title: Komisjoni direktiiv 98/73/EÜ, 18. september 1998, millega kohandatakse kahekümne neljandat korda tehnika arenguga nõukogu direktiivi 67/548/EMÜ ohtlike ainete liigitamist, pakendamist ja märgistamist käsitlevate õigus- ja haldusnormide ühtlustamise kohtaEMPs kohaldatav tekst.

text: 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 139 31998L0073 L 305/1 EUROOPA ÜHENDUSTE TEATAJA 16. 11. 1998 KOMISJONI DIREKTIIV 98/73/EÜ, 18. september 1998, millega kohandatakse kahekümne neljandat korda tehnika arenguga nõukogu direktiivi 67/548/EMÜ ohtlike ainete liigitamist, pakendamist ja märgistamist käsitlevate õigus- ja haldusnormide ühtlustamise kohta (EMPs kohaldatav tekst) EUROOPA ÜHENDUSTE KOMISJON, ON VASTU VÕTNUD KÄESOLEVA DIREKTIIVI: võttes arvesse Euroopa Ühenduse asutamislepingut, Artikkel 1 võttes arvesse nõukogu 27. juuni 1967. aasta direktiivi 67/548/EMÜ ohtlike ainete liigitamist, pakendamist ja märgista- mist käsitlevate õigus- ja haldusnormide ühtlustamise kohta, (1) viimati muudetud komisjoni direktiiviga 97/69/EÜ, (2) eriti selle artiklit 28, Käesolevaga muudetakse direktiivi 67/548/EMÜ järgmiselt. 1. I lisa muudetakse järgmiselt: ning arvestades, et: direktiivi 67/548/EMÜ I lisa sisaldab ohtlike ainete loetelu koos iga aine liigitamise ja märgistamise korra üksikasjadega; praegu- sed teadus- ja tehnikaalased teadmised on näidanud, et kõnealuses lisas sisalduvat ohtlike ainete loetelu tuleks kohandada ja täienda- da; direktiivi 67/548/EMÜ V lisas on sätestatud ainete ja valmististe füüsikaliste ja keemiliste omaduste, toksilisuse ning ökotoksilisuse määramise meetodid; kõnealust lisa on vaja kohandada tehnika arenguga; a) käesoleva direktiivi I lisa kanded asendavad direktiivi 67/548/EMÜ I lisa vastavad kanded; b) käesoleva direktiivi II lisa kanded lisatakse direktiivi 67/548/EMÜ I lisa kannetele. 2. V lisa muudetakse järgmiselt: a) käesoleva direktiivi lisade III A, III B ja III C tekst lisatakse direktiivi 67/548/EMÜ V lisa A osale; b) käesoleva direktiivi lisa III D tekst lisatakse direktiivi 67/548/EMÜ V lisa C osale. käesolevas direktiivis sätestatud meetmed on kooskõlas ohtlike ainete ja valmististe tehniliste kaubandustõkete kõrvaldamist käsitlevaid direktiive tehnika arenguga kohandava komitee arva- musega, Artikkel 2 (1) EÜT 196, 16. 8. 1967, lk 1. (2) EÜT L 343, 13. 12. 1997, lk 19. Liikmesriigid jõustavad käesoleva direktiivi järgimiseks vajalikud õigus- ja haldusnormid hiljemalt 31. oktoobriks 1999. Nad teatavad sellest viivitamata komisjonile. 140 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd Kui liikmesriigid need sätted vastu võtavad, lisavad nad nendesse või nende ametliku avaldamise korral nende juurde viite käesolevale direktiivile. Sellise viitamise viisi näevad ette liikmesriigid. Artikkel 4 Käesolev direktiiv on adresseeritud liikmesriikidele. Brüssel, 18. september 1998 Artikkel 3 Käesolev direktiiv jõustub 20. päeval pärast selle avaldamist Euroopa Ühenduste Teatajas. Komisjoni nimel komisjoni liige Ritt BJERREGAARD 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 141 ANEXO I — BILAG I — ANHANG I — ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ I — ANNEX I — ANNEXE I — ALLEGATO I — BIJLAGE I — ANEXO I — LIITE I — BILAGA I — 142 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 143 144 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 145 146 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 147 148 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 149 150 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 151 152 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 153 154 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 155 156 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 157 158 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 159 160 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 161 162 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 163 164 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 165 166 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 167 168 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 169 170 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 171 172 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 173 174 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 175 176 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 177 178 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 179 180 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 181 182 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 183 184 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 185 186 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 187 188 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 189 190 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 191 192 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 193 194 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 195 196 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 197 198 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 199 200 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 201 202 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 203 204 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 205 206 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 207 ANEXO II — BILAG II — ANHANG II — ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ II — ANNEX II — ANNEXE II — ALLEGATO II — BIJLAGE II — ANEXO II — LIITE II — BILAGA II — 208 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 209 210 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 211 212 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 213 214 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 215 216 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 217 218 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 219 220 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 221 222 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 223 224 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 225 226 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 227 228 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 229 230 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 231 232 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 233 234 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 235 236 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 237 238 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 239 240 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 241 242 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 243 244 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 245 246 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 247 248 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 249 250 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 251 252 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 253 254 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 255 256 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 257 258 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 259 260 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 261 262 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 263 264 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 265 266 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 267 268 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 269 270 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 271 272 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 273 274 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 275 276 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 277 278 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd LISA III A A. 18. POLÜMEERIDE ARVKESKMINE MOLEKULMASS JA MOLEKULMASSIDE JAOTUS 1. MEETOD Käesolev geelkromatograafia (GPC) meetod on OECD katsejuhendi nr 118 (1996) koopia. Meetodi põhi- mõte ja tehniline lisainformatsioon on toodud kirjandusviites 1. 