title: A bizottság 98/73/EK irányelve (1998. szeptember 18.) a veszélyes anyagok osztályozására, csomagolására és címkézésére vonatkozó törvényi, rendeleti és közigazgatási rendelkezések közelítéséről szóló 67/548/EGK tanácsi irányelvnek a műszaki fejlődéshez történő huszonnegyedik hozzáigazításárólEGT vonatkozású szöveg.

eurovoc_concepts:
classification
dangerous substance
labelling
marketing standard
packaging

text: 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 139 31998L0073 1998. 11. 16. AZ EURÓPAI KÖZÖSSÉGEK HIVATALOS LAPJA L 305/1 A BIZOTTSÁG 98/73/EK IRÁNYELVE (1998. szeptember 18. ) a veszélyes anyagok osztályozására, csomagolására és címkézésére vonatkozó törvényi, rendeleti és közigazgatási rendelkezések közelítéséről szóló 67/548/EGK tanácsi irányelvnek a műszaki fejlődéshez történő huszonnegyedik hozzáigazításáról (EGT vonatkozású szöveg) AZ EURÓPAI KÖZÖSSÉGEK BIZOTTSÁGA, ELFOGADTA EZT AZ IRÁNYELVET: tekintettel az Európai Gazdasági Közösséget létrehozó szerző- désre, 1. cikk tekintettel a legutóbb a 97/69/EK bizottsági irányelvvel módosí- tott (1), a veszélyes anyagok osztályozására, csomagolására és címkézésére vonatkozó törvényi, rendeleti és közigazgatási rendelkezések közelítéséről szóló, 1967. június 27-i 67/548/EGK tanácsi irányelvre (2) és különösen annak 28. cikkére, mivel a 67/548/EGK irányelv I. melléklete tartalmaz egy, a veszé- lyes anyagokat felsoroló listát, minden egyes anyag osztályozá- sának és címkézésének részleteivel együtt; mivel a jelenlegi tudo- mányos és műszaki ismeretek azt mutatják, hogy felül kell vizsgálni és ki kell egészíteni az e mellékletben közölt veszélyes anyagok listáját; mivel a 67/548/EGK irányelv V. melléklete tartalmazza a veszé- lyes anyagok és készítmények fizikai-kémiai tulajdonságainak, toxicitásának és ökotoxicitásának meghatározására szolgáló mód- szereket; mivel e mellékletet a műszaki fejlődéshez kell hozzáiga- zítani; A 67/548/EGK irányelv a következőképpen módosul: 1. Az I. melléklet a következőképpen módosul: a) ezen irányelv I. mellékletének tételei a 67/548/EGK irány- elv I. mellékletének megfelelő tételei helyébe lépnek; b) ezen irányelv II. mellékletének tételeivel egészül ki a 67/548/EGK irányelv I. melléklete. 2. Az V. melléklet a következőképpen módosul: a) ezen irányelv III. A. , III. B. és III. C. mellékletének szövegé- vel egészül ki a 67/548/EGK irányelv V. mellékletének A. része; b) ezen irányelv III. D. mellékletének szövegével egészül ki a 67/548/EGK irányelv V. mellékletének C. része. mivel ezen irányelv előírásai összhangban vannak a veszélyes anyagok és készítmények kereskedelme technikai akadályainak felszámolásáról szóló irányelveknek a műszaki fejlődéshez tör- ténő hozzáigazításával foglalkozó bizottság véleményével, 2. cikk (1) HL L 343. , 1997. 12. 13. , 19. o. (2) HL 196. , 1967. 8. 16. , 1. o. A tagállamok hatályba léptetik azokat a törvényi, rendeleti és közigazgatási rendelkezéseket, amelyek szükségesek ahhoz, hogy legkésőbb 1999. október 31-ig ennek megfeleljenek. Erről haladéktalanul tájékoztatják a Bizottságot. irányelvnek az 140 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet Amikor a tagállamok elfogadják ezeket az intézkedéseket, azokban hivatkozni kell erre az irányelvre,vagy azokhoz hivatalos kihirdetésük alkalmával ilyen hivatkozást kell fűzni. A hivatkozás módját tagállamok határozzák meg. Ennek az irányelvnek a tagállamok a címzettjei. 4. cikk Kelt Brüsszelben, 1998. szeptember 18-án. 3. cikk Ez az irányelv az Európai Közösségek Hivatalos Lapjában való kihirdetését követő 20. napon lép hatályba. a Bizottság részéről Ritt BJERREGAARD a Bizottság tagja ANEXO I – BILAG I – ANHANG I – ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ I – ANNEX I – ANNEXE I – ALLEGATO I – BIJLAGE I – ANEXO I – LIITE I – BILAGA I 142 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 143 144 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 145 146 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 147 148 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 149 150 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 151 152 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 153 154 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 155 156 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 157 158 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 159 160 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 161 162 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 163 164 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 165 166 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 167 168 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 169 170 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 171 172 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 173 174 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 175 176 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 177 178 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 179 180 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 181 182 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 183 184 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 185 186 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 187 188 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 189 190 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 191 192 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 193 194 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 195 196 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 197 198 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 199 200 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 201 202 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 203 204 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 205 206 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet ANEXO II – BILAG II – ANHANG II – ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ II – ANNEX II – ANNEXE II – ALLEGATO II – BIJLAGE II – ANEXO II – LIITE II – BILAGA II 208 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 209 210 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 211 212 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 213 214 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 215 216 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 217 218 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 219 220 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 221 222 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 223 224 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 225 226 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 227 228 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 229 230 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 231 232 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 233 234 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 235 236 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 237 238 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 239 240 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 241 242 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 243 244 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 245 246 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 247 248 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 249 250 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 251 252 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 253 254 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 255 256 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 257 258 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 259 260 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 261 262 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 263 264 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 265 266 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 267 268 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 269 270 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 271 272 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 273 274 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 275 276 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 277 278 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet III. A. MELLÉKLET A. 18. A POLIMEREK SZÁMÁTLAG SZERINTI MOLEKULATÖMEGE ÉS MOLEKULATÖMEG-ELOSZLÁSA 1. MÓDSZER E Gél Permeációs Kromatográfiás módszer megfelel az OECD TG 118-nak (1996). Az alapelvek és további technikai információk az 1. hivatkozásban találhatók. 1. 1. Bevezetés Mivel a polimerek tulajdonságai olyan változatosak, lehetetlen egyetlen módszert leírni, pontosan felso- rolva az elválasztás és kiértékelés feltételeit, amelyek lefednek minden, a polimerek elválasztásánál előfor- duló eshetőséget és különlegességet. Különösen a komplex-polimer rendszereknél gyakran nem használ- ható a Gél Permeációs Kromatográfia (GPC). Amennyiben a GPC nem használható, a molekulatömeg más módszerekkel határozható meg (ld. melléklet). Ilyen esetekben meg kell adni a használt módszer valamennyi részletét és igazolását. A leírt módszer az 55672 DIN szabványon alapul (1). Ebben a DIN szabványban található részletes infor- máció a kísérletek kivitelezéséről és az adatkiértékelésről. Amennyiben a kísérleti körülmények módosítása szükséges, a változtatásokat igazolni kell. Más szabvány is használható, amennyiben teljes körű hivatko- zással rendelkezik. A leírt módszer kalibrációra ismert polidiszperzitású polisztirol mintákat használ, és esetleg módosítani kell, hogy megfelelő legyen bizonyos polimereknél, pl. : vízben oldható és hosszú láncú elágazó polimerek. 1. 2. Fogalommeghatározások és mértékegységek Az Mn számátlag molekulatömeget és az Mw tömegátlag molekulatömeget az alábbi egyenletekkel lehet meghatározni: ahol Hi a detektorjel szintje az alapvonaltól Vi retenciós térfogatra Mi a polimerfrakció molekulatömege Vi retenciós térfogatnál, és n az adatpontok száma. A molekulatömeg eloszlásának szélességét, ami a rendszer diszperzitásának mértéke, az Mw/Mn arány adja meg. 1. 3. Referenciaanyagok Kalibrációt kell készíteni, mert a GPC relatív módszer. Keskeny eloszlású, lineárisan felépített, ismert Mn és Mw átlagos molekulatömegű, és ismert molekulatömeg eloszlású polisztirol standardokat használnak e cél- ra. Az ismeretlen minta molekulatömegének meghatározására a kalibrációs görbe csak akkor használható, amennyiben a minta és a standardok elválasztásának körülményei azonos módon lettek kiválasztva. A molekulatömeg és az elúciós térfogat között meghatározott kapcsolat csak az adott kísérlet sajátos körül- ményei között érvényes. A körülmények magukban foglalják mindenek felett a hőmérsékletet, az oldószert (vagy oldószerkeveréket), a kromatográfiás feltételeket és az elválasztó oszlopot vagy oszlopokat. 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 279 A minta így meghatározott molekulatömegei relatív értékek és „polisztirol ekvivalens molekulatömeg”-ként írták le őket. Ez azt jelenti, hogy a minta és a standard szerkezeti és kémiai különbségeitől függően a mole- kulatömegek kisebb-nagyobb mértékben eltérhetnek az abszolút értéktől. Amennyiben más standardokat használtak, pl. polietilén-glikol, polietilén-oxid, polimetil-metakrilát, poliakrilsav, azt meg kell indokolni. 1. 4. A vizsgálati módszer elve A minta molekulatömeg-eloszlása és az átlagos molekulatömegek (Mn, Mw) GPC-vel meghatározhatók. A GPC a folyékony kromatográfia speciális típusa, aminél a minta az egyes alkotók hidrodinamikai térfogata szerint választódik el (2). Az elválasztás a minta porózus anyaggal, tipikusan szerves géllel töltött oszlopon való áthaladásakor való- sul meg. Kis molekulák be tudnak hatolni a pórusokba, a nagy molekulák nem. A nagy molekulák útja ezért rövidebb, és elsőként eluálódnak. A közepes méretű molekulák a pórusok egy részébe behatolnak, és később eluálódnak. A legkisebb, a gél pórusainál kisebb átlagos hidrodinamikai sugarú molekulák minden pórusba be tudnak hatolni. Ezek eluálódnak utoljára. Ideális helyzetben az elválasztást teljesen a molekulafajták mérete szabja meg, de a gyakorlatban nehéz elke- rülni valamely abszorpciós hatás közrehatását. A nem egyenletes oszlopfeltöltés és a holt térfogat ronthatja a helyzetet (2). A detektálás megvalósul pl. a törésmutatóval vagy az UV-elnyeléssel, és egyszerű eloszlási görbét eredmé- nyez. Azonban ahhoz, hogy a tényleges molekulatömeg-értékeket a görbéhez lehessen rendelni, az oszlo- pot kalibrálni kell ismert molekulatömegű és ideális esetben nagyjából hasonló szerkezetű polimerek, pl. különböző polisztirol standardok futtatásával. Tipikusan Gauss-görbe kapható, néha a kis molekulatömeg oldalán kis farokkal eltorzítva, a függőleges tengely a különböző eluált molekulafajták tömeg szerinti mennyiségét, a vízszintes tengely a molekulatömeg logaritmusát mutatja. 1. 5. Minőségi követelmények Az elúciós térfogat reprodukálhatósága (relatív standard deviáció, RSD) 0,3 %-nál jobb kell, hogy legyen. Az analízis megkövetelt reprodukálhatóságát belső standarddal való korrekcióval kell biztosítani, amennyiben a kromatogramot az idő függvényében értékelik ki, és nem felel meg a fent említett követel- ménynek (1). A polidiszperzitás függ a standardok molekulatömegétől. Polisztirol standardoknál a tipikus értékek: Mp < 2 000 2 000 ≤ Mp ≤ 106 Mp > 106 Mw/Mn < 1,20 Mw/Mn < 1,05 Mw/Mn < 1,20 (Mp a standard molekulatömege a csúcsmaximumnál) 1. 