title: Directiva 98/73/CE a Comisiei din 18 septembrie 1998 de efectuare a celei de-a douăzeci și patra adaptări la progresul tehnic a Directivei 67/548/CEE a Consiliului privind armonizarea actelor cu putere de lege și a actelor administrative privind clasificarea, ambalarea și etichetarea substanțelor periculoaseText cu relevanță pentru SEE.

formats: pdf print xhtml

text: 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 125 31998L0073 L 305/1 JURNALUL OFICIAL AL COMUNITĂȚILOR EUROPENE 16. 11. 1998 DIRECTIVA 98/73/CE A COMISIEI din 18 septembrie 1998 de efectuare a celei de-a douăzeci ș(cid:13)i patra adaptări la progresul tehnic a Directivei 67/548/CEE a Consiliului privind armonizarea actelor cu putere de lege ș(cid:13)i a actelor administrative privind clasificarea, ambalarea ș(cid:13)i etichetarea substanțelor periculoase (Text cu relevanță pentru SEE) COMISIA COMUNITĂȚILOR EUROPENE, ADOPTĂ PREZENTA DIRECTIVĂ: având în vedere Tratatul de instituire a Comunității Europene, Articolul 1 având în vedere Directiva 67/548/CEE a Consiliului din 27 iunie 1967 privind armonizarea actelor cu putere de lege ș(cid:13)i a actelor administrative privind clasificarea, ambalarea ș(cid:13)i etichetarea sub- stanțelor periculoase (1), astfel cum a fost modificată ultima dată prin Directiva 97/69/CE a Comisiei (2), în special articolul 28, întrucât anexa I la Directiva 67/548/CEE conține o listă de substanțe periculoase specificând pentru fiecare clasificarea ș(cid:13)i modalitățile de etichetare; întrucât, din cunoș(cid:13)tințele ș(cid:13)tiințifice ș(cid:13)i tehnice actuale, reiese că lista cu substanțe periculoase din anexa menționată trebuie adaptată ș(cid:13)i completată; întrucât anexa V la Directiva 67/548/CEE defineș(cid:13)te metodele pen- tru determinarea proprietăților fizico-chimice, a toxicității ș(cid:13)i ecotoxicității substanțelor ș(cid:13)i preparatelor; întrucât este necesară adaptarea acestei anexe la progresul tehnic; Directiva 67/548/CEE se modifică după cum urmează: 1. Anexa I se modifică după cum urmează: (a) intrările din anexa I intrările corespunzătoare din anexa I 67/548/CEE; la prezenta directivă înlocuiesc la Directiva (b) intrările din anexa II la prezenta directivă se introduc în anexa I la Directiva 67/548/CEE. 2. Anexa V se modifică după cum urmează: (a) în partea A din anexa V la Directiva 67/548/CEE se introduc textele anexelor III A, III B ș(cid:13)i III C la prezenta directivă; (b) în partea C din anexa V la Directiva 67/548/CEE se intro- duce textul anexei III D la prezenta directivă. întrucât măsurile prevăzute de prezenta directivă sunt conforme cu avizul Comitetului pentru adaptarea la progresul tehnic a directivelor privind eliminarea barierelor tehnice din calea comerțului cu substanțe ș(cid:13)i preparate periculoase, Articolul 2 (1) (2) JO L 196, 16. 8. 1967, p. 1. JO L 343, 13. 12. 1997, p. 19. Statele membre adoptă ș(cid:13)i pun în aplicare actele cu putere de lege ș(cid:13)i actele administrative necesare aducerii la îndeplinire a prezentei directive până la 31 octombrie 1999. Acestea informează de îndată Comisia cu privire la aceasta. 126 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 Atunci când statele membre adoptă aceste dispoziții, ele cuprind o trimitere la prezenta directivă sau sunt însoțite de o asemenea trimitere la data publicării lor oficiale. Statele membre stabilesc modalitatea de efectuare a acestei trimiteri. Articolul 4 Prezenta directivă se adresează statelor membre. Articolul 3 Prezenta directivă intră în vigoare în a douăzecea zi de la data publicării în Jurnalul Oficial al Comunităților Europene. Adoptată la Bruxelles, 18 septembrie 1998. Pentru Comisie, Ritt BJERREGAARD Membru al Comisiei ANEXO I — BILAG I — ANHANG I — ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ I — ANNEX I — ANNEXE I — ALLEGATO I — BIJLAGE I — ANEXO I — LIITE I — BILAGA I 128 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 129 130 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 131 132 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 133 134 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 135 136 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 137 138 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 139 140 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 141 142 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 143 144 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 145 146 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 147 148 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 149 150 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 151 152 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 153 154 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 155 156 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 157 158 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 159 160 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 161 162 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 163 164 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 165 166 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 167 168 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 169 170 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 171 172 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 173 174 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 175 176 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 177 178 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 179 180 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 181 182 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 183 184 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 185 186 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 187 188 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 189 190 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 191 192 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 ANEXO II — BILAG II — ANHANG II — ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ II — ANNEX II — ANNEXE II — ALLEGATO II — BIJLAGE II — ANEXO II — LIITE II — BILAGA II 194 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 195 196 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 197 198 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 199 200 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 201 202 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 203 204 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 205 206 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 207 208 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 209 210 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 211 212 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 213 214 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 215 216 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 217 218 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 219 220 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 221 222 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 223 224 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 225 226 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 227 228 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 229 230 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 231 232 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 233 234 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 235 236 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 237 238 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 239 240 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 241 242 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 243 244 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 245 246 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 247 248 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 249 250 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 251 252 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 253 254 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 255 256 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 257 258 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 259 260 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 261 262 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 263 264 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 ANEXA III A A. 18. DETERMINAREA MASEI MOLECULARE NUMERICE MEDII Ș(cid:13) I A DISTRIBUȚIEI MASELOR MOLECULARE A POLIMERILOR 1. METODA Această metodă cromatografică pe gel permeabil urmează orientarea OCDE TG 118 (1996). Principiile fundamentale ș(cid:13)i toate celelalte informații tehnice sunt prezentate în bibliografie. 1. 1. Introducere Proprietățile polimerilor sunt atât de diversificate, încât este imposibil de descris o metodă unică, care să indice cu precizie condițiile de separare ș(cid:13)i evaluare, care să acopere toate eventualitățile ș(cid:13)i particularitățile întâlnite la separarea polimerilor. Sistemele complexe de polimeri, în special, se pretează mai rar la cromatografia pe gel permeabil. În cazul în care cromatografia pe gel permeabil nu este aplicabilă, se poate determina conținutul de polimeri cu masă moleculară medie, utilizând alte metode (vezi anexa). Într-o astfel de situație, este necesară furnizarea tuturor detaliilor legate de metoda folosită, cu justificarea alegerii. Metoda descrisă în continuare se bazează pe norma DIN 55672 (1). Aceasta furnizează indicații detaliate asupra modului de realizare a experiențelor ș(cid:13)i de evaluare a rezultatelor. Dacă este necesară modificarea condițiilor experimentale, schimbările trebuie justificate. Pot fi utilizate alte normative, cu condiția menționării tuturor referințelor. Metoda descrisă utilizează pentru etalonare eș(cid:13)antioane de polistiren a căror polidispersie este cunoscută ș(cid:13)i ar putea fi, probabil, adaptată pentru cazul altor polimeri, de exemplu polimerii solubili în apă ș(cid:13)i polimerii ramificați cu catenă lungă. 1. 2. Definiții ș(cid:13)i unități Masa moleculară numerică medie Mn ș(cid:13)i masa moleculară medie ponderală Mw se determină prin ecuațiile următoare: unde: Hi este amplitudinea semnalului detectat, corespunzător volumului de retenție Vi, față de nivelul de referință; Mi este masa moleculară a fracțiunii de polimer, corespunzătoare volumului de retenție Vi ș(cid:13)i n este numărul de puncte experimentale. Lărgimea distribuției maselor moleculare, care reprezintă o măsură a polidispersiei sistemului este exprimată de raportul Mw/Mn. 1. 3. Substanțe de referință Metoda cromatografiei pe gel permeabil este o metodă relativă, fiind necesar să se procedeze la o etalonare. În general, aceasta se realizează cu ajutorul polistirenilor etalon cu lanț liniar ș(cid:13)i distribuție îngustă, pentru care se cunosc atât masele moleculare medii Mn ș(cid:13)i Mw, cât ș(cid:13)i distribuția maselor moleculare. Curba de etalonare nu poate fi utilizată pentru determinarea masei moleculare a unui eș(cid:13)antion necunoscut decât dacă condițiile de separare a eș(cid:13)antioanelor ș(cid:13)i etaloanelor au fost selecționate într-un mod identic. O relație determinată între masa moleculară ș(cid:13)i volumul de eluare nu este valabilă decât în condițiile particulare ale unei experiențe date. Printre aceste condiții figurează, înainte de toate: temperatura, solventul (sau amestecul de solvenți), condițiile cromatografice, precum ș(cid:13)i coloana de separare sau sistemul de coloane. 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 265 Masele moleculare ale eș(cid:13)antioanelor determinate prin această metodă constituie valori relative; le vom numi „mase moleculare în echivalent-polistiren”. Aceasta semnifică faptul că, în funcție de diferențele chimice ș(cid:13)i structurale dintre eș(cid:13)antioanele testate ș(cid:13)i etaloane, masele moleculare pot devia față de valorile absolute, într-o manieră mai mult sau mai puțin importantă. Dacă sunt utilizate alte etaloane, de exemplu polietilenglicol, poli(etilenoxid), poli(metacrilat de metil) sau acid poliacrilic, este important să se justifice motivul. 1. 4. Principiul metodei Cromatografia pe gel permeabil permite determinarea distribuției maselor moleculare, precum ș(cid:13)i a maselor (Mn, Mw). Cromatografia pe gel permeabil reprezintă o metodă particulară de moleculare medii cromatografie lichidă, în cadrul căreia eș(cid:13)antionul pentru testat este separat în funcție de volumul hidrodinamic al fiecărui constituent (2). Separarea se efectuează pe măsură ce eș(cid:13)antionul înaintează printr-o coloană umplută cu un material poros, în general un gel organic. Moleculele mici pot penetra în pori, în vreme ce moleculele mari sunt excluse. Din acest motiv, traseul moleculelor mari este mai scurt; acestea sunt separate primele. Moleculele de dimensiuni medii penetrează parțial în pori, fiind separate mai târziu. Moleculele cele mai mici, a căror rază hidrodinamică medie este mai mică decât cea a porilor de gel, pot penetra în toți porii. Acestea vor fi eluate ultimele. În situația ideală, dimensiunea speciilor moleculare este cea care decide integral separarea, dar în practică este greu de evitat interferența unor fenomene de absorbție. O umplere neregulată a coloanei, ca ș(cid:13)i existența unui volum mort important, pot agrava situația (2). Detecția se efectuează, de exemplu, prin măsurarea indicelui de refracție sau al absorbției în UV, pentru realizarea unei curbe de distribuție simple. Totuș(cid:13)i, pentru a putea asocia acestei curbe valorile maselor moleculare reale, este necesară etalonarea coloanei prin trecerea unui polimer cu masa moleculară cunoscută ș(cid:13)i, în cazul ideal, cu o structură cât mai apropiată, de exemplu diferiți polistireni standard. În general, se va obține o curbă Gauss; uneori, aceasta poate prezenta o asimetrie, pe partea maselor moleculare mici; axa verticală indică cantitatea (greutatea) speciilor de diferite mase moleculare eluate, iar pe axa orizontală figurează logaritmul masei moleculare. 1. 5. Criterii calitative Reproductivitatea (deviația-standard relativă) a volumului de eluare trebuie să fie cel mult egală cu 0,3 %. Există modalități de ameliorare a reproductivității de analiză, grație unei corecții ce utilizează un standard intern, dacă un cromatograf este evaluat în funcție de timp ș(cid:13)i nu satisface criteriile menționate mai sus [vezi informațiile complementare la (1)]. Polidispersările depind de masele moleculare ale etaloanelor. În cazul polistirenilor etalon, valorile tipice sunt: MP < 2 000 2 000 ≤ MP ≤ 106 MP > 106 Mw/Mn < 1,20 Mw/Mn < 1,05 Mw/Mn < 1,20 (MP este masa moleculară a etalonului, corespunzătoare semnalului maxim). 1. 6. Descrierea metodei 1. 6. 1. Prepararea soluțiilor etalon de polistiren Se vor dizolva polistirenii etalon, amestecând cu grijă până la diluția aleasă. Soluțiile se vor prepara ținând cont de recomandările fabricantului. Concentrațiile etaloanelor alese depind de diferiți factori, cum ar fi: volumul de injecție, viscozitatea soluției ș(cid:13)i sensibilitatea detectorului. Volumul de injecție maxim trebuie să fie adaptat lungimii coloanei, având grijă să nu o supraîncarce. Volumele de injecție curente pentru separările analitice prin metoda cromatografică pe gel permeabil, pentru o coloană de 30 cm × 7,8 mm, variază de obicei între 40ș(cid:13)i 100 μl. Se pot obține ș(cid:13)i volume mai mari, dar acestea nu trebuie să depăș(cid:13)ească 250 μl. Se va determina raportul optim între volumul de injecție ș(cid:13)i concentrație, înainte de etalonarea coloanei. 