1. 1. Sissejuhatus Kuna polümeeride omadused on väga erinevad, siis on võimatu kirjeldada ühtainust meetodit, mis kirjel- daks täpselt eraldamis- ja analüüsitingimusi, mis kataks kõiki polümeeride eraldamisel esinevaid võima- likke juhtumeid ja olukordi. Eelkõige on keeruliste polümeerisegude lahutamine geelkromatograafia abil sageli võimatu. Kui geelkromatograafia ei ole kasutatav, siis võib molekulmassi määramiseks kasutada teisi meetodeid (vt lisa). Sellistel juhtudel tuleb kasutatava meetodi kohta esitada kõik üksikasjad ja põhjendu- sed. Kirjeldatav meetod põhineb DIN standardil nr 55672 (1). Üksikasjalik informatsioon katsete läbiviimiseks ja andmete hindamiseks on toodud nimetatud DIN standardis. Kui katse tingimuste muutmine osutub vaja- likuks, siis peab vastavaid muudatusi põhjendama. Muude standardite kasutamisel peab nende jaoks andma täielikud viited. Kirjeldatava meetodi kalibreerimiseks kasutatakse teadaoleva polüdisperssusega polüstü- reeniproove ja teatud polümeeride (näiteks vesilahustuvad ja pika ahelaga hargnenud polümeerid) analüü- simiseks võib osutuda vajalikuks meetodis muudatuste tegemine. 1. 2. Definitsioonid ja ühikud Arvkeskmise molekulmassi Mn ja masskeskmise molekulmassi Mw arvutamiseks kasutatakse järgmisi vale- meid: kus Hi on detektori signaali kõrgus mõõdetuna baasjoonelt retensiooniruumala Vi jaoks Mi on retensiooniruumalale Vi vastava polümeerifraktsiooni molekulmass, ja n on mõõtepunktide arv. Molekulmassi jaotuse ulatus, mis iseloomustab segu disperssust, leitakse Mw/Mn suhtest. 1. 3. Võrdlusained Kuna geelkromatograafia on suhteline meetod, siis peab seda kalibreerima. Selleks otstarbeks kasutatakse tavaliselt kitsa fraktsioonilise jaotusega lineaarseid polüstüreenistandardeid, mille keskmised molekulmas- sid Mn ja Mw ning molekulmasside jaotus on teada. Kalibreerimiskõverat võib kasutada tundmatu proovi molekulmassi määramiseks vaid siis, kui proovi ja standardi lahutamiseks kasutatavad tingimused on vali- tud ühesuguselt. Molekulmassi ja elueerunud ruumala vaheline suhe on õige vaid konkreetsele katsele iseloomulikel tingi- mustel. Nimetatud tingimused hõlmavad eelkõige temperatuuri, lahustit (või lahustite segu), kromatograa- filisi tingimusi ja kasutatavat kolonni või kolonnisüsteemi. 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 279 Sellisel viisil proovist määratud molekulmassid on suhtelised ja neid nimetatakse “polüstüreeniekvivalendi molekulmassideks”. See tähendab seda, et sõltuvalt proovi ja standardi vahelistest struktuurilistest ja kee- milistest erinevustest võivad molekulmassid hälbida absoluutsetest väärtustest rohkemal või vähemal mää- ral. Juhul kui kasutatakse teisi standardeid nagu näiteks polüetüleenglükool, polüetüleenoksiid, polümetüül metakrülaat, polüakrüülhape, siis peab seda põhjendama. 1. 4. Katsemeetodi põhimõte Geelkromatograafia abil võib määrata nii proovi molekulmassi jaotust kui keskmisi molekulmasse (Mn, Mw). Geelkromatograafia on spetsiaalne vedelikkromatograafia liik, milles proov lahutatakse üksikute koostis- osade hüdrodünaamiliste ruumalade järgi (2). Lahutamiseks juhitakse proov läbi poorse materjaliga, tavaliselt orgaanilise geeliga, täidetud kolonni. Väi- kesed molekulid suudavad tungida pooridesse, kuhu suurte molekulide juurdepääs on takistatud. Seetõttu on suurte molekulide teepikkus lühem ja nad elueeruvad kiiremini. Keskmise suurusega molekulid tungi- vad osadesse pooridesse, mistõttu nad elueeruvad mõnevõrra aeglasemalt. Kõige väiksemad molekulid, mille keskmine hüdrodünaamiline raadius on väiksem kui geeli poorid, tungivad kõikidesse pooridesse ja eluee- ruvad viimastena. Ideaaljuhul mõjutab lahutamist ainult molekulide suurus, kuid praktikas on raske vältida vähemalt mõnin- gaid adsorptsioonist tingitud segavaid mõjusid. Kolonni ebaühtlane täitematerjal ja suurem omaruumala võivad olukorda halvendada (2). Detekteerimiseks kasutatakse näiteks refraktsiooni indeksit või UV-absorptsiooni ja tulemuseks saadakse lihtne jaotuskõver. Selleks, et omistada saadud kõverale tegelikke molekulmassi väärtusi, tuleb kolonni kalib- reerida teadaolevate molekulmassidega ja ideaaljuhul üldjoontes sarnase struktuuriga polümeeridega nagu näiteks erinevad polüstüreenistandardid. Tüüpiliselt saadakse Gaussi kõver, mis on mõnikord madalate molekulmasside osas väljaveninud sabaga, kusjuures vertikaalsel teljel on elueerunud erinevate molekul- massiga ühendite kogus massi järgi ja horisontaalsel teljel on logaritmilises skaalas molekulmass. 1. 5. Kvaliteedikriteeriumid Elutsiooniruumala korratavus (suhteline standardhälve, RSD) peaks olema parem kui 0,3 %. Kui kromato- grammi hinnatakse ajalise sõltuvuse põhjal ja see ei vasta ülaltoodud kriteeriumitele, tagatakse nõutav ana- lüüsi korratavus sisestandardi kasutamisega (1). Polüdisperssused sõltuvad standardite molekulmassidest. Polüstüreenistandardite kasutamisel on tüüpilised väärtused järgmised: Mp < 2 000 2 000 ≤ Mp ≤ 106 Mp > 106 Mw/Mn < 1,20 Mw/Mn < 1,05 Mw/Mn < 1,20 (Mp on piigi maksimumile vastav standardi molekulmass) 1. 6. Katsemeetodi kirjeldus 1. 6. 1. Polüstüreeni standardlahuste valmistamine Polüstüreenistandardid lahustatakse ettevaatlikul segamisel valitud eluendiga. Lahuste valmistamisel peab arvestama tootjapoolseid soovitusi. Valitud standardi kontsentratsioonid sõltuvad mitmetest erinevatest teguritest nagu näiteks süsteruumala, lahuse viskoossus ja analüütilise detektori tundlikkus. Maksimaalset süsteruumala peab kohandama vasta- valt kolonni pikkusele, et vältida kolonni ülelaadimist. Geelkromatograafia analüütiliste meetodite korral jäävad tüüpilised süsteruumalad vahemikku 40 kuni 100 μl, kui kolonni mõõdud on 30 cm × 7,8 mm. Või- malik on kasutada ka suuremaid ruumalasid, kuid need ei tohiks ületada 250 μl. Enne kolonni tegelikku kalibreerimist tuleb kindlaks teha süsteruumala ja kontsentratsiooni vaheline optimaalne suhe. 280 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 1. 6. 2. Proovi lahuse valmistamine Põhimõtteliselt kehtivad ülaltoodud nõudmised ka proovi lahuste valmistamisel. Proov lahustatakse sobi- vas lahustis, näiteks tetrahüdrofuraanis (THF), ettevaatlikul loksutamisel. Mitte mingil juhul ei tohi lahus- tamiseks kasutada ultrahelivanni. Vajaduse korral puhastatakse proovi lahust membraanfiltriga, mille poo- ride suurus on 0,2 kuni 2 μm. Lahustumatute osakeste olemasolu peab ära märkima ka lõplikus protokollis, kuna see võib olla tingitud kõrge molekulmassiga ühenditest. Lahustunud osakeste massiprotsendi määramiseks peab kasutama sobi- vat meetodit. Valmistatud lahuseid peab kasutama 24 tunni jooksul. 1. 6. 3. Seadmed — mahuti lahustile, — degaseerija (vajadusel), — pump, — pulsatsioonisummuti (vajadusel), — injektsioonisüsteem, — kromatograafilised kolonnid, — detektor, — kulumõõtja (vajadusel), — andmesalvesti ja -töötleja, — nõu jääkide jaoks. Eelnevalt peab kindlaks tegema, et geelkromatograafia süsteem oleks kasutatavate lahustite suhtes inertne (näiteks tetrahüdrofuraani jaoks kasutada teraskapillaare). 1. 6. 4. Injektsiooni ja lahusti etteandmise süsteem Proovi lahuse etteantud kogus sisestatakse automaatse injektoriga või käsitsi täpselt kindlaksmääratud kolonni piirkonda. Käsitsi injektsiooni korral võib süstla kolvi liiga kiire tagasitõmbamine või vabastamine põhjustada muutusi mõõdetava molekulmassi jaotuses. Lahusti etteandmise süsteem peaks olema võima- likult pulseerimisvaba, sisaldades ideaaljuhul pulsatsioonisummutit. Voolukiirus on suurusjärgus 1 ml/min. 1. 6. 