdz stacionāram stāvoklim var paredzēt, izmantojot 3. vienādojumu. pielikumā. Attīrīša- nās periods sākas pēc tam, kad zivis pārnestas citā tīrā traukā tajā pašā vidē, bet bez pārbaudāmās vielas. Ja iespējams, biokoncentrēšanas koeficientu vislabāk aprēķina gan kā attiecību (BCFSS) koncentrācijai zivīs (Cf) pret koncentrāciju ūdenī (Cw) šķietami stacionārā stāvoklī, gan kā kinētisko biokoncentrēšanas koeficientu (BCFk) kā uzņemšanas ātruma konstantes (k1) attiecību pret attīrīšanās ātruma konstanti (k2), pieņemot, ka reakcijas kinētika ir pirmās kārtas. Ja kinētika acīmredzami nav pirmās kārtas, tad jāizmanto sarežģītāki modeļi (5. pielikums). Ja stacionārs stāvoklis nav sasniegts 28 dienās, uzņemšanas fāze jāpagarina līdz stacionāra stāvokļa sasnieg- šanai vai līdz 60 dienām, līdz notikumam, kurš no abiem minētajiem notiek ātrāk. Pēc tam uzsāk attīrīša- nas fāzi. Uzņemšanas ātruma konstanti, attīrīšanās (zuduma) ātruma konstanti ja iesaistīti sarežģītāki modeļi), biokoncentrēšanas koeficientu un, ja iespējams, ticamības robežas katram no šiem parametriem aprēķina, izmantojot modeli, kas vislabāk apraksta pārbaudāmās vielas izmērītās koncentrā- cijas zivīs un ūdenī. (vai konstantes, BCF izsaka kā funkciju no zivju kopējā slapjā svara. Tomēr īpašiem mērķiem var izmantot specifiskus audus vai orgānus (piem. , muskuļus, aknas), ja zivis ir pietiekami lielas vai arī ja zivis var sadalīt ēdamajā (fileja) un neēdamajā (iekšējie orgāni) daļā. Tā kā daudzām organiskām vielām ir skaidri izteikta sakarība starp bio- koncentrēšanas potenciālu un lipofilitāti, pastāv arī atbilstoša sakarība starp tauku saturu analizējamās zivīs un novēroto šādu vielu biokoncentrēšanu. Tādēļ, lai samazinātu pārbaudes rezultātu mainīgumu vielām ar augstu lipofilitāti (piem. , ar log Pow > 3), biokoncentrēšanu būtu jāizsaka attiecībā pret tauku saturu papil- dus attiecināšanai pret visa ķermeņa masu. 300 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. Tauku saturs būtu jānosaka tam pašam bioloģiskajam materiālam, ko izmanto pārbaudāmās vielas kon- centrācijas noteikšanai, ja tas ir iespējams. 1. 4. Informācija par pārbaudāmo vielu Pirms biokoncentrēšanas testa veikšanas būtu jāzina šāda informācija par pārbaudāmo vielu: a) šķīdība ūdenī; b) oktanola-ūdens sadalījuma koeficients Pow (apzīmē arī kā Kow, ko nosaka ar HPLC metodi A. 8. ); c) hidrolīze; d) fotopārvērtības ūdenī, ko nosaka saules starojuma vai mākslīga saules starojuma ietekmē un tādos sta- rojuma apstākļos, kādos tiek veikts biokoncentrācijas tests (3); e) virsmas spraigums (t. i. , vielām, kam nevar noteikt Pow); f) tvaika spiediens; g) biodegradēšanās iespēja (ja vajadzīgs). Cita vajadzīga informācija ir toksicitāte attiecībā uz testā izmantojamām zivju sugām, vislabāk, asimpto- tiskais LC50 (t. i. , no laika neatkarīgs). Lai kvantitatīvi noteiktu pārbaudāmo vielu šķīdumos un bioloģiskajā materiālā, jābūt pieejamai piemērotai analītiskai metodei ar zināmu precizitāti un jutību, kā arī informā- cijai par paraugu sagatavošanu un glabāšanu. Jābūt zināmai arī pārbaudāmās vielas analītiskās noteikšanas robežai kā ūdenī tā zivju audos. Ja lieto ar 14C iezīmētu pārbaudāmo vielu, tad jāzina arī radioaktivitāte procentos, kas saistīta ar piemaisījumiem. 1. 5. Testa derīgums Lai pārbaude būtu derīgs, jāievēro šādi apstākļi: — temperatūras svārstības ir mazākas par ± 2oC, — izšķīdušā skābekļa koncentrācija nav mazāka par 60 % no piesātinājuma, — pārbaudāmās vielas koncentrāciju nodalījumos uztur ± 20 % robežās no vidējās izmērītās vērtības uzņemšanas fāzes laikā, — mirstība un citas negatīvas ietekmes/saslimšanas kā kontroles, tā eksperimenta grupā testa beigās ir mazākas par 10 %; ja šis tests turpinās vairākas nedēļas vai mēnešus, tad mirstībai vai citām negatīvām ietekmēm abās zivju grupās būtu jābūt mazākai par 5 % mēnesī un kopumā nebūtu jāpārsniedz 30 %. 1. 6. Standartvielas Standartvielu ar zināmu biokoncentrēšanas potenciālu izmantošana būtu noderīga eksperimentālās pro- cedūras pārbaudei, ja vajadzīgs. Tomēr specifiskas vielas vēl nevar ieteikt. 1. 7. Testa metodes apraksts 1. 7. 1. Aparatūra Jāpievērš vērība, lai visās iekārtas daļās izvairītos izmantot materiālus, kas varētu šķīst, sorbēties vai eks- trahēties un kam varētu būt negatīva ietekme uz zivīm. Var izmantot no ķīmiski inerta materiāla izgata- votus proporcionāli ievietojamam zivju daudzumam piemērotas ietilpības standarta taisnstūrainus vai cilin- driskus baseinus. Plastmasas caurules jāizmanto minimāli. Priekšroka ir teflona (R), nerūsējošā tērauda un/vai stikla cauruļu izmantošanai. Pieredze rāda, ka vielām ar augstiem absorbcijas koeficientiem, tādām kā sintētiskie piretroīdi, var būt vajadzīgs kvarca stikls. Tādos gadījumos iekārta pēc izmantošanas jāizmet. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 301 1. 7. 