6. A vizsgálati módszer leírása 1. 6. 1. A standard polisztirol oldatok készítése A polisztirol standardokat óvatosan keverve oldják fel a választott eluensben. A gyártó ajánlásait számí- tásba kell venni az oldatok készítésénél. A választott standardok koncentrációja különböző faktoroktól függ, pl. injektált térfogat, az oldat viszko- zitása, és az elemző detektor érzékenysége. A túltöltés elkerülése érdekében a maximális injektált térfogatot az oszlop hosszához kell igazítani. 30 cm × 7,8 mm-es oszlopú GPC-vel történő analitikai elválasztásoknál a jellemző injektált térfogat rendesen 40 és 100 μl között van. Nagyobb térfogat is elképzelhető, de nem lépheti túl a 250 μl-t. Az oszlop aktuális kalibrációja előtt meg kell határozni az injektált térfogat és a kon- centráció optimális arányát. 280 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 1. 6. 2. A mintaoldat elkészítése Elvben a mintaoldatok elkészítésére is ugyanezek a követelmények érvényesek. A mintát megfelelő oldó- szerben pl. tetrahidrofurán (THF) óvatos rázással oldják fel. Semmilyen körülmények között sem szabad ult- rahangos fürdőben feloldani. Amennyiben szükséges, az oldat tisztítható 0,2-2 μm-es pórusméretű memb- ránszűrővel. A feloldatlan részecskék jelenlétét, amik nagy molekulatömegű fajták miatt fordulhatnak elő, fel kell jegyezni a végleges jelentésben. A feloldott részecskék tömegszázalékának meghatározására megfelelő mód- szert kell alkalmazni. Az oldatot 24 órán belül fel kell használni. 1. 6. 3. Készülék – oldószer tartály, – gáztalanító (szükség szerint), – pumpa, – – – – – – rezgéscsillapító (szükség szerint), injektáló rendszer, kromatográfiás oszlopok, detektor, áramlásmérő (szükség szerint), adat rögzítő-feldolgozó, – hulladéktároló. Biztosítani kell, hogy a GPC rendszer inert legyen a használt oldószerekkel szemben (pl. THF oldószernél acél kapillárisok használata). 1. 6. 4. Injektáló és oldószerszállító rendszer A minta oldatának meghatározott térfogatát automata adagolóval, vagy kézzel töltik az oszlopra egy pon- tosan meghatározott zónába. Amennyiben kézzel végzik, a fecskendő dugattyújának túl gyors benyomása vagy kihúzása a megfigyelt molekulatömeg-eloszlásban változásokat okozhat. Az oldószert szállító rend- szernek, amennyire csak lehet, lüktetésmentesnek kell lenni, ideálisan rezgéscsillapítót magában foglalva. Az áramlási sebesség 1 ml/perc nagyságrendű. 1. 6. 5. Oszlop A mintától függően a polimert egy egyszerű, vagy több, sorba kötött oszlopot használva jellemeznek. Szá- mos meghatározott tulajdonságokkal (pl. pórusméret, szelektivitási határérték) rendelkező porózus oszlop- anyag elérhető a kereskedelemben. Az elválasztó gél vagy az oszlophossz megválasztása a minta tulajdon- ságaitól (pl. hidrodinamikai térfogatok, molekulatömeg-eloszlás) és az elválasztás sajátos körülményeitől, pl. oldószer, hőmérséklet és áramlási sebesség, is függ (1) (2) (3). 1. 6. 6. Elméleti tányérszám Az elválasztásra használt oszlopot vagy oszlopkombinációt az elméleti tányérszámmal kell jellemezni. A THF eluáló oldószer esetében ez magában foglalja etil-benzol, vagy más megfelelő nem poláris oldat tölté- sét ismert hosszúságú oszlopra. Az elméleti tányérszámot a következő egyenlet adja meg: W1/2)2 N = 5. 54( Ve , W)2 vagy N = 16(Ve ahol N Ve az elméleti tányérszám az elúciós térfogat a csúcsmaximumnál W az alapvonal csúcsszélesség W1/2 a csúcsszélesség félmagasságnál. 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 281 1. 6. 7. Az elválasztás hatékonysága Az elméleti tányérszámon kívül, ami a sávszélességet meghatározó mennyiség, az elválasztás hatékonysá- gának is van szerepe, amit a kalibrációs görbe meredeksége határoz meg. Egy oszlop elválasztási hatékony- ságát a következő kapcsolat adja meg: V – V e,M x e,(10M x) Az oszlop keresztmet szetének t erülete 3 2] ≥ 6,0[cm cm ahol Ve, Mx az Mx molekulatömegű polisztirol elúciós térfogata Ve, (10Mx) a 10-szer nagyobb molekulatömegű polisztirol elúciós térfogata. A rendszer felbontása általában így definiált: R1,2 = 2× We1–Ve2 W1+W2 × 1 Log10(M2/M1) ahol Ve1, Ve2 két polisztirol standard elúciós térfogata a csúcsmaximumnál W1, W2 az alapvonal csúcsszélességei M1, M2 a molekulatömegek a csúcsmaximumnál (10-es faktorral térjenek el). Az oszloprendszerre az R-értéknek nagyobbnak kell lennie, mint 1,7 (4). 1. 6. 8. Oldószerek Minden oldószernek nagy tisztaságúnak kell lennie (THF-ből 99,5 %-os tisztaságút használnak). Az oldó- szertartálynak (inertgáz-atmoszférában, amennyiben szükséges) elég nagynak kell lenni az oszlop kalibrá- lásához és néhány mintaanalízishez. Az oldószert gáztalanítani kell, mielőtt a pumpával az oszlopra jut- tatják. 1. 6. 9. Hőmérsékletszabályozás A kritikus belső komponensek (injektáló hurok, oszlopok, detektor, csövezés) hőmérsékletét állandó és az oldószerválasztásnak megfelelő értéken kell tartani. 1. 6. 10. Detektor A detektor célja az oszlopról eluált minta koncentrációjának mennyiségi rögzítése. A csúcsok szükségtelen szélesedésének elkerülésére a detektorcella küvetta térfogatának a lehető legkisebbnek kell lenni. Nem lehet nagyobb 10 μl-nél, kivéve a fényszórási és viszkozitás detektoroknál. A detektálásra differenciális törésmutató-mérést szokás használni. Azonban, ha a minta vagy az elúciós oldószer sajátos tulajdonságai megkövetelik, más detektortípusok is használhatók, pl. UV/látható fény, IR, viszkozitás detektor stb. 2. ADATOK ÉS JELENTÉS 2. 1. Adatok A DIN szabványra (1) kell hivatkozni a részletes értékelési követelménynél éppúgy, mint az adatgyűjtéssel és -feldolgozással kapcsolatos követelményeknél. Minden mintánál két független kísérletet kell végezni. Külön-külön kell azokat elemezni. Mn-t, Mw-t, Mw/Mn-t, és Mp-t meg kell adni minden mérésnél. Fontos egyértelműen jelezni, hogy a mért érté- kek a használt standard molekulatömegével ekvivalens relatív értékek. A retenciós térfogatok, vagy 282 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet a retenciós idők (lehetőleg belső standardot használva korrigáltak) meghatározása után a log Mp értékek (Mp a kalibráló standard csúcsmaximuma) lesznek ábrázolva egyikük függvényében. Molekulatömeg- dekádonként legalább két kalibrációs pont szükséges, és legalább öt mérési pont kell a teljes görbéhez, ami- nek le kell fedni a minta becsült molekulatömegét. A kalibrációs görbe kis molekulatömegű végpontját n- hexil-benzol, vagy más megfelelő nem poláris oldott anyag definiálja. A számátlag és a tömegátlag mole- kulatömeget általában elektronikus adatfeldolgozással, az 1. 2. pont képletei alapján határozzák meg. A kézi digitalizálás esetében az ASTM D 3536-91 használható (3). Az eloszlási görbét táblázat, vagy ábra (differenciális frekvencia, vagy összeg százalék a log M függvényé- ben) formájában kell megadni. Grafikus ábrázolásnál egy molekulatömeg-dekádnak általában kb. 4 cm szé- lesnek kell lenni, a csúcsmaximumnak pedig kb. 8 cm magasnak kell lenni. Integrális eloszlási görbék ese- tében az ordinátában a különbségnek 0 és 100 % között kb. 10 cm-esnek kell lenni. 2. 2. Vizsgálati jelentés A vizsgálati jelentésnek az alábbi információkat kell tartalmaznia: 2. 2. 1. Vizsgált anyag – – elérhető információk a vizsgált anyagról (azonosság, adalékanyag, szennyező anyag), a mintakezelés, megfigyelések, problémák leírása. 2. 2. 2. Műszerezettség – eluens tartály, inert gáz, az eluens gáztalanítása, az eluens összetétele, szennyezők, – pumpa, rezgéscsillapító, injektáló rendszer, – – elválasztó oszlopok (a gyártó, az oszlop jellemzőiről minden információ, mint pórusméret, az elvá- lasztó anyag fajtája stb. , a használt oszlopok száma, hossza, és elrendezése), az oszlop (vagy oszlopkombináció) elméleti tányérszáma, elválasztás hatékonysága (a rendszer felbon- tása), – információ a csúcsok szimmetriájáról, – oszlophőmérséklet, hőmérséklet-szabályozás módja, – – – detektor (mérési elv, típus, küvettatérfogat), áramlásmérő, amennyiben használva lett (gyártó, mérési elv), adatrögzítő és -feldolgozó rendszer (hardver és szoftver). 2. 2. 3. A rendszer kalibrálása – – – – a kalibrációs görbék megalkotásához használt módszer részletes leírása, információk a módszer minőségi követelményeiről (pl. korrelációs együttható, eltérés négyzetösszege stb. ), információk minden, a kísérleti eljárás és az adatok kiértékelése és feldolgozása során alkalmazott ext- rapolációról, feltételezésről és közelítésről, a kalibrációs görbék megalkotásához használt minden mérést dokumentálni kell egy táblázatban, amely minden kalibrációs pont esetében az alábbiakat tartalmazza: – – – – – a minta neve, a minta gyártója, az Mp, Mn, Mw, és Mw/Mn, standardok jellemző értékei, ahogy azokat a gyártó rendelkezésre bocsá- totta, vagy az azt követő mérésekből következnek, a meghatározási módszer részleteivel együtt, injektálási térfogat és koncentráció, a kalibrációhoz használt Mp érték, 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 283 – – – a csúcsmaximumoknál mért elúciós térfogat, vagy korrigált retenciós idő, a csúcsmaximumnál számított Mp, a számított Mp és a kalibrációs érték százalékos hibája. 2. 2. 4. Kiértékelés: – – – – időn alapuló kiértékelés: a megkövetelt reprodukálhatóság biztosítására használt módszerek (korrek- ciós módszer, belső standard stb. ), információ arról, hogy a kiértékelés az elúciós térfogat, vagy a retenciós idő alapján történt, információ a kiértékelés korlátairól, amennyiben nem elemeztek egy csúcsot teljesen, a kiegyenlítési módszerek leírása, amennyiben használva lettek, – minta-előállítási és -előkezelési eljárások, – – – – – – feloldatlan részecskék jelenléte, amennyiben voltak, injektálási térfogat (μl) és injektálási koncentráció (mg/ml), az ideális GPC profiltól való eltéréshez vezető hatásokat jelző megfigyelések, a vizsgálati eljárások minden módosításának részletes leírása, a hibatartományok részletei, az eredmények értelmezésére vonatkozó bármely egyéb információ és megfigyelés. 3. IRODALOMJEGYZÉK (1) DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutions- mittel, 1. rész. (2) Yau, W. W. , Kirkland, J. J. , and Bly, D. D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons. (3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. (4) ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polistyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. 284 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet Melléklet Példák polimerek számátlag molekulatömege (Mn) meghatározásának más módszereire Mn meghatározására a gél permeációs kromatográfia (GPC) az előnyben részesített módszer, különösen, ha elérhető a polimeréhez hasonló szerkezetű standardkészlet. Azonban, ha gyakorlati nehézségekbe ütközik a GPC használata, vagy amennyiben számítani lehet arra, hogy nincs megfelelő érték az Mn számára (és ami igazolást igényel), alterna- tív módszerek alkalmazhatók, úgymint: 1. A kolligatív tulajdonságok felhasználása 1. 1. Ebullioszkópia/krioszkópia: az oldószer polimer hozzáadásával kiváltott forráspont emelkedésének (ebullioszkó- pia), vagy fagypont csökkenésének (krioszkópia) mérése. A módszer azon a tényen alapul, hogy az oldott poli- mer hatása a folyadék forrás/fagypontjára a polimer molekulatömegétől függ (1) (2). Alkalmazhatóság: Mn < 20 000. 1. 2. Gőznyomás csökkentése: a kiválasztott referenciafolyadék gőznyomásának mérése ismert mennyiségű polimer hozzáadása előtt és után (1) (2). Alkalmazhatóság: Mn < 20 000 (elméletben; gyakorlatban azonban korlátozott értékű). 1. 3. Membrán ozmometria: az ozmózis elvén alapul, azaz, hogy az oldószermolekulák hajlamosak híg oldatból a tömény oldatba átmenni egy félig áteresztő membránon keresztül, hogy egyensúly jöjjön létre. A vizsgálatnál a híg oldat nulla koncentrációjú, a tömény oldat pedig a polimert tartalmazza. Az oldószer átvándorlása a membránon keresztül nyomáskülönbséget okoz, amely az oldat koncentrációjától és a polimer molekulatö- megétől függ (1) (3) (4). Alkalmazhatóság: Mn 20 000–200 000 között. 1. 4. Gőzfázis ozmometria: tiszta oldószer aeroszol párolgási sebességének összehasonlítása legalább három eltérő koncentrációban polimert tartalmazó aeroszolhoz képest (1) (5) (6). Alkalmazhatóság: Mn < 20 000. 2. Végcsoport analízis A módszer alkalmazásához a polimer általános szerkezetének és a láncot lezáró végcsoportok szerkezetének (aminek a fő váztól pl. NMR-rel, vagy titrálással/származékképzéssel megkülönböztethetőnek kell lenni) isme- rete szükséges. A polimerben jelen lévő végcsoportok molekulakoncentrációjának meghatározása a moleku- latömeg értékéhez vezethet (7) (8) (9). Alkalmazhatóság: Mn 50 000 – ig (csökkenő megbízhatósággal). IRODALOMJEGYZÉK (1) Billmeyer, F. W. Jr. , (1984). Textbook of Polymer Science, 3rd. Edn. , John Wiley, New York. (2) Glover, C. A. , (1975). Absolute Colligative Property Methods. Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I P. E. Slade, Jr. ed. , Marcel Dekker, New York. (3) ASTM D 3750-79, (1979). Standard Practice for Determination of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Membrane Osmometry. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsyl- vania. (4) Coll, H. (1989). Membrane Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A. R. Copper ed. , J. Wiley and Sons, 25-52. oldal. (5) ASTM 3592-77, (1977). Standard Recommended Practice for Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 285 (6) Morris, C. E. M. , (1989). Vapour Pressure Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A. R. Cooper ed. , John Wiley and Sons. (7) Schröder, E. , Müller, G. , and Arndt, K-F. , (1989). Polymer Characterisation, Carl Hanser Verlag, Munich. (8) Garmon, R. G. , (1975). End-Group Determinations, Chapter 3. In: Polymer Molecular Weighs, Part I, P. E. Sla- de, Jr. ed. Marcel Dekker, New York. (9) Amiya S. , et al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, 2139-2146. oldal. 286 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet III. B. MELLÉKLET A. 19. POLIMEREK KIS MOLEKULATÖMEG-TARTALMA 1. MÓDSZER Ez a gél permeációs kromatográfiás módszer az OECD TG 119-nek megfelelője (1996). Az alapelvek és további technikai információk az 1. hivatkozásban találhatók. 1. 1. Bevezetés mivel a polimerek tulajdonságai olyan változatosak, lehetetlen egyetlen módszert leírni, pontosan felso- rolva az elválasztás és kiértékelés feltételeit, amelyek lefednek minden, a polimerek elválasztásánál előfor- duló eshetőséget és különlegességet. Különösen a komplex-polimer rendszereknél gyakran nem használ- ható a gél permeációs kromatográfia (GPC). Amennyiben a GPC nem használható, a molekulatömeg más módszerekkel határozható meg (ld. melléklet). Ilyen esetekben meg kell adni a használt módszer valamennyi részletét és igazolását. A leírt módszer az 55672 DIN szabványon alapul (1). Ebben a DIN szabványban található részletes infor- máció a kísérletek kivitelezéséről és az adatkiértékelésről. Amennyiben a kísérleti körülmények módosítása szükséges, a változtatásokat igazolni kell. Más szabvány is használható, ha teljes körű hivatkozással ren- delkezik. A leírt módszer ismert polidiszperzitású polisztirol kalibrációs mintákat használ, és esetleg módo- sítani kell, hogy megfelelő legyen bizonyos polimereknél, pl. : vízben oldható és hosszú láncú elágazó poli- merek. 1. 2. Fogalommeghatározások és mértékegységek A kis molekulatömeget önkényesen 1 000 dalton alattiként definiálták. Az Mn számátlag molekulatömeg és az Mw tömegátlag molekulatömeg a következő egyenletekkel lehet meghatározni: ahol Hi a detektorjel szintje az alapvonaltól Vi retenciós térfogatra Mi a polimerfrakció molekulatömege Vi retenciós térfogatnál, és n az adatpontok száma. A molekulatömeg eloszlásának szélességét, ami a rendszer diszperzitásának mértéke, az Mw/Mn arány adja meg. 1. 3. Referenciaanyagok Kalibrációt kell készíteni, mert a GPC relatív módszer. Keskeny eloszlású, lineárisan felépített, ismert Mn és Mw átlagos molekulatömegű, és ismert molekulatömeg eloszlású polisztirol standardokat használnak e cél- ra. Az ismeretlen minta molekulatömegének meghatározására a kalibrációs görbe csak akkor használható, amennyiben a minta és a standardok elválasztásának körülményei azonos módon lettek kiválasztva. 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 287 A molekulatömeg és az elúciós térfogat között meghatározott kapcsolat csak az adott kísérlet sajátos körül- ményei között érvényes. A körülmények magukban foglalják mindenek felett a hőmérsékletet, az oldószert (vagy oldószerkeveréket), a kromatográfiás feltételeket és az elválasztó oszlopot vagy oszlopokat. A minta így meghatározott molekulatömegei relatív értékek és „polisztirol ekvivalens molekulatömeg”-ként írták le őket. Ez azt jelenti, hogy a minta és a standard szerkezeti és kémiai különbségeitől függően a mole- kulatömegek kisebb-nagyobb mértékben eltérhetnek az abszolút értéktől. Amennyiben más standardokat használtak, pl. polietilén-glikol, polietilén-oxid, polimetil-metakrilát, poliakrilsav, azt meg kell indokolni. 1. 4. A vizsgálati módszer elve A minta molekulatömeg-eloszlása és az átlagos molekulatömegek (Mn, Mw) GPC-vel meghatározhatók. A GPC a folyékony kromatográfia speciális típusa, aminél a minta az egyes alkotók hidrodinamikai térfogata szerint választódik el (2). Az elválasztás a minta porózus anyaggal, tipikusan szerves géllel töltött oszlopon való áthaladásakor való- sul meg. Kis molekulák be tudnak hatolni a pórusokba, a nagy molekulák nem. A nagy molekulák útja ezért rövidebb, és elsőként eluálódnak. A közepes méretű molekulák a pórusok egy részébe behatolnak, és később eluálódnak. A legkisebb, a gél pórusainál kisebb átlagos hidrodinamikai sugarú molekulák minden pórusba be tudnak hatolni. Ezek eluálódnak utoljára. Ideális helyzetben az elválasztást teljesen a molekulafajták mérete szabja meg, de a gyakorlatban nehéz elke- rülni valamely abszorpciós hatás közrehatását. A nem egyenletes oszlopfeltöltés és a holt térfogat ronthatja a helyzetet (2). A detektálás megvalósul pl. a törésmutatóval vagy az UV-elnyeléssel, és egyszerű eloszlási görbét eredmé- nyez. Azonban ahhoz, hogy a tényleges molekulatömeg-értékeket a görbéhez lehessen rendelni, az oszlo- pot kalibrálni kell ismert molekulatömegű és ideális esetben nagyjából hasonló szerkezetű polimerek, pl. különböző polisztirol standardok futtatásával. Tipikusan Gauss-görbe kapható, néha a kis molekulatömeg oldalán kis farokkal eltorzítva, a függőleges tengely a különböző eluált molekulafajták tömeg szerinti mennyiségét mutatja, a vízszintes tengely a molekulatömeg logaritmusát. A kis molekulatömeg tartalmat ebből a görbéből származtatjuk. A számítás csak akkor lehet pontos, amennyiben az alacsony molekulatömegű fajták a polimerre, mint egészre ekvivalensen, tömeg szerinti ala- pon hatnak vissza. 1. 5. Minőségi követelmények Az elúciós térfogat reprodukálhatósága (relatív standard deviáció, RSD) 0,3 %-nál jobb kell, hogy legyen. Az analízis megkövetelt reprodukálhatóságát belső standarddal való korrekcióval kell biztosítani, amennyiben a kromatogramot az idő függvényében értékelik ki, és nem felel meg a fent említett követel- ménynek (1). A polidiszperzitás függ a standardok molekulatömegétől. Polisztirol standardoknál a tipikus értékek: Mp < 2 000 2 000 ≤ Mp ≤ 106 Mp > 106 Mw/Mn < 1,20 Mw/Mn < 1,05 Mw/Mn < 1,20 (Mp a standard molekulatömege a csúcsmaximumnál) 1. 6. A vizsgálati módszer leírása 1. 6. 1. A standard polisztirol oldatok készítése A polisztirol standardokat óvatosan keverve oldják fel a választott eluensben. A gyártó ajánlásait számí- tásba kell venni az oldatok készítésénél. 288 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet A választott standardok koncentrációja különböző faktoroktól függ, pl. injektált térfogat, az oldat viszko- zitása, és az elemző detektor érzékenysége. A túltöltés elkerülése érdekében a maximális injektált térfogatot az oszlop hosszához kell igazítani. 30 cm × 7,8 mm-es oszlopú GPC-vel történő analitikai elválasztásoknál a jellemző injektált térfogat rendesen 40 és 100 μl között van. Nagyobb térfogat is elképzelhető, de nem lépheti túl a 250 μl-t. Az oszlop aktuális kalibrációja előtt meg kell határozni az injektált térfogat és a kon- centráció optimális arányát. 1. 6. 2. A mintaoldat készítése Elvben a mintaoldatok elkészítésére is ugyanezek a követelmények érvényesek. A mintát megfelelő oldó- szerben, pl. tetrahidrofurán (THF), óvatos rázással oldják fel. Semmilyen körülmények között sem szabad ultrahangos fürdőben feloldani. Amennyiben szükséges, az oldat tisztítható 0,2-2 μm-es pórusméretű membránszűrővel. A feloldatlan részecskék jelenlétét, amik nagy molekulatömegű fajták miatt fordulhatnak elő, fel kell jegyezni a végleges jegyzőkönyvben. A feloldott részecskék tömegszázalékának meghatározására megfe- lelő módszert kell alkalmazni. Az oldatot 24 órán belül fel kell használni. 1. 6. 3. A szennyező anyag- és adalékanyagtartalom korrekciója Rendszerint szükséges az M < 1 000 fajta tartalmának korrekciója a nem polimer fajtájú jelen lévő kom- ponensek (pl. szennyezőanyagok, és/vagy adalékanyagok) járulékára, kivéve, ha a mért tartalom már < 1 %. Ezt a polimer oldat, vagy a GPC eluátum közvetlen analízisével érik el. Amennyiben az oszlopon való áthaladás után az eluátum túl híg a további analízishez, töményíteni kell. Szükséges lehet az eluátum beszáradásig való párologtatása és újraoldása. Az eluátum töményítésének olyan körülmények között kell történnie, amelyek biztosítják, hogy az eluátumban nem történik változás. A GPC lépés utáni eluátumkezelés függ a mennyiségi meghatározás használt analítikus módszerétől. 1. 6. 4. Készülék A GPC készülék a következő komponensekből áll: – oldószer tartály, – gáztalanító (szükség szerint), – pumpa, – – – – – – rezgéscsillapító (szükség szerint), injektáló rendszer, kromatográfiás oszlopok, detektor, áramlásmérő (szükség szerint), adatrögzítő, -feldolgozó, – hulladéktároló. Biztosítani kell, hogy a GPC rendszer inert legyen a használt oldószerekkel szemben (pl. THF oldószernél acél kapillárisok használata). 1. 6. 5. Injektáló és oldószerszállító rendszer A minta oldatának meghatározott térfogatát automata adagolóval, vagy kézzel töltik az oszlopra egy pon- tosan meghatározott zónába. Amennyiben kézzel végzik, a fecskendő dugattyújának túl gyors benyomása vagy kihúzása a megfigyelt molekulatömeg-eloszlásban változásokat okozhat. Az oldószert szállító rend- szernek, amennyire csak lehet, lüktetésmentesnek kell lenni, ideálisan rezgéscsillapítót magában foglalva. Az áramlási sebesség 1 ml/perc nagyságrendű. 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 289 1. 6. 6. Oszlop A mintától függően a polimert egy egyszerű, vagy több, sorba kötött oszlopot használva jellemeznek. Szá- mos meghatározott tulajdonságokkal (pl. pórusméret, kizárási határérték) rendelkező porózus oszlopanyag elérhető a kereskedelemben. Az elválasztó gél vagy az oszlophossz megválasztása a minta tulajdonságaitól (pl. hidrodinamikai térfogatok, molekulatömeg-eloszlás) és az elválasztás sajátos körülményeitől, pl. oldó- szer, hőmérséklet és áramlási sebesség, is függ (1) (2) (3). 1. 6. 7. Elméleti tányérszám Az elválasztásra használt oszlopot vagy oszlopkombinációt az elméleti tányérszámmal kell jellemezni. A THF eluáló oldószer esetében ez magában foglalja Etil-benzol, vagy más megfelelő nem poláris oldat töl- tését ismert hosszúságú oszlopra. Az elméleti tányérszámot a következő egyenlet adja meg: W1/2)2 N = 5. 54( Ve W)2 , vagy N = 16(Ve ahol N Ve az elméleti tányérszám az elúciós térfogat a csúcsmaximumnál W az alapvonal csúcsszélesség W1/2 a csúcsszélesség félmagasságnál. 1. 6. 8. Az elválasztás hatékonysága Az elméleti tányérszámon kívül, ami a sávszélességet meghatározó mennyiség, az elválasztás hatékonysá- gának is van szerepe, amit a kalibrációs görbe meredeksége határoz meg. Egy oszlop elválasztási hatékony- ságát a következő kapcsolat adja meg: V – V e,M x e,(10M x) Az oszlop keresztmet szetének t erülete 3 2] ≥ 6,0[cm cm ahol Ve, Mx az Mx molekulatömegű polisztirol elúciós térfogata Ve, (10 Mx) a 10-szer nagyobb molekulatömegű polisztirol elúciós térfogata. A rendszer felbontása általában így definiált: R1,2 = 2× We1–Ve2 W1+W2 × 1 Log10(M2/M1) ahol Ve1, Ve2 két polisztirol standard elúciós térfogata a csúcsmaximumnál W1, W2 az alapvonal csúcsszélességei M1, M2 a molekulatömegek a csúcsmaximumnál (10-es faktorral térjenek el). Az oszloprendszerre az R-értéknek nagyobbnak kell lennie mint 1,7 (4). 1. 6. 9. Oldószerek Minden oldószernek nagy tisztaságúnak kell lennie (THF-ből 99,5 %-os tisztaságút használnak). Az oldó- szertartálynak (inertgáz-atmoszférában, amennyiben szükséges) elég nagynak kell lenni az oszlop kalibrá- lásához és néhány mintaanalízishez. Az oldószert gáztalanítani kell, mielőtt a pumpával az oszlopra jut- tatják. 290 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 1. 6. 10. Hőmérsékletszabályozás A kritikus belső komponensek (injektáló hurok, oszlopok, detektor, csövezés) hőmérsékletét állandó és az oldószerválasztásnak megfelelő értéken kell tartani. 1. 6. 11. Detektor A detektor célja az oszlopról eluált minta koncentrációjának mennyiségi rögzítése. A csúcsok szükségtelen szélesedésének elkerülésére a detektorcella küvettatérfogatának a lehető legkisebbnek kell lenni. Nem lehet nagyobb 10 μl-nél, kivéve a fényszórási és viszkozitás detektoroknál. A detektálásra differenciális törésmu- tató mérést szokás használni. Azonban, ha a minta vagy az elúciós oldószer sajátos tulajdonságai megkö- vetelik, más detektortípusok is használhatók, pl. UV/látható fény, IR, viszkozitás detektor stb. 2. ADATOK ÉS JELENTÉS 2. 