266 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 1. 6. 2. Prepararea soluției de eș(cid:13)antion În principiu, prepararea soluțiilor de eș(cid:13)antion se realizează în condiții identice. Eș(cid:13)antionul se dizolvă într-un solvent adecvat, de exemplu THF, agitând cu grijă. În nici un caz nu se va dizolva într-o baie cu ultrasunete. Dacă este necesar, soluția de probă se purifică cu ajutorul unui filtru cu membrană, cu dimensiunea porilor cuprinsă între 0,2-2 μm. Prezența particulelor nedizolvate trebuie menționată în raportul final, în măsura în care acestea pot rezulta din specii cu mase moleculare mari. Trebuie să se recurgă la o metodă potrivită pentru determinarea procentajului în greutate al particulelor nedizolvate. Analiza soluțiilor se va face în termen de 24 ore. 1. 6. 3. Aparatură Un aparat pentru cromatografie pe gel permeabil este compus din următoarele elemente: — un rezervor pentru solvent; — un sistem pentru degazare (dacă este necesar); — o pompă; — un amortizor de impulsuri (dacă este necesar); — un sistem de injecție; — coloane cromatografice; — un detector; — un debitmetru (dacă este necesar); — un sistem de înregistrare ș(cid:13)i tratare a datelor; — un recipient pentru recuperarea soluțiilor utilizate. Sistemul cromatografic pe gel permeabil trebuie să fie inert față de solventul utilizat (de exemplu utilizarea capilarelor din oțel, atunci când solvent este THF). 1. 6. 4. Injecția ș(cid:13)i sistemul de pompare a solventului Un volum definit din soluția de probă este injectat în coloană, într-o zonă bine definită, cu ajutorul unui aparat pentru eș(cid:13)antionare automată sau manuală. Dacă se operează manual, retragerea ori împingerea prea bruscă a pistonului seringii poate determina modificări în distribuția maselor moleculare observate. Este indicat ca sistemul de pompare a solventului să fie lipsit de pulsații; este de preferat ca acesta să includă un amortizor de impulsuri. Debitul este de ordinul a 1 ml/min. 1. 6. 5. Coloana În funcție de natura eș(cid:13)antionului testat, polimerul se caracterizează făcând recurs la o singură coloană sau la mai multe coloane, conectate în serie. În comerț sunt disponibile mai multe materiale poroase pentru coloane, cu proprietăți definite (de exemplu dimensiunea porilor, limita de excludere). Alegerea unui gel de separare sau a lungimii de coloană depinde, pe de o parte, de proprietățile eș(cid:13)antionului testat (volume hidrodinamice, distribuția maselor moleculare) ș(cid:13)i, pe de altă parte, de condițiile particulare ale separării, cum ar fi: natura solventului, temperatura ș(cid:13)i debitul (1) (2) (3). 1. 6. 6. Talere teoretice Coloana (sau combinația de coloane) utilizată pentru separare trebuie caracterizată prin numărul de talere teoretice. Pentru aceasta, în cazul în care solventul de eluare este THF, se trece o soluție de etilbenzen sau o altă substanță dizolvată nepolară potrivită printr-o coloană de lungime cunoscută. Numărul de talere teoretice este dat de ecuația următoare: W1/2)2 N = 5,54( Ve W)2 sau N = 16(Ve unde: N Ve este numărul de talere teoretice este volumul de eluare, corespunzător semnalului maxim W este lărgimea semnalului maxim, la nivelul liniei de bază W1/2 este lărgimea semnalului maxim, la jumătatea înălțimii coloanei. 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 267 1. 6. 7. Eficacitatea separării În afară de numărul de talere teoretice, parametru determinant al lărgimii de bandă, eficacitatea de separare este o altă importantă caracteristică determinată de panta curbei de calibrare. Eficacitatea de separare a unei coloane se calculează cu ajutorul relației următoare: V e,M x – V e,(10M x) secțiunea coloani 3 2] ≥ 6,0[cm cm unde Ve, Mx este volumul de eluare al polistirenului cu masa moleculară Mx, Ve, (10Mx) este volumul de eluare al polistirenului cu masa moleculară de 10 ori mai mare. Rezoluția sistemului este în general definită după cum urmează: R1,2 = 2 × Ve1 – Ve2 W1 + W2 × 1 log10(M2/M1) unde Ve1 ș(cid:13)i Ve2 sunt volumele de eluare ale celor doi polistireni standard la semnalul maxim, W1 ș(cid:13)i W2 sunt lărgimile vârfului la nivelul liniei bazei, M1 ș(cid:13)i M2 sunt masele moleculare corespunzătoare semnalului maxim (aceste mase ar trebui să fie diferite printr-un factor 10). Valoarea lui R pentru sistemul de coloane trebuie să fie superioară valorii de 1,7 (4). 1. 6. 8. Solvenți Toți solvenții trebuie să aibă o mare puritate (se va folosi THF de puritate 99,5 %). Rezervorul pentru solvent (la nevoie, pus în atmosferă de gaz inert) trebuie să fie suficient de mare pentru a permite etalonarea coloanei ș(cid:13)i mai multe analize de eș(cid:13)antioane. Solventul va fi degazat înainte de a fi pompat în coloană. 1. 6. 9. Reglarea temperaturii Temperatura componentelor interne critice (bucla de injecție, coloana sau coloanele, detectorul ș(cid:13)i tuburile) trebuie să fie constantă ș(cid:13)i compatibilă cu solventul ales. 1. 6. 10. Detectorul Detectorul înregistrează în mod cantitativ concentrația eș(cid:13)antionului eluat din coloană. Pentru evitarea unei lărgimi nedorite a picului, volumul cuvei detectorului va fi ales cât mai mic posibil. Acesta nu trebuie să depăș(cid:13)ească 10 μl, cu excepția detectoarelor ce funcționează prin difuzia luminii ș(cid:13)i a viscozimetrelor. În general, detecția se realizează prin refractometrie diferențială. Totuș(cid:13)i, dacă proprietățile specifice ale eș(cid:13)antionului sau ale solventului pentru eluare o cer, se pot folosi alte tipuri de detectoare, cum ar fi cele UV/VIS sau IR, viscozimetrele etc. 2. REZULTATE Ș(cid:13) I PROCESUL VERBAL AL TESTĂRII 2. 1. Rezultate Se va face referință la normele DIN (1) în ceea ce priveș(cid:13)te criteriile de evaluare detaliate, la fel pentru specificațiile relative la colectarea ș(cid:13)i interpretarea datelor. Pentru fiecare eș(cid:13)antion analizat, se vor realiza două experiențe independente. Rezultatele acestora se vor analiza separat. Parametrii Mn, Mw, Mw/Mn, Mp se determină pentru fiecare măsurătoare. Trebuie indicat în mod explicit că valorile măsurate sunt valori relative corespunzând unor echivalenți de masă moleculară ale standardului folosit. 268 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 După determinarea volumelor ș(cid:13)i a timpilor de retenție (eventual corectate cu ajutorul unui standard intern) se vor reprezenta grafic valorile log MP (MP fiind semnalul maxim al polimerilor standard), în funcție de una dintre acele cantități. Sunt necesare cel puțin 2 puncte de etalonare pentru fiecare factor 10 de masă moleculară. Pentru trasarea întregii curbe sunt necesare cel puțin 5 puncte de măsură; această curbă va acoperi masa moleculară estimată a eș(cid:13)antionului. Punctul extrem al curbei de etalonare, spre partea maselor moleculare mici, se poate defini folosind n-hexilbenzenul sau altă substanță dizolvată nepolară adecvată. Masele moleculare medii, ca număr ș(cid:13)i ca greutate, sunt în general determinate prin prelucrarea informatică a datelor, bazată pe formule menționate la punctul 1. 2. Dacă s-a optat pentru o prelucrare manuală, este indicat să se consulte ASTM D 3536-91 (3). Curba de distribuție va fi prezentată sub forma unui tabel sau a unui grafic (frecvența diferențială sau procentajele cumulative în funcție de log M). În cazul reprezentării grafice, o putere de 10 pentru masa moleculară corespunde în mod normal unei lărgimi de aproximativ 4 cm, în vreme ce pentru maximul de semnal este adecvată o înălțime de aproximativ 8 cm. În cazul curbelor de distribuție cumulative, diferența între 0 – 100 % pe axa ordonatei trebuie să fie în jur de 10 cm. 2. 2. Procesul-verbal al testării Procesul-verbal al experimentului va cuprinde informațiile următoare: 2. 2. 1. Substanța testată — informații disponibile legate de substanța testată (natură, aditivi, impurități); — descrierea tratamentului aplicat eș(cid:13)antionului, observații, probleme. 2. 2. 2. Dispozitivul experimental — un rezervor pentru solvent, gaz inert, sistem pentru degazarea solventului, compoziția solventului, impurități; — pompă, amortizor de impulsuri, sistem de injecție; — coloane de separare (fabricant, toate precizările legate de caracteristicile coloanei, cum ar fi dimensiunea porilor, natura materialului de separare etc. , numărul, lungimea ș(cid:13)i ordinul coloanelor utilizate); — numărul de talere teoretice ale coloanei (sau al combinației de coloane), eficacitatea separării (resorbția sistemului); — informații legate de simetria semnalelor maxime; — temperatura coloanei, modul de reglare a temperaturii; — detector (principiul de măsurare, tip, volumul cuvei); — debitmetru, dacă există (fabricant, principiul de măsurare); — sistemul utilizat pentru culegere ș(cid:13)i prelucrarea datelor (echipament ș(cid:13)i programe informatice). 2. 2. 3. Etalonarea sistemului — descrierea detaliată a metodei utilizate pentru determinarea curbei de etalonare; — precizări asupra criteriilor de calitate proprii acestei metode (de exemplu coeficientul de corelare, eroarea pătratică medie etc. ); — informații asupra tuturor extrapolărilor, ipotezelor ș(cid:13)i aproximărilor efectuate în cursul proceselor experimentale, precum ș(cid:13)i asupra evaluării ș(cid:13)i prelucrării datelor; — toate măsurătorile efectuate pentru stabilirea curbei de etalonare trebuie prezentate sub forma unui tabel care cuprinde, pentru fiecare punct de etalonare, următoarele informații: — denumirea eș(cid:13)antionului; — fabricantul eș(cid:13)antionului; — valorile caracteristice MP, Mn, Mw, Mw/Mn ale etaloanelor furnizate de fabricant, deduse din măsurătorile ulterioare, completate de indicațiile legate de metoda de determinare; — volumul de injecție ș(cid:13)i concentrația soluției injectate; — valoarea de MP utilizată pentru etalonare; 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 269 — volumul de eluare sau timpul de retenție corectat, măsurat la semnalul maxim; — MP calculat la semnalul maxim; — procentajul de eroare la MP calculat ș(cid:13)i la valoarea de etalonare. 2. 2. 4. Evaluare — evaluare în funcție de timp: toate metodele care vizează ameliorarea reproductivității cerute (metode de corecție, standard intern etc. ); — se precizează dacă evaluarea s-a efectuat plecând de la volumul de eluare sau de la timpul de retenție; — se indică limitele de evaluare, dacă un pic nu a fost complet analizat; — se descriu metodele de netezire, dacă s-au folosit; — se indică procedeele de preparare ș(cid:13)i pretratare a eș(cid:13)antionului; — dacă există, se indică prezența particulelor nedizolvate; — se indică volumul de injecție (μl) ș(cid:13)i concentrația de injecție (mg/ml); — se menționează observațiile privind efectele generatoare de deviații, în raport cu profilul ideal de cromatografie pe gel permeabil; — se descriu în detaliu toate modificările aduse procedurilor de analiză; — se precizează intervalele de eroare; — se consemnează orice alte informații ș(cid:13)i observații utile pentru interpretarea rezultatelor. 3. REFERINȚE BIBLIOGRAFICE (1) DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatografie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1. (2) Yau, W. W. , Kirkland, J. J. , and Bly, D. D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatogrphy, J. Wiley & Sons. (3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPG). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. (4) ASTM D 5296-92 (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. 270 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 Exemple de alte metode de determinare a masei moleculare numerice medii (Mn) a polimerilor Anexă Cromatografia pe gel permeabil reprezintă metoda preferată pentru determinarea Mn, mai ales atunci când dispunem de un ansamblu de substanțe standard cu o structură comparabilă cu cea a polimerului. Totuș(cid:13)i, atunci când folosirea metodei cromatografiei pe gel permeabil prezintă dificultăți practice sau când ne putem aș(cid:13)tepta ca substanța să nu satisfacă un criteriu reglementar pentru Mn (ceea ce cere o confirmare), există metode alternative, ca de exemplu: 1. Utilizarea proprietăților coligative 1. 1. Ebulioscopia ș(cid:13)i crioscopia înseamnă măsurarea creș(cid:13)terii punctului de fierbere (ebulioscopia) sau coborârii punctului de congelare (crioscopia) ale unui solvent atunci când este adăugat un polimer. Metoda se bazează pe faptul că dizolvarea unui polimer într-un lichid are un efect asupra punctelor de fierbere sau de congelare ale acestuia care depinde de masa moleculară a polimerului (1) (2). Domeniul de aplicare corespunde unei Mn < 20 000. 1. 2. Coborârea presiunii vaporilor consistă în măsurarea presiunii vaporilor unui lichid de referință înainte ș(cid:13)i după adăugarea unor cantități stabilite de polimeri (1) (2). Domeniul de aplicare corespunde unei Mn < 20 000 (în teorie; în practică, nu reprezintă decât o valoare limitată). 1. 3. Osmometria cu membrană se bazează pe principiul osmozei, adică tendința naturală a moleculelor de solvent de a traversa o membrană semipermeabilă plecând de la o soluție diluată către o soluție concentrată, aș(cid:13)a încât să se realizeze echilibrul. În experiment, concentrația soluției diluate este nulă, în timp ce soluția concentrată conține polimerul. Trecerea solventului de-a lungul membranei induce o diferență de presiune care depinde de concentrație ș(cid:13)i de masa moleculară a polimerului (1) (3) (4). Domeniul de aplicare corespunde valorilor lui Mn între 20 000 ș(cid:13)i 200 000. 1. 4. Osmometria - faza de vapori constă în comparația vitezei de evaporare a unui aerosol de solvent pur cu viteza a cel puțin trei aerosoli care conțin polimerul la diferite concentrații (1) (5) (6). Domeniul de aplicare corespunde unei Mn < 20 000. 2. Analiza grupurilor terminale Pentru a se utiliza această metodă, trebuie cunoscute atât structura globală a polimerului, cât ș(cid:13)i natura grupurilor terminale situate în capetele catenei (acestea trebuie să poată fi diferențiate de catena principală, de exemplu prin spectrul lor RMN sau prin titrarea ș(cid:13)i formarea derivaților). Determinarea concentrației moleculare a grupurilor terminale prezente pe polimer poate apoi să furnizeze o valoare a masei moleculare (7) (8) (9). Domeniul de aplicare corespunde valorilor lui Mn, ce pot atinge valoarea de 50 000 (cu o fiabilitate descrescătoare). REFERINȚE BIBLIOGRAFICE LA ANEXĂ (1) Billmeyer, F. W. Jr. , (1984). Textbook of Polymer Science, 3rd Edn. , John Wiley, New York. (2) Glover, C. A. , (1975). Absolute Colligative Property Methods. Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I P. E. Slade, Jr. ed. , Marcel Dekker, New York. (3) ASTM D 3750-79, (1979). Standard Practice for Determination of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Membrane Osmometry. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. (4) Coll, H. (1989). Membrane Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A. R. Cooper ed. , J. Wiley and Sons, pp. 25-52. (5) ASTM D 3592-77, (1977). Standard Recommended Practice for Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 271 (6) Morris, C. E. M. , (1989). Vapour Pressure Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A. R. Cooper ed. , J. Wiley and Sons. (7) Schröder, E. , Müller, G. , and Arndt, K. -F. , (1989). Polymer Characterisation, Carl Hanser Verlag, München. (8) Garmon, R. G. , (1975). End-Group Determinations, Chapter 3. In Polymer Molecular Weights, Part I, P. E. Slade, Jr. ed. Marcel Dekker, New York. (9) Amiya, S. , et. al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, 2139-2146. 