2. Ūdens Testos parasti lieto parasto ūdeni un tā ieguves avotam jābūt nepiesārņotam un nemainīgas kvalitātes. Atšķaidīšanā lietotajam ūdenim jābūt tādas kvalitātes, kas ļauj izvēlētās sugas zivīm izdzīvot aklimatizāci- jas un testa laikā normālā izskatā un ar normālu izturēšanos. Ideālā gadījumā būtu jāparāda, ka testā izman- totās sugas atšķaidīšanai izmantotajā ūdenī var dzīvot, augt un vairoties (piem. , laboratorijas kultūrā vai dzīves cikla toksicitātes testā). Ūdeni būtu jāraksturo vismaz ar pH, cietumu, kopējo cieto vielu saturu, kopējo organisko oglekli un vēlams arī amoniju, nitrītiem un bāziskumu un, jūras dzīvniekiem, sāļumu. Parametri, kas ir svarīgi optimāliem zivju eksistences apstākļiem, ir pilnībā zināmi, bet 1, pielikumā ir dotas ieteicamās maksimālās koncentrācijas testos lietojamā saldūdens un jūras ūdens vairākiem parametriem. Ūdens kvalitātei testa laikā jābūt konstantai. pH vērtībai jābūt starp 6,0 un 8,5, bet vienas testa laikā tam jābūt ± 0, 5 pH vienību robežās. Lai nodrošinātu, ka atšķaidīšanas ūdens nevajadzīgi neietekmē testa rezul- tātu (piemēram, veidojot kompleksus ar pārbaudes vielu) vai negatīvi neietekmē zivju partijas uzvedību, laiku pa laikam jāņem paraugi analīzei. Ja ir zināms, ka ūdens kvalitāte ir relatīvi nemainīga, tad, piemē- ram, reizi trijos mēnešos būtu jāveic smago metālu (piem. , Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), biežāk sastopamo anjonu un katjonu (piem. , Ca, Mg, Na, K, Cl, SO4), pesticīdu (piem. , kopējo hlororganisko un fosfororga- nisko pesticīdu), kopējā organiskā oglekļa un suspendēto cieto daļiņu analīze. Ja ir parādīts, ka ūdens kva- litāte ir nemainīga ilgāk par vienu gadu, tad noteikšanas var veikt retāk un intervālus pagarināt (piem. , reizi sešos mēnešos). Dabīgajam daļiņu saturam un kopējam organiskajam ogleklim (TOC) atšķaidīšanas ūdenī būtu jābūt iespē- jami mazākam, lai izvairītos no tā, ka pārbaudāmās vielas absorbcija uz organiskā materiāla varētu sama- zināt vielas biopieejamību (4). Maksimāli pieļaujamais lielums ir 5 mg/l konkrētam materiālam (sauss mate- riāls, kas neiziet caur 0,45 μm filtru) un 2 mg/l kopējam organiskajam ogleklim (sk. 1. pielikumu). Vajadzības gadījumā ūdens pirms lietošanas jāfiltrē. Organiskā oglekļa daļai ūdenī no pārbaudes zivīm (eks- krementi) un no barības pārpalikuma jābūt iespējami mazai. Visā testa laikā organiskā oglekļa koncentrā- cijai testa baseinā nevajadzēt vairāk nekā par 10 mg/l (± 20 %) pārsniegt to organiskā oglekļa koncentrā- ciju, kas rodas no pārbaudāmās vielas un šķīdību veicinošā aģenta, ja tādu izmanto. 1. 7. 3. Testa šķīdumi Sagatavo pārbaudāmās vielas piemērotas koncentrācijas darba šķīdumu. Darba šķīdumu vislabāk pagata- vot vienkārši maisot vai kratot pārbaudāmo vielu atšķaidīšanas ūdenī. Šķīdinātāju vai disperģējošu vielu (šķīdību veicinošu reaģentu) lietošana nav ieteicama; tomēr dažos gadījumos tos var izmantot, lai pagata- votu piemērotas koncentrācijas darba šķīdumu. Šķīdinātāji, ko var lietot, ir etanols, metanols, etilenglikola monometilēteris, etilenglikola dimetilēteris, dimetilformamīds un trietilenglikols. Disperģējošas vielas, ko var lietot ir Cremophor RH40, Tween 80, 0,01 % metilceluloze un HCO-40. Jābūt uzmanīgiem, ja lieto viegli biodegradējamus reaģentus, jo tie var radīt problēmas ar baktēriju augšanu caurplūdes testos. Pārbaudāmā viela var būt radioaktīvi iezīmēta un tai būtu jābūt augstas tīrības pakāpes (piem. , vēlams > 98 %). Caurplūdes testiem ir vajadzīga sistēma, kas nepārtraukti padod un atšķaida pārbaudāmās vielas darba šķī- dumu (piem. , dozējošs sūknis, proporcionāls atšķaidītājs, sistēma piesātināšanai ar gaisu), lai padotu pār- baudāmās koncentrācijas šķīdumu testa nodalījumos. Caur katru testa nodalījumu dienā vislabāk ir izdarīt vismaz piecas tilpuma nomaiņas. Priekšroka ir caurplūdes režīmam, bet, ja tas nav iespējams (piem. , ja tas negatīvi ietekmē pārbaudes organismus), var izmantot pusstatisku tehniku ar noteikumu, ka ir izpildīti tica- mības kritēriji. Darba šķīdumu plūsmas ātrumus jākontrolē 48 stundas pirms testa un pēc tam testa laikā vismaz katru dienu. Šajā kontrolē ir ietverta plūsmas ātruma kontrole caur katru testa nodalījumu un jāno- drošina, ka plūsmas ātrums nemainās vairāk par 20 % katrā nodalījumā un vairāk arī neatšķiras starp noda- lījumiem. 302 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 1. 7. 4. Sugu izvēle Sugu izvēlē svarīgs kritērijs ir tas, vai tās ir viegli pieejamas, vai tās var iegūt piemērotos lielumos un vai tās var apmierinoši turēt laboratorijā. Citi kritēriji zivju sugu izvēlei ietver atlabšanas, komerciālo, ekoloģisko svarīgumu kā arī salīdzināmu jutīgumu, veiksmīgo izmantošanu iepriekš utt. Iesakāmās sugas pārbaudēm ir uzskaitītas 2. pielikumā. Citas sugas var izmantot, bet testa procedūru vaja- dzētu tām piemērot, lai nodrošinātu piemērotus pārbaudes apstākļus. Šajā gadījumā jādod pamatojums sugas izvēlei un izvēlētā eksperimenta metode. 1. 7. 5. Zivju turēšana Zivju partijas populāciju vismaz divas nedēļas aklimatizē testa temperatūras ūdenī un visu laiku baro ar pietiekamu diētu, kas ir tāda pati, kādu izmantos testa laikā. Pēc 48 stundu sākumposma reģistrē mirstību un piemēro šādus kritērijus: — mirstība septiņās dienās lielāka par 10 % no populācijas: izbrāķē visu grupu, — mirstība starp 5 un 10 % no populācijas septiņās dienās: aklimatizē septiņas papildus dienas, — mirstība mazāka par 5 % no populācijas septiņās dienās: pieņem partiju, bet ja mirstība nākošo septiņu dienu laikā ir lielāka par 5 %, izbrāķē visu partiju. Nodrošina, lai testiem izmantojamām zivīm nebūtu redzamas saslimšanas vai nenormālības. Zivīm nebūtu jāsaņem ārstēšana divu nedēļu laikā pirms testiem vai testu laikā. 1. 8. Testu veikšana 1. 8. 1. Iepriekšējs tests Var būt noderīgi izdarīt iepriekšēju eksperimentu, lai optimizētu testa veikšanu, piem. , pārbaudāmās vielas koncentrācijas (koncentrāciju) izvēli, uzņemšanas un attīrīšanas fāzes ilgumu. 1. 8. 2. Uzņemšanas fāzes apstākļi 1. 8. 