1. Adatok A DIN szabványra (1) kell hivatkozni a részletes értékelési követelménynél éppúgy, mint az adatgyűjtéssel és -feldolgozással kapcsolatos követelményeknél. Minden mintánál két független kísérletet kell végezni. Külön-külön kell azokat elemezni. Minden esetben elengedhetetlen a mintával azonos körülmények között kezelt vakpróbákból származó adatokat is megha- tározni. Fontos egyértelműen jelezni, hogy a mért értékek a használt standard molekulatömegével ekvivalens relatív értékek. A retenciós térfogatok, vagy a retenciós idők (lehetőleg belső standardot használva korrigáltak) meghatá- rozása után a log Mp értékek (Mp a kalibráló standard csúcsmaximuma) lesznek ábrázolva egyikük függvé- nyében. Molekulatömeg-dekádonként legalább két kalibrációs pont szükséges, és legalább öt mérési pont kell a teljes görbéhez, aminek le kell fedni a minta becsült molekulatömegét. A kalibrációs görbe kis mole- kulatömegű végpontját n – hexil-benzol, vagy más megfelelő nem poláris oldott anyag definiálja. A görbé- nek az 1 000 – nél kisebb molekulatömegeknek megfelelő részét a szennyező és adalékanyagoknak meg- felelően határozták meg és korrigálták. Az elúciós görbéket általában elektronikus adatfeldolgozás útján értékelik ki. A kézi digitalizálás esetében az ASTM D 3536-91 használható (3). Amennyiben az oszlopon visszamaradt bármilyen nem oldható polimer, molekulatömege valószínűleg nagyobb az oldható frakcióénál, és amennyiben ezt figyelmen kívül hagyják, az az alacsony molekulatömeg- tartalom túlbecsülését eredményezi. A kis molekulatömeg-tartalmú nem oldható polimer korrekciójára vonatkozó útmutatás a mellékletben található. Az eloszlási görbét táblázat vagy ábra (differenciális frekvencia, vagy összegszázalék a log M függvényében) formájában kell megadni. Grafikus ábrázolásnál egy molekulatömeg-dekádnak általában kb. 4 cm széles- nek kell lenni, a csúcsmaximumnak pedig kb. 8 cm magasnak kell lenni. Integrális eloszlási görbék eseté- ben az ordinátában a különbségnek 0 és 100 % között kb. 10 cm-esnek kell lenni. 2. 2. Vizsgálati jelentés A vizsgálati jelentésnek az alábbi információkat kell tartalmaznia: 2. 2. 1. Vizsgált anyag – – elérhető információk a vizsgált anyagról (azonosság, adalékanyagok, szennyezőanyagok), a mintakezelés, megfigyelések, problémák leírása. 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 291 2. 2. 2. Műszerezettség – eluens tartály, inert gáz, az eluens gáztalanítása, az eluens összetétele, szennyezők, – pumpa, rezgéscsillapító, injektáló rendszer, – – elválasztó oszlopok (a gyártó, az oszlop jellemzőiről minden információ, mint pórusméret, az elvá- lasztó anyag fajtája stb. , a használt oszlopok száma, hossza, és elrendezése), az oszlop (vagy oszlopkombináció) elméleti tányérszáma, elválasztás hatékonysága (a rendszer felbon- tása), – információ a csúcsok szimmetriájáról, – oszlophőmérséklet, hőmérséklet-szabályozás módja, – – – detektor (mérési elv, típus, küvettatérfogat), áramlásmérő, amennyiben használva lett (gyártó, mérési elv), adatrögzítő és -feldolgozó rendszer (hardver és szoftver). 2. 2. 3. A rendszer kalibrálása – – – – a kalibrációs görbék megalkotásához használt módszer részletes leírása, információk a módszer minőségi követelményeiről (pl. korrelációs együttható, eltérés négyzetösszege stb. ), információk minden, a kísérleti eljárás és az adatok kiértékelése és feldolgozása során alkalmazott ext- rapolációról, feltételezésről és közelítésről, a kalibrációs görbék megalkotásához használt minden mérést dokumentálni kell egy táblázatban, amely minden kalibrációs pont esetében az alábbiakat tartalmazza: – – – – – – – – a minta neve, a minta gyártója, az Mp, Mn, Mw, és Mw/Mn, standardok jellemző értékei, ahogy azokat a gyártó rendelkezésre bocsá- totta, vagy az azt követő mérésekből következnek, a meghatározási módszer részleteivel együtt, injektálási térfogat és koncentráció, a kalibrációhoz használt Mp érték, a csúcsmaximumoknál mért elúciós térfogat, vagy korrigált retenciós idő, a csúcsmaximumnál számított Mp, a számított Mp és a kalibrációs érték százalékos hibája. 2. 2. 4. Információ a kis molekulatömegű polimer tartalomról – – – az analízishez használt módszerek és a kísérletek kivitelezési módjának leírása, információ a teljes mintára vonatkozó kis molekulatömegű frakciók százalékos (w/w) tartalmáról, információ a teljes mintára vonatkozó szennyező-, adalékanyagokról, és más nem polimer frakcióról, tömegszázalékban kifejezve. 2. 2. 5. Kiértékelés: – – – – időn alapuló kiértékelés: a megkövetelt reprodukálhatóság biztosítására használt módszerek (korrek- ciós módszer, belső standard stb. ), információ arról, hogy a kiértékelés az elúciós térfogat, vagy a retenciós idő alapján történt, információ a kiértékelés korlátairól, amennyiben nem elemeztek egy csúcsot teljesen, a kiegyenlítési módszerek leírása, amennyiben használva lettek, 292 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet – minta-előállítási és minta-előkezelési eljárások, – – – – – – feloldatlan részecskék jelenléte, amennyiben voltak, injektálási térfogat (μl) és injektálási koncentráció (mg/ml), az ideális GPC profiltól való eltéréshez vezető hatásokat jelző megfigyelések, a vizsgálati eljárások minden módosításának részletes leírása, a hibatartományok részletei, az eredmények értelmezésre vonatkozó bármely egyéb információ és megfigyelés. 3. IRODALOMJEGYZÉK (1) DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutions- mittel, 1. rész. (2) Yau, W. W. , Kirkland, J. J. , and Bly, D. D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons. (3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. (4) ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 293 Útmutató a kis molekulatömeg-tartalom korrekciójához a nem oldható polimerfrakciók vonatkozásában Melléklet Amennyiben nem oldható polimer van jelen a mintában, tömegveszteséget okoz a GPC analízis során. A nem old- ható polimer irreverzibilisen visszamarad az oszlopon vagy a mintaszűrőn, míg a minta oldható része áthalad az osz- lopon. Amennyiben a polimer törésmutató növekedése (dn/dc) megbecsülhető vagy mérhető, meg lehet becsülni a minta tömegvesztését az oszlopon. Ekkor az ismert koncentrációjú standard anyagokkal való külső kalibrálás és a dn/dc használatával korrekciót alkalmaznak a refraktométer válaszának kalibrálására. Az alábbi példában poli(metil- metakrilát) (pMMA) standardot használtak. Az akril polimerek analízisénél a külső kalibráció során ismert koncentrációjú tetrahidrofuránban oldott pMMA stan- dardot analizálnak GPC-vel, és a kapott adatok használhatók a refraktométer-állandó megállapításához, a következő egyenlet szerint: K = R/(C × V × dn/dc) ahol K R C V dn/dc a törésmutató növekedése pMMA-ra tetrahidrofuránban (ml/mg-ban). a refraktométer-állandó (mikrovoltszekundum/ml-ben) a pMMA standard válasza (mikrovoltszekundumban) a pMMA standard koncentrációja (mg/ml-ben) az injektált térfogat (ml-ben) és A következő adatok tipikusak a pMMA standardra: R C = 2 937 891 = 1,07 mg/ml = 0,1 ml V dn/dc = 9 × 10-5 ml/mg. Az eredményül kapott K értéket (3,05 × 1011) ezután az elméleti detektorválasz kiszámítására lehet használni, amennyiben az injektált polimer 100 %-a eluálódótt a detektoron. 294 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet III. C. MELLÉKLET A. 20. POLIMEREK OLDÓDÁS/EXTRAKCIÓ VISELKEDÉSE VÍZBEN 1. MÓDSZER A leírt módszer megfelel az OECD TG 120-nak (1997). Az alapelvek és további technikai információk az 1. hivatkozásban találhatók. 1. 1. Bevezetés Bizonyos polimereknél, pl. emulziós polimereknél, kezdeti előkészítő munkára lehet szükség, mielőtt az alább leírt módszert használni lehetne. A módszer nem alkalmazható folyékony polimerek és a vizsgálati körülmények között vízzel reagáló polimerek esetében. Amennyiben a módszer nem praktikus, vagy nem lehetséges, az oldódási/extrakciós viselkedés más mód- szerekkel is vizsgálható. Ilyen esetben meg kell adni a használt módszer minden részletét és igazolását. 1. 2. Referenciaanyagok Nincsenek. 1. 3. A vizsgálati módszer elve A polimerek vizes közegben való oldódási/extrakciós viselkedése lombik módszerrel (ld. A. 6 oldhatóság vízben, lombik módszer) határozható meg, az alább leírt módosításokkal. 1. 4. Minőségi követelmények Nincsenek. 1. 5. A vizsgálati módszer leírása 1. 5. 1. Berendezés A következő berendezés szükséges a módszerhez: – – aprító eszköz, pl. őrlőmalom ismert méretű részecskék előállítására, rázókészülék, hőmérséklet-szabályozási lehetőséggel, – membránszűrő-rendszer, – megfelelő analitikai berendezés, – standardizált szűrők. 1. 5. 2 Mintakészítés Egy reprezentatív mintát először 0,125 és 0,25 mm közötti részecske méretűre kell csökkenteni megfelelő szűrőket használva. A minta stabilitásához vagy az őrlési folyamatnál szükség lehet hűtésre. Gumiszerű anyagok folyékonynitrogén-hőmérsékleten apríthatók (1). Amennyiben a megkövetelt részecskeméret-frakció nem érhető el, a részecskeméretet annyira le kell csök- kenteni, amennyire csak lehetséges, és jegyzőkönyvezni kell az eredményt. A jegyzőkönyvben fel kell tün- tetni az aprított minta vizsgálat előtti tárolási módját. 1. 5. 3. Eljárás A vizsgált anyagból három 10 g-os mintát kell bemérni egyenként, három üvegdugós edénybe, és 1 000 ml vizet kell adni mindegyikhez. Amennyiben 10 g polimer kezelése kivihetetlen, a következő legnagyobb kezelhető mennyiséget kell használni, és a víz mennyiségét ehhez igazítani. 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 295 Az edényeket szorosan le kell zárni és 20 °C-on felrázni. Állandó hőmérsékleten működni képes rázó vagy keverő eszközt kell használni. 24 órás időtartam elteltével az edények tartalmát centrifugálni vagy szűrni kell, és a polimer koncentrációját a tiszta vizes fázisban megfelelő analitikai módszerrel meg kell határozni. Amennyiben a vizes fázishoz nincs megfelelő analitikai módszer, a teljes oldhatóság/extrahálhatóság megbecsülhető a szűrési maradék, vagy centrifugálási csapadék száraz tömegéből. Rendszerint szükség van egyrészt a szennyezőanyagok és az adalékanyagok, másrészt a kis molekulatö- megű fajták közti mennyiségi megkülönböztetésre. Gravimetriás meghatározásnál vizsgált anyag haszná- lata nélküli vakpróba elvégzése is szükséges, hogy a kísérleti eljárásból származó maradékokkal is el lehes- sen számolni. A polimerek oldódási/extrakciós viselkedésének meghatározása vízben 37 °C-on 2-es és 9-es pH-nál, a 20 °C-on történő kísérlet leírása szerint végezhető. A pH értékek alkalmas pufferek vagy megfelelő savak és bázisok, mint sósav, ecetsav, analitikai tisztaságú nátrium-, vagy káliumhidroxid, vagy NH3 hozzáadá- sával állíthatók be. A használt analitikai módszertől függően egy vagy két vizsgálatot kell elvégezni. Amennyiben a vizes fázis polimertartalmának közvetlen analízisére megfelelő sajátos módszerek állnak rendelkezésre, egy, a fent leír- tak szerinti vizsgálatnak kielégítőnek kell lenni. Amennyiben ilyen módszerek nem állnak rendelkezésre és a polimer oldódási/extrakciós viselkedésének meghatározása csak a vizes extraktum teljes szervesszén- tartalmának (TOC) meghatározásával végzett közvetett analízisre korlátozott, még egy további vizsgálatot kell elvégezni. Ezt a további vizsgálatot is háromszor kell elvégezni, 10-szer kisebb polimermintákkal és az első vizsgálatban használttal azonos vízmennyiséggel. 1. 5. 4. Analízis 1. 5. 4. 1. Eg y m i n t a m é r e t t e l v é g z e t t v i z s g á l a t A vizes fázisú polimer komponenseinek közvetlen analízisére módszerek állhatnak rendelkezésre. Alter- natív lehetőségként megfontolható az oldott/extrahált polimerkomponensek közvetett analízise a teljes oldhatórész-tartalom meghatározásával és a nem polimerspecifikus komponensekre vonatkozó korrekci- óval. A vizes fázis analízise az összes polimerfajta esetében lehetséges: vagy elegendően érzékeny módszerrel, pl. – TOC, CO2-ot fejlesztő perszulfát vagy dikromát feltárással, amit IR-rel, vagy kémiai analízissel történő becslés követ, – atomabszorpciós spektrometria (AAS), vagy induktív csatolású plazmaemissziós (ICP) ekvivalense szi- lícium, vagy fémtartalmú polimereknél, – UV abszorpció vagy spektrofluorimetria aril polimereknél, – LC-MS alacsony molekulatömegű mintáknál, vagy a vizes extraktum száradásig történő vákuumpárologtatásával és a maradék spektroszkópiás (IR, UV, stb. ) vagy AAS/ICP analízisével. Amennyiben a vizes fázis ily módon történő analízise nem kivitelezhető, a vizes kivonatot vízzel nem vegyíthető szerves oldószerrel, pl. klórozott szénhidrogénnel kell extrahálni. Az oldószert ezután el kell párologtatni, és a maradékot a fentiek szerint, a megadott polimertartalomnak megfelelően kell analizálni. Bármilyen szennyezőként vagy adalékként azonosított komponenst ebben a maradékban le kell vonni a polimerre magára jellemző oldódási/extrakciós fok meghatározásának céljából. Amennyiben ezen anyagok viszonylag nagy mennyisége vannak jelen, szükséges lehet a maradékot pél- dául HPLC vagy GC analízisnek alávetni annak érdekében, hogy megkülönbözethetők legyenek a szennye- zők a jelen lévő monomer és monomerszármazék-fajtáktól, és így az utóbbiak valódi tartalma meghatá- rozható legyen. Néhány esetben elegendő lehet a szerves oldószer egyszerű száradásig történő elpárologtatása és a száraz maradék lemérése. 296 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 1. 5. 4. 2. Ké t külö n b ö z ő m i n t a m é r e t t e l vé g z e t t v i z s g á l a t Minden vizes extraktum TOC-ra nézve analizált. A minta nem oldódott/nem extrahált részén gravimetriás meghatározást végeznek. Amennyiben az egyes edények tartalmának centrifugálása vagy szűrése után polimer maradékok maradnak az edény falához tapadva, az edényt a szűrlettel kell öblíteni, amíg az edény megtisztul minden látható maradéktól. Ezt köve- tően a szűrletet újra centrifugálják, vagy szűrik. A szűrőn, vagy a centrifugacsőben maradó maradékok 40 °C-on vákuumban szárítják és lemérik. A szárítást állandó tömeg eléréséig kell folytatni. 2. ADATOK 2. 1. Egy mintamérettel végzett vizsgálat Mind a három lombik eredményeit és az átlagértékeket is meg kell adni, és tömeg per az oldat térfogatban (tipikusan mg/l), vagy tömeg per polimerminta-tömegben (tipikusan mg/g) kell kifejezni. Továbbá a minta tömegvesztését (számítása: az oldott anyag tömege osztva a kiindulási minta tömegével) is meg kell adni. Ki kell számolni a relatív standard deviációkat (RSD). Egyedi számokat kell megadni a teljes anyagra (po- limer + alapvető adalékok, stb. ) és csak a polimerre (azaz az ilyen adalékok levonása után). 