272 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 ANEXA III B A. 19 DETERMINAREA CONȚINUTULUI ÎN POLIMERI CU MASĂ MOLECULARĂ MICĂ 1. METODA Această metodă cromatografică pe gel permeabil urmează orientarea OCDE TG 119 (1996). Principiile fundamentale ș(cid:13)i toate celelalte informații tehnice sunt prezentate în bibliografie. 1. 1. Introducere Proprietățile polimerilor sunt atât de diversificate, încât este imposibil de descris o metodă unică, care să indice cu precizie condițiile de separare ș(cid:13)i evaluare, care să acopere toate eventualitățile ș(cid:13)i particularitățile întâlnite la separarea polimerilor. Sistemele complexe de polimeri, în special, se pretează mai rar la cromatografia pe gel permeabil. În cazul în care cromatografia pe gel permeabil nu este aplicabilă, se poate determina conținutul de polimeri cu masă moleculară medie, utilizând alte metode (vezi anexa). Într-o astfel de situație, este necesară furnizarea tuturor detaliilor legate de metoda folosită, cu justificarea alegerii. Metoda descrisă în continuare se bazează pe norma DIN 55672 (1). Aceasta furnizează indicații detaliate asupra modului de realizare a experiențelor ș(cid:13)i de evaluare a rezultatelor. Dacă este necesară modificarea condițiilor experimentale, schimbările trebuie justificate. Pot fi utilizate alte normative, cu condiția menționării tuturor referințelor. Metoda descrisă utilizează pentru etalonare eș(cid:13)antioane de polistiren a căror polidispersie este cunoscută ș(cid:13)i ar putea fi, probabil, adaptată pentru cazul altor polimeri, de exemplu polimerii solubili în apă ș(cid:13)i polimerii ramificați cu catenă lungă. 1. 2. Definiții ș(cid:13)i unități Masa moleculară mică se defineș(cid:13)te în mod arbitrar ca fiind o masă moleculară inferioară celei de 1 000 daltoni. Masa moleculară medie (numerică) Mn ș(cid:13)i masa moleculară medie (greutate) Mw, sunt determinate cu ajutorul ecuațiilor următoare: unde: Hi este amplitudinea semnalului detectat, corespunzător volumului de retenție Vi, în funcție de nivelul de referință, Mi este masa moleculară a fracțiunii de polimer, corespunzătoare volumului de retenție Vi ș(cid:13)i n este numărul de puncte experimentale. Lărgimea de distribuție a maselor moleculare, care reprezintă o măsură a polidispersiei sistemului este exprimată de raportul Mw/Mn. 1. 3. Substanțe de referință Metoda cromatografiei pe gel permeabil este o metodă relativă, fiind necesar să se procedeze la o etalonare. În general, aceasta se realizează cu ajutorul polistirenilor etalon cu lanț liniar ș(cid:13)i distribuție îngustă, pentru care se cunosc atât masele moleculare medii Mn ș(cid:13)i Mw, cât ș(cid:13)i distribuția maselor moleculare. Curba de etalonare nu poate fi utilizată pentru determinarea masei moleculare a unui eș(cid:13)antion necunoscut, decât dacă condițiile de separare a eș(cid:13)antioanelor ș(cid:13)i etaloanelor au fost selecționate într-un mod identic. 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 273 O relație determinată între masa moleculară ș(cid:13)i volumul de eluare nu este valabilă decât în condițiile particulare ale unei experiențe date. Printre aceste condiții figurează, înainte de toate: temperatura, solventul (sau amestecul de solvenți), condițiile cromatografice, precum ș(cid:13)i coloana de separare sau sistemul de coloane. Masele moleculare ale eș(cid:13)antioanelor determinate prin această metodă constituie valori relative; le vom numi „mase moleculare în echivalent-polistiren”. Aceasta semnifică faptul că, în funcție de diferențele chimice ș(cid:13)i structurale dintre eș(cid:13)antioanele testate ș(cid:13)i etaloane, masele moleculare pot devia față de valorile absolute, într-o manieră mai mult sau mai puțin importantă. Dacă sunt utilizate alte etaloane, de exemplu polietilenglicol, poli(etilenoxid), poli(metacrilat de metil) sau acid poliacrilic, este important să se justifice motivul. 1. 4. Principiul metodei Cromatografia pe gel permeabil permite determinarea distribuției maselor moleculare, precum ș(cid:13)i a maselor (Mn, Mw). Cromatografia pe gel permeabil reprezintă o metodă particulară de moleculare medii cromatografie lichidă, în cadrul căreia eș(cid:13)antionul pentru testat este separat în funcție de volumul hidrodinamic al fiecărui constituent. (2). Separarea se efectuează pe măsură ce eș(cid:13)antionul înaintează printr-o coloană umplută cu un material poros, în general un gel organic. Moleculele mici pot penetra în pori, în vreme ce moleculele mari sunt excluse. Din acest motiv, traseul moleculelor mari este mai scurt; acestea sunt separate primele. Moleculele de dimensiuni medii penetrează parțial în pori, fiind separate mai târziu. Moleculele cele mai mici, a căror rază hidrodinamică medie este mai mică decât cea a porilor de gel, pot penetra în toți porii. Acestea vor fi eluate ultimele. În situația ideală, dimensiunea speciilor moleculare este cea care decide integral separarea, dar în practică este greu de evitat interferența unor fenomene de absorbție. O umplere neregulată a coloanei, ca ș(cid:13)i existența unui volum mort important pot agrava situația (2). Detecția se efectuează, de exemplu, prin măsurarea indicelui de refracție sau al absorbției în UV, pentru realizarea unei curbe de distribuție simple. Totuș(cid:13)i, pentru a putea asocia acestei curbe valorile maselor moleculare reale, este necesară etalonarea coloanei prin trecerea unui polimer cu masa moleculară cunoscută ș(cid:13)i, în cazul ideal, cu o structură cât mai apropiată, de exemplu diferiți polistireni standard. În general, se va obține o curbă Gauss; uneori aceasta poate prezenta o asimetrie, pe partea maselor moleculare mici; axa verticală indică cantitatea (greutatea) speciilor de diferite mase moleculare eluate, iar pe axa orizontală figurează logaritmul masei moleculare. Conținutul în polimeri cu masă moleculară mică se deduce cu ajutorul acestei curbe. Calculul nu poate fi exact decât dacă speciile cu masă moleculară mică se comportă în acelaș(cid:13)i fel cu ansamblul polimerului, pe unitatea de masă. 1. 5. Criterii calitative Reproductivitatea (deviația-standard relativă) a volumului de eluare trebuie să fie cel mult egală cu 0,3 %. Există modalități de ameliorare a reproductivității de analiză, grație unei corecții ce utilizează un standard intern, dacă un cromatograf este evaluat în funcție de timp ș(cid:13)i nu satisface criteriile menționate mai sus [vezi informațiile complementare la (1)]. Polidispersările depind de masele moleculare ale etaloanelor. În cazul polistirenilor etalon, valorile tipice sunt: MP < 2 000 2 000 ≤ MP ≤ 106 MP > 106 Mw/Mn < 1,20 Mw/Mn < 1,05 Mw/Mn < 1,20 (MP este masa moleculară a etalonului, corespunzătoare semnalului maxim). 1. 6. Descrierea metodei 1. 6. 1. Prepararea soluțiilor etalon de polistiren Se vor dizolva polistirenii etalon, amestecând cu grijă până la diluția aleasă. Soluțiile se vor prepara ținând cont de recomandările fabricantului. 274 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 Concentrațiile etaloanelor alese depind de diferiți factori, cum ar fi: volumul de injecție, viscozitatea soluției ș(cid:13)i sensibilitatea detectorului. Volumul de injecție maxim trebuie să fie adaptat lungimii coloanei, având grijă să nu o supraîncarce. Volumele de injecție curente pentru separările analitice prin metoda cromatografică pe gel permeabil, pentru o coloană de 30 cm x 7,8 mm, variază de obicei între 40ș(cid:13)i 100 μl. Se pot obține ș(cid:13)i volume mai mari, dar acestea nu trebuie să depăș(cid:13)ească 250 μl. Se va determina raportul optim între volumul de injecție ș(cid:13)i concentrație, înainte de etalonarea coloanei. 1. 6. 2. Prepararea soluției de eș(cid:13)antion În principiu, prepararea soluțiilor de eș(cid:13)antion se realizează în condiții identice. Eș(cid:13)antionul se dizolvă într-un solvent adecvat, de exemplu THF, agitând cu grijă. În nici un caz nu se va dizolva într-o baie cu ultrasunete. Dacă este necesar, soluția de probă se purifică cu ajutorul unui filtru cu membrană, cu dimensiunea porilor cuprinsă între 0,2-2 μm. Prezența particulelor nedizolvate trebuie menționată în raportul final, în măsura în care acestea pot rezulta din specii cu mase moleculare mari. Trebuie să se recurgă la o metodă potrivită pentru determinarea procentajului în greutate al particulelor nedizolvate. Analiza soluțiilor se va face în termen de 24 ore. 1. 6. 3. Corecție legată de prezența impurităților ș(cid:13)i a aditivilor Fiind vorba despre conținutul în specii cu M < 1 000, este necesar, în general, să se aplice o corecție care să țină cont de prezența compuș(cid:13)ilor particulari nepolimerici (cum ar fi impuritățile sau aditivii), cu excepția cazului în care conținutul măsurat nu depăș(cid:13)eș(cid:13)te valoarea de 1 %. Această corecție se poate realiza prin analiza directă a soluției de polimer sau a eluatului pentru cromatografia pe gel permeabil. În cazul în care eluatul este prea diluat pentru a permite analizarea, după traversarea coloanei, este necesar să fie concentrat. Va fi, eventual, necesară evaporarea soluției până la sec, urmată de redizolvare. Concentrarea soluției se va efectua astfel încât să nu intervină nici o modificare a compoziției. Tratamentul soluției, după faza cromatografiei pe gel permeabil, este funcție de metoda de analiză utilizată pentru determinarea cantitativă. 1. 6. 4. Aparatură Un aparat pentru cromatografie pe gel permeabil este compus din următoarele elemente: — un rezervor pentru solvent; — un sistem pentru degazare (dacă este necesar); — o pompă; — un amortizor de impulsuri (dacă este necesar); — un sistem de injecție; — coloane cromatografice; — un detector; — un debitmetru (dacă este necesar); — un sistem de înregistrare ș(cid:13)i tratare a datelor; — un recipient pentru recuperarea soluțiilor utilizate. Sistemul cromatografic pe gel permeabil trebuie să fie inert față de solventul utilizat (de exemplu utilizarea capilarelor din oțel, atunci când solvent este THF). 1. 6. 5. Injecția ș(cid:13)i sistemul de pompare a solventului Un volum definit din soluția de probă este injectat în coloană, într-o zonă bine definită, cu ajutorul unui aparat pentru eș(cid:13)antionare automată sau manuală. Dacă se operează manual, retragerea ori împingerea prea bruscă a pistonului seringii poate determina modificări în distribuția maselor moleculare observate. Este indicat ca sistemul de pompare a solventului să fie lipsit de pulsații; este de preferat ca acesta să includă un amortizor de impulsuri. Debitul este de ordinul a 1 ml/min. 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 275 1. 6. 6. Coloana În funcție de natura eș(cid:13)antionului testat, polimerul se caracterizează făcând recurs la o singură coloană sau la mai multe coloane, conectate în serie. În comerț sunt disponibile mai multe materiale poroase pentru coloane, cu proprietăți definite (de exemplu dimensiunea porilor, limita de excludere). Alegerea unui gel de separare sau a lungimii de coloană depinde, pe de o parte, de proprietățile eș(cid:13)antionului testat (volume hidrodinamice, distribuția maselor moleculare) ș(cid:13)i, pe de altă parte, de condițiile particulare ale separării, cum ar fi: natura solventului, temperatura ș(cid:13)i debitul (1) (2) (3). 1. 6. 7. Talere teoretice Coloana (sau combinația de coloane) utilizată pentru separare trebuie caracterizată prin numărul de talere teoretice. Pentru aceasta, în cazul în care solventul de eluare este THF, se trece o soluție de etilbenzen sau o altă substanță dizolvată nepolară potrivită, printr-o coloană de lungime cunoscută. Numărul de talere teoretice este dat de ecuația următoare: W1/2)2 N = 5,54( Ve W)2 sau N = 16(Ve unde: N Ve este numărul de talere teoretice; este volumul de eluare, corespunzător semnalului maxim; W este lărgimea semnalului maxim, la nivelul liniei de bază; W1/2 este lărgimea semnalului maxim, la jumătatea înălțimii coloanei. 1. 6. 8. Eficacitatea separării În afară de numărul de talere teoretice, parametru determinant al lărgimii de bandă, eficacitatea de separare este o altă importantă caracteristică determinată de panta curbei de calibrare. Eficacitatea de separare a unei coloane se calculează cu ajutorul relației următoare: V e,M x – V e,(10M x) secțiunea coloanei 3 2] ≥ 6,0[cm cm unde: Ve, Mx este volumul de eluare al polistirenului cu masa moleculară Mx; Ve, (10 Mx) este volumul de eluare al polistirenului cu masa moleculară de 10 ori mai mare. Rezoluția sistemului este în general definită după cum urmează: R1,2 = 2 × Ve1 – Ve2 W1 + W2 × 1 log10(M2/M1) unde Ve1 ș(cid:13)i Ve2 sunt volumele de eluare ale celor doi polistireni standard la semnalul maxim; W1 ș(cid:13)i W2 sunt lărgimile vârfului la nivelul liniei bazei; M1 ș(cid:13)i M2 sunt masele moleculare corespunzătoare semnalului maxim (aceste mase ar trebui să fie diferite printr-un factor 10). Valoarea lui R pentru sistemul de coloane trebuie să fie superioară valorii de 1,7 (4). 1. 6. 9. Solvenți Toți solvenții trebuie să aibă o mare puritate (se va folosi THF de puritate 99,5 %). Rezervorul pentru solvent (la nevoie, pus în atmosferă de gaz inert) trebuie să fie suficient de mare pentru a permite etalonarea coloanei ș(cid:13)i mai multe analize de eș(cid:13)antioane. Solventul va fi degazat înainte de a fi pompat în coloană. 276 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 1. 6. 10. Reglarea temperaturii Temperatura componentelor interne critice (bucla de injecție, coloana sau coloanele, detectorul ș(cid:13)i tuburile) trebuie să fie constantă ș(cid:13)i compatibilă cu solventul ales. 1. 6. 11. Detectorul Detectorul înregistrează în mod cantitativ concentrația eș(cid:13)antionului eluat din coloană. Pentru evitarea unei lărgimi nedorite a picului, volumul cuvei detectorului va fi ales cât mai mic posibil. Acesta nu trebuie să depăș(cid:13)ească 10 μl, cu excepția detectoarelor ce funcționează prin difuzia luminii ș(cid:13)i a viscozimetrelor. În general, detecția se realizează prin refractometrie diferențială. Totuș(cid:13)i, dacă proprietățile specifice ale eș(cid:13)antionului sau ale solventului pentru eluare o cer, se pot folosi alte tipuri de detectoare, cum ar fi cele UV/VIS sau IR, viscozimetrele etc. 2. REZULTATE Ș(cid:13) I PROCESUL-VERBAL AL TESTĂRII 2. 