2. 1. U z ņem š an as fāz es il gums Uzņemšanas fāzes ilgumu var paredzēt pēc praktiskās pieredzes (piem. , no iepriekšējiem pētījumiem vai līdzīgas ķīmiskas vielas uzkrāšanās) vai no noteiktām empīriskām sakarībām, kur izmantotas zināšanas vai nu par pārbaudāmās vielas šķīdību ūdenī vai par oktanola/ūdens sadalījuma koeficientu (sk. 3. pielikumu). Uzņemšanas fāze būtu jāturpina 28 dienas, ja vien nevar parādīt, ka līdzsvars ir sasniegts agrāk. Ja stacio- nārs stāvoklis nav sasniegts 28 dienās, uzņemšanas fāze būtu jāpagarina līdz stacionāra stāvokļa sasnieg- šanai vai līdz 60 dienām, kurš no abiem notikumiem iestājas drīzāk. 1. 8. 2. 2. At t ī r ī š a n ā s f ā z e s i l g u m s Parasti puse no uzņemšanas fāzes ilguma ir pietiekama, lai notiktu atbilstoša (piem. , 95 %) ķermenī uzņemtās vielas samazināšanās (noteikšanas paskaidrojumus sk. 3. pielikumā). Ja laiks 95 % sasniegšanai ir nerealizējami ilgs, piemēram, ja tas divreiz pārsniedz parasto uzņemšanas fāzes ilgumu (t. i. , vairāk par 56 dienām), tad var izmantot īsāku laiku (t. i. līdz pārbaudāmās vielas koncentrācija ir mazāka par 10 % no stacionārā stāvokļa koncentrācijas). Tomēr vielām, kurām ir sarežģītāks uzņemšanas un attīrīšanās rak- sturs, nekā attēlo viena zivju nodalījuma modelis, kas uzrāda pirmās kārtas kinētiku, jāļauj ilgākas attīrī- šanās fāzes, lai noteiktu zuduma ātruma konstantes. Šo laika posmu tomēr nosaka laika posms, kurā pār- baudāmās vielas koncentrācija zivīs paliek virs analītiskās noteikšanas robežas. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 303 1. 8. 2. 3. Tes t a zi vj u s k a i t s Zivju skaitu uz testa koncentrāciju izvēlas tādu, lai katrā paraugā būtu pieejamas vismaz četras zivis. Ja ir vajadzīga lielāka statistiska nozīmība, ir vajadzīgs lielāks zivju skaits paraugā. Ja izmanto pieaugušas zivis, ziņo, vai tās ir tēviņi vai mātītes, vai eksperimentā izmanto abus dzimumus. Ja izmanto abus dzimumus, jādokumentē tauku satura atšķirības starp dzimumiem, kam pirms pakļaušanas vielu iedarbībai būtu jābūt nenozīmīgām; var būt vajadzīga visu tēviņu un mātīšu apvienošana paraugā. Ikvienā atsevišķā testā izvēlas zivis ar līdzīgu masu, tā lai mazākā nebūtu vieglāka par divām trešdaļām no lielākās svara. Visām būtu jābūt vienas vecuma klases un jābūt iegūtām no viena avota. Tā kā zivju masai un vecumam dažreiz, izrādās, ir nozīme BCF lielumos (1), šīs detaļas precīzi jāprotokolē. Ir iesakāms pirms testa nosvērt nelielu zivju partijas parauga daļu, lai noteiktu vidējo svaru. 1. 8. 2. 4. I evi e t o š a n a Lai Cw samazināšanās, ko rada zivju ievietošana testa sākumā, būtu iespējami maza un arī lai izvairītos no izšķīdušā skābekļa koncentrācijas samazināšanās, izmanto augstu ūdens/zivju attiecību. Ir svarīgi, lai ievie- tošanas ātrums būtu piemērots testā izmantojamām zivju sugām. Katrā ziņā parastais iesakāmais ievieto- šanas ātrums ir 0,1 līdz 1 g zivs (slapjais svars) uz litru ūdens dienā. Lielus ievietošanas ātrumus var lietot, ja ir parādīts, ka pārbaudāmās vielas koncentrāciju var uzturēt ± 20 % robežās un izšķīdušā skābekļa kon- centrācija nesamazinās zem 60 % no piesātinājuma. Izvēloties piemērotu ievietošanas režīmu, jāņem vērā zivju parastā dabiskā vide. Piemēram, zivīm, kas dzīvo ūdens tilpnes dibenā, var vajadzēt lielāku akvārija dibena laukumu uz to pašu ūdens tilpumu nekā tuvu ūdens virsmai dzīvojošām zivju sugām. 1. 8. 2. 5. Ba r o š a n a Aklimatizācijas un testa laikā zivis baro ar piemērotu diētu, kurai ir zināms tauku un kopējo olbaltumvielu saturs, pietiekamā daudzumā, lai tās uzturētu veselas un saglabātu ķermeņa svaru. Aklimatizācijas un testa laikā zivis baro katru dienu aptuveni 1 līdz 2 % no ķermeņa masas apmērā; tas uztur tauku koncentrāciju vairumam zivju sugu testa laikā relatīvi nemainīgā līmenī. Barojuma līmeni jāpārrēķina, piemēram, reizi nedēļā, lai uzturētu nemainīgu ķermeņa masu un tauku saturu. Šim aprēķinam zivju masu katrā testa noda- lījumā var novērtēt no zivs, kas visnesenāk ir paņemta paraugam šajā nodalījumā. Nodalījumā palikušās zivis nesver. Neapēsto barību un izkārnījumus no testa nodalījuma atsūc ar sifonu katru dienu īsu laiku pēc barošanas (no 30 minūtēm līdz vienai stundai). Testa laikā nodalījumus tur iespējami tīrus, lai organiskā materiāla koncentrācija būtu pēc iespējas mazāka, jo organiskā oglekļa klātbūtne var ierobežot pārbaudāmās vielas biopieejamību (1). Tā kā daudzu veidu zivju barība ir izveidota no zivju miltiem, barībā jānosaka pārbaudāmās vielas saturs. Ir vēlams barību analizēt arī uz pesticīdiem un smagajiem metāliem. 1. 8. 2. 6. Ga i s m a un t e m p e r a t ū r a Fotoperiods parasti ilgst 12 līdz 16 stundas un temperatūrai (± 2 °C) jābūt piemērotai pētāmo zivju sugai (sk. 2. pielikumu). Apgaismojuma tipam un raksturojumam būtu jābūt zināmam. Uzmanība jāpievērš pār- baudāmās vielas iespējamām fotopārvērtībām pētījuma starojuma apstākļos. Jāizmanto piemērots apgai- smojums, lai izvairītos no zivju pakļaušanas nedabīgu fotoproduktu iedarbībai. Dažos gadījumos var būt atbilstoši izmantot filtru, lai ekranētu UV starojumu ar viļņa garumu zem 290 nm. 1. 8. 2. 7. P ā r b a u d ā m ā s k o n c e n t r ā c i j a s Caurplūdes apstākļos zivis pakļauj vismaz divu koncentrāciju pārbaudāmās vielas ūdens šķīduma iedarbī- bai. Parasti augsto (vai augstāko) pārbaudāmās vielas koncentrāciju izvēlas apmēram 1 % līmenī no akūtas asimptotiskas LC50 lieluma, un tai jābūt vismaz desmit reižu augstākai par vielas noteikšanas robežu ūdenī ar izmantojamo analītisko metodi. 