5. Kolonn Sõltuvalt proovist kasutatakse polümeeri analüüsiks kas ühte lihtsat kolonni või mitut järjestikku ühenda- tud kolonni. Kolonni täitematerjalidena on kaubanduslikult kättesaadavad paljud poorsed kindlate oma- dustega ained (näiteks poori suurus, eksklusioonipiirid). Lahutamiseks kasutatava geeli või kolonni pikkuse valik sõltub nii proovi omadustest (hüdrodünaamiline ruumala, molekulmasside jaotus) kui ka spetsiifilis- test lahutamistingimustest, nagu näiteks lahusti, temperatuur ja voolukiirus (1) (2) (3). 1. 6. 6. Teoreetilised taldrikud Lahutamiseks kasutatavat kolonni või kolonnide süsteemi iseloomustatakse teoreetiliste taldrikute arvuga. Tetrahüdrofuraani kasutamisel eluendina hinnatakse seda etüülbenseeni või mõne muu sobiva mittepo- laarse lahustunud aine (soluudi) laadimisel teadaoleva pikkusega kolonni. Teoreetiliste taldrikute arv saa- dakse järgmiste valemite põhjal: W1/2)2 N = 5,54( Ve W)2 või N = 16(Ve kus N Ve on teoreetiliste taldrikute arv on piigi maksimumile vastav elutsiooniruumala W on piigi laius baasjoonel W1/2 on piigi laius poolel piigi kõrgusel. 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 281 1. 6. 7. Lahutamise efektiivsus Lisaks ribalaiust määravale teoreetiliste taldrikute arvule on tähtis ka lahutamise efektiivsus, mis sõltub sel- lest, kui järsk on kalibreerimiskõvera tõus. Kolonni lahutamisefektiivsus saadakse järgmisest valemist: V – V e,M x e,(10M x) kolonni ristlõikepindala 3 2] ≥ 6,0 [cm cm kus Ve,Mx on polüstüreeni molekulmassiga Mx elutsiooniruumala Ve,(10Mx) on 10 korda suurema molekulmassiga polüstüreeni elutsiooniruumala. Süsteemi lahutusvõime defineeritakse tavaliselt järgmiselt: R1,2 = 2× Ve1 – Ve2 W1 + W2 × 1 log10(M2/M1) kus Ve1, Ve2 on kahe polüstüreenistandardi elutsiooniruumalad piigi maksimumil W1, W2 on piigi laiused baasjoonel M1, M2 on piigi maksimumile vastavad molekulmassid (peaksid erinema 10 korda). Kolonnisüsteemi R-väärtus peaks olema suurem kui 1,7 (4). 1. 6. 8. Lahustid Kõik lahustid peavad olema kõrge puhtusastmega (kasutatava tetrahüdrofuraani puhtus on 99,5 %). Lahusti mahuti (vajadusel paigutatud inertgaasi atmosfääri) peab olema piisavalt suur, et võimaldada kolonni kalib- reerimist ja proovide analüüsi. Enne pumpamist kolonni peab lahustit degaseerima. 1. 6. 9. Temperatuurikontroll Kriitilise tähtsusega komponentide (injektsioonisilmus, kolonnid, detektor ja torustik) temperatuur peab olema konstantne ja sobima kasutatavale lahustile. 1. 6. 10. Detektor Detektori eesmärgiks on kolonnist elueeruva proovi kontsentratsiooni kvantitatiivne mõõtmine. Selleks, et vältida piikide tarbetut laienemist, peab detektori mõõteraku küveti ruumala olema võimalikult väike. See ei tohiks olla suurem kui 10 μl, välja arvatud valguse hajuvust ja viskoossust mõõtvate detektorite korral. Detekteerimiseks kasutatakse tavaliselt diferentsiaalrefraktomeetriat. Tingituna proovi või eluendi spetsiifi- listest omadustest võib kasutada ka muid detektsioonimeetodeid nagu näiteks UV/VIS, IR, viskoossusde- tektorid, jms. 2. ANDMED JA NENDE ESITAMINE 2. 1. Andmed Hindamiskriteeriumitele ning andmete kogumisele ja töötlemisele esitatavate üksikasjaliste nõuete osas peaks järgima DIN standardit (1). Iga proovi jaoks peab läbi viima kaks teineteisest sõltumatut katset. Neid katseid peab eraldi analüüsima. Iga mõõtmise tulemused peavad hõlmama Mn, Mw, Mw/Mn ja Mp väärtusi. Üheselt mõistetavalt peab näi- tama, et mõõdetud väärtused on suhtelised väärtused, mis on ekvivalentsed kasutatud standardi molekul- massidega. 282 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd Peale retensiooniruumalade või -aegade kindlaksmääramist (mida võib parandada sisestandardite kasuta- misega) esitatakse log Mp väärtused (kus Mp on kalibreerimiseks kasutatava standardi piigi maksimum) ühe eelnevalt toodud suuruse funktsioonina. Molekulmassi dekaadi (10-kordse vahemiku) kohta on vaja vähe- malt kahte kalibreerimiskõvera punkti ja terve kõvera jaoks on vaja vähemalt viit mõõtepunkti, mis peaks hinnanguliselt katma proovi molekulmassi. Kalibreerimiskõvera madala molekulmassiga osa lõpp-punkt määratakse kindlaks n-heksüülbenseeni või muu sobiva mittepolaarse soluudi abil. Arvkeskmised ja mass- keskmised molekulmassid arvutatakse tavaliselt elektroonilise andmetöötlusega, mis põhineb punktis 1. 2 toodud valemitel. Käsitsi digitaliseerimise kasutamisel võib eeskujuks võtta standardi ASTM D 3536-91 (3). Jaotuskõvera peab esitama tabeli või joonise kujul (diferentsiaalne sagedus või protsentide summa log M funktsioonina). Graafilisel kujutamisel peab üks molekulmassi kümnekordne vahemik olema umbes 4 cm laiune ja piigi maksimum peab olema umbkaudu 8 cm kõrgune. Integraalsete jaotuskõverate korral peab ordinaadi 0 ja 100 % vahemik olema umbes 10 cm laiune. 2. 2. Katseprotokoll Katseprotokoll peab sisaldama järgmist informatsiooni: 2. 2. 1. Katsetatav aine — olemasolev informatsioon analüüsitava aine kohta (identifitseerimiskood, lisandid, ebapuhtused), — proovi eeltöötluse täpne kirjeldus, tähelepanekud, probleemid. 2. 2. 2. Aparatuur — eluendi mahuti, inertgaas, eluendi degaseerimine, eluendi koostis, ebapuhtused, — pump, pulsatsioonisummuti, injektsioonisüsteem, — lahutuskolonnid (tootja, kõik kolonni näitajad, nagu poori suurus, täitematerjali liik jms, kasutatavate kolonnide arv, pikkus ja järjekord), — kolonni (või nende kombinatsiooni) teoreetiliste taldrikute arv, lahutamise efektiivsus (süsteemi lahu- tusvõime), — andmed piikide sümmeetria kohta, — kolonni temperatuur, temperatuurikontrolli liik, — detektor (mõõtmise põhimõte, tüüp, küveti ruumala), — kulumõõtja, kui kasutati (tootja, mõõte põhimõte), — andmete salvestamise ja töötlemise süsteem (riist- ja tarkvara). 2. 2. 3. Süsteemi kalibreerimine — kalibreerimiskõvera koostamiseks kasutatud meetodi täpne kirjeldus, — andmed selle meetodi kvaliteedikriteeriumite kohta (näiteks korrelatsioonikoefitsient, ruutsumma viga jms), — andmed kõikide ekstrapoleerimiste, oletuste ja lähenduste kohta, mis tehti eksperimendi ning andmete hindamise ja töötlemise käigus, — kõik kalibreerimiskõvera koostamiseks tehtud mõõtmised peavad olema dokumenteeritud tabelis, mis sisaldab kalibreerimiskõvera iga punkti kohta alljärgnevat informatsiooni: — proovi nimetus, — proovi tootja, — tootjapoolsed või mõõtmistel saadud standardit iseloomustavad Mp, Mn, Mw ja Mw/Mn väärtused, koos määramismeetodi üksikasjadega, — süsteruumala ja -kontsentratsioon, — kalibreerimisel kasutatud Mp väärtus, 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 283 — piigi maksimumile vastav mõõdetud elutsiooniruumala või parandatud retensiooniaeg, — piigi maksimumile arvutatud Mp, — arvutatud Mp protsentuaalne viga ja kalibreerimistulemus. 2. 2. 4. Hindamine — aja põhjal hindamine: nõutava korratavuse tagamiseks kasutatavad meetodid (parandusmeetod, sise- standard jms), — informatsioon selle kohta, kas hindamine viidi läbi elutsiooniruumala või retentsiooniaja põhjal, — informatsioon hindamise piiratuse kohta, kui piik ei ole täielikult analüüsitud, — silumismeetodite kirjeldus, kui neid kasutati, — proovi ettevalmistamise ja eeltöötluse protseduurid, — lahustumatute osakeste olemasolu, — süsteruumala (μl) ja -kontsentratsioon (mg/ml), — tähelepanekud seikade kohta, mis võivad põhjustada kõrvalekaldumist ideaalsest geelkromatograafia profiilist, — kõikide katseprotseduurides tehtud muudatuste üksikasjalik kirjeldus, — veapiiride üksikasjalikud andmed, — mis tahes muu informatsioon ja tähelepanekud, mis puudutavad tulemuste tõlgendamist. 3. VIITED (1) DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutions- mittel, Teil 1. (2) Yau, W. W. , Kirkland, J. J. , and Bly, D. D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons. (3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. (4) ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. 