2. 2. Két különböző mintamérettel végzett vizsgálat Meg kell adni a két három párhuzamossal végzett kísérlet vizes extraktumainak egyedi TOC értékeit és vala- mennyi kísérlet átlagértékét, tömeg per az oldat térfogata (tipikusan mgC/l) és tömeg per kiindulási min- tatömeg (tipikusan mgC/g) egységekben is kifejezve. Amennyiben nincs különbség a nagy és kis minta/víz arány eredményeiben, ez azt jelezheti, hogy vala- mennyi extrahálható komponens tényleg extrahálva lett. Ebben az esetben a közvetlen analízis általában nem szükséges. A maradékok egyedi tömegeit meg kell adni és a minták kiindulási tömegének százalékában kell kifejezni. Átlagokat kísérletenként kell számolni. A 100 és a talált százalék különbsége az eredeti mintában lévő old- ható és extrahálható anyag százalékát képviseli. 3. JELENTÉS 3. 1. Vizsgálati jelentés A vizsgálati jelentésben az alábbi információkat kell tartalmazni: 3. 1. 1. Vizsgált anyag – a vizsgált anyagról rendelkezésre álló információk (azonosság, adalékok, szennyezők, alacsony mole- kulatömegű fajok tartalma). 3. 1. 2. Kísérleti körülmények – – a használt eljárások és kísérleti körülmények leírása, az analitikai és detektálási módszerek leírása. 3. 1. 3. Eredmények – oldhatósági/extrahálhatósági eredmények mg/l-ben; a különböző oldatokbeli extrakciós tesztek egyedi és átlagértékei, polimertartalom és szennyezőanyagok, adalékanyagok stb. szerint bontva, – oldhatósági/extrahálhatósági eredmények mg/polimer g-ban, – a vizes extraktumok TOC értékei, az oldott anyag tömege és a számolt százalékok, amennyiben mérik, 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 297 – – – – az egyes minták pH-ja, információ a vakpróba értékekről, irodalmi hivatkozások a vizsgált anyag kémiai instabilitásról a vizsgálati és az analitikai eljárás alatt, amennyiben szükséges, valamennyi, az eredmények értelmezéséhez fontos információ. 4. IRODALOMJEGYZÉK (1) DIN 5377 (1976) Zerkleinerung von Kunstofferzeugnissen für Prüfzwecke. 298 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet III. D. MELLÉKLET C. 13. BIOKONCENTRÁCIÓ VIZSGÁLATA: ÁTFOLYÁSOS HALVIZSGÁLAT 1. MÓDSZER Ez a biokoncentrációs módszer megfelel az OECD TG 305-nek (1996). 1. 1. Bevezetés Ez a módszer a különböző anyagoknak a halakban található, átfolyásos körülmények közötti biokoncent- rációs potenciáljának jellemzésére szolgáló eljárást ír le. Bár az átfolyásos vizsgálatot előnyben kell része- síteni, félstatikus rendszerek is megengedhetők, feltéve, hogy az érvényességi követelményeknek megfelel. A módszer elegendő részlettel szolgál a vizsgálat kivitelezéséhez, miközben kellő szabadságot enged a kísér- let kialakításának adaptálására az egyes laboratóriumok körülményeihez és a vizsgálati anyagok változó jel- lemzőihez. A módszer leghatékonyabban 1,5-6,0 log Pow értékkel rendelkező stabil szerves vegyi anya- gokra alkalmazható (1), de még alkalmazható erőteljesen lipofil anyagokra (log Pow > 6,0). Az előre becsülhető biokoncentrációs tényező (BCF), amit néha KB – ként is jelölnek, az ilyen erősen lipofil anya- gokra feltehetően nagyobb lesz, mint a laboratóriumi kísérletekből várt állandósult biokoncentrációs tényező (BCFSS) értéke. A kb. 9,0-ig terjedő log Pow értékkel rendelkező szerves vegyi anyagok előre becsült biokoncentrációs tényezője Bintein és mtsai egyenletével kapható meg (2). A biokoncentrációs potenciált jellemző paraméterekhez tartozik a felvételi sebességi állandó (k1), a tisztulási sebességi állandó (k2) és a BCFSS. A radioaktívan jelzett vizsgálati anyagok megkönnyíthetik a víz- és halminták analízisét, és felhasználha- tók annak eldöntésére, hogy kell-e bomlástermék-azonosítást és -kvantifikálást végezni. Amennyiben vala- mennyi radioaktív maradékot megmérték (például égetéssel, vagy szövetfeloldással), a BCF a kiindulási vegyületen, bármely visszatartott metaboliton és az asszimilált szénen is alapul. Valamennyi radioaktív maradékon alapuló BCF-eket ezért nem lehet közvetlenül összehasonlítani csak a kiindulási vegyület sajá- tos kémiai analíziséből nyert BCF-fel. Radioaktív jelzési vizsgálatoknál kiürülési fázis alkalmazható a kiindulási vegyületre alapozott BCF meg- határozása céljából, és a fő metabolitok jellemezhetők, amennyiben szükségesnek minősül. Az anyagmetabolizmus-vizsgálatot a biokoncentráció vizsgálattal kombinálni is lehet a szövetekben levő maradékok analízise és azonosítása révén. 1. 2. Fogalommeghatározások és mértékegységek A biokoncentráció/bioakkumuláció a vizsgált anyag koncentrációjának növekedése egy szervezetben/en (meghatározott szöveteiben/n) a vizsgált anyagnak a környező közegben lévő koncentrációjához viszo- nyítva. A biokoncentrációs tényező (BCF, vagy KB) a vizsgált anyag halban/on, vagy meghatározott szöveteiben/n (Cf, μg/g [ppm]) lévő koncentrációja az akkumulációs vizsgálat felvételi fázisának bármely időpontjában és a vegyszer környező közegben lévő koncentrációjának hányadosa a (Cw, μg/ml [ppm]). Az állandósult biokoncentrációs tényező (BCFSS, vagy KB) nem változik jelentősen egy hosszabb időtartam során, amely alatt a vizsgált anyag koncentrációja állandó a környező közegben. Plató, vagy állandósult állapot látható a halban mért vizsgált anyag (Cf) időfüggő ábráján, amennyiben a görbe párhuzamos az időtengellyel, és Cf három egymást követő, legalább két nap különbséggel vett min- tában ± 20 %-on belül vannak az analízisek egymáshoz képest, és nincs számottevő különbség a három mintavételi periódus között. Összevont minták analízisénél legalább négy egymást követő analízis szük- séges. Olyan vizsgált anyagoknál, amelyek felvétele lassú, sokkal megfelelőbbek a hétnapos időközök. 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 299 A biokoncentrációs tényezőket, amelyeket kinetikus koncentrációs tényezőnek (BCFk) neveznek, közvetlenül a kinetikai sebességállandókból (k1/k2) számolják. Az oktanol-víz megoszlási együttható (Pow) a vegyi anyag n-oktanolban és vízben, egyensúlyban mért oldha- tóságának aránya (A. 8 módszer), Kow-vel is jelölik. A vegyi anyag vízi szervezetekbeli biokoncentrációs potenciálja jelzésére a Pow logaritmusát használják. Az expozíciós, vagy felvételi fázis az az időtartam, amíg a hal érintkezik a vizsgált anyaggal. A felvételi sebességi állandó (k1) a vizsgált anyag koncentrációjának – halban/on (vagy meghatározott szöveteiben/n) való – növekedési sebességét definiáló numerikus érték, az expozíciós idő alatt (k1 1/nap- ban van kifejezve). Az expozíció utáni, vagy tisztulási (ürülési) fázis a kísérleti halból (vagy meghatározott szövetéből) a vizsgált anyagot tartalmazó közegből az anyagot nem tartalmazó közegbe történő kiürülésének (vagy nettó ürü- lése) időtartama. A tisztulási (ürülési) sebességi állandó (k2) a vizsgált anyag koncentrációjának a halban (vagy meghatározott szöveteiben) való csökkenési sebességét definiáló numerikus érték, a kísérleti halnak a kísérleti anyagot tar- talmazó közegből az anyagot nem tartalmazó közegbe való áthelyezését követően (k2 1/nap-ban van kife- jezve). 1. 3. A vizsgálati módszer elve A vizsgálat két fázisból áll: az expozíciós (felvételi) és az expozíció utáni (tisztulási) fázisból. A felvételi fázis alatt az egy fajhoz tartozó halak különálló csoportjai a vizsgált anyag legalább két koncentrációjával érint- keznek. Ezután átkerülnek a vizsgált anyagot nem tartalmazó közegbe tisztulási fázisra. A tisztulási fázis mindig szükséges, kivéve, ha az anyag felvétele a felvételi fázis alatt elhanyagolható volt (pl. a BCF kisebb 10-nél). A vizsgált anyag koncentrációját a halban/on (vagy meghatározott szövetében/n) a vizsgálat mind- két fázisa alatt figyelemmel kísérik. A két kísérleti koncentráción túlmenően, a halak egy kontrollcsoport- ját azonos körülmények között tartják – leszámítva a vizsgált anyag hiányát – annak érdekében, hogy a biokoncentráció által okozott ártalmas hatások a megfelelő kontrollcsoporthoz legyenek viszonyíthatók, és meghatározható legyen a vizsgált anyag háttér-koncentrációja. A felvételi fázis 28 napig tart, kivéve, ha az egyensúly bizonyítottan már korábban beáll. A 3. melléklet egyenletével lehet következtetni a felvételi fázis hosszára és az állandósult állapot eléréséhez szükséges idő- re. A tisztulási periódus ezután a hal egy másik tiszta, ugyanolyan közeget, de vizsgált anyagot nem tar- talmazó edénybe való áthelyezésével kezdődik. Amennyiben lehetséges, a biokoncentrációs tényezőt lehe- tőleg az állandósult állapotban a halban (Cf) és vízben mért (Cw) koncentráció arányaként (BCFSS) is, továbbá a felvételi (k1) és tisztulási (k2) sebességi állandó arányával, elsőrendű kinetikát feltételezve, kine- tikai biokoncentrációs tényezőként (BCFk) kell kiszámítani. Amennyiben nyilvánvalóan nem elsőrendű a kinetika, összetettebb modelleket kell alkalmazni (5. melléklet). Amennyiben 28 nap alatt nem áll be az állandósult állapot, a felvételi fázist meg kell hosszabbítani az állan- dósult állapot eléréséig, vagy 60 napra, amelyik előbb következik be; ezután kezdődik a tisztulási fázis. A felvételi sebességi állandót, a tisztulási (ürülési) sebességi állandót (vagy állandókat, amennyiben össze- tettebb modellt alkalmaztak), a biokoncentrációs tényezőt, és amennyiben lehetséges, e paraméterek mind- egyike esetében a konfidenciahatárokat, a halban és a vízben mért vizsgáltanyag-koncentrációt legjobban leíró modell szerint számítják ki. A BCF a hal teljes nedves tömegének függvényeként van kifejezve. Különleges célokra azonban meghatá- rozott szövetek és szervek (pl. izom, máj) is használhatók, amennyiben a hal elég nagy, illetve ha a hal ehető (filé) és nem ehető (zsiger) részekre osztható. Mivel számos szerves anyagnál egyértelmű kapcsolat van a biokoncentrációs potenciál és a lipofilitás között, ezért ugyanilyen kapcsolat van a kísérleti hal lipidtar- talma és az ilyen anyagok megfigyelt biokoncentrációja között is. Ezért a nagy lipofilitású (azaz log Pow > 3) anyagokra kapott vizsgálati eredmények változatosságának e forrása csökkentéséhez a biokoncentrációt a teljes testtömegen kívül a lipidtartalom vonatkozásában is ki kell fejezni. 300 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet Amennyiben megvalósítható, a lipidtartalmat ugyanazon a biológiai anyagon kell meghatározni, mint amit a vizsgált anyag koncentrációjának meghatározására használtak. 1. 4. A vizsgált anyagra vonatkozó információk A biokoncentrációs vizsgálat elvégzése előtt a vizsgált anyagról az alábbi adatokra van szükség: a) oldhatóság vízben; b) oktanol-víz megoszlási együttható Pow (Kow-vel is jelölik, az A. 8-ban megadott HPLC módszerrel meg- határozva); c) hidrolízis; d) fototranszformáció vízben nap- vagy szimulált napsugárzásnál és a biokoncentrációs vizsgálatnál alkal- mazott sugárzási feltételek mellett e) felületi feszültség (azaz olyan anyagoknál, ahol Pow-t nem lehet meghatározni); f) gőznyomás; g) gyors biológiai lebonthatóság (adott esetben). További megkövetelt információ a vizsgálat során használt halfajokra kifejtett toxicitás, lehetőleg az aszimptotikus (azaz az időtől független) LC50. Legyen ismert pontosságú és érzékenységű analitikai mód- szer a vizsgált anyag kvantifikálására a vizsgált oldatokban és a biológiai anyagban, a mintakészítés és táro- lás részleteivel együtt. A vizsgált anyag vízben és halszövetekben érvényes analitikai kimutatási határának is ismertnek kell lenni. Amennyiben 14C-vel jelzett vizsgált anyagot használnak, ismerni kell a szennyező anyagokhoz tartozó százalékos radioaktivitást. 1. 5. A vizsgálat érvényessége Az alábbi feltételeknek kell teljesülniük a vizsgálat érvényességéhez: – – – – a hőmérsékletingadozás kisebb ± 2 °C-nál, az oldott oxigén koncentrációja nem eshet 60 %-os telítettség alá, a kamrákban a vizsgált anyag koncentrációját a felvételi fázisban mért értékek átlagának ± 20 %-án belül kell tartani, a vizsgálat végén a kontroll és a kezelt halak mortalitásának és egyéb káros hatásoknak/betegségeknek 10 %-nál kisebbnek kell lenni; amennyiben a vizsgálat több hétig vagy hónapig tart, a pusztulásnak, vagy más ártalmas hatásnak a halak mindkét csoportjában kisebbnek kell lenni havi 5 %-nál, és nem haladhatja meg a 30 %-ot összesen. 1. 6. Referenciavegyületek Az ismert biokoncentrációs potenciálú referenciavegyületek használata hasznos lehet a kísérleti eljárások ellenőrzése során, amennyiben elvárt. Bár meghatározott anyagok még nem ajánlhatók. 1. 7. A vizsgálati módszer leírása 1. 7. 1. Eszközök A vizsgálat során kerülni kell az olyan anyagok használatát, amelyek oldódhatnak, szorbeálódhatnak, vagy kimosódhatnak az eszközökből, és ártalmasak lehetnek a halakra. Szabványos, kémiailag inert anyagból készült, a töltési sebességnek megfelelő térfogatú négyszögletes vagy hengeres tartályok használhatók. A puha műanyag-csövek használatát minimalizálni kell. Teflon (R), rozsdamentes acél és/vagy üvegcsövek használata ajánlott. A tapasztalatok alapján szükséges lehet a nagy abszorpciós együtthatójú anyagok, mint szintetikus piretroidok esetében, szilanizált üveg használata. Ilyen esetekben a felszerelést használat után el kell dobni. 