1. Rezultate Se va face referință la normele DIN (1) pentru ceea ce priveș(cid:13)te criteriile de evaluare detaliate, la fel pentru specificațiile relative la colectarea ș(cid:13)i interpretarea datelor. Pentru fiecare eș(cid:13)antion analizat, se vor realiza două experiențe independente. Rezultatele acestora se vor analiza separat. În toate cazurile, este esențial să se determine ș(cid:13)i datele relative la blancuri, acestea fiind tratate în acelaș(cid:13)i mod ca eș(cid:13)antioanele. Trebuie indicat în mod explicit că valorile măsurate sunt valori relative corespunzând unor echivalenți de masă moleculară ale standardului folosit. După determinarea volumelor ș(cid:13)i a timpilor de retenție (eventual corectate cu ajutorul unui standard intern) se vor reprezenta grafic valorile log MP (MP fiind semnalul maxim al polimerilor standard), în funcție de una dintre acele cantități. Sunt necesare cel puțin 2 puncte de etalonare pentru fiecare factor 10 de masă moleculară. Pentru trasarea întregii curbe sunt necesare cel puțin 5 puncte de măsură; această curbă va acoperi masa moleculară estimată a eș(cid:13)antionului. Punctul extrem al curbei de etalonare, spre partea maselor moleculare mici, se poate defini folosind n-hexilbenzenul sau altă substanță dizolvată nepolară adecvată. Se determină porțiunea de curbă corespunzătoare maselor moleculare mai mici de 1 000ș(cid:13)i se va corecta, dacă va fi necesar, luând în considerare prezența impurităților ș(cid:13)i a aditivilor. În general, curbele de eluare sunt evaluate prin intermediul unui sistem de prelucrare informatică a datelor. Dacă s-a optat pentru o prelucrare manuală, este indicat să se consulte ASTM D 3536-91 (3). Dacă un polimer insolubil este reținut în coloană, masa sa moleculară este, foarte probabil, superioară celei corespunzătoare fracțiunii solubile ș(cid:13)i trebuie ținut cont de aceasta, pentru a evita subestimarea conținutului în polimeri de masă moleculară mică. În anexă se află indicațiile ce permit corecția conținutului în polimeri de masă moleculară mică, luând în considerare polimerii insolubili. Curba de distribuție va fi prezentată sub forma unui tabel sau a unui grafic (frecvența diferențială sau procentajele cumulative în funcție de log M). În cazul reprezentării grafice, o putere de 10 pentru masa moleculară corespunde în mod normal unei lărgimi de aproximativ 4 cm, în vreme ce pentru maximul de semnal este adecvată o înălțime de aproximativ 8 cm. În cazul curbelor de distribuție cumulative, diferența între 0-100 % pe axa ordonatei trebuie să fie în jur de 10 cm. 2. 2. Procesul-verbal al testării Procesul-verbal al experimentului va cuprinde informațiile următoare: 2. 2. 1. Substanța testată: — informații disponibile legate de substanța testată (natură, aditivi, impurități); — descrierea tratamentului aplicat eș(cid:13)antionului, observații, probleme. 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 277 2. 2. 2. Dispozitivul experimental: — un rezervor pentru solvent, gaz inert, sistem pentru degazarea solventului, compoziția solventului, impurități; — pompă, amortizor de impulsuri, sistem de injecție; — coloane de separare (fabricant, toate precizările legate de caracteristicile coloanei, cum ar fi dimensiunea porilor, natura materialului de separare etc. , numărul, lungimea ș(cid:13)i ordinul coloanelor utilizate); — numărul de talere teoretice ale coloanei (sau al combinației de coloane), eficacitatea separării (resorbția sistemului); — informații legate de simetria semnalelor maxime; — temperatura coloanei, modul de reglare a temperaturii; — detector (principiul de măsurare, tip, volumul cuvei); — debitmetru, dacă există (fabricant, principiul de măsurare); — sistemul utilizat pentru culegere ș(cid:13)i prelucrarea datelor (echipament ș(cid:13)i programe informatice). 2. 2. 3. Etalonarea sistemului: — descrierea detaliată a metodei utilizate pentru determinarea curbei de etalonare; — precizări asupra criteriilor de calitate proprii acestei metode (de exemplu coeficientul de corelare, eroarea pătratică medie etc. ); — informații asupra tuturor extrapolărilor, ipotezelor ș(cid:13)i aproximărilor efectuate în cursul proceselor experimentale, precum ș(cid:13)i asupra evaluării ș(cid:13)i prelucrării datelor; — toate măsurătorile efectuate pentru stabilirea curbei de etalonare trebuie prezentate sub forma unui tabel care cuprinde, pentru fiecare punct de etalonare, următoarele informații: — denumirea eș(cid:13)antionului; — fabricantul eș(cid:13)antionului; — valorile caracteristice MP, Mn, Mw, Mw/Mn ale etaloanelor furnizate de fabricant, deduse din măsurătorile ulterioare, completate de indicațiile legate de metoda de determinare; — volumul de injecție ș(cid:13)i concentrația substanței injectate; — valoarea de MP utilizată pentru etalonare; — volumul de eluare sau timpul de retenție corectat, măsurat la semnalul maxim; — MP calculat la semnalul maxim; — procentajul de eroare la MP calculat ș(cid:13)i la valoarea de etalonare. 2. 2. 4. Informații asupra conținutului în polimeri cu masă moleculară mică: — descrierea metodelor de analiză utilizate ș(cid:13)i a modului în care au fost conduse experimentele; — informații privind procentajul conținutului în specii de masă moleculară mică (greutate/greutate) în raport cu ansamblul eș(cid:13)antionului; — informații legate de impurități, aditivi ș(cid:13)i alte substanțe nepolimerice, în procentaj ponderal, funcție de ansamblul eș(cid:13)antionului. 2. 2. 5. Evaluare: — evaluare în funcție de timp: toate metodele care vizează ameliorarea reproductivității cerute (metode de corecție, standard intern etc. ); — se precizează dacă evaluarea s-a efectuat plecând de la volumul de eluare sau de la timpul de retenție; — se indică limitele de evaluare, dacă un pic nu a fost complet analizat; — se descriu metodelor de netezire, dacă s-au folosit; 278 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 — se indică procedeelor de preparare ș(cid:13)i pretratare a eș(cid:13)antionului; — dacă există, se indică prezența particulelor nedizolvate; — se indică volumul de injecție (μl) ș(cid:13)i concentrația de injecție (mg/ml); — se menționează observațiile privind efectele generatoare de deviații, în raport cu profilul ideal de cromatografie pe gel permeabil; — se descriu în detaliu toate modificările aduse procedurilor de analiză; — se precizează intervalele de eroare; — se consemnează orice alte informații ș(cid:13)i observații utile pentru interpretarea rezultatelor. 3. REFERINȚE BIBLIOGRAFICE (1) DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatografie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1. (2) Yau, W. W. , Kirkland, J. J. , and Bly, D. D. eds. (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley & Sons. (3) ASTM D 3536-91 (1991) Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPG). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. (4) ASTM D 5296-92 (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 279 Anexă Indicații care permit corecția conținutului de polimeri cu masă moleculară mică, luând în considerare polimerii insolubili Prezența unui polimer insolubil într-un eș(cid:13)antion antrenează o pierdere de masă în cursul analizei cromatografice pe gel permeabil. Polimerul insolubil este ireversibil reținut în coloană sau în filtrul eș(cid:13)antionului, atunci când partea solubilă a eș(cid:13)antionului traversează coloana. Dacă indicele de refracție diferențial (dn/dc) al polimerului poate fi estimat sau măsurat, este posibilă estimarea masei pe care eș(cid:13)antionul a pierdut-o în coloană. În acest caz, se efectuează o corecție cu ajutorul unui etalon extern al refractometrului, cu etaloane având concentrația ș(cid:13)i raportul dn/dc, cunoscute. În exemplul următor, s-a utilizat un etalon de poli(metacrilat de metil). Etalonarea externă, practicată în timpul analizei polimerilor acrilici, constă în analizarea cu ajutorul metodei cromatografice pe gel permeabil a unei soluții etalon de poli(metacrilat de metil) în tetrahidrofuran, cu concentrația cunoscută; rezultatele servesc la calcularea constantei refractometrului, conform ecuației următoare: K = R/(C × V × dn/dc) unde: K R C V este constanta refractometrului (µV sec/ml); este răspunsul etalonului de polimetacrilat de metil (µV sec); este concentrația etalonului de polimetacrilat de metil (mg/ml); este volumul de injecție (ml) ș(cid:13)i dn/dc este indicele de refracție diferențial al unei soluții de polimetacrilat de metil în tetrahidrofuran (ml/mg). Următoarele date caracterizează în general un etalon de polimetacrilat de metil: R C = 2 937 891 = 1,07 mg/ml V = 0,1 ml dn/dc = 9. 10-5 ml/mg. Valoarea K rezultată, 3,05 × 1011, este apoi utilizată pentru a calcula răspunsul teoretic al detectorului, adică ceea ce s-ar obține dacă 100 % din polimerul injectat s-ar alege la traversarea detectorului. 280 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 ANEXA III C A. 20. COMPORTAMENTUL DE DIZOLVARE – EXTRACȚIE AL POLIMERILOR ÎN APĂ 1. METODA Metoda descrisă urmează orientarea OCDE TG 120 (1997). Mai multe informații tehnice se găsesc în referințele bibliografice (1). 1. 1. Introducere În cazul anumitor polimeri, cum ar fi polimerii în emulsie, poate fi necesar un tratament inițial, înainte de utilizarea metodei expuse. Metoda nu este aplicabilă polimerilor lichizi, nici polimerilor care reacționează cu apa în condițiile experimentale. Dacă este dificil sau imposibil să se pună în practică metoda, comportamentul de dizolvare-extracție al polimerilor poate fi studiat cu ajutorul altor metode. În acest caz, metoda utilizată va fi în întregime detaliată ș(cid:13)i justificată. 1. 2. Substanțe de referință Nici una 1. 3. Principiul metodei Comportamentul de dizolvare-extracție al polimerilor în mediu apos se determină prin metoda flaconului (vezi A. 6. , Solubilitatea în apă, metoda flaconului), căreia i se vor aduce modificările descrise mai jos. 1. 4. Criterii calitative Fără 1. 5. Descrierea metodei 1. 5. 1. Aparatură Aparatura necesară pentru aplicarea metodei este următoarea: — un dispozitiv care permite măcinarea eș(cid:13)antionului până la obținerea unei pulberi, cum ar fi un concasor ce produce particule de dimensiuni determinate; — un sistem de agitare, cu posibilitatea de reglare a temperaturii; — un sistem de filtrare cu membrane; — un dispozitiv de analiză; — site standardizate. 1. 5. 2. Prepararea soluției de eș(cid:13)antion Inițial trebuie măcinat un eș(cid:13)antion reprezentativ, până la dimensiuni ale particulelor cuprinse între 0,125 ș(cid:13)i 0,25 mm, utilizând sitele potrivite. Poate fi necesară o răcire pentru a garanta stabilitatea eș(cid:13)antionului sau pentru a se proceda la concasare. Materialele de tipul cauciucului pot fi pulverizate la temperatura azotului lichid (1). Dacă nu este posibilă obținerea de particule la dimensiunile cerute, se vor reduce dimensiunile acestora cât mai mult posibil ș(cid:13)i se va consemna rezultatul. În cuprinsul raportului, este necesar să se indice modul în care eș(cid:13)antionul pulverizat a fost conservat înainte de analiză. 1. 5. 3. Mod de lucru Se cântăresc trei eș(cid:13)antioane din substanța testată, fiecare de 10 g, în trei recipiente prevăzute cu dop de sticlă ș(cid:13)i se adaugă câte 1 000 ml apă în fiecare recipient. Dacă manipularea a 10 g de polimer se dovedeș(cid:13)te imposibilă, este indicat să se folosească cea mai mare cantitate care poate fi manipulată; volumul de apă va fi mărit în mod proporțional. 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 281 Recipientele se vor închide bine, apoi se vor agita la temperatura de 20 °C. Se va folosi un dispozitiv de agitare care funcționează la temperatură constantă. După 24 ore, conținutul fiecărui recipient este centrifugat sau filtrat, iar concentrația polimerului în faza apoasă limpede, va fi determinată cu ajutorul unei metode potrivite de analiză. Dacă nu există o metodă adecvată, care să permită o analiză în faza apoasă, se poate obține o estimare a solubilității - extractibilității totale, prin cântărirea, după uscare, a reziduu-lui filtrat sau a precipitatului centrifugat. De asemenea, este necesară diferențierea cantitativă a impurităților ș(cid:13)i aditivilor, pe de o parte, ș(cid:13)i a speciilor de masă moleculară mică, pe de altă parte. În cazul unei determinări gravimetrice, este important să se realizeze o analiză inițială, fără substanță de testare, în scopul de a lua în considerare reziduurile generate prin metoda experimentală. În mod similar, se poate determina comportamentul de dizolvare-extracție al polimerilor în apă, la 37 °C, pentru pH 2 ș(cid:13)i pH 9, aș(cid:13)a cum a fost descrisă experiența realizată la 20 °C. Valorile pH-ului pot fi obținute prin adăugare de soluții-tampon adecvate sau adăugare de acizi ori baze potrivite; dintre acestea, se pot enumera: acid clorhidric, acid acetic, hidroxizi de sodiu ș(cid:13)i de potasiu de calitate analitică sau amoniac. Trebuie realizate una sau două experiențe, conform metodei. În cazul în care sunt disponibile metode suficient de specifice pentru analizarea directă a polimerului în faza apoasă, un experiment ca acela descris mai sus este destul. Însă atunci când aceste metode nu există, iar determinarea comportamentului de dizolvare-extracție al polimerului nu se poate face decât indirect – respectiv prin determinarea conținutului în carbon organic total (COT) al extractului apos –, este necesară o experiență suplimentară. De asemenea, ș(cid:13)i aceasta se va face în triplicat, cu eș(cid:13)antioane de polimer de 10 ori mai mici ș(cid:13)i cu aceleaș(cid:13)i cantități de apă, ca ș(cid:13)i la primul experiment. 1. 5. 4. Analiza 1. 5. 4. 1. E x p e r i m e n t e r e a l i z a t e c u eș(cid:13) a n t i o a n e d e d i m e n s i u n i u n i c e Este posibil să dispunem de metode care permit o analiză directă a polimerilor, în fază apoasă. În caz contrar, poate fi luată în considerare analiza indirectă a polimerilor dizolvați sau extraș(cid:13)i. Pentru aceasta, se va determina conținutul total în părți solubile, care se va corecta ținând cont de substanțele nepolimerice. Pentru a determina conținutul total în specii polimerice, analiza extrasului apos se poate realiza: fie printr-o metodă suficient de sensibilă, de exemplu: — determinarea COT cu persulfat sau dicromat, pentru a se obține CO2, urmată de o estimare prin IR sau de o analiză chimică; — spectrometria de absorbție atomică (SAA) sau echivalentul acesteia, emisie în plasmă cuplată prin inducție (PCI) în cazul polimerilor ce conțin siliciu sau un metal; — absorbția UV sau spectrofluorimetria pentru polimerii arilici; — cromatografia în fază lichidă cuplată cu spectrometria de masă, pentru eș(cid:13)antioane cu mase moleculare mici, fie prin evaporate completă, în vid, a extrasului apos, urmată de o analiză a reziduului prin spectroscopie (IR, UV etc. ) sau prin SAA-PCI. Dacă o astfel de analiză a fazei apoase este imposibilă, extrasul apos se va obține cu ajutorul unui solvent organic nemiscibil în apă (o hidrocarbură clorurată, de exemplu). Apoi solventul este evaporat ș(cid:13)i reziduul se analizează (prin IR, UV sau SAA-PCI), pentru determinarea conținutului său în polimer specificat. Toți constituenții acestui reziduu, care se dovedesc a fi impurități sau aditivi, trebuie separați, în scopul determinării gradului de dizolvare-extracție al polimerului. Atunci când astfel de substanțe sunt prezente în cantități relativ importante, poate fi necesară supunerea reziduului unei analize cromatografice în fază lichidă, de înaltă performanță, sau în fază gazoasă, de exemplu, în scopul diferențierii acelor impurități prezente de monomeri ș(cid:13)i derivați monomerici, astfel încât conținutul real în aceste ultime specii să poată fi determinat. În anumite cazuri, o simplă evaporare completă a solventului organic, urmată de cântărirea reziduu-lui uscat, poate fi suficientă. 282 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 1. 5. 4. 2. D o z ă r i r e a l i z a t e c u d o u ă eș(cid:13) a n t i o a n e d e m ă r i m i d i f e r i t e Conținutul în carbon organic total trebuie determinat pentru toate extrasele apoase. Se realizează o determinare prin gravimetrie asupra părții nedizolvate sau neextrase a eș(cid:13)antionului. Dacă după centrifugarea sau filtrarea conținutului fiecărui recipient reziduul de polimer aderă încă la peretele recipientului, trebuie clătit respectivul recipient cu filtratul, până când nu se mai observă urme de reziduu. După aceea, filtratul este refiltrat sau centrifugat. Reziduurile depuse pe filtru sau în tubul centrifugei sunt uscate la 40 °C, în vid, apoi se cântăresc. Se va continua uscarea, până la obținerea unei mase constante. 2. REZULTATE 2. 