284 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd Muude meetodite näited, mida kasutatakse polümeeride arvkeskmise molekulmassi (Mn) määramisel Lisa Geelkromatograafia (GPC) on eelistatud meetod Mn määramiseks, eriti juhul, kui kättesaadav on standardite kogum, mille struktuur on võrreldav uuritava polümeeri struktuuriga. Kui geelkromatograafia kasutamisel on praktilist laadi raskused või olemasolevate andmete põhjal võib eeldada, et uuritav aine ei vasta esitatavatele Mn kriteeriumitele (va- jab eelnevalt kinnitamist), siis on võimalik kasutada alternatiivseid meetodeid, nagu: 1. Kolligatiivsete omaduste kasutamine 1. 1. Ebullioskoopia/krüoskoopia: hõlmab lahusti keemistemperatuuri tõusu (ebullioskoopia) või külmumistempera- tuuri alanemise (krüoskoopia) mõõtmist peale polümeeri lisamist. Meetod põhineb sellel, et lahustunud polü- meeri mõju keemis- või külmumistemperatuurile sõltub polümeeri molekulmassist (1) (2). Rakendatavus: Mn < 20 000. 1. 2. Aururõhu alandamine: hõlmab valitud võrdlusvedeliku aururõhu mõõtmist enne ja peale teadaoleva koguse polümeeri lisamist (1) (2). Rakendatavus: Mn < 20 000 (teoreetiliselt; praktikas siiski piiratud). 1. 3. Membraan osmomeetria: põhineb osmoosi põhimõttel, st tasakaalu saavutamiseks läbivad lahusti molekulid poolläbilaskvat membraani lahjemast lahusest kontsentreeritumasse lahusesse. Katses kasutatav lahja lahus on nullkontsentratsiooniga ja kontsentreeritud lahus sisaldab polümeeri. Läbi membraani tungiv lahusti tekitab rõhkude erinevuse, mis sõltub polümeeri kontsentratsioonist ja molekulmassist (1) (3) (4). Rakendatavus: Mn vahemikus 20 000–200 000. 1. 4. Aurufaasi osmomeetria: hõlmab puhta lahusti aerosooli aurustumiskiiruse võrdlemist vähemalt kolme aerosoo- liga, mis sisaldavad uuritava polümeeri erinevaid kontsentratsioone (1) (5) (6). Rakendatavus: Mn < 20 000. 2. Lõpp-rühma analüüs Selle meetodi kasutamiseks on vajalik teada nii polümeeri üldist struktuuri kui ka ahela otsmiste rühmade kee- milist koostist (mis peab olema eristatav põhiahelast näiteks NMR või tiitrimise/derivatiseerimise abil). Polü- meeris esinevate otsmiste rühmade molekulaarse kontsentratsiooni määramise kaudu saab leida molekulmassi (7) (8) (9). Rakendatavus: Mn kuni 50 000 (kahaneva usaldusväärsusega). VIITED (1) Billmeyer, F. W. Jr. , (1984). Textbook of Polymer Science, 3rd Edn. , John Wiley, New York. (2) Glover, C. A. , (1975). Absolute Colligative Property Methods. Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I P. E. Slade, Jr. ed. , Marcel Dekker, New York. (3) ASTM D 3750-79, (1979). Standard Practice for Determinition of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Menbrane Osmometry. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylva- nia. (4) Coll, H. (1989). Membrane Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A. R. Cooper ed. , J. Wiley and Sons, pp. 25 to 52. (5) ASTM 3592-77, (1977). Standard Recommended Practice for Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 285 (6) Morris, C. E. M. , (1989). Vapour Pressure Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A. R. Coo- per ed. , John Wiley and Sons. (7) Schröder, E. , Müller, G. , and Arndt, K-F. , (1989). Polymer Characterisation, Carl Hanser Verlag, Munich. (8) Garmon, R. G. , (1975). End-Group Determinations, Chapter 3. In: Polymer Molecular Weights, Part I, P. E. Slade, Jr. ed. Marcel Dekker, New York. (9) Amiya, S. , et al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, 2139-2146. 286 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd LISA III B A. 19 MADALAMOLEKULAARSETE AINETE SISALDUS POLÜMEERIS 1. MEETOD Käesolev geelkromatograafia (GPC) meetod on OECD katsejuhendi nr 119 (1996) koopia. Meetodi põhi- mõte ja tehniline lisainformatsioon on toodud kirjandusviidetes. 1. 1. Sissejuhatus Kuna polümeeride omadused on väga erinevad, siis on võimatu kirjeldada ühtainust meetodit, mille lahutamis- ja analüüsitingimused katavad kõiki polümeeride eraldamisel esinevaid võimalikke juhtumeid ja iseärasusi. Sageli ei ole keeruliste polümeerisegude koostisosadeks lahutamine geelkromatograafiaga või- malik. Kui geelkromatograafia ei ole kasutatav, siis võib molekulmassi määramiseks kasutada teisi meeto- deid (vt lisa). Sellistel juhtudel tuleb kasutatava meetodi kohta esitada kõik üksikasjad ja põhjendused. Kirjeldatav meetod põhineb DIN standardil nr 55672 (1). Üksikasjalik informatsioon katsete läbiviimiseks ja andmete hindamiseks on toodud nimetatud DIN standardis. Kui katse tingimuste muutmine osutub vaja- likuks, siis peab vastavaid muudatusi põhjendama. Kasutada võib ka muid standardeid, kui neile antakse täielikud viited. Kirjeldatava meetodi kalibreerimiseks kasutatakse teadaoleva polüdisperssusega polüstü- reenproove ja teatud polümeeride (näiteks vesilahustuvad ja pika ahelaga hargnenud polümeerid) analüüsil võib osutuda vajalikuks meetodi muutmine. 1. 2. Definitsioonid ja ühikud Madal molekulmass on kokkuleppeliselt molekulmass, mis on väiksem kui 1 000 daltonit. Arvkeskmise molekulmassi Mn ja masskeskmise molekulmassi Mw arvutamiseks kasutatakse järgmisi vale- meid: kus Hi on detektori signaali kõrgus mõõdetuna baasjoonelt retensioonimahu Vi jaoks Mi on retensioonimahule Vi vastava polümeerifraktsiooni molekulmass, ja n on mõõtepunktide arv. Molekulmassi jaotuse laius, mis iseloomustab segu disperssust, saadakse Mw/Mn suhtest. 1. 3. Võrdlusained Kuna geelkromatograafia on suhteline meetod, siis peab seda kalibreerima. Selleks otstarbeks kasutatakse tavaliselt kitsa fraktsioonilise jaotusega lineaarseid polüstüreenstandardeid, mille keskmised molekulmassid Mn ja Mw ja molekulmasside jaotus on teada. Kalibreerimiskõverat võib kasutada tundmatu proovi mole- kulmassi määramiseks vaid siis, kui proovi ja standardi lahutamiseks kasutatavad tingimused on valitud üht- viisi. 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 287 Molekulmassi ja elueerunud ruumala vaheline suhe on õige vaid konkreetsele katsele iseloomulikel tingi- mustel. Nimetatud tingimused hõlmavad eelkõige temperatuuri, lahustit (või lahustite segu), kromatograa- filisi tingimusi ja kasutatavat kolonni või kolonnisüsteemi. Sellisel viisil proovist määratud molekulmassid on suhtelised ja neid nimetatakse “polüstüreeniekvivalendi molekulmassideks”. See tähendab seda, et sõltuvalt proovi ja standardi vahelistest struktuurilistest ja kee- milistest erinevustest võivad molekulmassid hälbida absoluutsetest väärtustest rohkemal või vähemal mää- ral. Juhul kui kasutatakse teisi standardeid nagu näiteks polüetüleenglükool, polüetüleenoksiid, polümetüül metakrülaat, polüakrüülhape, siis peab seda põhjendama. 1. 4. Katsemeetodi põhimõte Geelkromatograafiaga võib määrata nii proovi molekulmassi jaotust kui keskmisi molekulmasse (Mn, Mw). Geelkromatograafia on spetsiaalne vedelikkromatograafia liik, milles proov lahutatakse üksikute koostis- osade hüdrodünaamiliste ruumalade järgi (2). Lahutamiseks juhitakse proov läbi poorse materjaliga, tavaliselt orgaanilise geeliga täidetud kolonni. Väi- kesed molekulid suudavad tungida pooridesse, kuhu suurte molekulide juurdepääs on takistatud. Seetõttu on suurte molekulide teepikkus lühem ja nad elueeruvad kiiremini. Keskmise suurusega molekulid tungi- vad osadesse pooridesse, mistõttu nad elueerivad mõnevõrra aeglasemalt. Kõige väiksemad molekulid, mille keskmine hüdrodünaamiline raadius on väiksem kui geeli poorid, tungivad kõikidesse pooridesse ja eluee- ruvad viimastena. Ideaaljuhul mõjutab lahutamist ainult molekulide suurus, kuid praktikas on raske vältida vähemalt mõnin- gaid adsorptsioonist tingitud segavaid mõjusid. Kolonni ebaühtlane täitematerjal ja suurem omaruumala võivad olukorda halvendada (2). Detekteerimiseks kasutatakse näiteks refraktsiooni indeksit või UV-absorptsiooni ja tulemuseks saadakse lihtne jaotuskõver. Selleks, et omistada saadud kõverale tegelikke molekulmassi väärtusi, tuleb kolonni kalib- reerida teadaolevate molekulmassidega ja ideaaljuhul üldjoontes sarnase struktuuriga polümeeridega nagu näiteks erinevad polüstüreenstandardid. Tüüpiliselt saadakse Gaussi kõver, mis on mõnikord madalate molekulmasside osas väljaveninud sabaga, kusjuures vertikaalsel teljel on elueerunud erinevate molekul- massiga ühendite kogus massi järgi ja horisontaalsel teljel on logaritmilises skaalas molekulmass. Nimetatud kõveralt saadakse madalmolekulaarsete ainete sisaldus. Arvutused saavad olla täpsed vaid siis, kui madala molekulmassiga ühendid annavad massi alusel detektorile samase signaali kui kogu polümeer. 