304 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. Augstāko testa koncentrāciju var noteikt arī, dalot akūto 96 stundu LC50 ar piemērotu akūto/hronisko attiecību (piemērotas attiecības dažām ķīmiskām vielām var būt starp 3 un 100). Ja iespējams, izvēlas citu koncentrāciju(–as) tā, lai tās atšķirtos viena no otras ar koeficientu 10. Ja tas nav iespējams 1 % no LC50 kritērija dēļ un analītiskās robežas dēļ, tad var lietot mazāku koeficientu vai jāapsver ar 14C iezīmētas pār- baudāmās vielas lietošana. Neviena izmantojamā koncentrācija nevar būt lielāka par pārbaudāmās vielas šķīdību. Ja lieto šķīdību veicinošu reaģentu, tā koncentrācijai jābūt mazākai par 0,1 ml/l, un tai jābūt vienādai visos mēģinājumu akvārijos. Būtu jāzina kopējais reaģenta un pārbaudāmās vielas ieguldījums kopējā organiskā oglekļa saturā testā izmantojamā ūdenī. Tomēr jāpieliek visas pūles, lai izvairītos no tādu reaģentu izman- tošanas. 1. 8. 2. 8. Kontroles grupa Bez testa sērijām jāizdara viena atšķaidīšanas ūdens analīze kontroles grupai vai, ja tas ir būtiski, jāizdara viena analīze ūdenim, kas satur šķīdību veicinošo reaģentu, ar noteikumu, ka ir noskaidrots, ka reaģents neietekmē zivis. Ja tā nav, jāveic abas kontroles. 1. 8. 3. Ūdens kvalitātes mērījumu biežums Testa laikā visos akvārijos jāmēra izšķīdušais skābeklis, TOC, pH un temperatūra. Kopējais cietums un sāļums, ja tas ir būtiski, jāmēra kontroles mēģinājumā un vienā traukā ar augstāku (vai visaugstāko) kon- centrāciju. Izšķīdušo skābekli un sāļumu, ja tas ir nozīmīgs, jāmēra minimāli trīs reizes — uzņemšanas posma sākumā, apmēram vidū un beigās — un reizi nedēļā attīrīšanās posma laikā. TOC būtu jāmēra testa sākumā (24 stundas un 48 stundas pirms uzņemšanas fāzes uzsākšanas) pirms zivju ielaišanas un vismaz reizi nedēļā uzņemšanas un attīrīšanās fāžu laikā. Temperatūra jāmēra katru dienu, pH katra posma sākumā un beigās un cietība vienreiz katrā testā. Temperatūra vislabāk jāpārrauga visu laiku vismaz vienā traukā. 1. 8. 4. Zivju un ūdens paraugu ņemšana un analīze 1. 8. 4. 1. Zi v j u un ū de n s p ar augu ņemšanas grafiks Ūdeni no testa nodalījumiem pārbaudāmās vielas koncentrācijas noteikšanai ņem pirms zivju ielaišanas un kā uzņemšanas, tā arī attīrīšanās fāžu laikā. Kā minimumu ūdens paraugus ņem tajā pašā laikā, kad zivju paraugus, un pirms barošanas. Uzņemšanas fāzes laikā pārbaudāmās vielas koncentrāciju nosaka, lai pār- baudītu atbilstību ticamības kritērijiem. Zivju paraugus ņem vismaz piecas reizes uzņemšanas fāzes laikā un vismaz četras reizes attīrīšanās fāzes laikā. Tā kā dažos gadījumos ir grūti ar pieņemamu precizitāti izrēķināt aptuveno BCF vērtību, pamatojo- ties uz šo paraugu skaitu, jo īpaši, ja ir norādījumi, ka attīrīšanās kinētika nav vienkārša pirmās kārtas kinē- tika, tad var būt ieteicams paraugus abās fāzēs ņemt biežāk (sk. 4. pielikumu). Papildu paraugus uzglabā un analizē tikai tad, ja pirmā cikla analīzes izrādās neadekvātas, lai ar vēlamo precizitāti aprēķinātu BCF. Pieņemama paraugu ņemšanas grafika paraugs ir 4. pielikumā. Citus grafikus var viegli izrēķināt, izman- tojot citas pieņemtas Pow vērtības, lai aprēķinātu zivju pakļaušanas ķimikālijas iedarbībai laiku 95 % uzņemšanai. Paraugu ņemšanu turpina uzņemšanas fāzes laikā, līdz konstatē stacionāru stāvokli, vai 28 dienas, kas no abiem notiek drīzāk. Ja stacionārs stāvoklis nav sasniegts 28 dienās, paraugu ņemšana turpinās līdz sta- cionāra stāvokļa sasniegšanai vai 60 dienas, kas no abiem notiek drīzāk. Pirms attīrīšanās fāzes sākuma zivis pārvieto tīros akvārijos. 1. 8. 4. 2. Paraugu ņemšana un sagatavošana Ūdens paraugus analīzei iegūst, piemēram, sifonējot caur inerta materiāla cauruli no testa nodalījuma vidu- spunkta. Tā kā ne filtrēšana, ne centrifugēšana vienmēr neatdala pārbaudāmās vielas bionepieejamo frak- ciju no tās, kas ir biopieejama (īpaši superlipofīlām vielām, t. i. , ķīmiskām vielām ar log Pow > 5) (1) (5), paraugus var nepakļaut šādai apstrādei. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 305 Tā vietā būtu jāveic pasākumi, lai uzturētu baseinus iespējami tīrus, un kopējā organiskā oglekļa saturs jākontrolē gan uzņemšanas, gan attīrīšanās fāzes laikā. Katrā paraugu ņemšanas reizē no testa nodalījumiem izņem piemērotu skaitu zivju (parasti minimālais dau- dzums ir četras). Paraugam ņemtās zivis ātri noskalo ar ūdeni, nosusina “sausas”, uzreiz nogalina, izman- tojot vispiemērotāko un humānāko metodi, un pēc tam nosver. Vislabāk ir analizēt zivis un ūdeni tūlīt pēc paraugu noņemšanas, lai novērstu sadalīšanos un citus zudu- mus un lai izrēķinātu aptuvenos uzņemšanas un attīrīšanās ātrumus, kamēr tests turpinās. Tūlītēja analīze arī palīdz izvairīties no aizkavēšanās, nosakot laiku, kad ir sasniegts līknes plato. Ja analīzi neveic tūlīt, paraugus glabā, izmantojot piemērotu metodi. Pirms sākt pētījumus, iegūst infor- māciju par konkrētai pārbaudāmai vielai piemērotu glabāšanas metodi — piemēram, dziļo saldēšanu, turē- šanu 4 °C temperatūrā, ekstrakciju, utt. 1. 8. 4. 