1. Dozări realizate cu eș(cid:13)antioane de dimensiuni unice Rezultatele obținute pentru fiecare dintre cele trei flacoane, precum ș(cid:13)i valorile medii trebuie consemnate ș(cid:13)i exprimate în unități de masă per volum de soluție (în general, în mg/l) sau în unități de masă per masa de eș(cid:13)antion de polimer (de obicei, în mg/g). În plus, pierderea de masă de eș(cid:13)antion (calculată prin raportarea masei soluției la masa inițială de eș(cid:13)antion) va fi de asemenea menționată. Trebuie calculate deviațiile standard relative. Diversele valori vor fi menționate o dată, pentru produsul total (polimer + principalii aditivi etc. ) ș(cid:13)i repetate, pentru polimerul singur (pentru a cunoaș(cid:13)te, după separare, mărimea relativă a respectivilor aditivi). 2. 2. Experimente realizate cu eș(cid:13)antioane de dimensiuni diferite Diferitele concentrații ale carbonului organic total în extrasele apoase, provenite din cele două serii a câte trei experiențe, precum ș(cid:13)i valorile medii pentru fiecare serie, trebuie consemnate ș(cid:13)i exprimate în unități de masă per volum de soluție (în general, în mgC/l), precum ș(cid:13)i în unități de masă per masa de eș(cid:13)antion inițial (de obicei, în mgC/g). Dacă nu există diferențe între rezultatele corespunzătoare rapoartelor dimensiune de eș(cid:13)antion/volum de apă mare sau mic, aceasta poate semnifica faptul că toți constituenții susceptibili a fi extraș(cid:13)i au fost efectiv extraș(cid:13)i. În acest caz, o analiză directă nu este de regulă necesară. Diferitele mase de reziduu trebuie consemnate ș(cid:13)i exprimate în procente de masă inițială de eș(cid:13)antion. Se vor calcula valori medii pentru fiecare experiență. Diferența dintre 100 ș(cid:13)i procentajul obținut reprezintă procentul de materii solubile ș(cid:13)i extractibile din eș(cid:13)antioanele inițiale. 3. PROCESUL-VERBAL AL TESTĂRII 3. 1. Procesul-verbal al testării Procesul verbal al testării trebuie să cuprindă următoarele informații: 3. 1. 1. Substanța testată: — informații disponibile, legate de substanța testată (natură, aditivi, impurități, proporția speciilor cu masă moleculară mică). 3. 1. 2. Condiții experimentale: — descrierea metodelor utilizate ș(cid:13)i a condițiilor experimentale; — descrierea metodelor de analiză ș(cid:13)i detecție. 3. 1. 3. Rezultate: — rezultate de solubilitate - extractibilitate în mg/l: toate valorile ș(cid:13)i valorile medii obținute pentru experiențele de extracție în diferite soluții, repartizate în polimeri ș(cid:13)i impurități, aditivi etc. ; — rezultate de solubilitate - extractibilitate în mg/g de polimer; — concentrațiile carbonului organic total în extractele apoase, masa soluției ș(cid:13)i procentajele calculate, dacă s-a făcut măsurarea; 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 283 — pH-ul fiecărui eș(cid:13)antion; — informații privind valorile obținute în experiențele-martor (fără solvent); — dacă este necesar, se va menționa instabilitatea chimică a substanței testate, în cursul procedurii experimentale ș(cid:13)i în cursul analizei; — toate informațiile importante pentru interpretarea rezultatelor. 4. REFERINȚE BIBLIOGRAFICE (1) DIN 53733 (1976) Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen für Prüfzwecke. 284 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 ANEXA III D C. 13 BIOCONCENTRAREA: EXPERIENȚA CU REÎNNOIRE CONTINUĂ ASUPRA PEȘ(cid:13) TILOR 1. METODA Prezenta metodă de bioconcentrare reproduce directivele OECD TG 305 (1996). 1. 1. Introducere Prezenta metodă descrie o procedură de caracterizare a potențialului de bioconcentrare în cazul peș(cid:13)tilor supuș(cid:13)i la o reînnoire continuă a anumitor substanțe. Regimurile experimentale cu reînnoire continuă sunt de departe preferate, dar ș(cid:13)i cele semistatice sunt acceptate, în măsura în care sunt îndeplinite criteriile de validitate. Metoda oferă toate informațiile necesare executării experimentului, însă lasă libertatea indispensabilă de adaptare a conceptului experimental la condițiile specifice fiecărui laborator ș(cid:13)i nu impune în mod strict caracteristicile substanțelor testate. În special, sunt indicate produsele organice stabile, pentru care valorile log Pow sunt cuprinse între 1,5 ș(cid:13)i 6,0 (1), însă metoda este aplicabilă ș(cid:13)i substanțelor superlipofile (log Pow > 6,0). Pentru acestea din urmă, estimarea prealabilă a factorului de bioconcentrare (BCF), denumit uneori KB, va fi probabil superioară valorii factorului de bioconcentrare în starea staționară (BCFSS), la care ne putem aș(cid:13)tepta în cazul unei experiențe de laborator. Evaluările preliminare ale factorului de bioconcentrare pentru produsele organice ale căror valori log Pow ajung până la aproximativ 9,0 pot fi calculate cu ajutorul ecuației Bintein ș(cid:13)i al (2). Potențialul de bioconcentrare se caracterizează pentru anumiți parametrii, cum ar fi: constanta de viteză de absorbție (k1), constanta de viteză de eliminare (k2)ș(cid:13)i BCFSS. Substanțele experimentale marcate radioactiv pot facilita analiza eș(cid:13)antioanelor de apă ș(cid:13)i de peș(cid:13)ti; de asemenea, pot servi la definirea degradării, dacă este necesar să o identificăm ș(cid:13)i să o cuantificăm. Dacă se măsoară totalul de reziduu radioactiv (de exemplu prin combustia ori solubilizarea țesuturilor), BCF-ul se bazează pe compusul de origine, toți metaboliții reținuți ș(cid:13)i carbonul asimilat. Factorii BCF care se bazează pe reziduurile radioactive totale nu pot fi, aș(cid:13)adar, comparați direct cu un factor BCF derivat dintr-o analiză chimică particulară exclusiv a compusului de origine. Proceduri de epurare pot fi utilizate, în cadrul studiilor cu markeri radioactivi, pentru determinarea BCF pe baza compusului original, iar principalii metaboliți vor fi determinați dacă se consideră necesar. De asemenea, există posibilitatea combinării unui studiu de metabolism al peș(cid:13)tilor, cu un studiu de bioconcentrare, prin analiza ș(cid:13)i identificarea reziduurilor tisulare. 1. 2. Definiții ș(cid:13)i unități Bioconcentrare/Bioacumulare: creș(cid:13)terea concentrației substanței testate la/sau într-un organism (țesuturile specifice ale acestuia) în raport cu concentrația acestei substanțe în mediul ambiant. Factor de bioconcentrare (BCF sau KB): în orice moment din faza de absorbție a experienței de acumulare, concentrația substanței testate la/în peș(cid:13)ti sau pe țesuturi determinate ale acestora [Cf în µg/g (ppm)], raportată la concentrația substanței chimice din mediul ambiant [CW în µg/ml (ppm)]. Factor de bioconcentrare în stare staționară (BCFSS sau KB): nu se modifică prea mult într-o perioadă mare de timp, concentrația substanței experimentale din mediul ambiant fiind constantă pentru aceeaș(cid:13)i perioadă de timp. Platoul sau starea staționară: în reprezentarea grafică a substanței experimentale la peș(cid:13)ti (Cf), funcție de timp, este de aș(cid:13)teptat pentru curbă să devieze paralel față de axa timpului, iar pentru trei analize succesive ale Cf – realizate asupra unor eș(cid:13)antioane prelevate la intervale de cel puțin două zile – să rămână într-o plajă de 20 % una față de alta; nu există diferențe semnificative între cele trei perioade de eș(cid:13)antionare. Când se analizează eș(cid:13)antioane reunite, se efectuează minimum patru analize succesive. Dacă substanțele experimentale au caracteristici de absorbție lente, este preferabil să se opteze pentru intervale săptămânale. 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 285 Factori de bioconcentrare: se calculează direct, plecând de la constantele cinetice (k1/k2), se numesc factori de concentrare cinetică, BCFk. Coeficient de partiție octanol-apă (POW): raportul de solubilitate a unui produs chimic în n-octanol ș(cid:13)i în apă, la echilibru (Metoda A. 8), de asemenea desemnat prin KOW. Logaritmul lui POW indică potențialul de bioconcentrare al unui produs chimic în organismele acvatice. Faza de expunere sau de absorbție: timpul în care peș(cid:13)tii sunt expuș(cid:13)i la produsul chimic testat. Constanta de viteză de absorbție (k1): valoare numerică ce defineș(cid:13)te viteza de creș(cid:13)tere a concentrației substanței testate la/în peș(cid:13)ti (sau în țesuturile specifice ale acestora), atunci când sunt expuș(cid:13)i la acea substanță chimică (k1 este exprimată în zile-1). Faza de post-expunere sau de eliminare (pierdere): ca urmare a transferării peș(cid:13)tilor dintr-un mediu care conține substanța testată într-un mediu care nu conține acea substanță, timp în care eliminarea (sau pierderea netă) de substanță de către peș(cid:13)ti (sau de către țesuturile specifice) este studiată. Constanta de viteză de eliminare (pierdere) (k2): valoare numerică ce defineș(cid:13)te viteza de scădere a concentrației substanței testate la/în peș(cid:13)ti (sau în țesuturile specifice ale acestora), ca urmare a transferării lor dintr-un mediu care conține substanța testată într-un mediu care nu conține acea substanță (k2 este exprimată în zile-1). 1. 3. Principiul metodei experimentale Experimentul se împarte în două faze: faza de expunere (absorbție) ș(cid:13)i de post-expunere (eliminare). În cursul fazei de absorbție, grupele separate de peș(cid:13)ti dintr-o specie sunt supuse la cel puțin două concentrații ale substanței totale. Apoi aceș(cid:13)tia sunt transferați într-un mediu care nu conține respectiva substanță, pentru faza de eliminare. Aceasta din urmă este întotdeauna necesară, în afară de cazul în care absorbția substanței în timpul fazei de absorbție a fost nesemnificativă (de exemplu, dacă BCF este mai mic de 10). Concentrația substanței testate la/în peș(cid:13)ti (sau în țesuturile specificate ale acestora) este urmărită de-a lungul celor două faze ale experimentului. În afară de cele două concentrații experimentale, un grup martor de peș(cid:13)ti este menținut în condiții identice, cu excepția substanței testate, care este absentă. Acest lucru este necesar pentru stabilirea eventualelor relații între efectele nefaste observate la testul de bioconcentrare ș(cid:13)i acest grup martor, precum ș(cid:13)i pentru deducerea concentrației de bază a substanței testate. Faza de absorbție durează 28 de zile, în cazul în care nu se demonstrează mai devreme că a fost atins echilibrul. Se poate estima durata fazei de absorbție ș(cid:13)i timpul necesar pentru obținerea stării staționare cu ajutorul ecuațiilor din anexa 3. Perioada de epurare începe aș(cid:13)adar cu transferarea peș(cid:13)tilor în alt recipient curat, conținând acelaș(cid:13)i mediu, cu excepția substanței testate. Atunci când devine posibil, se calculează factorul de bioconcentrare, de preferință sub formă de raport (BCFSS) de concentrație de peș(cid:13)ti (Cf)ș(cid:13)i în apă (CW), în starea de echilibru aparent ș(cid:13)i în calitate de factor de bioconcentrare cinetică, ș(cid:13)i BCFk ca ș(cid:13)i raport al constantelor de viteză de absorbție (k1)ș(cid:13)i de epurare (k2), considerând o cinetică de ordinul întâi. Dacă se constată că nu a urmat o cinetică de ordinul întâi, trebuie utilizate modele mai complexe (anexa 5). Dacă nu se obține o stare staționară în 28 de zile, faza de absorbție se va prelungi până la obținerea acesteia sau timp de 60 de zile, preferându-se alternativa cea mai scurtă; apoi începe faza de eliminare. Constanta de viteză de absorbție, constanta de viteză de epurare (pierdere) (sau constantele, atunci când este vorba de modele complexe), factorul de bioconcentrare ș(cid:13)i, dacă este posibil, limitele de încredere pentru fiecare dintre aceș(cid:13)ti parametri, sunt calculate pornind de la modelul care descrie cel mai fidel măsurătorile de concentrație a substanței testate, în peș(cid:13)ti ș(cid:13)i în apă. Factorul BCF se exprimă în funcție de greutatea totală umedă de peș(cid:13)te. Totuș(cid:13)i, pentru anumite studii, pot fi utilizate țesuturi sau organe specifice (de exemplu muș(cid:13)chi, ficat), dacă peș(cid:13)tii sunt suficient de mari sau dacă pot fi separați în părți comestibile (fileuri) ș(cid:13)i necomestibile (viscere). Existând o relație clară care leagă potențialul de bioconcentrare ș(cid:13)i lipofilia pentru numeroase substanțe organice, va exista ș(cid:13)i o relație corespunzătoare între conținutul lipidic la peș(cid:13)tii pentru experiență ș(cid:13)i bioconcentrațiile observate pentru aceste substanțe. Aș(cid:13)adar, pentru a elimina această variabilă din rezultatele experiențelor cu substanțe foarte lipofile (adică având log POW > 3), bioconcentrarea trebuie exprimată în funcție de masa corporală totală ș(cid:13)i de conținutul lipidic. 286 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 Dacă este posibil, conținutul determinarea concentrației substanței testate. lipidic se va stabili folosind acelaș(cid:13)i material biologic care a servit la 1. 4. Informații despre substanța testată Înainte de a executa experiența de bioconcentrare, următoarele informații trebuie cunoscute despre substanța testată: (a) solubilitatea în apă; (b) coeficientul de partiție octanol-apă POW (de asemenea, KOW, determinat printr-o metodă HPLC în A. 8); (c) hidroliza; (d) fototransformarea în apă, la radiația solară sau solară artificială simulată ș(cid:13)i în condițiile de radiații ale experienței de bioconcentrare (3); (e) tensiunea superficială (adică pentru substanțele la care log POW nu a putut fi măsurat); (f) presiunea de vapori; (g) biodegradabilitatea numită „facilă” (dacă este cazul). De asemenea, trebuie cunoscută toxicitatea relativă pentru specia de peș(cid:13)ti utilizată pentru experiență, de preferință LC50 asimptotică (adică independentă de timp). Este indispensabil să se utilizeze o metodă analitică potrivită cu exactitatea, precizia ș(cid:13)i sensibilitatea cunoscute, pentru a cuantifica substanța testată în soluția experimentală ș(cid:13)i în materialul biologic, precum ș(cid:13)i informații precise legate de prepararea ș(cid:13)i păstrarea eș(cid:13)antioanelor. De asemenea, trebuie să fie cunoscută limita de detecție analitică a substanței testate, atât în apă, cât ș(cid:13)i în țesuturile peș(cid:13)tilor. Dacă se utilizează o substanță pentru testat marcată cu 14C, trebuie cunoscut procentajul de radioactivitate asociat impurităților. 1. 5. Condițiile de validitate ale testării Pentru ca un test să fie valabil, trebuie îndeplinite următoarele condiții: — variația de temperatură să fie mai mică de ± 2 °C; — concentrația oxigenului dizolvat să nu coboare sub 60 % din nivelul de saturație; — concentrația substanței testate în vase să fie menținută la ± 20 % din media valorilor măsurate în timpul fazei de absorbție; — mortalitatea ș(cid:13)i alte efecte sau maladii indezirabile înregistrate la peș(cid:13)tii-martor sau la cei supuș(cid:13)i experimentului să fie mai mici de 10 % la sfârș(cid:13)itul experimentului; atunci când experimentul se prelungeș(cid:13)te pe mai multe săptămâni sau luni, mortalitatea sau alte efecte indezirabile apărute la cele două grupe de peș(cid:13)ti trebuie să fie mai mici de 5 % pe lună ș(cid:13)i să nu depăș(cid:13)ească 30 % în total. 1. 6. Compuș(cid:13)i de referință Utilizarea compuș(cid:13)ilor de referință având un potențial de bioconcentrare cunoscut, ar putea sprijini controlul asupra procedurii experimentale, dacă este necesar. Totuș(cid:13)i, nu se pot încă recomanda substanțe specifice. 1. 7. Descrierea metodei experimentale 1. 7. 