1. 5. Kvaliteedikriteeriumid Elutsiooniruumala korratavus (suhteline standardhälve, RSD) peaks olema parem kui 0,3 %. Kui kromato- grammi hinnatakse ajalise sõltuvuse põhjal ja see ei vasta ülaltoodud kriteeriumitele, tagatakse analüüsi nõu- tav korratavus sisestandardi kasutamisega (1). Polüdisperssused sõltuvad standardite molekulmassidest. Polüstüreenistandardite kasutamisel on tüüpilised väärtused järgmised: Mp < 2 000 2 000 ≤ Mp ≤ 106 Mp > 106 Mw/Mn < 1,20 Mw/Mn < 1,05 Mw/Mn < 1,20 (Mp on piigi maksimumile vastav standardi molekulmass). 1. 6. Katsemeetodi kirjeldus 1. 6. 1. Polüstüreeni standardlahuste valmistamine Polüstüreeni standardid lahustatakse ettevaatlikul segamisel valitud eluendiga. Lahuste valmistamisel peab arvestama tootjapoolseid soovitusi. 288 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd Valitud standardi kontsentratsioonid sõltuvad mitmetest erinevatest teguritest, nagu näiteks süsteruumala, lahuse viskoossus ja analüütilise detektori tundlikkus. Maksimaalset süsteruumala peab kohandama vasta- valt kolonni pikkusele, et vältida kolonni ülelaadimist. Geelkromatograafia analüütiliste meetodite korral jäävad tüüpilised süsteruumalad vahemikku 40 kuni 100 μl, kui kolonni mõõdud on 30 cm × 7,8 mm. Või- malik on kasutada ka suuremaid ruumalasid, kuid need ei tohiks ületada 250 μl. Enne kolonni tegelikku kalibreerimist tuleb kindlaks teha süsteruumala ja kontsentratsiooni vaheline optimaalne suhe. 1. 6. 2. Proovi lahuse valmistamine Põhimõtteliselt kehtivad ülaltoodud nõudmised ka proovi lahuste valmistamisel. Proov lahustatakse sobi- vas lahustis, näiteks tetrahüdrofuraanis (THF), ettevaatlikul loksutamisel. Mitte mingil juhul ei tohi lahus- tamiseks kasutada ultrahelivanni. Vajaduse korral puhastatakse proovi lahust membraanfiltriga, mille poo- ride suurus on 0,2 kuni 2 μm. Lahustumatute osakeste olemasolu peab ära märkima ka lõplikus protokollis, kuna see võib olla tingitud kõrge molekulmassiga ühenditest. Lahustunud osakeste massiprotsendi määramiseks peab kasutama sobi- vat meetodit. Valmistatud lahuseid peab kasutama 24 tunni jooksul. 1. 6. 3. Parandused ebapuhtuste ja lisandite sisalduse jaoks Tavaliselt on vajalik ühendite molekulmassiga M < 1 000 sisalduse korrigeerimine, mis on tingitud mitte- polümeersetest komponentidest (näiteks ebapuhtused ja/või lisandid), välja arvatud juhul, kui nende ühen- dite mõõdetud sisaldus on niigi < 1 %. Selleks analüüsitakse otse polümeerilahust või geelkromatograafi eluaati. Kui eluaat on peale kolonni läbimist liiga lahja edasiseks analüüsiks, siis peab seda kontsentreerima. Vajalik võib olla eluaadi kuivaks aurutamine ja saadud jäägi uuesti lahustamine. Eluaati peab kontsentreerima tin- gimustel, mis ei põhjusta eluaadis muutusi. Geelkromatograafi eluaadi töötlemine sõltub kvantitatiivseks määramiseks kasutatavast analüütilisest meetodist. 1. 6. 4. Seadmed Geelkromatograafia seadmed sisaldavad järgmisi komponente: — mahuti lahustile, — degaseerija (vajadusel), — pump, — pulsatsioonisummuti (vajadusel), — injektsioonisüsteem, — kromatograafilised kolonnid, — detektor, — kulumõõtja (vajadusel), — andmesalvesti ja -töötleja, — nõu jääkide jaoks. Eelnevalt peab kindlaks tegema, et geelkromatograafia süsteem oleks kasutatavate lahustite suhtes inertne (näiteks tetrahüdrofuraani jaoks kasutada teraskapillaare). 1. 6. 5. Injektsiooni ja lahusti etteandmise süsteem Proovi lahuse etteantud kogus sisestatakse automaatse injektoriga või käsitsi täpselt kindlaksmääratud kolonni piirkonda. Käsitsi injektsiooni korral võib süstla kolvi liiga kiire tagasitõmbamine või vabastamine põhjustada muutusi mõõdetava molekulmassi jaotuses. Lahusti etteandmise süsteem peaks olema võima- likult pulseerimisvaba, sisaldades ideaaljuhul pulsatsioonisummutit. Voolukiirus on suurusjärgus 1 ml/min. 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 289 1. 6. 6. Kolonn Sõltuvalt proovist kasutatakse polümeeri iseloomustamiseks kas ühte kolonni või mitut järjestikku ühen- datud kolonni. Kolonni täitematerjalidena on kaubanduslikult kättesaadavad paljud poorsed kindlate oma- dustega ained (näiteks poori suurus, eksklusioonipiirid). Lahutamiseks kasutatava geeli või kolonni pikkuse valik sõltub nii proovi omadustest (hüdrodünaamiline ruumala, molekulmasside jaotus) kui ka spetsiifilis- test lahutamistingimustest, nagu näiteks lahusti, temperatuur ja voolukiirus (1) (2) (3). 1. 6. 7. Teoreetilised taldrikud Lahutamiseks kasutatavat kolonni või kolonnide süsteemi iseloomustatakse teoreetiliste taldrikute arvuga. Tetrahüdrofuraani kasutamisel eluendina hinnatakse seda etüülbenseeni või mõne muu sobiva mittepo- laarse lahustunud aine (soluudi) laadimisel teadaoleva pikkusega kolonni. Teoreetiliste taldrikute arv saa- dakse järgmiste valemite põhjal: W1/2)2 N = 5,54( Ve W)2 või N = 16(Ve kus N Ve on teoreetiliste taldrikute arv on piigi maksimumile vastav elutsiooniruumala W on piigi laius baasjoonel W1/2 on piigi laius poolel piigi kõrgusel. 1. 6. 8. Lahutamise efektiivsus Lisaks ribalaiust määravale teoreetiliste taldrikute arvule on tähtis ka lahutamise efektiivsus, mis sõltub sel- lest, kui järsk on kalibreerimiskõvera tõus. Kolonni lahutuse efektiivsus saadakse järgmisest seosest: V – V e,M x e,(10M x) kolonni ristlõikepindala 3 2] ≥ 6,0[cm cm kus Ve,Mx on polüstüreeni molekulmassiga Mx elutsiooniruumala Ve,(10 Mx) on 10 korda suurema molekulmassiga polüstüreeni elutsiooniruumala. Süsteemi lahutusvõimet defineeritakse tavaliselt järgmiselt: R1,2 = 2× Ve1 – Ve2 W1 + W2 × 1 log10(M2/M1) kus Ve1, Ve2 on kahe polüstüreenistandardi elutsiooniruumalad piigi maksimumil W1, W2 on piigi laiused baasjoonel M1, M2 on piigi maksimumile vastavad molekulmassid (peaksid erinema 10 korda). Kolonnisüsteemi R-väärtus peaks olema suurem kui 1,7 (4). 1. 6. 9. Lahustid Kõik lahustid peavad olema kõrge puhtusastmega (kasutatava tetrahüdrofuraani puhtus on 99,5 %). Lahusti mahuti (vajadusel paigutatud inertgaasi atmosfääri) peab olema piisavalt suur, et võimaldada kolonni kalib- reerimist ja proovide analüüsi. Enne pumpamist kolonni peab lahustit degaseerima. 290 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 1. 6. 10. Temperatuurikontroll Kriitilise tähtsusega komponentide (injektsioonisilmus, kolonnid, detektor ja torustik) temperatuur peab olema konstantne ja sobima kasutatavale lahustile. 1. 6. 11. Detektor Detektori eesmärgiks on kolonnist elueeruva proovi kontsentratsiooni kvantitatiivne mõõtmine. Selleks, et vältida piikide tarbetut laienemist, peab detektori mõõteraku küveti ruumala olema võimalikult väike. See ei tohiks olla suurem kui 10 μl, välja arvatud valguse hajuvust ja viskoossust mõõtvate detektorite korral. Detektorina kasutatakse tavaliselt diferentsiaalrefraktomeetriat. Tingituna proovi või eluendi spetsiifilistest omadustest võib kasutada ka muud tüüpi detektsioonimeetodeid, nagu näiteks UV/VIS, IR, viskoossusde- tektorid jms. 2. ANDMED JA NENDE ESITAMINE 2. 