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 301 1. 7. 2. Víz A kísérletekhez általában természetes vizet kell használni, amely nem szennyezett, és állandó minőségű. A hígításra használt víz minőségének lehetővé kell tennie a választott halfajok túlélését az akklimatizációs és a kísérleti időszakok alatt anélkül, hogy bármilyen rendellenes külső megjelenés vagy viselkedés jelentkez- ne. Ideális esetben a vizsgált fajok bizonyítottan képesek túlélni, fejlődni és szaporodni a hígító vízben (pl. laboratóriumi tenyészetben, vagy életciklusra vonatkozó toxicitás vizsgálatnál). A vizet legalább a pH-val, keménységgel, valamennyi szilárd anyaggal, összes szerves szénnel, és lehetőleg ammónium-, nitrit tarta- lommal és alkalitással, és tengeri fajoknál sótartalommal is jellemezni kell. A halak optimális jólétéhez fon- tos paraméterek teljesen ismertek, de az 1. melléklet megadja számos paraméter esetében az ajánlott maxi- mális koncentrációt a vizsgált édes- és tengervízre. A kísérleti időszak alatt a víznek állandó minőségűnek kell lenni. A pH értékének 6,0 és 8,5 között kell lenni, de egy adott vizsgálat során ± 0, 5 pH egységnyi tartományon belül kell maradnia. Analízis céljából időközönként mintákat kell venni, annak érdekében, hogy a hígítóvíz ne befolyásolhassa hátrányosan a vizsgálati eredményeket (például a vizsgált anyag komplexálásával), vagy ne legyen káros hatással a halál- lomány állapotára. Nehézfémek (pl. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), főbb anionok és kationok (pl. Ca, Mg, Na, K, Cl, SO4), peszticidek (pl. összes szerves foszforvegyület és összes szerves klórpeszticidek), összes szerves szén és szuszpendált szilárd anyag meghatározását el kell végezni, például háromhavonta, amennyiben a hígítóvíz ismerten viszonylag állandó minőségű. Amennyiben legalább egy éven keresztül állandónak bizo- nyul a vízminőség, a vizsgálatot ritkábban és nagyobb időközönként is el lehet végezni (pl. minden hat hónapban). A hígítóvíz természetes részecske- és a teljes szervesszén-tartalmának (TOC) is a lehető legalacsonyabbnak kell lenni, hogy a vizsgált anyag ne abszorbeálódjon szerves anyagon, ami csökkenthetné a biológia elér- hetőségét (4). A maximális elfogadható érték 5 mg/l szemcsés anyagok esetében (szárazanyag 0,45 μm-es szűrőn nem jut át) és 2 mg/l az összes szerves szén esetében (ld. 1. melléklet). A vizet szűrni kell felhasz- nálás előtt, amennyiben szükséges. A kísérleti halaktól (ürülék) és a táplálékmaradékból származó szerves széntartalom járulékának a lehető legkisebbnek kell lenni a vízben. A vizsgálat során a kísérleti edényben a szerves szén koncentrációja nem haladhatja meg a vizsgált anyagból származó szerves szén koncentrá- cióját és, amennyiben alkalmazták, az oldószer koncentrációját 10 mg/l-nél nagyobb mértékben (± 20 %). 1. 7. 3. Vizsgált oldat A vizsgált anyagból megfelelő koncentrációjú törzsoldat készül. A törzsoldatot célszerű a vizsgált anyag- nak egyszerűen a hígítóvízbe keverésével vagy összerázással elkészíteni. Az oldószerek vagy diszpergáló- szerek (oldódást segítő szerek) használata nem ajánlott; néhány esetben azonban alkalmazhatók megfelelő töménységű törzsoldat készítése érdekében. A felhasználható oldószerek: etanol, metanol, etilén-glikol- metil-éter, etilénglikol-dimetil-éter, dimetil-formamid, és trietilén-glikol. A felhasználható diszpergálósze- rek: Cremophor RH40, Tween 80, metilcellulóz 0,01 % és HCO-40. Gondosan kell eljárni a biológiailag könnyen lebontható szerek használata esetén, mivel átfolyásos vizsgálatokban baktériumnövekedés révén problémát okozhatnak. A vizsgált anyag radioaktívan is jelölhető, és a legnagyobb tisztaságúnak kell lenni (pl. lehetőleg > 98 %). Átfolyásos vizsgálatokban a vizsgált anyag törzsoldatát folyamatosan adagoló és hígító rendszerre (pl. állandó áramlási sebességet biztosító pumpa, szabályozható hígítórendszer, telítőrendszer) van szükség a kísérleti koncentrációk kísérleti kamrákba juttatásához. Az egyes tartályok esetében a napi öt térfogatcsere a megengedhető. Az átfolyásos mód részesül előnyben, amennyiben nem alkalmazható (pl. ha a vizsgált szervezetekre károsan hat), fél-statikus módszer használható, feltéve, hogy az érvényességi követelmények teljesülnek. A törzsoldatok és a hígítóvíz áramlási sebességét legalább naponta a vizsgálat előtt és után 48 órával ellenőrizni kell. Az ellenőrzés magában foglalja az áramlási sebesség meghatározását az egyes kísér- leti tartályokban, és biztosítja, hogy ne változzon 20 %-nál nagyobb mértékben sem az egyes kamrákban, sem azok között. 302 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 1. 7. 4. A fajok megválasztása A fajok megválasztásánál fontos követelmény, hogy könnyen és megfelelő méretben elérhetők, és a labo- ratóriumban kielégítő körülmények között tarthatók legyenek. A halfajok megválasztásának egyéb köve- telményei közé tartozik a fontosság rekreációs, kereskedelmi, ökológiai szempontból éppúgy, mint az összehasonlítható érzékenység, múltbeli sikeres használat stb. Az ajánlott fajok a 2. mellékletben találhatók. Más fajok is használhatók, de a kísérleti eljárást esetleg át kell dolgozni a megfelelő vizsgálati körülmények biztosításához. A fajok és a kísérleti módszer megválasz- tásának indoklását fel kell tüntetni a jelentésben. 1. 7. 5. A halak tartása Legalább két hétig a vizsgálat során alkalmazott hőmérsékletű vízben akklimatizálják a törzspopulációt, és kielégítő, a vizsgálat alatt használttal megegyező típusú étrenden tartják őket. 48 órás betelepítési időszak után a mortalitást jegyzőkönyvezni kell, és az alábbi követelményeket kell alkalmazni: – amennyiben a mortalitás a populáció 10 %-ánál nagyobb hét nap alatt: az egész halállományt ki kell cserélni, – mortalitás a populáció 5-10 %-a hét nap alatt: további hét napig kell akklimatizálni, – mortalitás a populáció 5 %-ánál kisebb hét nap alatt: a tételt kell elfogadni – ha a második hét nap alatt a mortalitás 5 %-nál több, az egész tételt ki kell selejtezni. Beteg és rendellenesen fejlődött halak nem használhatók a vizsgálathoz. Minden beteg haltól meg kell sza- badulni. A kísérletet megelőző két hétben és a kísérlet alatt a halak nem kaphatnak kezelést betegségre. 1. 8. A vizsgálat elvégzése 1. 8. 1. Elővizsgálat Hasznos lehet elővizsgálatokat végezni a vizsgálati körülmények optimalizására a döntő vizsgálathoz, pl. a vizsgált anyag koncentrációjának, a felvételi és tisztulási fázisok megválasztására. 1. 8. 2. Az expozíció körülményei 1. 8. 2. 1. A f e l v é t e l i f á z i s i d ő t a r t a m a A felvételi fázis időtartamának előrejelzése előzetes tapasztalatból (pl. előző vizsgálatból, vagy akkumulá- cióhoz kapcsolódó vegyi anyagból), vagy bizonyos, a vizsgált anyag vízben való oldhatósága, vagy oktanol/víz megoszlási együtthatója ismeretét felhasználó tapasztalati kapcsolatokból nyerhető (ld. 3. mel- léklet). A felvételi fázis 28 napig tart, kivéve, ha igazolható, hogy az egyensúly korábban beállt. Amennyiben az állandósult állapot nem áll be 28 nap alatt, a felvételi fázist ki kell terjeszteni további méréseket végezve, amíg az állandósult állapot beáll, vagy legfeljebb 60 napig. 1. 8. 2. 2. A t i s z t u l á s i f á z i s i d ő t a r t a m a A felvételi fázis időtartamának a fele rendszerint elég az anyag megfelelő (pl. 95 %-os) csökkenéséhez (ld. 3. mellékletet a becslés magyarázatához). Amennyiben a 95 %-os csökkenéshez szükséges idő aránytala- nul hosszú, meghaladja például a felvételi fázis hosszának kétszeresét (azaz több mint 56 nap), rövidebb időtartam is használható (azaz amíg a vizsgált anyag koncentrációja kisebb lesz az állandósult állapotú kon- centráció 10 %-ánál). Az elsőrendű kinetikát eredményező egyrekeszes hal-modellnél összetettebb felvételi és tisztulási fázissal rendelkező anyagoknál azonban az ürülési sebességi állandó meghatározására azon- ban hosszabb tisztulási fázis is megengedett. Az időtartamot azonban az a periódus szabhatja meg, ami után a halban a vizsgált anyag koncentrációja az analitikai detektálási határ fölött marad. 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 303 1. 8. 2. 3. A kí s é r l e t i h a l a k s z á m a A halak számát koncentrációnként úgy választják ki, hogy mintánként legalább négy hal álljon rendelke- zésre minden mintavételnél. Amennyiben komolyabb statisztikai számításokat akarunk végezni, mintán- ként több hal szükséges. Amennyiben kifejlett halakat használnak, rögzíteni kell, hogy hímeket és nőstényeket milyen arányban használnak a kísérletben. Amennyiben mindkét nemet használják, dokumentálni kell, hogy az expozíció kezdete előtt a két nem között a lipidtartalom különbsége jelentéktelen; szükséges lehet az összes hím és az összes nőstény hal egybegyűjtése. Mindegyik vizsgálatban hasonló tömegű halakat kell kiválasztani, a legkisebbek ne legyenek kisebbek a leg- nagyobb hal tömegének kétharmadánál. Ugyanabba a korcsoportba tartozzanak, és a származásuk is azo- nos legyen. Mivel a halak tömege és kora időnként jelentős hatással lehet a BCF értékekre (1), ezeket a rész- leteket pontosan rögzíteni kell. Ajánlott az átlagtömeg becslése érdekében a vizsgálat előtt a halpopuláció egy mintacsoportját lemérni. 1. 8. 2. 4. Fe l t ö l t é s A halak méretéhez viszonyítva nagy mennyiségű vizsgálati oldatot kell használni annak érdekében, hogy lehessen a vizsgálat kezdetén a halak hozzáadásával okozott Cw és az oldott oxigén minimalizálni koncentrációjának csökkenést. Fontos, hogy a feltöltési sebesség a használt kísérleti fajnak megfelelő legyen. Minden esetben 0,1-1,0 g hal (nedves tömeg) per liter víz per nap az ajánlott feltöltési sebesség. Akkor hasz- nálható nagy töltési sebesség, amennyiben igazolt, hogy a vizsgált anyag megkövetelt koncentrációja fenn- tartható ± 20 %-os határon belül, és hogy az oldott oxigén koncentrációja nem esik 60 %-os telítettség alá. A megfelelő feltöltési rendszerek kiválasztásánál a halfajok természetes életterét kell figyelembe venni. A fenéken élő halak például nagyobb alapterületű akváriumot igényelnek, mint a nyíltvízi halfajok. 1. 8. 2. 5. Tá pl á l á s Az akklimatizációs és kísérleti időszak alatt a halakat megfelelő, ismert lipid- és összfehérjetartalmú táp- lálékkal kell etetni, az egészségük megőrzéséhez és a testtömegük fenntartásához elegendő mennyiségben. A halak az akklimatizációs és kísérleti időszakban naponta kapnak enni, testtömegük körülbelül 1–2 %- ának megfelelő mennyiségben; ez a legtöbb halfaj esetén a lipidkoncentrációt viszonylag állandó szinten tartja a vizsgálat alatt. A táplálék mennyiségét újra kell számolni, például hetente egyszer, hogy egy állandó szinten legyen tartható a testtömeg és a lipidkoncentráció. Ennek kiszámításához az egyes tartályokban a halak tömege a tartályból legújabban vett halminta tömegéből becsülhető meg. A tartályban maradó halak nem mérhetők le. A kísérleti tartályból a maradék eledelt és az ürüléket az etetést követően (30 perc–1 óra) naponta szívó- csövön keresztül el kell távolítani. A vizsgálat alatt a tartályokat a lehető legtisztábban kell tartani, hogy a szervesanyag-koncentráció a lehető legkisebb legyen, mivel a szerves szén jelenléte korlátozhatja a vizsgált anyag biológiai elérhetőségét (1). Miután sok táplálék hallisztből származik, a táplálék vizsgáltanyag-tartalmát is vizsgálni kell. A táplálék peszticid- és nehézfémanalízise is kívánatos. 1. 8. 2. 6. Fé ny és hőm érsék l et A fényperiódus rendszerint 12-16 órás, és a fajok számára megfelelő hőmérsékletet (± 2 °C) kell biztosí- tani (ld. 2. melléklet). A megvilágítás típusának és jellemzőinek ismertnek kell lenni. Figyelmet kell fordí- tani a vizsgáltanyag – a vizsgálat besugárzási körülményei közötti – lehetséges fotoátalakulására. Megfelelő megvilágítást kell használni, hogy a fény hatására nem természetes bomlástermékek lehetőleg ne keletkez- zenek. Néhány esetben megfelelő lehet a 290 nm alatti UV sugárzást kiszűrő ernyő használata. 1. 8. 2. 7. Kí s é r l e t i k o n c e n t r á c i ó k Átfolyási körülmények között legalább két koncentrációt kell készíteni. Általában a nagyobb (vagy legma- gasabb) vizsgált anyag-koncentráció akut aszimptotikus LC50 értékének körülbelül 1 %-ánál és a használt analitikai módszerre vonatkozó vízben elérhető detektálási határnál legalább tízszer nagyobb legyen. 304 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet A legnagyobb kísérleti koncentráció az akut (96 órás)/krónikus LC50 aránnyal is megosztható legyen (né- hány vegyi anyag esetében a megfelelő arány 3-100 lehet). Amennyiben lehetséges, a többi koncentráci- ó(ka)t úgy kell megválasztani, hogy a fenti értéktől 10-es faktorral különbözzön. Amennyiben ez nem lehetséges az 1 %-os LC50 követelmény és az analitikai határ miatt, 10-nél kisebb faktor is használható, vagy fontolóra kell venni 14C-vel jelzett vizsgált anyag használatát. A vizsgált anyag oldhatósága feletti koncent- rációt nem szabad használni. Amennyiben szolubilizáló anyagot használnak, annak koncentrációja nem lehet nagyobb 0,1 ml/l-nél, és minden kísérleti tartályban azonosnak kell lennie. Ismerni kell, hogy mennyivel járul hozzá a kísérleti víz teljes szervesszén-tartalmához. Mindent meg kell tenni azonban az ilyen anyagok használatának elkerülése érdekében. 1. 8. 2. 