1. Aparatura Se vor evita materialele care pot prezenta un efect indezirabil de absorbție, de dizolvare sau de lesivaj asupra peș(cid:13)tilor, ș(cid:13)i aceasta pentru toate echipamentele folosite. Se vor utiliza bazine standard rectangulare sau cilindrice, din materiale inerte chimic, de capacitate adaptată regimului de umplere. Se va reduce la mimimum folosirea de țevi din plastic flexibil. Este preferabilă tubulatura din teflon (R), oțel inoxidabil ș(cid:13)i/sau sticlă. Experiențele au dovedit că, pentru substanțele cu coeficienți mari de absorbție, cum ar fi piretrinele de sinteză, poate fi necesară sticla silanizată. În acest caz, echipamentul se va arunca după utilizare. 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 287 1. 7. 2. Apa În general se utilizează apă naturală, provenită dintr-o sursă nepoluată ș(cid:13)i de calitate uniformă. Calitatea apei utilizate pentru diluție trebuie să permită supraviețuirea speciei de peș(cid:13)ti aleasă, în perioada de aclimatare ș(cid:13)i în cursul experimentului, fără apariția vreunui comportament anormal. În cazul ideal, ar trebui demonstrat că speciile supuse experimentului pot supraviețui, creș(cid:13)te ș(cid:13)i reproduce în apa de diluție (de exemplu prin creș(cid:13)tere în laborator sau printr-un studiu de toxicitate asupra unui ciclu biologic). Apa va fi caracterizată cel puțin prin pH, duritate, materii solide totale, carbon organic total ș(cid:13)i, de preferință, prin conținutul de substanțe amoniacale, nitrați ș(cid:13)i alcalinitate; pentru speciile marine, apa va fi caracterizată ș(cid:13)i prin salinitate. Se cunosc perfect principalii parametrii optimi pentru peș(cid:13)ti, iar anexa 1 indică concentrațiile maxime recomandate unui anumit număr de parametri privind apa folosită la experiment, dulce ș(cid:13)i marină. Pe toată perioada testării, apa trebuie să fie de calitate constantă. pH-ul se aduce la valori cuprinse între 6,0 ș(cid:13)i 8,5, însă pentru un experiment dat, pH-ul trebuie să rămână în interiorul unei plaje de ± 0,5 unități de pH. Pentru a avea siguranța că apa de diluție nu influențează rezultatele studiului (de exemplu prin complexarea substanței testate) sau că nu afectează negativ performanțele stocului de peș(cid:13)ti, se vor preleva în mod regulat eș(cid:13)antioane pentru analiză. De exemplu, este convenabil de făcut aceasta o dată la trei luni, interval în care o apă de diluție îș(cid:13)i păstrează calitățile relativ constante; se determină metalele grele (de exemplu Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), anionii ș(cid:13)i cationii principali (de exemplu Ca, Mg, Na, K, Cl, SO4), pesticidele (de exemplu cele organofosforice totale ș(cid:13)i cele organoclorurate totale), carbonul organic total ș(cid:13)i solidele aflate în suspensie. Dacă se demonstrează constanța calităților apei, pe parcursul a cel puțin un an, aceste analize se pot rări, iar intervalele dintre ele pot fi distanțate (de exemplu la ș(cid:13)ase luni). Conținutul în particule naturale, precum ș(cid:13)i în carbon organic total (TOC) din apa de diluție vor fi cât mai mici posibil, pentru a evita absorbția substanței testate în materiile organice, ceea ce i-ar putea reduce biodisponibilitatea (4). Valoarea maximă admisă este de 5 mg/l, pentru particulele de materie (materia uscată nu trece printr-un filtru de 0,45 µm) ș(cid:13)i de 2 mg/l, pentru carbonul organic total (vezi anexa 1). Dacă este necesar, apa se va filtra înainte de utilizare. De asemenea, contribuțiile peș(cid:13)tilor testați (excreții), ale reziduurilor alimentare, ca ș(cid:13)i conținutul apei în carbon organic total trebuie să fie cât mai mici posibil. De-a lungul întregului experiment, concentrația în carbon organic din recipient nu trebuie să depăș(cid:13)ească cu mai mult de 10 mg/l (± 20 %), concentrația de carbon organic provenit din substanța testată ș(cid:13)i, eventua, pe cea a agentului de dizolvare. 1. 7. 3. Soluții de testat Se prepară o soluție stoc de substanță de testat, la concentrația dorită. De preferință, soluția stoc va fi preparată prin simplă amestecare ori agitare a substanței testate, în apa de diluție. Nu este recomandată utilizarea solvenților sau a dispersanților (agenți de dizolvare); se poate totuș(cid:13)i recurge la aceș(cid:13)tia, în anumite situații, pentru producerea soluției stoc, la concentrația necesară. Solvenții susceptibili a fi utilizați sunt: etanol, metanol, eterul monometilic de etilen glicol, eterul dimetilic de etilen glicol, dimetilformamida ș(cid:13)i trietilen glicolul. Dispersanții utilizabili sunt: Cremophor RH40, Tween 80, metilceluloză 0,01 % ș(cid:13)i HCO-40. Se vor lua măsuri de precauție în cazul utilizării agenților uș(cid:13)or biodegradabili, aceș(cid:13)tia putând provoca probleme de creș(cid:13)tere bacteriană în testele cu reînnoire continuă. Substanța testată poate fi marcată radioactiv ș(cid:13)i trebuie să aibă cea mai mare puritate posibilă (de exemplu, de preferință, > 98 %). Pentru experimentele cu reînnoire continuă, se va utiliza aparatură care să aducă ș(cid:13)i să dilueze în permanență soluția stoc de substanță testată (cum ar fi pompe dozatoare, diluator proporțional, sistem saturator), pentru a aduce concentrațiile experimentale până la recipiente. Trebuie prevăzute minimum cinci volume de înlocuitor pe zi, pentru fiecare incintă experimentală. Se optează pentru metoda cu reînnoire continuă, însă dacă aplicarea acesteia devine imposibilă (de exemplu, organismele din cadrul experimentului suferă efecte nefaste), se poate recurge la o tehnică semistatică, în cazul în care criteriile de validare rămân satisfăcătoare. Debitul soluțiilor stoc ș(cid:13)i al apei de diluție va fi controlat cu 48 de ore înainte de experiment, iar în cursul în fiecare incintă derulării acestuia, cel puțin zilnic. Controlul comportă determinarea debitului experimentală, având grijă ca acesta să nu difere cu mai mult de 20 % pentru fiecare dintre ele. 288 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 1. 7. 4. Selecția speciilor Printre criteriile importante de selecție a speciilor figurează cel al facilității de procurare, dimensiunea ș(cid:13)i posibilitatea întreținerii uș(cid:13)oare în laborator. De asemenea, speciile de peș(cid:13)ti se aleg în funcție de importanța lor în materie de distracții, comerț sau ecologie. Speciile de peș(cid:13)ti trebuie să fie de sensibilitate comparabilă, să fi produs rezultate bune anterior etc. În anexa 2 se află o listă de specii recomandate pentru experiențe. Pot fi utilizate ș(cid:13)i alte specii, însă atunci procedura experimentală ar putea avea nevoie de adaptări, pentru a se determina condiții experimentale adecvate. Într-un asemenea caz, se expun motivațiile alegerii speciilor ș(cid:13)i a metodei experimentale folosite. 1. 7. 5. Păstrarea peș(cid:13)tilor Populația de peș(cid:13)ti trebuie aclimatizată timp de cel puțin două săptămâni, în apă aflată la temperatura experimentală, oferindu-li-se hrană suficientă ș(cid:13)i de acelaș(cid:13)i tip cu cea folosită în cursul experimentului. După o perioadă de instalare de 48 de ore, se înregistrează rata mortalității, aplicându-se următoarele criterii: — mortalitate mai mare de 10 % din populație, în ș(cid:13)apte zile: se renunță la întregul lot; — mortalitate cuprinsă între 5 ș(cid:13)i 10 % din populație, în ș(cid:13)apte zile: se prelungeș(cid:13)te perioada de aclimatare cu ș(cid:13)apte zile; — mortalitate mai mică de 5 % din populație, în ș(cid:13)apte zile: se acceptă lotul – dacă mortalitatea depăș(cid:13)eș(cid:13)te 5 % în următoarele ș(cid:13)apte zile, se renunță la întregul lot. Peș(cid:13)tii utilizați pentru experimente nu trebuie să prezinte maladii ș(cid:13)i nici anomalii observabile. Se elimină toți peș(cid:13)tii bolnavi. Peș(cid:13)tii nu vor fi tratați contra nici unei maladii două săptămâni înaintea experimentului ș(cid:13)i nici în cursul acestuia. 1. 8. Executarea testului 1. 8. 1. Testul preliminar Se poate dovedi utilă o experimentare preliminară pentru optimizarea condițiilor de execuție ale experimentului real, în ceea ce priveș(cid:13)te, de exemplu, selecția concentrațiilor substanței testate, duratele fazelor de absorbție ș(cid:13)i de eliminare. 1. 8. 2. Condiții de expunere 1. 8. 2. 1. D u r a t a f a z e i d e a b s o r b ț i e Se poate estima durata fazei de absorbție, cu ajutorul unei experiențe preliminare (de exemplu plecând de la un studiu anterior sau de la un produs chimic cu proprietăți de acumulare) sau pornind de la anumite relații empirice, bazate pe ceea ce se cunoaș(cid:13)te despre solubilitatea în apă ori folosind coeficientul de partiție octanol/apă al substanței testate (a se vedea anexa 3). Faza de absorbție va dura 28 de zile, exceptând cazul în care se poate demonstra că a fost atins un echilibru mai devreme. Dacă nu se ajunge la o stare staționară în decurs de 28 de zile, faza de echilibru se va prelungi ș(cid:13)i se vor face alte măsurători până la obținerea stării staționare sau timp de 60 de zile (are întâietate alternativa cea mai scurtă). 1. 8. 2. 2. D u r a t a f a z e i d e e l i m i n a r e În general, jumătate din durata fazei de absorbție este suficientă pentru a se produce o reducere convenabilă (de exemplu 95 %) a conținutului corporal în substanță testată (a se vedea explicațiile privind estimarea din anexa 3). Dacă timpul necesar pentru realizarea unei pierderi de 95 % este prea lung, depăș(cid:13)ind, de exemplu, de două ori durata fazei de absorbție (adică mai mare de 56 de zile), se poate opta pentru o perioadă mai scurtă (respectiv, până ce concentrația substanței testate devine mai mică cu 10 % din concentrația stării staționare). Totuș(cid:13)i, pentru substanțele având scheme de absorbție ș(cid:13)i eliminare mai complexe decât modelul peș(cid:13)tilor în compartiment unic, după o cinetică de ordinul întâi, se utilizează faze de epurare mai lungi, pentru determinarea constantelor de viteză de eliminare. Această perioadă de timp poate fi totuș(cid:13)i controlată prin intermediul perioadei în care concentrația substanței testate din peș(cid:13)ti se situează deasupra limitei de detecție analitice. 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 289 1. 8. 2. 3. N u m ă r u l d e p eș(cid:13) t i p e n t r u e x p e r i m e n t Alegerea numărului de peș(cid:13)ti pentru concentrația experimentală se face astfel încât să fie disponibili cel puțin patru peș(cid:13)ti per eș(cid:13)antion, la fiecare eș(cid:13)antionare. Dacă se doreș(cid:13)te o statistică mai performantă, numărul peș(cid:13)tilor per eș(cid:13)antion va fi mărit. Dacă se folosesc peș(cid:13)ti adulți, se va indica dacă sunt masculi sau femele, ori dacă ambele sexe servesc experimentului. În această ultimă situație, înainte de a începe expunerea, trebuie verificat ca diferențele de conținut lipidic să nu fie semnificative; s-ar putea dovedi necesară utilizarea de loturi distincte de masculi ș(cid:13)i femele. Toate experiențele se fac utilizând peș(cid:13)ti de greutate asemănătoare, în sensul că cei mai mici nu vor avea o greutate mai mică decât 2/3 din cea a peș(cid:13)tilor cei mai mari. Toți vor aparține aceleiaș(cid:13)i clase de vârstă ș(cid:13)i vor proveni din aceeaș(cid:13)i sursă. Greutatea ș(cid:13)i vârsta unui peș(cid:13)te, având aparent efecte notabile asupra valorilor BCF (1), aceste informații vor fi înregistrate cu precizie. Este indicat ca un subeș(cid:13)antion din populația de peș(cid:13)ti să fie cântărit înainte de experiment, pentru estimarea greutății medii. 1. 8. 2. 4. Î n c ă r c a r e a Raporturile apă/peș(cid:13)ti se măresc în scopul de a minimiza scăderea CW datorită adăugării peș(cid:13)tilor la începutul experimentului, dar ș(cid:13)i pentru a evita diminuarea concentrației în oxigen dizolvat. Este important ca regimul de încărcare să fie adaptat speciei utilizate pentru experiment. Un regim de încărcare de 0,1-1,0 g de peș(cid:13)te (produs viu) la litru de apă ș(cid:13)i pe zi este cel recomandat pentru toate cazurile experimentale. Se pot realiza încărcări mai rapide dacă se demonstrează că se poate ajusta concentrația necesară de substanță testată în limitele de ± 20 % ș(cid:13)i că, de asemenea, concentrația oxigenului dizolvat nu coboară sub 60 % din nivelul de saturare. La alegerea regimului de încărcare se va ține cont de habitatul normal al speciei. De exemplu, peș(cid:13)tii bentonici pot necesita un acvariu cu suprafața fundului mai mare, spre deosebire de speciile pelagice, la acelaș(cid:13)i volum de apă. 1. 8. 2. 5. A l i m e n t a ț i a Pe parcursul perioadelor de alimentare ș(cid:13)i experimentale, peș(cid:13)tii vor fi hrăniți după un regim adecvat, cu un conținut cunoscut în lipide ș(cid:13)i proteine totale, în cantitate suficientă menținerii peș(cid:13)tilor în stare bună de sănătate, astfel încât greutatea lor corporală să se conserve. Peș(cid:13)tii vor fi alimentați zilnic, în perioadele de aclimatare ș(cid:13)i în cele experimentale, cu rații de aproximativ 1 până la 2 % din greutatea lor corporală. Astfel, pentru cea mai mare parte dintre specii, se menține concentrația lipidică la un nivel relativ constant, de-a lungul experimentului. Cantitatea de hrană trebuie recalculată o dată pe săptămână, de exemplu, pentru menținerea greutății corporale ș(cid:13)i a conținutului lipidic la un nivel consistent. Pentru acest calcul, greutatea peș(cid:13)tilor din fiecare incintă experimentală se va estima pornind de la greutatea peș(cid:13)tilor eș(cid:13)antionați cel mai recent, din respectiva incintă. Nu se cântăresc peș(cid:13)tii rămaș(cid:13)i în incintă. Hrana neconsumată ș(cid:13)i excrementele vor fi evacuate zilnic, prin sifonarea incintelor experimentale, la puțin timp după alimentare (30 minute-1 oră). Incintele vor fi menținute cât mai curate posibil în cursul întregului experiment, astfel încât concentrația de materie organică să fie cât mai mică, deoarece prezența carbonului organic poate limita biodisponibilitatea substanței testate (1). Numeroase alimente sunt derivate din făină de peș(cid:13)te; acestea vor fi analizate pentru determinarea conținutului în substanță testată. De asemenea, trebuie analizat conținutul hranei în pesticide ș(cid:13)i metale grele. 1. 8. 2. 6. I l u m i n a r e ș(cid:13) i t e m p e r a t u r ă În general, fotoperioada este de 12-16 ore la temperatura (± 2 °C) corespunzătoare speciei utilizate (vezi anexa 2). Tipul ș(cid:13)i caracteristicile iluminării vor fi clar definite. Se va ține seama de eventualele fototransformări ale substanței testate în condițiile de iradiere ale studiului. Iluminarea nu trebuie să expună peș(cid:13)tii la fotoproduse nenaturale. În anumite cazuri poate fi esențială utilizarea de filtre pentru blocarea radiației UV mai mici de 290 nm. 1. 8. 2. 7. C o n c e n t r a ț i i e x p e r i m e n t a l e Peș(cid:13)tii sunt expuș(cid:13)i la o reînnoire continuă de cel puțin două concentrații apoase ale substanței testate. În mod normal, concentrația mare (sau cea mai mare) a substanței testate este stabilită la aproximativ 1 % din LC50 acută asimptotică ș(cid:13)i de cel puțin 10 ori mai mare decât limita sa de detecție în apă, prin metoda de analiză aleasă. 290 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 Cea mai mare concentrație testată poate fi stabilită ș(cid:13)i împărțind LC50 la 96 ore, printr-un raport procentual adecvat acut/cronic (rapoartele procentuale adecvate ale anumitor produș(cid:13)i chimici pot varia de la 3 la 100). Dacă este posibil, se alege altă concentrație (alte concentrații), astfel încât diferența față de cea căreia îi este superioară să atingă un factor zece. Dacă este imposibil, din cauza criteriului de 1 % al LC50 ș(cid:13)i a limitei analitice, poate fi utilizat un factor inferior celui de zece sau se poate accepta intervenția unei substanțe marcate radioactiv cu 14C. Nici una dintre concentrațiile utilizate nu va depăș(cid:13)i solubilitatea substanței testate. Atunci când se utilizează un agent de dizolvare, concentrația acestuia nu va depăș(cid:13)i 0,1 ml/l ș(cid:13)i trebuie să fie aceeaș(cid:13)i, în toate recipientele pentru experiment. Contribuția sa, adăugată celei a substanței testate, la conținutul global de carbon organic din apa pentru experiment trebuie să fie cunoscute. Totuș(cid:13)i, se va face tot posibilul, să nu se recurgă la astfel de materiale. 