1. Andmed Hindamiskriteeriumitele ning andmete kogumisele ja töötlemisele esitatavate üksikasjaliste nõuete osas peaks järgima DIN standardit (1). Iga proovi jaoks peab läbi viima kaks teineteisest sõltumatut katset. Neid katseid peab eraldi analüüsima. Kõikidel juhtudel on oluline arvestada ka pimekatse andmeid, mis on läbi viidud prooviga samadel katse- tingimustel. Üheselt mõistetavalt peab näitama, et mõõdetud väärtused on suhtelised väärtused, mis on ekvivalentsed kasutatud standardi molekulmassidega. Peale retensiooniruumalade või -aegade kindlaksmääramist (mida võib parandada sisestandardite kasuta- misega) esitatakse log Mp väärtused (kus Mp on kalibratsioonistandardi piigi maksimum) ühe järgnevalt too- dud suuruse funktsioonina: Mn, Mw või Mw/Mn. Molekulmassi dekaadi (10-kordse vahemiku) kohta on vaja vähemalt kahte kalibreerimiskõvera punkti ja terve kõvera jaoks on vaja vähemalt viit mõõtepunkti, mis peaks hinnanguliselt katma proovi molekulmassi. Kalibreerimiskõvera madala molekulmassiga osa lõpp- punkt määratakse kindlaks n-heksüülbenseeni või muu sobiva mittepolaarse soluudi abil. Kõvera osa, mis vastab molekulmassidele alla 1 000, analüüsitakse ja parandatakse ebapuhtuste ja lisandite suhtes. Elutsioo- nikõveraid analüüsitakse tavaliselt elektrooniliste andmetöötluse vahenditega. Käsitsi digitaliseerimise kasu- tamisel võib eeskujuks võtta standardi ASTM D 3536-91 (3). Juhul, kui mis tahes lahustumatu polümeer jääb kolonni, siis on selle molekulmass tõenäoliselt suurem kui mis tahes komponendi oma lahustuvas fraktsioonis ja selle arvesse võtmata jätmisel hinnatakse üle madala molekulmassiga komponentide sisaldust. Madala molekulmassiga komponentide sisalduse määramise parandusjuhised lahustumatu polümeeri jaoks on toodud lisas. Jaotuskõvera peab esitama tabeli või joonise kujul (diferentsiaalne sagedus või protsentide summa log M funktsioonina). Graafilisel kujutamisel peab üks molekulmassi kümnekordne vahemik olema umbes 4 cm laiune ja piigi maksimum peab olema umbkaudu 8 cm kõrgune. Integraalsete jaotuskõverate korral peab ordinaadi 0 ja 100 % vahemik olema umbes 10 cm laiune. 2. 2. Katseprotokoll Katseprotokoll peab sisaldama järgmist informatsiooni: 2. 2. 1. Katsetatav aine — olemasolev informatsioon analüüsitava aine kohta (identifitseerimiskood, lisandid, ebapuhtused), — proovi eeltöötluse täpne kirjeldus, tähelepanekud, probleemid. 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 291 2. 2. 2. Aparatuur — eluendi mahuti, inertgaas, eluendi degaseerimine, eluendi koostis, ebapuhtused, — pump, pulsatsioonisummuti, injektsioonisüsteem, — lahutuskolonnid (tootja, kõik kolonni näitajad nagu poori suurus, täitematerjali liik jms, kasutatavate kolonnide arv, pikkus ja järjekord), — kolonni (või nende kombinatsiooni) teoreetiliste taldrikute arv, lahutamise efektiivsus (süsteemi lahu- tusvõime), — andmed piikide sümmeetria kohta, — kolonni temperatuur, temperatuurikontrolli liik, — detektor (mõõtmise põhimõte, tüüp, küveti ruumala), — kulumõõtja, kui kasutati (tootja, mõõte põhimõte), — andmete salvestamise ja töötlemise süsteem (riist- ja tarkvara). 2. 2. 3. Süsteemi kalibreerimine — kalibreerimiskõvera koostamiseks kasutatud meetodi täpne kirjeldus, — andmed selle meetodi kvaliteedinõuete kohta (näiteks korrelatsioonikoefitsient, ruutsumma viga jms), — andmed kõikide ekstrapoleerimiste, oletuste ja lähenduste kohta, mis tehti eksperimendi ning andmete hindamise ja töötlemise käigus, — kõik kalibreerimiskõvera koostamiseks tehtud mõõtmised peavad olema dokumenteeritud tabelis, mis sisaldab kalibreerimiskõvera iga punkti kohta alljärgnevat informatsiooni: — proovi nimetus, — proovi tootja, — tootjapoolsed või mõõtmistel saadud standardit iseloomustavad Mp, Mn, Mw ja Mw/Mn väärtused, koos määramismeetodi üksikasjadega, — süsteruumala ja -kontsentratsioon, — kalibreerimisel kasutatud Mp väärtus, — piigi maksimumile vastav mõõdetud elutsiooniruumala või parandatud retensiooniaeg, — piigi maksimumile arvutatud Mp, — arvutatud Mp protsentuaalne viga ja kalibreerimistulemus. 2. 2. 4. Informatsioon madalamolekulaarse polümeeri sisalduse kohta — analüüsimeetodite kirjeldus ja katsete läbiviimise viis, — madalmolekulaarsete komponentide protsentuaalne sisaldus (massi järgi) võrreldes kogu prooviga, — andmed ebapuhtuste, lisandite ja muude mittepolümeersete komponentide kohta massiprotsendina kogu proovist. 2. 2. 5. Hindamine — retensiooniaja järgi hindamine: nõutava korratavuse tagamiseks kasutatavad meetodid (parandusmee- tod, sisestandard jms), — informatsioon selle kohta, kas hindamine viidi läbi elutsiooniruumala või retensiooniaja põhjal, — informatsioon hindamise piiratuse kohta, kui piik ei ole täielikult analüüsitud, — silumismeetodite kirjeldus, kui neid kasutati, 292 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd — proovi ettevalmistamise ja eeltöötluse protseduurid, — lahustumatute osakeste olemasolu, — süsteruumala (μl) ja -kontsentratsioon (mg/ml), — tähelepanekud seikade kohta, mis võivad põhjustada kõrvalekaldumist ideaalsest geelkromatograafia profiilist, — kõikide katseprotseduurides tehtud muudatuste üksikasjalik kirjeldus, — veapiiride üksikasjalikud andmed, — mis tahes muu informatsioon ja tähelepanekud, mis puudutavad tulemuste tõlgendamist. 3. VIITED (1) DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutions- mittel, Teil 1. (2) Yau, W. W. , Kirkland, J. J. , and Bly, D. D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons. (3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. (4) ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 293 Madala molekulmassiga komponentide sisalduse parandusjuhised lahustumatu polümeeri olemasolul Lisa Proovis sisalduv lahustumatu polümeer põhjustab massikadu geelkromatograafilises analüüsis. Lahustumatu polü- meer jääb pöördumatult kolonni või proovi ettevalmistamisel kasutatud filtrile, kuid proovi lahustuv osa läbib kolon- ni. Kui polümeeri refraktsiooniindeksi juurdekasvu (dn/dc) saab hinnata või mõõta, siis on võimalik hinnata proovi massikadu kolonnis. Sellisel juhul kasutatakse paranduse tegemiseks välist kalibreerimist teadaoleva kontsentratsioo- niga ja dn/dc väärtusega standardainetega, et kalibreerida refraktomeetri signaali. Järgnevas näites kasutatakse polü- (metüülmetakrülaat) (pMMA) standardit. Akrüülpolümeeride analüüsil välise kalibreerimise saamiseks viiakse geelkromatograafi teadaoleva kontsentratsioo- niga pMMA standardi lahus tetrahüdrofuraanis ja saadud andmeid kasutatakse refraktomeetri konstandi leidmiseks järgmise valemi põhjal: K = R/(C × V × dn/dc) kus on refraktomeetri konstant (mikrovoltsekund/ml) on pMMA standardi signaal (mikrovoltsekund) on pMMA standardi kontsentratsioon (mg/ml) on süsteruumala (ml) ja K R C V dn/dc on pMMA lahuse tetrahüdrofuraanis refraktsiooniindeksi juurdekasv (ml/mg). Järgmised andmed on tüüpilised pMMA standardi jaoks: R C = 2 937 891 = 1,07 mg/ml = 0,1 ml V dn/dc = 9 × 10–5 ml/mg. Saadavat K väärtust, 3,05 × 1011, kasutatakse teoreetilise detektori signaali arvutamiseks, kui 100 % süstitud polü- meerist elueerus läbi detektori. 294 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd LISA III C A. 20 POLÜMEERIDE LAHUSTUMIS-/EKSTRAHEERUMISKÄITUMINE VEES 1. MEETOD Kirjeldatav meetod on OECD katsejuhendi nr 120 (1997) parandatud versiooni koopia. Täpsem tehniline lisainformatsioon on toodud kirjandusviites (1). 1. 1. Sissejuhatus Osade polümeeride nagu emulsioonipolümeerid korral on vajalik eeltöötlus enne allkirjeldatud meetodi kasutamist. Meetod ei ole kasutatav vedelate polümeeride ja katsetingimustel veega reageerivate polümee- ride jaoks. Kui meetod ei ole otstarbekohane või võimalik, siis võib polümeeri lahustumis- või ekstraheerumiskäitu- mist uurida muude meetodite abil. Sellistel juhtudel tuleb kasutatava meetodi kohta esitada kõik üksikas- jad ja põhjendused. 1. 2. Võrdlusained Puuduvad. 1. 3. Katsemeetodi põhimõte Polümeeride lahustumis- või ekstraheerumiskäitumist vesilahuses uuritakse muudatustega kolvimeetodil (vt A. 6 vees lahustuvus, kolvimeetod), mida on alljärgnevalt kirjeldatud. 1. 4. Kvaliteedinõuded Puuduvad. 