3. Ana l ī t i s k ā s m e t o d e s k v a l i t ā t e Tā kā visu procedūru pēc būtības nosaka pārbaudāmajai vielai izmantojamās analītiskās metodes precizi- tāte, pareizība un jutība, eksperimentāli jāpārbauda, vai ķīmiskās analīzes precizitāte un atkārtojamība, kā arī pārbaudāmās vielas atpakaļiegūšana gan no ūdens, gan no zivīm ar konkrēto metodi ir apmierinoša. Pārbauda arī, vai pārbaudāmā viela nav konstatējama atšķaidīšanai izmantojamā ūdenī. Ja vajadzīgs, no testa iegūtās Cw un Cf vērtības koriģē uz atgūstamo vielu un kontroles mēģinājuma fona vērtībām. Zivju un ūdens paraugus visu laiku apstrādā tā, lai līdz minimumam samazinātu piesārņojumu un zudumus (piem. , tos, kas rodas no adsorbcijas uz parauga ņemšanas ierīces). 1. 8. 4. 4. Zi v j u pa r a u g a a n a l ī z e Ja testā izmanto radioaktīvi iezīmētus materiālus, iespējams analītiski noteikt kopējo radioaktīvo iezīmi (t. i. , izejas savienojumam kopā ar metabolītiem) vai arī paraugi ir tā jātīra, lai izejas savienojumu varētu analizēt atsevišķi. Galvenos metabolītus var raksturot arī stacionārā stāvoklī vai uzņemšanas fāzes beigās, kurš no abiem iestājas ātrāk. Ja BCF kopējo radioaktīvi iezīmēto atlikumvielu izteiksmē ir ≥ 1 000 %, tad var būt ieteicams, un dažu kategoriju ķīmiskām vielām, piemēram, pesticīdiem, pat stingri ieteicams iden- tificēt un kvantitatīvi noteikt noārdīšanas produktus, kas veido ≥ 10 % no kopējā vielu atlikuma zivju audos stacionārā stāvoklī. Ja noārdīšanās produkti, kas veido ≥ 10 % no kopējā radioaktīvi iezīmētā vielu atli- kuma zivju audos, ir identificēti un kvantitatīvi noteikti, tad ir arī iesakāms identificēt un kvantitatīvi noteikt noārdīšanās produktus testa ūdenī. Pārbaudāmās vielas koncentrāciju parasti būtu jānosaka katrā nosvērtā atsevišķā zivī. Ja tas nav iespējams, var veikt paraugu apvienošanu katram paraugu ņemšanas gadījumam, bet apvienošana noteikti ierobežo statistikas procedūras, ko var piemērot datiem. Ja specifiska statistikas procedūra un nozīmīgums ir svarīgi apsvērumi, testā jāietver atbilstošs skaits zivju, lai pielāgotu vēlamo apvienošanas procedūru un statistisko nozīmīgumu (6) (7). BCF jāizsaka kā kopējā svara funkcija un lipofīlām vielām arī kā tauku satura funkcija. Tauku saturu zivīs nosaka katrā paraugu ņemšanas reizē, ja tas ir iespējams. Tauku satura noteikšanai jālieto piemērotas meto- des (8. un 2. atsauce 3. pielikumā). Kā standartmetodi var ieteikt hloroforma/metanola ekstrakcijas metodi (9). Dažādas metodes nedod identas vērtības (10), tādēļ ir svarīgi uzrādīt izmantotās metodes detaļas. Ja iespējams, tauku analīze jāveic tam pašam ekstraktam, kas sagatavots pārbaudāmās vielas analīzei, jo tauki bieži jāizdala no šķīduma, pirms to var analizēt hromatogrāfiski. Tauku saturam zivīs (mg/kg slapja svara) eksperimenta beigās nebūtu jāatšķiras no tauku satura eksperimenta sākumā vairāk nekā par ± 25 %. Cieto vielu saturs audos arī būtu jāprotokolē, lai varētu pārrēķināt tauku koncentrāciju no mitriem audiem uz sausiem. 306 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 2. DATI 2. 1. Rezultātu apstrāde Pārbaudāmās vielas uzņemšanas līkni iegūst, atliekot vielas koncentrāciju zivīs/ uz zivīm (vai konkrētos audos) uzņemšanas fāzē pret laiku aritmētiskā skalā. Ja līkne ir sasniegusi plato, tas ir, līkne ir aptuveni asimptotiska laika asij, tad stacionāra stāvokļa BCFSS aprēķina kā dalījumu: Cf stacionārā stāvoklī (vidējais) Cw stacionārā stāvoklī (vidējais) Ja stacionārs stāvoklis nav sasniegts, var būt iespējams aprēķināt BCFSS ar pietiekamu precizitāti nedrošam novērtējumam no “stacionāra stāvokļa” pie 80 % (1,6/k2) vai 95 % (3,0/k2) no līdzsvara koncentrācijas. Koncentrācijas koeficientu (BCFk)nosaka kā attiecību k1/k2 starp divām pirmās kārtas reakciju kinētiska- jām konstantēm. Attīrīšanās ātruma konstanti (k2) parasti nosaka no attīrīšanās līknes (t. i. , pārbaudāmās vielas koncentrācijas samazināšanos zivīs atliekot pret laiku). Uzņemšanas ātruma konstanti (k1) pēc tam izrēķina no dotās k2 vērtības un Cf vērtības, ko iegūst no uzņemšanas līknes (sk. arī 5. pielikumu). Labākā metode BCFk un konstanšu k1 un k2 iegūšanai ir nelineāru parametru novērtēšanas metožu izmantošana aprēķinos ar datoru (11). Citādi, k1 un k2 aprēķiniem var izmantot arī grafiskas metodes. Ja attīrīšanās līkne acīmredzami nav pirmās kārtas, tad būtu jāizmanto sarežģītāki modeļi (sk. atsauces 3. pielikumā) un jālūdz biostatistikas speciālista padoms. 2. 2. Rezultātu interpretācija Ja izmērītās pārbaudāmo šķīdumu koncentrācijas ir tuvas noteikšanas robežai, rezultāti jāinterpretē pie- sardzīgi. Skaidri definētas uzņemšanas un zuduma līknes norāda uz labas kvalitātes biokoncentrēšanas datiem. Divu testa šķīdumu uzņemšanas/attīrīšanās konstanšu atšķirībām būtu jābūt mazākām par 20 %. Novērotas nozīmīgas atšķirības starp uzņemšanas /attīrīšanās ātrumiem divām pielietotām testa koncentrācijām būtu jāprotokolē un jādod iespējamais izskaidrojums. Parasti BCFS ticamības robeža labi izveidotos pētījumos ir tuva ± 20 %. 3. PROTOKOLĒŠANA Testa ziņojumā jābūt šādai informācijai: 3. 1. Pārbaudāmā viela — fizikālās īpašības un, ja būtiski, fizikāli ķīmiskās īpašības, — ķīmiskās identifikācijas dati (ieskaitot organiskā oglekļa saturu, ja vajadzīgs), — ja viela ir radioaktīvi iezīmēta, iezīmēto atomu (iezīmētā atoma) precīzs stāvoklis un radioaktivitāte, kas saistīta ar piemaisījumiem. 3. 2. Testos izmantojamās sugas — zinātniskais nosaukums, dzimta, avots, iepriekšējā apstrāde, aklimatizācija, vecums, lielums, utt. 3. 