1. 8. 2. 8. M a r t o r i Apa de diluție martor sau, dacă este necesar, un martor conținând agentul de dizolvare, va fi disponibil pentru seria de teste, în măsura în care a fost stabilit că agentul nu are nici un efect asupra peș(cid:13)tilor. În caz contrar, se vor folosi doi martori. 1. 8. 3. Frecvența de măsurare a calității apei În cursul experimentului, oxigenul dizolvat, TOC, pH-ul ș(cid:13)i temperatura vor fi măsurate în toate recipientele. Duritatea totală ș(cid:13)i, eventual, salinitatea vor fi măsurate pe martori ș(cid:13)i la un recipient cu conținutul având concentrația mare (cea mai mare). Oxigenul dizolvat ș(cid:13)i, eventual, salinitatea vor fi măsurate de cel puțin trei ori – la începutul, mijlocul ș(cid:13)i sfârș(cid:13)itul perioadei de absorbție – ș(cid:13)i cel puțin o dată pe săptămână, în perioada de eliminare. TOC se va măsura la începutul experimentului (24 ș(cid:13)i 48 ore înainte de demararea fazei de absorbție), înainte de adăugarea peș(cid:13)tilor ș(cid:13)i cel puțin o dată pe săptămână, în perioadele de absorbție ș(cid:13)i de eliminare. Temperatura se va măsura zilnic, pH-ul – la începutul ș(cid:13)i la sfârș(cid:13)itul fiecărei perioade – iar duritatea, o dată pentru fiecare experiment. De preferință, temperatura va fi supravegheată continuu, cel puțin într-unul dintre recipiente. 1. 8. 4. Eș(cid:13)antionarea ș(cid:13)i analiza peș(cid:13)tilor ș(cid:13)i a apei 1. 8. 4. 1. P r o g r a m a r e a eș(cid:13) a n t i o n ă r i i p eș(cid:13) t i l o r ș(cid:13) i a apei Se va preleva apă din incintele experimentale, pentru determinarea concentrației substanței testate, înainte de adăugarea peș(cid:13)tilor ș(cid:13)i în cursul fazelor de absorbție ș(cid:13)i de epurare. Ca un minimum, apa va fi prelevată în acelaș(cid:13)i timp cu prelevarea peș(cid:13)tilor ș(cid:13)i înainte de hrănirea lor. În timpul fazei de absorbție, concentrațiile de substanță testată se determină pentru a verifica dacă ele satisfac criteriile de validitate. În cursul fazei de absorbție, peș(cid:13)tii sunt eș(cid:13)antionați de cel puțin cinci ori, iar în timpul fazei de epurare, de cel puțin patru ori. Uneori este dificil de calculat o valoare estimativă rezonabil de precisă pentru BCF, pe baza acestui număr de eș(cid:13)antioane, în special atunci când nu urmează o cinetică simplă de epurare, de ordinul întâi. În acest caz, se pot realiza eș(cid:13)antionările mai frecvent pentru cele două perioade (a se vedea anexa 4). Eș(cid:13)antioanele suplimentare sunt stocate ș(cid:13)i analizate numai dacă rezultatele primei serii de analize se dovedesc insuficiente pentru calculul BCF cu precizia dorită. În anexa 4 se găseș(cid:13)te un exemplu de calendar acceptabil de eș(cid:13)antionare. Altele pot fi determinate cu uș(cid:13)urință, pe baza valorilor presupuse ale POW, pentru a calcula timpul de expunere, corespunzător unei absorbții de 95 %. Se continuă eș(cid:13)antionarea în cursul fazei de absorbție, până la obținerea unei stări staționare sau timp de 28 de zile, optându-se pentru varianta cea mai scurtă. Dacă nu se obține o stare staționară după 28 de zile, eș(cid:13)antionarea continuă până la obținerea unei astfel de stări sau timp de 60 de zile, optându-se pentru alternativa cea mai scurtă. Înainte de începerea fazei de eliminare, peș(cid:13)tii se transferă în rezervoare curate. 1. 8. 4. 2. Eș(cid:13) a n t i o n a j u l ș(cid:13) i p r e p a r a r e a eș(cid:13) a n t i o a n e l o r Se prelevează eș(cid:13)antioane de apă pentru analize, de exemplu prin sifonare cu ajutorul unui tub inert, într-un punct central al incintei experimentale. Întrucât se pare că fracțiile non biodisponibile de substanță testată nu pot fi separate de cele biodisponibile – nici prin filtrare ș(cid:13)i nici prin centrifugare – (în particular pentru cazul produselor chimice super-lipofile, adică cele care au log POW > 5) (1) (5), se poate renunța la supunerea eș(cid:13)antioanelor la astfel de tratamente. 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 291 În schimb, trebuie avut grijă ca rezervoarele să fie cât mai curate posibil, iar conținutul în carbon organic va fi supravegheat pe întreaga durată a fazelor de absorbție ș(cid:13)i de eliminare. Un număr convenabil de peș(cid:13)ti (în mod normal, cel puțin patru), se prelevează din fiecare incintă experimentală pentru fiecare eș(cid:13)antionare. Peș(cid:13)tii prelevați vor fi clătiți rapid cu apă, uscați cu ajutorul hârtiei absorbante ș(cid:13)i sacrificați în mod instantaneu, într-o manieră cât mai umană posibil, după care se cântăresc. Este preferabil să se analizeze peș(cid:13)tii ș(cid:13)i apa imediat după eș(cid:13)antionare pentru a se evita orice degradare sau alte pierderi ș(cid:13)i pentru a calcula în mod aproximativ regimurile de absorbție ș(cid:13)i de purificare, în vreme ce experimentul continuă să se desfăș(cid:13)oare. De asemenea, analiza imediată evită întârzierea constatării atingerii unui platou. În lipsa unei analize imediate, eș(cid:13)antioanele se vor conserva după o metodă convenabilă. Înainte de începerea studiului se vor aduna toate datele cu privire la metodele de stocare adecvate substanței testate; de exemplu congelare, menținere la 4 °C, durata stocării, extracția etc. 1. 8. 4. 3. C a l i t a t e a m e t o d e i a n a l i t i c e Integralitatea procedurii fiind determinată, în principal, de exactitatea, precizia ș(cid:13)i sensibilitatea metodei analitice utilizate pentru substanța testată, trebuie controlat în mod experimental ca precizia ș(cid:13)i reproductivitatea analizei chimice, precum ș(cid:13)i recuperarea substanței testate – atât din apă, cât ș(cid:13)i din peș(cid:13)ti – să fie pe deplin satisfăcătoare, în cazul particular al respectivei metode. De asemenea, se are în vedere ca substanța testată să nu fie detectabilă în apa de diluție folosită. Dacă este necesar, valorile pentru CW ș(cid:13)i Cf derivate din experiment vor fi corectate după compararea cu valorile furnizate de martori ș(cid:13)i cu concentrația naturală a substanței testate. Pe tot parcursul testării, eș(cid:13)antioanele de peș(cid:13)ti ș(cid:13)i de apă sunt astfel manipulate, încât să se minimizeze contaminările ș(cid:13)i pierderile (rezultate, de exemplu, de absorbția prin materialul de eș(cid:13)antionare). 1. 8. 4. 4. A n a l i z a eș(cid:13) a n t i o a n e l o r d e p eș(cid:13) t i Dacă se utilizează materiale marcate radioactiv, se poate analiza marcajul radioactiv total (respectiv, compuș(cid:13)ii de origine ș(cid:13)i metaboliții) sau purifica eș(cid:13)antioanele, astfel încât compusul de origine să poată fi analizat separat. În plus, principalii metaboliți pot fi caracterizați fie la starea staționară, fie la sfârș(cid:13)itul fazei de absorbție, optându-se pentru varianta cea mai scurtă. Dacă BCF, în funcție de reziduurile marcate radioactiv totale, este ≥ 1 000 %, ar fi indicat (ș(cid:13)i, pentru anumite categorii de produse chimice, cum ar fi pesticidele, chiar recomandat cu tărie) să se identifice ș(cid:13)i cuantifice produsele de degradare reprezentând ≥ 10 % reziduuri totale în țesuturile peș(cid:13)tilor, în starea staționară. Dacă aceste produse reprezintă ≥ 10 % reziduuri totale marcate radioactiv în țesuturile peș(cid:13)tilor ele vor fi identificate ș(cid:13)i cuantificate; apoi, este recomandat ca acestea să fie identificate ș(cid:13)i cuantificate, de asemenea, în apa pentru experiment. În general, concentrația substanței testate trebuie să fie determinată pentru fiecare peș(cid:13)te cântărit. Dacă nu este posibil, se pot pune în comun eș(cid:13)antioanele la fiecare testare, însă această metodă restrânge veridicitatea procedurilor statistice a rezultatelor. Dacă o anumită procedură ș(cid:13)i o finețe statistică specifică sunt urmărite, va fi convenabil să se folosească în experiment un număr adecvat de peș(cid:13)ti, pentru satisfacerea procedurii de regrupare ș(cid:13)i precizia statistică dorită (6) (7). BCF-ul va fi exprimat, atât în funcție de greutatea totală de produs viu, câtș(cid:13)i pentru substanțele puternic lipofile, în funcție de conținutul lipidic. Conținutul lipidic al peș(cid:13)tilor se determină, dacă este posibil, la fiecare eș(cid:13)antionare. Pentru stabilirea conținutului lipidic, se vor utiliza metode bine adaptate (ref. 8 ș(cid:13)i 2 ale anexei 3). Se recomandă tehnici de extracție prin cloroform/metanol ca metode standard (9). Metodele nu oferă rezultate identice (10), motiv pentru care este important să se precizeze care metodă s-a utilizat. Analiza lipidelor se va face, pe cât posibil, pe aceleaș(cid:13)i extracte consacrate ș(cid:13)i pentru analiza substanței testate, întrucât, adesea, lipidele trebuie scoase din extras înainte de a-l putea analiza prin cromatografie. Conținutul lipidic al peș(cid:13)tilor (în mg/kg de produs proaspăt), la sfârș(cid:13)itul experienței, nu trebuie să difere față de cel inițial cu mai mult de ± 25 %. De asemenea, se va indica procentajul de solide din țesuturi, pentru a permite conversia concentrației lipidice a bazei umede la cea a bazei uscate. 292 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 2. DATE 2. 1. Prelucrarea rezultatelor Curba de absorbție a substanței testate va rezulta din traseul concentrației sale în funcție de timp, la/în peș(cid:13)ti (sau în țesuturile specifice), în perioada fazei de absorbție, folosind o scară aritmetică. Dacă curba atinge un platou, adică adoptă aproximativ un traseu asimptotic la axa timpului, starea staționară BCFSS se va calcula, după cum urmează: Cf stare staționară (valori medii) Cw stare staționară (valori medii) Atunci când nu se obține nici o stare staționară, rămâne posibilitatea calculării unui BCFSS de o precizie suficientă pentru evaluarea riscurilor, pornind de la o „stare staționară” la 80 % (1,6/k2) sau 95 % (3,0/k2) de echilibru. În plus, factorul de concentrare (BCFk) va fi definit ca raport k1/k2 de două constante cinetice de ordinul întâi. Constanta de viteză de eliminare (k2) se determină, în general, plecând de la curba de eliminare (adică de la un traseu al descreș(cid:13)terii concentrației substanței testate din peș(cid:13)ti, în funcție de timp). Apoi, constanta de viteză de absorbție (k1) va fi calculată în funcție de k2 ș(cid:13)i de o valoare a Cf derivată din curba de absorbție (a se vedea ș(cid:13)i anexa 5). Metoda cea mai bună pentru obținerea BCFk ș(cid:13)i a constantelor de viteză k1 ș(cid:13)i k2 este aceea care recurge la metode informatice neliniare de estimare a parametrilor (11). Alternativ, se pot utiliza metode grafice pentru calculul k1 ș(cid:13)i k2. Dacă curba de purificare se dovedeș(cid:13)te a nu fi de ordinul întâi, trebuie utilizate modele mai complexe (a se vedea referințele din anexa 3) ș(cid:13)i să se ceară opinia unui biostatistician. 2. 2. Interpretarea rezultatelor Rezultatele se vor interpreta cu precauție, atunci când concentrațiile măsurate de soluție experimentală se află la valori apropiate de limita de detecție a metodei de analiză. Claritatea cu care sunt definite curbele de absorbție ș(cid:13)i de eliminare dovedeș(cid:13)te buna calitate a datelor de bioconcentrare. Variația constantelor de absorbție/eliminare între cele două concentrații experimentale trebuie să fie mai mică de 20 %. Diferențele considerabile observate la ratele de absorbție/eliminare între cele două experimente de concentrare, vor fi înregistrate ș(cid:13)i explicate, dacă este posibil. În general, limita de încredere pentru BCF se apropie ± 20 %, în studiile bine concepute. 3. RAPORT Procesul-verbal al testării va cuprinde informațiile următoare: 3. 1. Substanța testată: — natura fizică ș(cid:13)i, eventual, proprietățile fizico-chimice; — date de identificare chimică (inclusiv conținutul în carbon organic, dacă este necesar); — în cazul marcării radioactive, poziția precisă a atomului(ilor) marcat(ți) ș(cid:13)i procentajul de radioactivitate asociată impurităților. 3. 2. Speciile utilizate: — denumire ș(cid:13)tiințifică, suș(cid:13)ă, sursă, orice tratament prealabil eventual, aclimatare, vârstă, gama de dimensiuni etc. 3. 3. Condițiile experimentale: — procedura utilizată (de exemplu, reînnoirea continuă sau semistatică); — tipul ș(cid:13)i caracteristicile iluminării utilizate ș(cid:13)i fotoperioada(ele); — conceptul experimental (de exemplu numărul ș(cid:13)i dimensiunea incintelor experimentale, regimul de înlocuire al volumelor de apă, numărul de subeș(cid:13)antioane ș(cid:13)i de peș(cid:13)ti per subeș(cid:13)antion, număr de concentrații testate, durata fazelor de absorbție ș(cid:13)i de epurare, frecvența eș(cid:13)antionării pentru peș(cid:13)ti ș(cid:13)i pentru apă); 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 293 — metoda de preparare a soluțiilor-mamă ș(cid:13)i frecvența de reînnoire (agentul de dizolvare, concentrația sa ș(cid:13)i contribuția sa la conținutul în carbon organic al apei pentru experiență – vor fi menționate, dacă este cazul); — concentrațiile experimentale nominale, mediile valorilor măsurate ș(cid:13)i deviația standard a acestora în recipientele experimentale, precum ș(cid:13)i metoda de obținere; — sursa de apă de diluție, descrierea tuturor tratamentelor prealabile, rezultatele tuturor demonstrațiilor de aptitudine a peș(cid:13)tilor de supraviețuire în această apă ș(cid:13)i caracteristicile apei: pH, duritate, temperatură, concentrația în oxigen dizolvat, nivelul clorului rezidual (dacă este măsurat), carbonul organic total, solide în suspensie, salinitatea mediului experimental (dacă este cazul)ș(cid:13)i orice alte măsurători făcute; — calitatea apei în recipientele experimentale, pH, duritate, temperatura ș(cid:13)i concentrația în oxigen dizolvat; — informații precise legate de alimentație (de exemplu tipul de hrană, sursă, compoziție – cel puțin conținutul în lipide ș(cid:13)i proteine dacă este posibil, cantitatea dată ș(cid:13)i frecvența); — informații legate de tratamentul peș(cid:13)tilor ș(cid:13)i al apei eș(cid:13)antionate, inclusiv detalii de preparare, stocare, extracție, proceduri (ș(cid:13)i precizia) de analiză a substanței testate ș(cid:13)i conținutul în lipide (dacă s-a măsurat). 3. 