1. 5. Katsemeetodi kirjeldus 1. 5. 1. Seadmed Meetodi jaoks on vajalikud järgmised seadmed: — purustamisseade, näiteks jahvatusmasin, kindla suurusega osakeste valmistamiseks, — seade loksutamiseks, temperatuurikontrolli võimalusega, — membraanfiltratsiooni süsteem, — asjakohased analüütilised seadmed, — standardsed sõelad. 1. 5. 2. Proovi ettevalmistus Esindusliku proovi peab esmalt vähendama osakeste suuruseni 0,125 kuni 0,25 mm kasutades vastavaid sõelu. Proovi stabiilsuse tagamiseks või jahvatamisel võib vajalik olla jahutamine. Kummilaadseid mater- jale saab purustada vedela lämmastiku temperatuuril (1). Kui soovitud osakeste suurusega fraktsioon ei ole saavutatav, peab vähendama osakeste suurust nii palju kui võimalik ja saadud tulemused protokollima. Protokollis peab täpselt ära näitama, mil viisil säilitati purustatud proovi enne katset. 1. 5. 3. Protseduur Katsetatava aine kolm proovi (á 10 g) kaalutakse vastavalt kolme klaaskorgiga varustatud nõusse ja igaühte lisatakse 1 000 ml vett. Kui polümeeri koguses 10 g ei ole võimalik käsitleda, siis peab kasutama suurimat kogust, mille käsitlemine on veel võimalik, ja muutma vastavalt sellele ka vee kogust. 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 295 Nõud suletakse tihedalt ja seejärel loksutatakse temperatuuril 20 °C. Kasutada tuleks konstantsel tempera- tuuril töötavat loksutit või segajat. Peale 24 tunni möödumist tsentrifuugitakse või filtritakse iga nõu sisu ja selges veefaasis määratakse polümeeri kontsentratsioon sobiva analüüsimeetodiga. Kui veefaasi jaoks puudub sobiv analüüsimeetod, siis võib summaarset lahustuvust/ekstraktiivsust hinnata filtril oleva jäägi või tsentrifuugimise sademe kuivkaalu põhjal. Tavaliselt on vajalik ebapuhtuste ja lisandite ning madala molekulmassiga komponentide kvantitatiivne eristamine. Gravimeetrilise analüüsi korral on tähtis sooritada ka pimekatse ilma testaineta, et hinnata kat- seprotseduurist tingitud jääkide kogust. Polümeeride lahustumis- või ekstraheerumiskäitumist vesilahuses temperatuuril 37 °C ning pH 2 ja pH 9 juures võib määrata samal viisil, nagu kirjeldati katse läbiviimist temperatuuril 20 °C. Vastava pH väärtuse saavutamiseks võib lisada kas sobivaid puhvreid, happeid või aluseid, nagu vesinikkloriidhape, etaanhape, analüütilise puhtusega naatrium- või kaaliumhüdroksiid või ammoniaak. Sõltuvalt analüüsimeetodist peaks tegema ühe või kaks katset. Kui polümeeri vesilahuse otsese analüüsi jaoks on olemas piisavalt spetsiifilised meetodid, siis piisab ühest eelnevalt kirjeldatud katsest. Kui sellised meetodid ei ole kättesaadavad ja polümeeri lahustumis- või ekstraheerumiskäitumise määramine piirdub vaid kaudse analüüsiga, kus määratakse veefaasi kogu orgaanilise süsiniku sisaldus (TOC), peab läbi viima lisakatse. Lisakatse hõlmab samuti kolme paralleelkatset, milles kasutatakse 10 korda väiksemat polümee- rikogust ja sama veekogust, mida kasutati esimeses katses. 1. 5. 4. Analüüs 1. 5. 4. 1. Ü he pr oo v i s uurusega l äbi viidud katse Polümeeri komponentide otseseks analüüsiks veefaasis võib olla sobivaid meetodeid. Alternatiivina saab kasutada lahustunud või ekstraheerunud polümeeri komponentide kaudset analüüsi, millega määratakse lahustuvate komponentide üldine sisaldus ning tehakse parandusi polümeerile mittespetsiifiliste kompo- nentide osas. Kõikide polümeeri komponentide analüüs veefaasis on võimalik: kas piisavalt tundliku meetodiga, nagu näiteks — kogu orgaanilise süsiniku määramine (TOC), kasutades persulfaadi või dikromaadiga lagundamist, tek- kiva süsinikdioksiidi koguse määramiseks kasutatakse infrapunaspektroskoopiat või keemilisi analüü- simeetodeid, — aatomabsorptsioonspektromeetria (AAS) või induktiivsidestunud plasma (ICP) emissioonspektromeet- ria, kui polümeer sisaldab räni või metalle, — UV-absorptsioon või spektrofluoromeetria arüülpolümeeride jaoks, — vedelikkromatograafia — mass-spektromeetria (LC-MS) madala molekulmassiga proovide jaoks, või aurutades vee ekstrakti kuivjäägini ja saadud jääki analüüsitakse spektroskoopiliselt (IR, UV, jms) või AAS/ICP abil. Kui veefaasi analüüs ei ole teostatav, siis peaks vesiekstrakti ekstraheerima vees segunematu orgaanilise lahustiga nagu näiteks klorosüsivesinikud. Lahusti aurutatakse ja saadud jäägis analüüsitakse ülalnimeta- tud polümeeri sisaldust. Selles jäägis sisalduvad ebapuhtusena või lisanditena identifitseeritud komponen- did lahutatakse tulemusest, et määrata polümeeri lahustumis- või ekstraheerumisastet. Kui proov sisaldab suhteliselt palju sellist materjali, siis võib jääki analüüsida vedelikkromatograafia (HPLC) või gaaskromatograafia (GC) abil, et eraldada ebapuhtused monomeeridest ja monomeeridest pärinevatest komponentidest nii, et saab määrata monomeeride tegeliku koguse. Osadel juhtudel on piisav orgaanilise lahusti aurutamine kuivjäägini ja saadud jäägi kaalumine. 296 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 1. 5. 4. 2. Ka he e r i n e v a p r o o v i s u u r u s e g a l ä b i v i i d u d k a t s e Kõikides vesiekstraktides analüüsitakse kogu orgaanilist süsinikku (TOC). Proovi lahustumatut või ekstraheerumatut osa analüüsitakse gravimeetriliselt. Kui peale iga nõu sisu tsent- rifuugimist või filtrimist on nõu seintel polümeeri jääke, siis peab nõud loputama filtraadiga kuni nõu sein- tel ei ole jääke näha. Seejärel filtritakse või tsentrifuugitakse filtraati uuesti. Filtril või tsentrifuugiklaasis ole- vat jääki kuivatatakse temperatuuril 40 °C vaakumis ning kaalutakse. Kuivatamist jätkatakse kuni konstantse kaalu saavutamiseni. 2. ANDMED 2. 1. Ühe proovi suurusega läbiviidud katse Kõigi kolme kolvikatse tulemused ja keskmised väärtused peab esitama ja tulemused tuleb väljendada mas- siühikutes lahuse ruumala kohta (tüüpiliselt mg/l) või massiühikutes polümeeri proovi massi kohta (tüü- piliselt mg/g). Lisaks tuleb esitada ka proovi massikadu (arvutatakse soluudi massi jagamisel esialgse proovi massiga). Katsete puhul tuleks arvutada ka suhteline standardhälve (RSD). Kogu proovi (polümeer + olu- lised lisandid jms) ja ainult polümeeri (peale selliste lisandite mõju lahutamist) kohta peab esitama eraldi tulemused. 2. 2. Kahe erineva proovi suurusega läbiviidud katse Kahest kolme paralleelkatsega eksperimendist saadud TOC väärtused ja iga eksperimendi keskmine tuleb esitada massiühikuna lahuse ruumala kohta (tavaliselt mgC/l) ja massiühikuna proovi massi kohta (tavali- selt mgC/g). Kõrge ja madala proovi/vee suhtega katsetulemuste vahelise erinevuse puudumine viitab sellele, et kõik eks- traheeruvad komponendid on ekstraheerunud. Sellistel juhtudel ei ole tavaliselt otsene analüüs vajalik. Jääkide massid peab esitama ja tulemused tuleb väljendada protsendina proovi esialgsest massist. Iga katse jaoks peab arvutama keskmise. Erinevused 100 % ja leitud protsendi vahel esitavad lahustuva ja ekstrahee- ruva materjali protsendilist sisaldust esialgses proovis. 3. ARUANDLUS 3. 1. Katseprotokoll Katsetulemused peavad sisaldama järgmist informatsiooni: 3. 1. 1. Katsetatav aine — olemasolev informatsioon analüüsitava ühendi kohta (identifitseerimiskood, lisandid, ebapuhtused, madala molekulmassiga komponentide sisaldus). 3. 1. 2. Katse tingimused — kasutatud protseduuride kirjeldus ja katse tingimused, — analüütiliste ja määramismeetodite kirjeldus. 3. 1. 3. Tulemused — lahustuvuse/ekstraktiivsuse tulemused (mg/l); erinevates lahustes läbiviidud ekstraktsioonikatsete üksi- kud ja keskmised väärtused, lagunenud polümeeri sisaldus, ebapuhtused, lisandid jms, — polümeeri lahustuvuse/ekstraktiivsuse tulemused (mg/g), — kui mõõdeti, siis vee ekstraktide TOC tulemused, soluudi mass ja arvutatud protsendid, 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 297 — iga proovi pH väärtus, — pimekatsete tulemused, — kus vajalik, peab viitama katsetatava ühendi keemilisele ebastabiilsusele nii katse kui ka analüütilise protsessi käigus, — kõik informatsioon, mis omab tähtsust tulemuste tõlgendamisel. 