8. Kontrollok A vizsgált sorozat mellett a hígítóvíz-kontrollt, és adott esetben, egy szolubilizálószert tartalmazó kont- rollt is be kell állítani, feltéve, hogy biztosított, hogy a szernek nincs hatása a halakra. Amennyiben ez nem áll fenn, mindkét kontrollt el kell végezni. 1. 8. 3. A vízminőség mérésének gyakorisága A vizsgálat során minden edényben mérni kell az oldott oxigént, TOC-t, pH-t és hőmérsékletet. A kont- rollokban és a nagyobb (vagy legnagyobb) koncentrációjú edényben mérni kell a teljes keménységet és (adott esetben) a sótartalmat. Az oldott oxigént és (adott esetben) a sótartalmat legalább háromszor kell mérni a felvételi periódusban – annak elején, közepén és a végén – és egyszer egy héten a tisztulási perió- dusban. TOC-t a vizsgálat kezdetén (a felvételi fázis előtt 24 és 48 órával) a halak bevitele előtt, és a felvé- teli és tisztulási fázis alatt pedig legalább hetente egyszer kell mérni. A hőmérsékletet naponta, pH-t a peri- ódusok kezdetén és végén, keménységet vizsgálatonként egyszer kell mérni. A hőmérsékletet ajánlott folyamatosan mérni, legalább egy edényben. 1. 8. 4. Hal- és vízmintavételezés és analízis 1. 8. 4. 1. Mi nt a v é t el e z é s i üt em t e r v A kísérleti tartályokból a vizsgált anyag koncentrációjának meghatározásához a halak bevitele előtt, vala- mint a felvételi és a tisztulási fázis alatt kell mintát venni. Vízmintát legalább a halmintával egy időben és etetés előtt kell venni. A felvételi fázis alatt meg kell határozni a vizsgált anyag koncentrációját az érvé- nyességi követelmények teljesülésének ellenőrzése céljából. A felvételi fázis alatt legalább ötször, a tisztulási fázis alatt legalább négyszer kell halmintát venni. Mivel egyes esetekben e mintaszámok alapján nehéz pontosan megbecsülni a BCF értékét, különösen, ha egy- szerű elsőrendűtől eltérő tisztulási kinetika mutatkozik, tanácsos mindkét periódusban gyakrabban mintát venni (ld. 4. melléklet). A külön minták tárolására és elemzésére csak akkor kerül sor, ha az elemzés első sorozata alkalmatlannak bizonyul a BCF kívánt pontosságú kiszámítására. Az elfogadható mintavételi ütemterv egy példája a 4. mellékletben található. Más feltételezett Pow értékkel más ütemtervet is gyorsan ki lehet dolgozni a 95 %-os felvétel expozíciós idejének kiszámolásával. A mintavételezést a felvételi fázisban addig kell folytatni, amíg az állandósult állapot beáll, vagy legfeljebb 28 napig. Amennyiben az állandósult állapot nem áll be 28 nap alatt, a mintavételezést addig kell foly- tatni, amíg beáll az állandósult állapot, de legfeljebb 60 napig. A tisztulási fázis megkezdése előtt a halak átkerülnek a tiszta tartályokba. 1. 8. 4. 2. Mi nt a vé t el e z é s és mi nt a k é s z í t é s Az analízishez a vízmintákat, például inert csövön keresztül, a kísérleti tartály középső pontjából veszik. Mivel a vizsgált anyag biológiailag nem elérhető részét a biológiailag elérhetőtől nem mindig lehet centri- fugálással vagy szűréssel elválasztani, (főleg erősen lipofil vegyszerek esetén, azaz log Pow > 5 vegyszerek- nél) (1) (5), a mintákon nem lehet ezen eljárásokat alkalmazni. 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 305 Ehelyett a tartályokat minél tisztábban kell tartani, és a teljes szervesszén-tartalmat a felvételi és tisztulási fázis alatt is figyelemmel kell kísérni. Minden mintavételezéskor megfelelő számú halat (általában legalább négyet) kell kivenni a kísérleti kam- rákból. A mintahalakat gyorsan le kell öblíteni vízzel, „szárazra” törölni, azonnal megölni a legmegfele- lőbb és humánus módszerrel, ezt követően lemérni. A lebomlás vagy egyéb veszteségek elkerülése érdekében a halakat és a vizet lehetőleg rögtön mintavéte- lezés után kell analizálni, és a vizsgálat előrehaladtával megközelítőleg ki kell számolni a felvételi és a tisz- tulási sebességet. Az azonnali analízis lehetővé teszi annak kiküszöbölését is, hogy egy platót késve ismer- jenek fel. Az azonnali analízis meghiúsulása esetén a mintákat megfelelő módszerrel tárolják. A vizsgálat kezdete előtt a különböző vizsgált anyagok tárolásának megfelelő módszeréről információkat kell szerezni – pél- dául mélyhűtés, 4 °C-on tartás, tárolás időhossza, extrakció stb. 1. 8. 4. 3. Az a nal iti ka i m ó ds z er minő sége mivel az egész eljárást alapvetően a vizsgált anyaghoz használt analitikai módszer pontossága és érzékeny- sége határozza meg, kísérlettel ellenőrizni kell a kémiai analízis pontosságát és reprodukálhatóságát, és a vizsgált anyag vízből és halakból való visszanyerését. Azt is ellenőrizni kell, hogy a vizsgált anyag ne legyen észlelhető a használt hígító vízben. Cw és Cf vizsgálatból kapott értékét korrigálni kell – szükség szerint – visszanyeréssel és a kontrollok hát- térértékével. A hal- és vízmintákkal végig úgy kell bánni, hogy minimális legyen a szennyezés és a (pl. a mintavevő eszköz adszorpciójából eredő) veszteség. 1. 8. 4. 4. Ha l m i nt a a n al í z i s e Amennyiben a vizsgálat során radioaktívan jelzett anyagokat használtak, mérhető az össz-radioaktivitás (a kiindulási vegyületét és metabolitokét együttesen), vagy a minták megtisztíthatók úgy, hogy a kiindulási vegyület külön analizálható legyen. A fő metabolitokat állandósult állapotban, vagy a felvételi fázis végén (amelyik előbb bekövetkezik) szintén lehet jellemezni. Amennyiben az összes mért radioaktívitás százalé- kában kifejezett BCF ≥ 1 000 %, tanácsos lehet, sőt bizonyos vegyszer-kategóriáknál, pl. peszticideknél erő- sen ajánlott, az állandósult állapotban a halszövetekben a teljes maradék 10 %-át meghaladó mennyiségű bomlástermékek azonosítása és kvantifikálása. Amennyiben a meghatározást elvégezték a halszövetben, el kell végezni a vízben is. A vizsgált anyag koncentrációját rendszerint meg kell határozni minden lemért halban. Amennyiben ez nem lehetséges, az egyes mintavételi alkalmakkor egyesíthetők a minták, de az összesítés korlátozza az ada- tokra alkalmazható statisztikai eljárások számát. Amennyiben a statisztikai eljárás megkívánja, akkor a kívánt egyesítési eljárást és az ehhez szükséges halak számát a vizsgálati módszerben rögzíteni kell (6) (7). BCF-et a teljes nedves tömeg függvényeként, és az erősen lipofil anyagok esetében a lipidtartalom függvé- nyeként is ki kell fejteni. A hal lipidtartalmát amennyiben lehetséges, minden mintavételi alkalommal meg kell határozni. A lipidtartalom meghatározására megfelelő módszereket kell alkalmazni (3. melléklet, 8. és 2. hivatkozás). Szabványmódszerként a kloroform/metanol extrakciós technika ajánlott (9). A különböző módszerek nem adnak azonos értékeket (10), ezért fontos megadni a használt módszer részleteit. Ameny- nyiben lehetséges, a lipid analízisét a vizsgált anyag analíziséhez készítettel azonos extraktumon kell elvé- gezni, mert a lipideket gyakran el kell távolítani az extraktumból, mielőtt kromatográfiásan elemezhetők lennének. A hal lipidtartalma (mg/kg nedves tömeg) a kísérlet végén nem térhet el a kezdeti értéktől ± 25 %- nál jobban. A szövet szárazanyag-tartalmát szintén rögzíteni kell, hogy a lipidkoncentráció átváltható legyen nedves állapotban mértről száraz állapotban mértre. 306 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 2. ADATOK 2. 1. Az eredmények kezelése A vizsgált anyag felvételi görbéje a felvételi fázisban a halban/on (vagy meghatározott szövetben/en) mért koncentrációt az idő függvényében, aritmetikus skálán ábrázolják. Amennyiben a görbe platót ér el, vagyis megközelítőleg párhuzamos az időtengellyel, az állandósult BCFSS a következő képlet alapján számolható: Cf állandósult állapotban (átlag) Cw állandósult állapotban (átlag) Amennyiben nem következett be az állandósult állapot, a BCFSS kielégítő pontossággal kiszámolható az „állandósult állapot” – ból, az egyensúly 80 %-ánál (1,6/k2) vagy 95 %-ánál (3,0/k2). A koncentrációs faktort (BCFk) is meghatározzák a két elsőrendű kinetikai állandó k1/k2 arányaként. A tisz- tulási sebességi állandó (k2) rendszerint a tisztulási görbéből határozható meg (azaz a halban a vizsgált anyag koncentrációjának csökkenése az idő függvényében). A felvételi sebességi állandó (k1) ezután kiszá- molható az adott k2 és a Cf egy, a felvételi görbéből levezetett értékéből (ld. 5. mellékletet is). A BCFk és a k1, k2 sebességi állandók kiszámításának megfelelő módszere a számítógéppel végzett nem lineáris para- méterbecslő módszer használata (11). Grafikus módszerek is használhatók k1 és k2 kiszámítására. Amennyiben a tisztulási görbe nyilvánvalóan nem elsőrendű, összetettebb modelleket kell használni (ld. a 3. melléklet hivatkozásait), és biostatisztikus tanácsát kell kikérni. 2. 2. Az eredmények értelmezése Amennyiben a vizsgált oldatok koncentrációi az analitikai módszer detektálási határához közeli szinten vannak, az eredményeket óvatosan kell értelmezni. Az egyértelműen definiált felvételi és tisztulási görbe megbízható biokoncentrációs adatokat jelez. A két kísérleti koncentrációnál a felvételi/tisztulási állandók ingadozásának 20 % alatt kell lenni. A két alkalma- zott kísérleti koncentráció felvételi/tisztulási sebességének jelentős különbségét rögzíteni kell, és meg kell adni rá a lehetséges magyarázatokat. A jól megtervezett vizsgálatokból kapott BCF-ek konfidenciahatára általában megközelíti a ± 20 %-ot. 3. JELENTÉS A kísérleti jelentésnek az alábbi információkat kell tartalmaznia: 3. 1. Vizsgált anyag – – – fizikai tulajdonság, és adott esetben, fizikai-kémiai tulajdonságok, kémiai jellemzők (a szervesszén-tartalmat is beleértve, amennyiben szükséges), amennyiben radioaktívan jelzett, a jelzett atom(ok) pontos helyzete, és a szennyezőkhöz kapcsolódó radioaktivitás százaléka. 3. 2. Vizsgált fajok – tudományos név, törzs, származás, bármilyen előkezelés, akklimatizálás, kor, mérettartomány stb. 3. 3. Vizsgálati körülmények – használt vizsgálati eljárás (pl. átfolyásos, vagy félsztatikus), – – a használt megvilágítás típusa és jellemzői, és időtartama, vizsgálat kialakítása (pl. a kísérleti tartályok száma és mérete, víztérfogat-csere sebessége, párhuzamos minták száma, halak száma mintánként, kísérleti koncentrációk száma, a felvételi és a tisztulási fázis hossza, hal- és vízminták mintavételi gyakorisága), 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 307 – – – – – – törzsoldatok előállításának módszere és a megújítás gyakorisága (amennyiben használták, meg kell adni a szolubilizálószert, koncentrációját és hogy a kísérleti víz szervesszén-tartalmához mennyiben járult hozzá), a névleges vizsgálati koncentrációk, a kísérleti edényben mért értékek átlaga és ezek standard deviáci- ója, és a kiszámítás módszere, a hígítóvíz eredete, bármely előkezelés leírása, minden olyan eredmény, amely igazolja, hogy a hígító- víz megfelel a kísérleti hal igényeinek, és a víz jellemzői: pH, keménység, hőmérséklet, oldottoxigén koncentrációja, maradék klór szintek (amennyiben mérték), összes szerves szén, szuszpendált szilárd anyagok, a vizsgált közeg sótartalma (amennyiben lehetséges), és bármilyen egyéb elvégzett mérés, vízminőség a kísérleti edényekben, pH, keménység, TOC, hőmérséklet és oldott oxigén koncentráció, a táplálásra vonatkozó részletes információk (például a táplálék fajtája, eredete, összetétele – legalább a lipid- és fehérjetartalom, amennyiben lehetséges, az etetések számát és az adott táplálék mennyisége), információk a hal- és vízminták kezeléséről, beleértve az előállítás részleteit, tárolást, extrakciót és ana- litikai eljárásokat (és pontosságot) a vizsgált anyag és lipidtartalom vonatkozásában (amennyiben mér- ték). 3. 4. Eredmények – minden elvégzett előzetes vizsgálat eredménye, – – – a kontrollhalak és az egyes expozíciós kamrákban lévő halak mortalitása, és bármely megfigyelt ren- dellenes viselkedés, a halak lipidkoncentrációja (amennyiben a kísérlet alkalmával meghatározták), a halakban a vizsgált vegyi anyag felvételét és tisztulását mutató görbék (minden mért adatot feltün- tetve), az állandósult állapotig eltelt idő, – Cf és Cw (standard deviációval és tartománnyal, adott esetben) minden mintavételi időpontra (Cf μg/g teljes nedves testtömeg, vagy meghatározott szövetei, pl. lipid tömegében (ppm) kifejezve, és Cw μg/ml- ben (ppm). A kontrollsorozat Cw értékei (a hátteret is rögzíteni kell), – – – az állandósult biokoncentrációs tényező (BCFSS) és/vagy kinetikus koncentrációs tényező (BCFk) és, adott esetben, a felvételi és tisztulási (ürülési) sebességi állandók 95 %-os konfidenciahatárai (valamen- nyit az állat teljes tömegére vagy meghatározott szöveteire, és amennyiben mérték, a teljes lipidtarta- lomra vonatkoztatva kell megadni), valamennyi használt kísérleti koncentrációnál a konfidenciahatá- rok és standard deviációk (ahogy megfelelőbb) és a számítás/adatelemzés módszerei, amennyiben radioaktívan jelzett anyagokat használtak, és amennyiben szükséges, bármely kimutatott metabolit akkumulációja bemutatható, bármi szokatlan dolog a vizsgálattal kapcsolatban, bármilyen eltérés ezektől az eljárásoktól, és bár- mely más vonatkozó információ. A „detektálási határon belül nem kimutatott” eredményeket előzetes vizsgálati módszer fejlesztéssel és kísérlettervezéssel kell minimalizálni, mert az ilyen eredmények nem használhatók sebességi állandók szá- molásához. 4. IRODALOMJEGYZÉK (1) Connell D. W. (1988). Bioaccumlation behaviour of persistent chemicals with aquatic organisms. Rev. Envi- ron. Contam. Toxicol. 