4. Rezultate: — rezultatele studiilor preliminare efectuate; — mortalitatea peș(cid:13)tilor martor ș(cid:13)i a peș(cid:13)tilor din fiecare incintă experimentală, precum ș(cid:13)i orice comportament anormal observat; — conținutul lipidic al peș(cid:13)tilor (dacă a fost determinat cu ocazia experimentului); — curbele (din toate măsurătorile efectuate) exprimând absorbția ș(cid:13)i eliminarea produselor chimice experimentale la peș(cid:13)ti, timpul de acces la starea staționară; — Cf ș(cid:13)i CW (cu deviația standard ș(cid:13)i, eventual, intervalul) la momentul fiecărui eș(cid:13)antionări [Cf se exprimă în µg/g de produs viu (ppm), din întreg peș(cid:13)tele sau din anumite țesuturi; de exemplu, lipidele ș(cid:13)i CW se exprimă în µg/ml (ppm)]. Valorile CW pentru seria martor (de asemenea, se indică concentrația de bază); — factorul de bioconcentrare în starea staționară (BCFSS)ș(cid:13)i/sau factorul de concentrare cinetică (BCFk)ș(cid:13)i, dacă este cazul, limitele de încredere la 95 % ale constantelor de viteză de absorbție ș(cid:13)i de eliminare (pierdere), toate exprimate în raport cu întregul corp ș(cid:13)i cu conținutul total de lipide, dacă acesta este măsurat, ale peș(cid:13)telui (ori ale anumitor țesuturi), limitele de încredere ș(cid:13)i deviația standard (dacă este disponibilă), metode de calcul/analiză ale rezultatelor pentru fiecare concentrație a substanței test utilizate; — atunci când se folosesc substanțe marcate radioactiv, poate fi semnalată acumularea tuturor metaboliților, dacă este necesar; — toate situațiile neobiș(cid:13)nuite legate de experiment, toate devierile de la aceste proceduri ș(cid:13)i orice alte informații pertinente. Se minimizează rezultatele de tipul „nedetectabil la limita de detecție”, prin folosirea unei metode experimentale preliminare ș(cid:13)i elaborarea unui concept experimental, deoarece astfel de rezultate sunt inutile pentru calculul constantelor de viteză. 4. REFERINȚE BIBLIOGRAFICE (1) Connell D. W. (1988). Bioaccumulation behaviour of persistent chemicals with aquatic organisms. Rev. Environ. Contam. Toxicol. 102, pp. 117-156. (2) Bintein S. , Devillers J. and Karcher W. (1993). Non-linear dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water partition coefficient. SAR and QSAR in Environmental Research, 1, pp. 29-390. (3) OECD, Paris (1996). Direct phototransformation of chemicals in water. Environmental Health and Safety Guidance Document Series on Testing and Assessment of Chemicals. No 3. (4) Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: Comparison of bioconcentration factors derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate organic matter to the bioavailability of chemicals. Water Quality Institute, Denmark. 294 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 (5) US EPA 822-R-94-002 (1994) Great Lake Water Quality Initiative Technical Support Document for the Procedure to Determine Bioaccumulation Factors. July 1994. (6) US FDA (Food and Drug Administration) Revision. Pesticide analytical manual, 1, 5600 Fisher’s Lane, Rockville, MD 20852, July 1975. (7) US EPA (1974). Section 5, A(1). Analysis of Human or Animal Adipose Tissue, in Analysis of Pesticide Residues in Human and Environmental Samples, Thompson J. F. (ed. ) Research Triangle Park, N. C. 27711. (8) Compaan H. (1980) in „The determination of the possible effects of chemicals and wastes on the aquatic environment: degradation, toxicity, bioaccumulation”, Ch. 2. 3, Part II. Government Publishing Office, The Hague, Netherlands. (9) Gardner et al. , (1995) Limn. & Oceanogr. 30, pp. 1099-1105 (10) Randall R. C. , Lee H. , Ozretich R. J. , Lake J. L. and Pruell R. J. (1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Envir. Toxicol. Chem. 10, pp. 1431-1436. (11) CEC, Bioconcentration of chemical substances in fish: the flow-through method – Ring Test Programme, 1984 to 1985. Final report March 1987. Authors: P. Kristensen and N. Nyholm. (12) ASTM E-1022-84 (Reapproved 1988). Standard Practice for conducting Bioconcentration Tests with Fishes and Saltwater Bivalve Molluscs. 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 295 Anexa 1 Caracteristici chimice acceptabile ale apei de diluție Substanța Concentrația- limită 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Particule insolubile Carbon organic total Amoniac neionizat Clor rezidual Pesticide organofosforice totale Pesticide organofluorurate totale + policlorobifenili Clor organic total Aluminiu Arsen Crom Cobalt Cupru Fier Plumb Nichel Zinc Cadmiu Mercur Argint 5 mg/l 2 mg/l 1 μg/l 10 μg/l 50 ng/l 50 ng/l 25 ng/l 1 μg/l 1 μg/l 1 μg/l 1 μg/l 1 μg/l 1 μg/l 1 μg/l 1 μg/l 1 μg/l 100 ng/l 100 ng/l 100 ng/l 296 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 Anexa 2 Specii de peș(cid:13)ti recomandate pentru experimente Specii recomandate Plaja de temperatură reco- mandată pentru experimente (°C) Lungimea totală recomandată pentru animalele utilizate (cm) 1 2 3 4 5 6 7 8 Danio rerio (1) (Teleostei, Cyprinidae) (Hamilton - Buchanan) Zebra Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae) (Rafinesque) Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae) (Linnaeus) Crap Oryzias lapites (Teleostei, Poeciliidae) Medaka (Temmink and Schlegel) Poccilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae) (Peters) Guppy Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchidae) (Rafinesque) Biban- soare 20-25 20-25 20-25 20-25 20-25 20-25 3,0 ± 0,5 5,0 ± 2,0 5,0 ± 3,0 4,0 ± 1,0 3,0 ± 1,0 5,0 ± 2,0 Oncorhynchus mykiss (Teleostei, Salmonidae) (Walbaum) Păstrăv curcubeu 13-17 8,0 ± 4,0 Gasterosteus aculeatus (Teleostei, Gasterosteidae) (Linnaeus) Ghidrin țepos 18-20 3,0 ± 1,0 (1) Meyer A. , Orti G. (1993) Proc. Royal Society of London, Series B, Vol. 252, p. 231. În anumite țări, au fost utilizate diverse specii marine ș(cid:13)i de estuar, de exemplu: Leiostomus xanthurus Cyprinodon variegatus Menidia beryllina Cymatogaster aggregata Parophrys vertulus Leptocottus armatus Ghidrin țepos Biban comun Obleț Leiostomus xanthurus Cyprinodon variegatus Menidia beryllina Cymatogaster aggregata Parophrys vertulus Leptocottus armatus Gasterosteus aculeatus Dicentracus labrax Alburnus alburnus Recoltare Peș(cid:13)tii de apă dulce menționați în tabelul de mai sus sunt uș(cid:13)or de crescut ș(cid:13)i/sau foarte disponibili, tot timpul anului, față de speciile marine sau de estuar, a căror disponibilitate este, în anumite țări, limitată. Ei se reproduc ș(cid:13)i trăiesc atât în fermele piscicole, cât ș(cid:13)i în laboratoare, în condițiile în care maladiile ș(cid:13)i paraziții se află sub control; aș(cid:13)adar, animalele utilizate vor fi în stare bună de sănătate, cu ascendență genetică cunoscută. Pot fi găsiți aproape în întreaga lume. 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 297 Anexa 3 Estimarea duratei fazelor de absorbție ș(cid:13)i de eliminare 1. Prognoza pentru durata fazei de absorbție Înainte de executarea testării, se poate estima k2 ș(cid:13)i, deci, un procentaj de timp necesar pentru a ajunge la starea staționară, pornind de la relațiile empirice între k2 ș(cid:13)i coeficientul de separare n-octanol/apă (POW) sau între k2 ș(cid:13)i solubilitatea în apă (s). Se estimează k2 (zile-1) pornind, de exemplu, de la relația empirică următoare (1): log10k2 = -0,414 log10(Pow) + 1,47 (r2 = 0,95) (ecuația 1) Pentru alte relații, vezi referințele bibliografice (2). Dacă coeficientul de partiție (Pow) nu este cunoscut, se va proceda la o estimare (3) plecând de la solubilitatea în apă (s) a substanței, după cum urmează: log10(Pow) = 0,862 log10(s) + 0,710 (r2 = 0,994) (ecuația 2) unde s = solubilitatea (mol/l): (n = 36) Aceste relații se aplică numai produselor chimice ale căror valori, log Pow, se situează între 2 ș(cid:13)i 6,5 (4). Timpul necesar pentru atingerea unui anumit procentaj din starea staționară va rezulta din ecuația cinetică generală, indicându-se absorbția ș(cid:13)i eliminarea (cinetica de ordinul I), prin aplicarea estimării k2: unde, dacă Cw este constant: Atunci când ne apropiem de starea staționară (t ∞), ecuația 3 se reduce (5) (6) la: Raportul k1/k2 ∙ CW se apropie astfel de concentrația substanței din peș(cid:13)ti în „starea staționară” (Cf,s). Aș(cid:13)adar, ecuația 3 poate fi transcrisă: Cf = Cf,s = (1 – e t –k 2 ) sau = 1 – e t –k 2 Cf Cfs (ecuația 4) Timpul necesar pentru atingerea unui anumit procentaj din starea staționară poate fi prevăzut grație ecuației 4, atunci când k2 a fost în prealabil estimat cu ajutorul ecuațiilor 1 sau 2. Cu titlu informativ, durata optimă statistică a fazei de absorbție, care permite obținerea de rezultate statistice acceptabile (BCFk), este perioada necesară pentru ca curba logaritmului concentrației de substanță testată din peș(cid:13)ti, trasată în funcție de timp în scară lineară, să ajungă la punctul median, adică la 1,6/k2 sau la 80 % din starea staționară, fără a depăș(cid:13)i 3,0/k2 sau 95 % din starea staționară (7). Timpul până la atingerea a 80 % din starea staționară este (ecuația 4): 0,80 = 1 – e t –k 80 2 SAU t80 = 1,6 k2 (ecuația 5) 298 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 Similar, pentru 95 % din starea staționară: t95 = 3,0 k2 (ecuația 6) De exemplu, durata fazei de absorbție (abs. ) a unei substanțe testate, având un log Pow = 4, va fi (folosind ecuațiile 1, 5ș(cid:13)i 6): log10k2 = -0,414. (4) + 1,47 k2 = 0,652 days-1 abs (80 %) = 1,6/0,652, adică 2,45 zile (59 ore) sau abs (95 %) = 3,0/0,652, adică 4,60 zile (110 ore) În acelaș(cid:13)i mod, pentru o substanță testată cu s = 10-5 mol/l [log (s) = 5,0], durata de absorbție va fi (folosind ecuațiile 1, 2, 5 ș(cid:13)i 6): log10 (Pow) = -0,862 (- 5,0) + 0,710 = 5,02 log10k2 k2 = -0,414 (5,02) + 1,47 = 0,246 days-1 abs (80 %) = 1,6/0,246, adică, 6,5 zile (156 ore) sau abs (95 %) = 3,0/0,246, adică 12,2 zile (293 ore) De asemenea, se poate utiliza expresia alternativă: pentru calculul timpului de atingere a stării staționare (4). teq = 6,54 × 10-3 Pow + 55,31 (ore) 2. Estimarea duratei fazei de eliminare Se poate estima, de asemenea, timpul necesar pentru ca substanța testată ajunsă în corpul peș(cid:13)tilor, să se reducă la un anumit procentaj din concentrația inițială, grație ecuației generale, ilustrând absorbția ș(cid:13)i eliminarea (cinetica de ordinul I) (1) (8). Pentru faza de eliminare, CW este considerată nulă. Ecuația poate fi redusă la: unde Cf,o este concentrația la începutul perioadei de eliminare. Se va obține apoi o eliminare de 50 %, la momentul (t50): În acelaș(cid:13)i mod, 95 % din faza de eliminare va fi atinsă la: Dacă ne plasăm la 80 % din faza de absorbție pentru prima perioadă (1,6/k2)ș(cid:13)i la 95 % din pierderi pentru faza de eliminare (3,0/k2), atunci faza de eliminare este aproximativ dublul duratei fazei de absorbție. Totuș(cid:13)i, este important de menționat că aceste estimări se bazează pe ipoteza că schemele de absorbție ș(cid:13)i eliminare urmează o cinetică de ordinul întâi. Dacă nu este cazul, se vor folosi modele mai complexe [de exemplu, referința bibliografică (1)]. 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 299 Bibliografie (pentru anexa 3) (1) Spacie A. and Hamelink J. L. (1982) Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. and Chem. 1, pp. 309-320. (2) Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of BCF’s derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate matter to the bioavailability of chemicals. Danish Water Quality Institute. (3) Chiou C. T. and Schmedding D. W. (1982). Partitioning of organic compounds in octanol-water systems. Environ. Sci. Technol. 16 (1), pp. 4-10. (4) Hawker D. W. and Connell D. W. (1988). Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22 (6), pp. 701-707. (5) Branson D. R. , Blau G. E. , Alexander H. C. and Neely W. B. (1975). Transactions of the American Fisheries Society, 104 (4), pp. 785-792. (6) Ernst W. (1985). Accumulation in Aquatic organisms. In: Appraisal of tests to predict the environmental behaviour of chemicals. Ed. by Sheehmann P. , Korte F. , Klein W. and Bourdeau P. H. Part 4. 4, pp. 243-255. SCOPE, 1985, John Wiley & Sons Ltd. N. Y. (7) Reilly P. M. , Bajramovic R. , Blau G. E. , Branson D. R. and Sauerhoff M. W. (1977). Guidelines for the optimal design of experiments to estimate parameters in first order kinetic models, Can. J. Chem. Eng. 55, pp. 614-622. (8) Könemann H. and Van Leeuwen K. (1980). Toxicokinetics in fish: Accumulation and Elimination of six Chlorobenzenes by Guppies. Chemosphere, 9, pp. 3-19. 300 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 Anexa 4 Exemple teoretice de grafice de eș(cid:13)antionare pentru testele de bioconcentrare ale substanțelor cu log POW = 4 Prelevări de peș(cid:13)ti Faza de absorbție I II III IV V Faza de epurare VI VII VIII IX Calendar de eș(cid:13)antionare Frecvența minimă cerută (zile) Eș(cid:13)antionare suplimen- tară Număr eș(cid:13)antioane de apă Număr de peș(cid:13)ti per eș(cid:13)antion - 1 0 0,3 0,6 1,2 2,4 4,7 5,0 5,9 9,3 14,0 0,4 0,9 1,7 3,3 5,3 7,0 11,2 17,5 2 (*) 2 2 (2) 2 (2) 2 (2) 2 (2) 2 Se adaugă 45-80 de peș(cid:13)ti 4 (4) 4 (4) 4 (4) 4 (4) 6 Peș(cid:13)tii se transferă într-o apă care nu conține produsul testat 4 (4) 4 (4) 4 (4) 6 (4) (*) Se prelevează apa după adăugarea a cel puțin 3 volume ale incintei experimentale. Notă: Estimarea înaintea experimentului a lui k2, pentru un log POW = 4,0, este de 0,652 zile-1. Durata totală a experimentului este fixată la: 3 × abs. = 3 × 4,6 zile, adică 14 zile. Pentru estimarea „abs. ” se utilizează anexa 3. Valorile dintre paranteze sunt numere de eș(cid:13)antioane (apă, peș(cid:13)ti) care trebuie prelevate, dacă se procedează la o eș(cid:13)antionare suplimentară. 13/vol. 24 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 301 Anexa 5 Deosebirile dintre modele S-a presupus că majoritatea rezultatelor de bioconcentrare sunt „rezonabil” de bine descrise, printr-un model simplu cu două compartimente/doi parametri, respectiv printr-o curbă rectilinie ce reprezintă aproximativ punctele de măsură ale concentrațiilor de substanță testată din peș(cid:13)ti, în cursul fazei de eliminare, pe hârtie semilogaritmică. (Atunci când aceste puncte nu se pot reduce la o dreaptă, este indicat să se recurgă la modele mai complexe, a se vedea, de exemplu, Spacie and Hamelink, ref. 1 din bibliografia anexei 3). Metoda grafică pentru determinarea constantei de viteză de eliminare (pierdere) k2 Se reprezintă, pe hârtie semilogaritmică, concentrația substanței testate, determinată la fiecare eș(cid:13)antion de peș(cid:13)ti, conform graficului de eș(cid:13)antionare. Panta acestei drepte este k2. k2 = ln (Cf1/Cf2) t2-t1 Atenție: abaterile față de această linie dreaptă pot indica o schemă de eliminare mai complexă decât cinetica de ordinul întâi. O metodă grafică poate rezolva acest tip de eliminare care se abate de la cinetica de ordinul întâi. Metoda grafică pentru determinarea constantei de viteză de absorbție k1 K2 fiind determinat, se calculează k1, după cum urmează: Se citeș(cid:13)te valoarea Cf în punctul median al curbei de absorbție netezite, aproximată cu o dreaptă, atunci când concentrația logaritmică este trasată în funcție de timp (pe o scară aritmetică). 302 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 24 Metoda de calcul informatic a constantelor de viteză de absorbție ș(cid:13)i de eliminare (pierdere) Pentru obținerea factorului de bioconcentrare ș(cid:13)i a constantelor de viteză k1 ș(cid:13)i k2, se vor utiliza de preferință metode informatice neliniare de estimare parametrică. Aceste programe determină valorile pentru k1 ș(cid:13)i k2, utilizând un ansamblu de rezultate secvențiale ale concentrației în timp, funcție de model: Cf = Cw∙ Cf = Cw∙ k1 k2 k1 k2 ×(l - e -k 2 t) 0 < t < tc (ecuația 2) ×(e -k 2(t -t c) - e -k 2 t) t < tc (ecuația 3) unde tc = timpul la sfârș(cid:13)itul fazei de absorbție. Această metodă furnizează estimarea deviațiilor standard a k1 ș(cid:13)i k2. întrucât în majoritatea cazurilor se poate estima k2 pornind de la curba de eliminare, ș(cid:13)i aceasta cu o precizie destul de mare, ș(cid:13)i întrucât există o strânsă corelare între cei doi parametri k1 ș(cid:13)i k2, este de dorit să se calculeze mai întâi k2, pornind numai de la datele de eliminare, ș(cid:13)i după aceea să se calculeze k1, de la datele de absorbție, cu ajutorul unei regresii neliniare