3. Testa apstākļi — izmantotā testa procedūra (piem. , caurplūdes vai pusstatiskā), — izmantotā apgaismojuma veids un raksturlielumi un fotoperiods(-i), — testa projekts (piem. , testa nodalījumu skaits un lielums, ūdens nomaiņas ātrums, atkārtojumu skaits, zivju skaits uz atkārtojumu, pārbaudāmo koncentrāciju skaits, uzņemšanas un attīrīšanās fāžu ilgums, paraugu ņemšanas biežums zivju un ūdens paraugiem), 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 307 — darba šķīdumu pagatavošanas metode un atjaunošanas biežums (šķīdību veicinošais reaģents, ja tādu lieto, jādod tā koncentrācija un ieguldījums testā lietojamā ūdens kopējā oglekļa saturā), — nominālā pārbaudāmā koncentrācija, izmērītie vidējie lielumi un to standartnovirzes testa traukos, un metode, ar kādu tās izrēķinātas, — atšķaidīšanas ūdens avots, priekšapstrādes apraksts, zivju dzīvotspējas testa rezultāti šajā ūdenī un ūdens raksturojums: pH, cietība, temperatūra, izšķīdušā skābekļa koncentrācija, atlikuma hlora līmenis (ja ir mērīts), kopējais organiskais ogleklis, suspendētas cietas daļiņas, testa vides sāļums (ja vajadzīgs) un jebkuri citi veikti mērījumi, — ūdens kvalitāte testa traukos, pH, cietība, TOC, temperatūra un izšķīdušā skābekļa koncentrācija, — sīka informācija par barošanu, (piemēram, barības tips, avots, sastāvs, vismaz tauku un olbaltumvielu saturs, ja iespējams, izēdinātais daudzums un barošanas biežums), — informācija par zivju un ūdens paraugu apstrādi, ieskaitot detaļas par sagatavošanu, glabāšanu, ekstra- kciju un analītiskām procedūrām (un precizitāti) pārbaudāmajai vielai un tauku saturam (ja tas ir mērīts). 3. 4. Rezultāti — jebkura iepriekš veikta pētījuma rezultāti, — kontroles grupas zivju mirstība un zivju mirstība katrā nodalījumā, un jebkura novērota nenormāla uzvedība, — tauku saturs zivīs (ja noteikts testa gadījumā), — līknes (ieskaitot visus mērījumu datus), kas rāda pārbaudāmās vielas uzņemšanu un attīrīšanos zivīs, laiku līdz stacionāra stāvokļa sasniegšanai, — Cf un CW (ar standartnovirzēm un diapazonu, ja vajadzīgs) visiem paraugu ņemšanas laikiem (Cf izsaka μg/g visa ķermeņa vai konkrētu tā audu (piem. , tauku) slapja svara (ppm) un Cw izsaka μg/ml (ppm). Protokolā ieraksta Cw vērtības arī kontroles sērijai (protokolē arī fona lielumus), — stacionāra stāvokļa biokoncentrācijas koeficients (BCFSS) un/vai kinētiskās koncentrācijas koeficients (BCFk) un vajadzības gadījumā 95 % ticamības robežas uzņemšanas un attīrīšanās ātrumu konstantēm (visas izsaka attiecībā uz visa ķermeņa masu un dzīvnieka vai tā specifisku audu kopējo tauku saturu, ja tas ir izmērīts), ticamības robežas un standartnovirzes (ja tās ir pieejamas) un aprēķinu metodes/datu analīzi izmantotās pārbaudāmās vielas katrai koncentrācijai, — ja izmanto radioaktīvi iezīmētas vielas un ja tas ir vajadzīgs, var uzrādīt detektēto metabolītu uzkrāša- nos, — viss neparastais attiecībā uz testu, visas novirzes no šīm procedūrām un jebkura cita būtiska informā- cija. Tādus rezultātus kā “noteikšanas robežās nav konstatēts” samazina līdz minimumam, attīstot pirmstesta metodes un eksperimenta plānu, jo tādus rezultātus nevar izmantot ātruma konstanšu aprēķinos. 4. ATSAUCES (1) Connell D. W. (1988). Bioaccumulation behaviour of persistent chemicals with aquatic organisms. Rev. Envi- ron. Contam. Toxicol. 102, pp. 117-156. (2) Bintein S. , Devillers J. and Karcher W. (1993). Non-linear dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water partition coefficient. SAR and QSAR in Environmental Research, 1, pp. 29-390. (3) OECD, Paris (1996). Direct phototransformation of chemicals in water. Environmental Health and Safety Gui- dance Document Series on Testing and Assessment of Chemicals. No 3. (4) Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of bioconcentration factors derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate organic matter to the bioavailability of chemicals. Water Quality Institute, Denmark. 308 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. (5) US EPA 822-R-94–002 (1994) Great Lake Water Quality Initiative Technical Support Document for the Pro- cedure to Determine Bioaccumulation Factors. July 1994. (6) US FDA (Food and Drug Administration) Revision. Pesticide analytical manual, 1, 5600 Fisher‘s Lane, Roc- kville, MD 20852, July 1975. (7) US EPA (1974). Section 5, A(1). Analysis of Human or Animal Adipose Tissue, in Analysis of Pesticide Resi- dues in Human and Environmental Samples, Thompson J. F. (ed. ) Research Triangle Park, N. C. 27711. (8) Compaan H. (1980) in “The determination of the possible effects of chemicals and wastes on the aquatic envi- ronment: degradation, toxicity, bioaccumulation”, Ch. 2. 3, Part II. Government Publishing Office, the Hague, Netherlands. (9) Gardner et al, (1995). Limn. & Oceanogr. 30, pp. 1099-1105. (10) Randall R. C. , Lee H. , Ozretich R. J. , Lake J. L. and Pruell R. J. (1991). Evaluation of selected lipid methods for normalizing pollutant bioaccumulation. Envir. Toxicol. Chem. 10, pp. 1431-1436. (11) CEC, Bioconcentration of chemical substances in fish: the flow-through method. Ring Test Programme, 1984 to 1985. Final report March 1987. Authors: P. Kristensen and N. Nyholm. (12) ASTM E-1022–84 (Reapproved 1988). Standard Practice for Conducting Bioconcentration Tests with Fishes and Saltwater Bivalve Molluscs. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 309 1. pielikums Pieņemama atšķaidīšanas ūdens ķīmiskie raksturlielumi Viela Robežkoncentrācija 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Daļiņas Kopējais organiskais ogleklis Nejonizēts amonjaks Nogulšņu hlors Kopējie fosfororganiskie pesticīdi Kopējie hlororganiskie pesticīdi un polihlorbifenīli Kopējais organiskais hlors Alumīnijs Arsēns Hroms Kobalts Varš Dzelzs Svins Niķelis Cinks Kadmijs Dzīvsudrabs Sudrabs 5 mg/l 2 mg/l 1 μg/l 10 μg/l 50 ng/l 50 ng/l 25 ng/l 1 μg/l 1 μg/l 1 μg/l 1 μg/l 1 μg/l 1 μg/l 1 μg/l 1 μg/l 1 μg/l 100 ng/l 100 ng/l 100 ng/l 310 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 2. pielikums Testiem ieteicamās zivju sugas Ieteicamās sugas Ieteicamais testa temperatūru dia- pazons ( °C) Ieteicamais kopējais testa dzīvnieku garums (cm) 1 2 3 4 5 6 7 8 Danio rerio (1)(Teleostei, Cyprinidae) (Hamilton-Buchanan) Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae) (Rafinesque) Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae) (Linnaeus) Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae) (Temminck un Schlegel) Poccilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae) (Peters) Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchidae) (Rafinesque) Oncorhynchus mykiss (Teleostei, Salmonidae) (Walbaum) Gasterosteus aculeatus (Teleostei, Gasterosteidae) (Linneus) 20 - 25 20 - 25 20 - 25 20 - 25 20 - 25 20 - 25 13 - 17 18 - 20 3,0 ± 0, 5 5,0 ± 2, 0 5,0 ± 3, 0 4,0 ± 1, 0 3,0 ± 1, 0 5,0 ± 2, 0 8,0 ± 4, 0 3,0 ± 1, 0 (1) Meyer A. , Orti G. (1993) Proc. Royal Society of London, Series B. , Vol. 252 p. 231. Dažādās valstīs izmanto dažādas upju grīvu un jūras sugas, piemēram: spots lāsumainais jūrasgrundulis saldūdens menīdija zeltainais jūrasasaris Kalifornijas jūrasmēle Leiostomus xanthurus Cyprinodon variegatus Menidia beryllina Cymatogaster aggregata Parophrys vertulus Ziemeļatlantijas ragainā buļļzivs Leptocottus armatus trīsadatu stagars labraks vīķe Gasterosteus aculeatus Dicentracus labrax Alburnus alburnus Savākšana Tabulā minētās saldūdens zivis ir viegli audzējamas un/vai viegli pieejamas visu gadu, kamēr jūras un upju grīvu zivis daļēji ir saistītas ar attiecīgām valstīm. Tās var audzēt un kultivēt vai nu zivjaudzētavās vai laboratorijā slimību un parazītu kontroles apstākļos, tā lai pētījumu dzīvnieki būtu veseli un ar zināmu izcelsmi. Šīs zivis ir pieejamas daudzās vietās pasaulē. 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 311 3. pielikums Uzņemšanas un attīrīšanās fāzes ilguma iepriekšnoteikšana 1. Uzņemšanas fāzes iepriekšnoteikšana Pirms testa veikšanas no empīriskām sakarībām starp k2 un n-oktanola/ūdens sadalījuma koeficienta (Pow) vai no k2 un šķīdības ūdenī (s) var novērtēt k2 un no šejienes aptuvenu laiku procentos, kas ir vajadzīgs, lai sasniegtu stacionāru stāvokli. Novērtēt k2 (dienas-1)var, piemēram, no šādas empīriskas sakarības (1): log10k2 = - 0,414 log10(Pow) + 1,47 (r2= 0,95) (1. vienādojums) Par citām sakarībām sk. 2. atsauci. Ja sadalījuma koeficients (Pow) nav zināms, novērtēt var (3), zinot vielas šķīdību un izmantojot šādu sakarību: log10(Pow) = 0,862 log10(s) + 0,710 (r2= 0,994) (2. vienādojums) kur s = šķīdība (moli/l): (n = 36). Šīs sakarības ir pielietojamas vienīgi vielām ar log Pow vērtībām starp 2 un 6,5 (4). Laiku, kas vajadzīgs, lai sasniegtu noteiktus procentus no stacionārā stāvokļa, var izrēķināt, izmantojot aptu- veno k2, no vispārējā kinētikas vienādojuma, kas apraksta uzņemšanu un attīrīšanos (pirmās kārtas kinētika): vai, ja Cw ir konstanta: Ja tuvojas stacionāram stāvoklim (t ∞) 3. vienādojumu var vienkāršot (5) (6) šādi: Tad k1/k2. Cw ir tuvinājums koncentrācijai zivīs “stacionārā stāvoklī” (Cfs). 3. vienādojumu var pārveidot: Cf = Cf,s = (1 – e t –k 2 ) jeb = 1 – e t –k 2 Cf Cfs (4. vienādojums) Izmantojot 4. vienādojumu, var iepriekš novērtēt laiku, kas vajadzīgs, lai sasniegtu noteiktus procentus no sta- cionāra stāvokļa, ja k2 iepriekš novērtē, izmantojot 1. vai 2. vienādojumu. Kā orientieris, statistiski optimāls uzņemšanas fāzes ilgums statistiski pieņemamu datu sniegšanai (BCFk) ir laika posms, kas vajadzīgs, lai pārbaudāmās vielas koncentrācijas zivīs logaritmiskā līkne, kas atlikta pret lineāro lai- ku, sasniegtu viduspunktu, jeb 1,6/k2, jeb 80 % no stacionārā stāvokļa, bet ne vairāk par 3,0/k2, jeb 95 % no stacionārā stāvokļa (7). Laiks, lai sasniegtu 80 % no stacionārā stāvokļa ir (4. vienādojums): 0,80 = 1 – e t –k 80 2 jeb t80 = 1,6 k2 (5. vienādojums) 312 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. Līdzīgi, 95 % no stacionāra stāvokļa ir: t95 = 3,0 k2 (6. vienādojums) Piemēram, uzņemšanas fāzes ilguma (uzņ. ) pārbaudāmajai vielai ar log Pow = 4 būtu (izmantojot 1. , 5. un 6. vienādojumu): log10k2 = – 0,414. (4) + 1,47 k2 = 0,652 dienas-1 uzņ. (80 %) = 1,6/0,652, t. i. , 2,45 dienas (59 stundas) vai uzņ. (95 %) = 3,0/0,652, t. i. , 4,60 dienas (110 stundas) Līdzīgi, pārbaudāmai vielai ar s = 10-5 mol/l (log(s) = 5,0) uzņemšanas ilgums būtu (izmantojot 1. , 2. , 5. un 6. vienādojumu): log10 (Pow) = – 0,862 (– 5,0) + 0,710 = 5,02 log10k2 k2 = – 0,414 (5,02) + 1,47 = 0,246 dienas-1 uzņ. (80 %) = 1,6/0,246, t. i. , 6,5 dienas (156 stundas) vai uzņ. (95 %) = 3,0/0,246, t. i. , 12,2 dienas (293 stundas) Alternatīvi, lai aprēķinātu laiku, kas vajadzīgs stacionārā stāvokļa sasniegšanai, var izmantot izteiksmi (4): teq = 6,54 x10-3 Pow + 55,31 (stundas). 