102, pp. 117-156. (2) Bintein S. , Devillers J. and Karcher W. (1993). Non-linear dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water partition coefficient. SAR and QSAR in Environmental Research, 1, pp. 29-390. (3) OECD Paris (1996). Direct phototransformation of chemicals in water. Environmental Health and Safety Guidance Document Series on Testing and Assessment of Chemicals. No. 3. (4) Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of bioconcentration factors derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate organic matter to the bioavailability of che- micals. Water Quality Institute, Denmark. 308 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet (5) US EPA 822-R-94–002 (1994). Great Lake Water Quality Initiative Technical Support Document for the Procedure to Determine Bioaccumlation Factors. July 1994. (6) US FDA (Food and Drug Administration) Revision. Pesticide analytical manual, 1, 5600 Fisher’s Lane, Rockville, MD 20852, July 1975. (7) US EPA (1974). Section 5, A(1). Analysis of Human or Animal Adipose Tissue, in Analysis of Pesticide Residues in Human and Environmental Samples, Thompson, J. F. (ed. ) Research Triangle Park, N. C. 27711. (8) Compaan H. (1980) in „The determination of the possible effects of chemicals and wastes on the aqua- tic environment: degradation, toxicity, bioaccumulation”, Ch. 2. 3, Part II. Government Publishing Offi- ce, the Hague, Netherlands. (9) Gardner et al, (1995). Limn. & Oceanogr. 30, pp. 1099-1105. (10) Randall R. C. , Lee H. , Ozretich R. J. , Lake J. L. and Pruell R. J. (1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Envir. Toxicol. Chem. 10, pp. 1431-1436. (11) CEC, Bioconcentration of chemical substances in fish: the flo-through method- Ring Test Program- me, 1984 to 1985. Final Report March 1987. Authors: P. Kristensen and N. Nyholm. (12) ASTM E-1022–84 (reapproved 1988). Standard Practice for conducting Bioconcentration Tests with Fishes and Saltwater Bivalve Mollucsc. 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 309 1. melléklet Egy megfelelő hígító víz kémiai jellemzői Anyag Határkoncentráció 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Lebegő anyag Teljes szerves szén Nem ionizált ammónia Maradék klór Szerves foszfortartalmú peszticidek Szerves klórtartalmú peszticidek + poliklórozott bifenilek Összes szerves klór Alumínium Arzén Króm Kobalt Réz Vas Ólom Nikkel Cink Kadmium Higany Ezüst 5 mg/l 2 mg/l 1 μg/l 10 μg/l 50 ng/l 50 ng/l 25 ng/l 1 μg/l 1 μg/l 1 μg/l 1 μg/l 1 μg/l 1 μg/l 1 μg/l 1 μg/l 1 μg/l 100 ng/l 100 ng/l 100 ng/l 310 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 2. melléklet Vizsgálathoz ajánlott halfajok Ajánlott fajok Ajánlott kísérleti hőmérséklet- tartomány (°C) Kísérleti állat aján- lott teljes hossza (cm) 1 2 3 4 5 6 7 8 Danio rerio (1) (Teleostei, Cyprinidae) (Hamilton-Buchanan) Zeb- radánió 20–25 3,0 ± 0, 5 Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae) (Rafinisque) Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae) (Linnaeus) Közönséges ponty 20–25 20–25 5,0 ± 2, 0 5,0 ± 3, 0 Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae) (Temminck és Schlegel) Japán rizshal 20–25 4,0 ± 1, 0 Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae) (Peters) Guppi Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchidae) (Rafinesque) Oncorhynchus mykiss (Teleostei, Salmonidae) (Walbaum) Szivár- ványos pisztráng 20–25 20–25 13–17 3,0 ± 1, 0 5,0 ± 2, 0 8,0 ± 4, 0 Gasterosteus aculeatus (Teleostei, Gasterosteidae) (Linnaeus) Tüs- kés pikó 18–20 3,0 ± 1, 0 (1) Meyer A. , Orti G. (1993) Proc. Royal Society of London, Series B. , Vol. 252, p. 231 A különböző országokban különböző torkolati és tengeri fajokat használnak, például: Spot Sheephead minnow Silverside Shiner perch English sole Staghorn sculpin Tüskés pikó Sea bass Küsz Leiostomus xanthurus Cyprinodon variegatus Menidia beryllina Cymatogaster aggregata Parophrys vertulus Leptocottus armatus Gasterosteus aculeatus Dicentracus labrax Alburnus alburnus A halak beszerzése A táblázatban felsorolt édesvízi halak könnyen tenyészthetők, és/vagy könnyen beszerezhetők egész évben, míg a ten- geri és torkolati fajok bizonyos országokra korlátozódnak. A fent felsorolt halfajok halastóban vagy laboratóriumban is (betegségek és paraziták szempontjából ellenőrzött körülmények között) tenyészhetők. Célszerű tenyészetekből származó kísérleti halakat alkalmazni, mivel ezek egészségi állapota és származása is ismert. Ezek a halak a világ sok részében beszerezhetők. 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 311 3. melléklet A felvételi és tisztulási fázis időtartamának meghatározása 1. A felvételi fázis időtartamának meghatározása A vizsgálat elvégzése előtt a k2, és így az állandósult állapot eléréséhez szükséges idő néhány százalékos hibával megbecsülhető a k2 és az n – oktanol/víz megoszlási együttható (Pow) vagy a k2 és a vízben való oldhatóság (s) tapasztalati összefüggéséből. A k2 becsült értéke (nap-1) megkapható például az alábbi tapasztalati összefüggésből (1): log10 k2 = – 0,414 log10(Pow) + 1,47 (r2 = 0,95) (1. egyenlet) Egyéb összefüggéseket ld. a 2. hivatkozásban. Amennyiben a megoszlási hányados (Pow) nem ismert, az anyag vízben való oldhatóságának (s) ismeretéből becsülhető meg (3): log10 Pow = 0,862 log10(S) + 0,710 (r2 = 0,944) (2. egyenlet) ahol s = az oldhatóság (mól/l): (n = 36). Ezek az összefüggések csak 2 és 6,5 közé eső log Pow értékkel rendelkező vegyszerekre alkalmazhatók (4). A k2 – becslés felhasználásával, a felvételt és tisztulást leíró általános kinetikai egyenletből (elsőrendű kinetika) kiszámítható az állandósult állapot néhány százalékának eléréséhez szükséges idő: vagy ha Cw állandó: Az állandósult állapot közelítésekor (t ), a 3. egyenlet egyszerűsíthető (5) (6): Ekkor k1/k2. Cw a halakban mérhető koncentráció közelítése „állandósult állapotban” (Cf, s). A 3. egyenlet átírható: Cf = Cf,s = (1–e t –k 2 ) vagy t –k 2 = 1–e Cf Cw (4. egyenlet) A 4. egyenlet alkalmazásával megjósolható az állandósult állapot néhány százalékának eléréséhez szükséges idő, amennyiben az 1. vagy 2. egyenlet felhasználásával k2 előre megbecsült. Iránymutatóként: statisztikailag elfogadható adatok (BCFk) előállításához a felvételi fázis statisztikailag optimális időtartama az a periódus, ami ahhoz szükséges, hogy a halban mérhető vizsgáltanyag-koncentráció logaritmu- sának görbéje lineáris időskálán felrajzolva elérje a felezőpontját, illetve 1,6/k2 – t, vagy az állandósult állapot 80 %-át, de ne legyen nagyobb 3,0/k2 – nél, vagy az állandósult állapot 95 %-nál (7). Az állandósult állapot 80 %-ának eléréséhez szükséges idő (4. egyenlet): 0,80 = 1 – e–k2t80 vagy t80 = 1,6 k2 (5. egyenlet) 312 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet A 95 %-os állandósult állapot hasonlóan: T95 = 3,0 k2 (6. egyenlet) Például log Pow = 4-es vizsgált anyag esetében a felvételi fázis (fel) időtartama (az 1. , 5. , és 6. egyenletet használva): Log10 k2 = – 0,414. (4) + 1,47 k2 = 0,652 nap –1 ff (80 %) = 1,6/0,652, azaz 2,45 nap (59 óra) Vagy ff (95 %) = 3,0/0,652, azaz 4,60 nap (110 óra) Hasonlóan, egy s = 10– 5 mól/l (log(s) = 5,0) vizsgált anyag esetében az ff időtartama (az 1, 2, 5, és 6. egyenletet használva): log10 (Pow) = – 0,862 (– 5,0) + 0,710 = 5,02 log10 k2 = – 0,414 (5,02) + 1,47 k2 = 0,246 nap–1 ff (80 %) = 1,6/0,246, azaz 6,5 nap (156 óra) vagy ff (95 %) = 3,0/0,246, azaz 12,2 nap (293 óra) Ezenkívül Teq = 6,54 × 10-3 Pow + 55. 31 (óra) kifejezés használható az effektív állandósult állapot eléréséhez szükséges idő kiszámolásához (4). 2. A tisztulási fázis időtartamának előrejelzése A test anyagterhelésének a kezdeti koncentráció néhány százalékára való csökkentéséhez szükséges idő megbe- csülhető a felvételi és tisztulási periódust leíró általános egyenletből (elsőrendű kinetika) (1) (8). A tisztulási fázisban Cw nullának feltételezett. Az egyenlet egyszerűsíthető: ahol Cf, 0 a koncentráció a tisztulási fázis kezdetén. Az 50 %-os tisztulás aztán t50 időpontban következik be: Hasonlóan, a 95 %-os tisztulás elérésének időpontja: Amennyiben 80 %-os felvételt használnak az első periódusban (1,6/k2), és 95 %-os ürülést a tisztulási fázisban (3,0/k2), akkor a tisztulási fázis megközelítőleg kétszer hosszabb a felvételi fázisnál. Fontos megjegyezni azonban, hogy a becslések azon a feltevésen alapulnak, hogy a felvételi és tisztulási mintá- zat elsőrendű kinetikát követ. Amennyiben nyilvánvalóan nem elsőrendű kinetikáról van szó, összetettebb modellt kell alkalmazni [pl. (1) hivatkozás]. 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 313 Irodalom (a 3. mellékleté) (1) Spacie A. and Hamelink J. L. (1982). Alternative models for desribing the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. and Chem. 1, pp. 309-320. (2) Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of BCFs derived from OECD and ASTM testing met- hods; influence of particulate matter to the bioavailability of chemicals. Danish Water Quality Institute. (3) Chiou C. T. and Schmedding D. W. (1982). Partitioning of organic compounds in octanol-water systems. Environ. Sci. Technol. 16 (1), pp. 4-10. (4) Hawker D. W. and Connell D. W. (1988). Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on biocon- centration kinetics with fish. Wat. Res. 22 (6), pp. 701-707. (5) Branson D. R. , Blau G. E. , Alexander H. C. and Neely W. B. (1975). Transactions of the American Fisheries Society, 104 (4), pp. 785-792. (6) Ernst W. (1985). Accumulation in Aquatic organisms. In : Appraisal of tests to predict the environmental behaviour of chemicals. Ed. by Sheehman P. , Korte F. , Klein W. and Bourdeau P. H. Part 4. 4, pp. 243-255. SCOPE, 1985, John Wiley & Sons Ltd. N. Y. (7) Reilly P. M. , Bajramovic R. , Blau G. E. , Branson D. R. and Sauerhoff M. W. (1977). Guidelines for the optimal design of experiments to estimate parameters in first order kenetic models, Can. J. Chem. Eng. 55, pp. 614-622. (8) Könemann H. and Van Leuween K. (1980). Toxicokinetics in fish: Accumulation and Elimination of six Chloro- benzenes by Guppies. Chemosphere, 9, pp. 3-19. 314 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet 4. melléklet Elméleti példa biokoncentrációs vizsgálatok mintavételezési ütemtervére log Pow = 4 anyagok esetében Mintavételek Halminta Minimálisan megkö- vetelt gyakoriság (nap) Járulékos mintavéte- lezés Vízminták száma Halak száma mintán- ként Felvételi fázis 1. 2. 3. 4. 5. Tisztulási fázis 6. 7. 8. 9. -1 0 0,3 0,6 1,2 2,4 4,7 5,0 5,9 9,3 14,0 0,4 0,9 1,7 3,3 5,3 7,0 11,2 17,5 2 (*) 2 2 (2) 2 (2) 2 (2) 2 (2) 2 45–80 hal telepítve 4 (4) 4 (4) 4 (4) 4 (4) 6 Halak áthelyezve vizsgált vegyi anyagtól mentes vízbe 4 (4) 4 (4) 4 (4) 6 (4) (*) Vízminta minimum három teljes térfogatcsere után lett véve. Figyelem: k2 vizsgálat előtti becslése 4,0-ás log Pow-re 0,652 nap-1. A kísérlet teljes időtartama 3 × ff = 3 × 4,6 nap, azaz 14 nap. A „ff” becslését ld. a 3. mellékletben. A zárójeles értékek a minták (víz, hal) számát jelentik, amennyiben járulékos mintavételezés történik. 13/21. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 315 5. melléklet A megfelelő modell kiválasztása A legtöbb biokoncentrációs adatról feltételezett, hogy jól leírható egy egyszerű kétváltozós modellel, amely a tisztu- lási fázisban (féllogaritmusos papíron ábrázolva) a halakban mérhető koncentrációk pontjaira illeszthető egyenest ad. (Amennyiben ezek a pontok nem írhatók le egyenessel meghatározott görbével, összetettebb modellt kell alkalmazni, ld. például Spacie és Hamelink, 3. melléklet, 1. hivatkozás). Grafikus módszer a k2 tisztulási (ürülési) sebességi állandó meghatározására Az egyes halmintákban talált vizsgált anyag koncentrációját a mintavételezési idő függvényében kell ábrázolni féllo- garitmusos papíron. Az egyenes meredeksége k2. k2 = ln(Cf1/Cf2) t2–t1 Meg kell jegyezni, hogy az egyenes vonaltól való eltérések elsőrendűnél összetettebb tisztulási mintázatot jelezhet- nek. Az elsőrendű kinetikától eltérő tisztulási típusok meghatározására grafikus módszer alkalmazható. Grafikus módszer a k1 felvételi sebességi állandó meghatározására Amennyiben k2 adott, k1 – et az alábbiaknak megfelelően kell kiszámítani: A log koncentrációt az idő függvényében (aritmetikus skálán) ábrázolva nyert szabályos felvételi görbe középpont- jából olvasható le Cf érték. 316 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/21. kötet Számítógépes módszer a felvételi és a tisztulási (ürülési) sebességi állandó számítására A biokoncentrációs tényező továbbá a k1 és k2 sebességi állandó kiszámításának előnyben részesített módszere a nem lineáris paraméterbecslési módszer alkalmazása számítógépen. Ezek a programok k1 és k2 értékét az egymást követő idő koncentráció adatokból és az alábbi modell alapján találják meg: Cf = Cw∙ k1 k2 ×(1–e –k 2 t) Cf = Cw∙ k1 k2 ahol tc = idő a felvételi fázis végén. ×(e –k 2(t –t c) - e 0 < t < tc (2. egyenlet) t < tc (3. egyenlet) –k 2 t) Ez a megközelítés a k1 és k2 standard deviációjára ad becslést. mivel k2 legtöbbször viszonylag nagy pontossággal megbecsülhető a tisztulási görbéből, és mert erős a korreláció a k1 és k2 paraméter között, amennyiben egyidejűleg becsülték meg őket, tanácsos lehet először csak a tisztulási ada- tokból kiszámolni k2-t, és ezt követően nem-lineáris regresszióval számolni k1-et a felvételi adatokból