2. Attīrīšanās fāzes iepriekšnoteikšana Iepriekš noteikt laiku, kas vajadzīgs, lai samazinātu ķermeņa uzņemto vielu līdz noteiktiem sākotnējās koncen- trācijas procentiem, var arī, izmantojot vispārēju vienādojumu, kas apraksta uzņemšanu un attīrīšanos (pirmās kārtas kinētika) (1) (8). Attīrīšanās fāzei pieņem, ka Cw ir vienāda ar nulli. Vienādojumu var vienkāršot līdz: kur Cf, 0 ir koncentrācija attīrīšanās posma sākumā. 50 % attīrīšanos sasniedz laikā (t50): Līdzīgi, 95 % attīrīšanās laiks ir: Ja pirmajā posmā izmanto 80 % uzņemšanu (1,6/k2) un attīrīšanās fāzē 95 % zudumu (3,0/k2), tad attīrīšanās fāze ir aptuveni divreiz ilgāka par uzņemšanas fāzi. Ir svarīgi atzīmēt, ka novērtējumi tomēr pamatojas uz pieņēmumu, ka uzņemšana un attīrīšanās notiek pēc pir- mās kārtas kinētikas. Ja pirmās kārtas kinētika acīm redzami nav spēkā, būtu jāizmanto sarežģītāki modeļi (piem. , 1. atsauce). 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 313 Literatūra (3. pielikumam) (1) Spacie A. un Hamelink J. L. (1982). Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish. Toxicol. and Chem. 1, pp. 309-320. (2) Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of BCFs derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particular matter to the bioavailability of chemicals. Danish Water Quality Institute. (3) Chiou C. T. and Schmedding D. W. (1982). Partitioning of organic compounds in octanol-water systems. Environ. Sci. Tech- nol. 16 (1), pp 4-10. (4) Hawker D. W. and Connell D. W. (1988). Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22 (6), pp. 701-707. (5) Branson D. R. , Blau G. E. , Alexander H. C. un Neely W. B. (1975). Transactions of the American Fisheries Society, 104 (4), pp. 785-792. (6) Ernst W. (1985). Accumulation in Aquatic organisms. In: Appraisal of tests to predict the environmental behaviour of che- micals. Ed. by Sheeman P. , Korte F. , Klein W. and Bourdeau P. H. Part 4. 4, pp. 243-255. SCOPE, 1985, John Wiley & Sons Ltd N. Y. (7) Reilly P. M. , Bajramovic R. , Blau G. E. , Branson D. R. and Sauerhoff M. W. (1977). Guidelines for the optimal design of experiments to estimate parameters in first order kinetic models, Can. J. Chem. Eng. 55, pp. 614-622. (8) Konemann H. and Van Leeuwen K. (1980). Toxicocinetics in fish: Accumulation and Elimination of Six Chlorobenzenes by Guppies. Chemosphere, 9, pp. 3-19. 314 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. 4. pielikums Biokoncentrāciju testu paraugu ņemšanas teorētisks piemērs vielām ar log Pow = 4 Zivju paraugu ņemšana Uzņemšanas fāze Pirmā Otrā Trešā Ceturtā Piektā Attīrīšanās fāze Sestā Septītā Astotā Devītā Paraugu ņemšanas laika grafiks Minimālais vajadzī- gais biežums (dienas) Papildu paraugu ņemšana Ūdens paraugu skaits Zivju skaits paraugā -1 0 0,3 0,6 1,2 2,4 4,7 5,0 5,9 9,3 14,0 0,4 0,9 1,7 3,3 5,3 7,0 11,2 17,5 2 (*) 2 2 (2) 2 (2) 2 (2) 2 (2) 2 Pievieno 45 līdz 80 zivis 4 (4) 4 (4) 4 (4) 4 (4) 6 Zivis pārvieto ūde- nī, kas nesatur testa vielu 4 (4) 4 (4) 4 (4) 6 (4) (*) Ūdens paraugu ņem pēc tam, kad pievadīti minimums trīs “nodalījuma tilpumi” ūdens. Ievērībai: Pirmstesta aptuvenais k2 pie log Pow lieluma 4,0 ir 0,652 dienas-1. Kopējais eksperimenta ilgums ir noteikts 3 x uzņ. = 3 x 4,6 dienas, t. i. , 14 dienas. Aptuveno “uzņ. ” novērtēšanu sk. 3. pielikumā. Skaitļi iekavās ir paraugu skaits (ūdenim, zivīm), kas jāņem, ja ņem papildu paraugus 13/21. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 315 5. pielikums Modeļa izvēle Uzskata, ka lielāko daļu biokoncentrācijas datu “pietiekami” labi apraksta vienkāršs divu nodalījumu/divu parametru modelis, kā rāda rektilineārā līkne, kas attīrīšanās fāzē tuvojas punktiem, kas atbilst koncentrācijām zivīs, ja šos punk- tus atliek puslogaritmiskā grafikā. (Ja šos punktus nevar aprakstīt ar rektilineāru līkni, tad jāizmanto sarežģītāks mode- lis, sk. , piemēram, Spacie un Hamelink, 3. pielikuma 1. atsauce). Attīrīšanās (zuduma) ātruma konstantes k2 noteikšanas grafiskā metode Testa vielas koncentrāciju, kas atrasta katrā zivju paraugā, atliek puslogaritmiskā grafikā pret parauga ņemšanas lai- ku. Šīs līknes slīpums ir k2. k2 = ln (Cf1/Cf2) t2 – t1 Ievērojiet, ka novirzes no taisnas līnijas var norādīt uz sarežģītāku attīrīšanās raksturu, nekā pirmās kārtas kinētika. Lai noskaidrotu attīrīšanās tipus, kas atšķiras no pirmās kārtas kinētikas, var izmantot grafisko metodi. Uzņemšanas ātruma konstantes k1 grafiskās noteikšanas metode Pie dotās k2 šādi aprēķina k1: Cf vērtību nolasa līdzenās uzņemšanas līknes viduspunktā, līkni iegūst no datiem, atliekot koncentrācijas log pret laiku (lineārā skalā). 316 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 13/21. sēj. Uzņemšanas un attīrīšanās (zuduma) ātruma konstanšu aprēķins ar datoru Labākais veids, kā aprēķināt biokoncentrēšanas koeficientu un ātruma konstantes k1 un k2, ir izmantot datoru neli- neāru parametru novērtēšanai. Datoru programmas aprēķina k1 un k2 lielumus dotajam datu kopumam, kurā ir secī- gas koncentrācijas un attiecīgie laika posmi, izmantojot modeli: Cf = Cw∙ Cf = Cw∙ k1 k2 k1 k2 x (l – e –k 2 t) x (e –k 2( t –t c)– e –k 2 t) 0 < t < tc (2. vienādojums) t < tc (3. vienādojums) kur tc ir laiks uzņemšanas fāzes beigās. Šī pieeja dod standartnoviržu aptuvenos lielumus k1 un k2. Tā kā k2 vairumā gadījumu var noteikt no attīrīšanās līknes ar relatīvi augstu precizitāti un tā kā starp abiem para- metriem k1 un k2 ir stingra korelācija, ja tie ir noteikti vienlaicīgi, ir ieteicams vispirms izrēķināt k2 tikai no attīrīša- nās datiem un pēc tam izrēķināt k1 no uzņemšanas datiem, izmantojot nelineāro regresiju