4. VIITED (1) DIN 53733 (1976) Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen für Prüfzwecke. 298 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd LISA III D C. 13 BIOKONTSENTRATSIOON: KALADEGA LÄBIVOOLUKATSE 1. MEETOD Käesolev biokontsentratsiooni meetod on OECD katsejuhendi nr 305 (1996) koopia. 1. 1. Sissejuhatus Käesolev meetod kirjeldab ainete biokontsentratsiooni potentsiaali hindamist kalades läbivoolava vee tin- gimustes. Kuigi kindlalt tuleb eelistada läbivoolutingimustega katseid, on katsetes lubatav kasutada ka pool- seisva vee tingimusi eeldusel, et valideerimisnõuded on täidetud. Meetodi kirjeldus on piisavalt üksikasjalik katse läbiviimiseks, samas võimaldades küllaldast vabadust katse kohandamiseks vastavalt konkreetsetele laboritingimustele ja uuritavate ainete omadustele. Meetod sobib kõige paremini stabiilsete orgaaniliste ainete hindamiseks, mille log Pow väärtus on 1,5 kuni 6,0 (1), kuid seda saab kasutada ka superlipofiilsete ainete jaoks, mille log Pow > 6,0. Biokontsentratsiooni teguri (BCF) eelhinnang, mida tähistatakse ka kui KB, on selliste superlipofiilsete ainete jaoks eeldatavasti kõrgem kui laborikatsetest saadud püsioleku biokontsentratsiooni tegur (BCFSS). Biokontsentratsiooni teguri eelhin- nanguid orgaaniliste kemikaalide jaoks, mille log Pow väärtused on kuni 9,0, saadakse Bintein et al. (2) võr- randitest. Biokontsentratsiooni potentsiaali iseloomustavad parameetrid on seondumise kiiruskonstant (k1), puhastumise kiiruskonstant (k2) ja BCFSS. Radiomärgistatud katseained lihtsustavad vee- ja kalaproovide analüüsimist ning neid võib kasutada otsus- tamisel, kas on vaja teha laguproduktide identifitseerimist ja kvantitatiivset analüüsi. Kogu radioaktiivse jäägi mõõtmisel (näiteks põletamisel või kudede lahustamisel) saadud BCF põhineb lähteainel, mis tahes säilinud metaboliitidel ja samuti assimileerunud süsinikul. Seetõttu ei ole kogu radioaktiivse jäägi mõõt- misel põhinev BCF otseselt võrreldav BCF-iga, mis on saadud ainult lähteaine analüüsil teatud keemiliste meetoditega. Radiomärgistamisega uuringutes võib lähteainel põhineva BCF määramisel kasutada puhastamismenetlust ja vajadusel iseloomustada peamiseid metaboliite. Lisaks on võimalik kombineerida kalade metabolismi uuringut biokontsentratsiooni uuringuga, analüüsides ja identifitseerides kudedes jääke. 1. 2. Mõisted ja ühikud Biokontsentratsioon/bioakumulatsioon on uuritava aine kontsentratsiooni kasv organismis või selle pinnal (tea- tud kudedes) võrreldes uuritava aine kontsentratsiooniga ümbritsevas keskkonnas. Biokontsentratsiooni tegur (BCF või KB) akumulatsioonikatse seondumisfaasi mis tahes ajahetkel on uuritava aine kontsentratsioon kalades (kala pinnal) või teatud kudedes (Cf, ühik μg/g (ppm)) jagatuna uuritava aine kontsentratsiooniga ümbritsevas keskkonnas (Cw, ühik μg/ml (ppm)). Püsioleku biokontsentratsiooni tegur (BCFSS või KB) ei muutu märkimisväärselt pikemaajalise ajavahemiku väl- tel, kui uuritava aine kontsentratsioon ümbritsevas keskkonnas on selle ajavahemiku vältel konstantne. Platoo või püsiolek saavutatakse kalades sisalduva uuritava aine kontsentratsiooni (Cf) ja aja funktsiooni esi- taval kõveral siis, kui see saab paralleelseks ajateljega ja vähemalt kahepäevaste intervallidega võetud proo- vide kolm järjestikust Cf analüüsi tulemust on üksteise suhtes ±20 % ja kolme proovivõtmisperioodi vahel ei ole märkimisväärseid erinevusi. Ühendatud (puulitud) proovide analüüsimisel on nõutavad vähemalt neli järjestikust analüüsi. Aeglaselt seonduvate ainete jaoks on sobivamaks intervalliks seitse päeva. 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 299 Kineetilistest kiiruskonstantidest (k1/k2) otse arvutatud biokontsentratsiooni tegurit nimetatakse kineetiliseks biokontsentratsiooni teguriks BCFk. Jaotuskoefitsient oktanool/vesi (Pow) on aine lahustuvuse suhe n-oktanoolis ja vees tasakaalutingimustel (mee- tod A. 8), seda tähistakse ka Kow. Pow logaritmi kasutatakse kemikaali biokontsentratsiooni potentsiaali tähistamiseks veeorganismides. Ekspositsiooni- või seondumisfaas on aeg, mille jooksul kala puutub kokku uuritava ainega. Seondumise kiiruskonstant (k1) on numbriline väärtus, mis iseloomustab uuritava aine kontsentratsiooni kasvu kiirust kalas või kala pinnal (või teatud kudedes), kui kala puutub kokku selle ainega (k1 ühik on päev–1). Ekspositsioonijärgne või puhastumise (kao) faas on aeg, mis järgneb kala viimisele uuritavat ainet sisaldavast keskkonnast ilma selle aineta keskkonda, mille kestel uuritakse selle aine puhastumist (või summaarset kadu) kalast (või teatud kudedest). Puhastumise (kao) kiiruskonstant (k2) on numbriline väärtus, mis iseloomustab uuritava aine kontsentrat- siooni vähenemise kiirust kalas (või teatud kudedes) peale kala viimist uuritavat ainet sisaldavast keskkon- nast seda ainet mittesisaldavasse keskkonda (k2 ühik on päev–1). 1. 3. Katsemeetodi põhimõte Katse koosneb kahest faasist: ekspositsiooni (seondumise) faas ja ekspositsioonijärgne (puhastumise) faas. Seondumisfaasi ajal viiakse sama liiki kalade erinevad rühmad kokku uuritava aine vähemalt kahe kont- sentratsiooniga. Seejärel viiakse kalad puhastumisfaasi jaoks uuritava aine vabasse keskkonda. Puhastumis- faas on alati vajalik, välja arvatud juhul, kui aine seondumine seondumisfaasis oli tähtsusetu (näiteks BCF < 10). Uuritava aine kontsentratsiooni kalas või kala pinnal (või teatud kudedes) jälgitakse katse mõlema faasi kestel. Lisaks kahele katses kasutatud kontsentratsioonile hoitakse kontrollrühma kalu samastes tin- gimustes ilma uuritava aineta, et võrrelda biokontsentratsiooni katse vältel täheldatud võimalikke ebasood- said mõjusid vastava kontrollrühmaga ja teha kindlaks uuritava aine foonilist (mõju mitte avaldavat) kont- sentratsiooni. Seondumisfaas kestab 28 päeva või vähem, kui on võimalik tõestada, et tasakaal püstitus varem. Seondu- misfaasi pikkust ja püsioleku saavutamiseks kuluvat aega saab hinnata lisas 3 toodud võrrandi abil. Puhas- tumisperiood algab kala üleviimisega puhtasse nõusse, milles on sama keskkond, kuid mis ei sisalda uuri- tavat ainet. Võimalusel arvutatakse biokontsentratsiooni tegur nii kalas (Cf) ja vees (Cw) sisalduva uuritava aine kontsentratsiooni suhtena näivas püsiolekus (BCFSS) kui ka kineetilise biokontsentratsiooni tegurina (BCFk) seondumise kiiruskonstandi (k1) ja puhastumise kiiruskonstandi (k2) suhtest eeldades, et protsessid on esimest järku kineetikaga. Kui ilmselgelt ei ole tegemist esimest järku kineetikaga, siis peab kasutama keerulisemaid mudeleid (lisa 5). Kui püsiolekut ei saavutata 28 päeva jooksul, siis peab seondumisfaasi pikendama kuni püsioleku saavu- tamiseni või 60 päeva pikkuseni, sõltuvalt kumb neist esimesena saavutatakse, misjärel alustatakse puhas- tumisfaasi. Seondumise kiiruskonstant, puhastumise (kao) kiiruskonstant (või konstandid keerulisemate mudelite kor- ral), biokontsentratsiooni tegur ja kus võimalik, iga nimetatud parameetri usalduspiirid arvutatakse mude- list, mis kirjeldab kõige paremini uuritava aine mõõdetud kontsentratsioone kalades ja vees. BCF esitatakse kalade märgkaalu funktsioonina. Siiski võib erieesmärgil kasutada teatud kudesid või orga- neid (näiteks lihased, maks), kui kala on piisavalt suur või kui kala võib jagada söödavaks (filee) ja mitte- söödavaks (sisikond) osaks. Kuna paljude orgaaniliste ainete potentsiaalse biokontsentratsiooni ja lipofiil- suse vahel on selge seos, siis on ka uuritava kala rasvasisalduse ja nende ainete vaadeldava biokontsentratsiooni vahel vastav seos. Seetõttu peaks kõrge lipofiilsusega ainete (näiteks log Pow > 3) bio- kontsentratsiooni väljendama lisaks kogukaalule ka rasvasisalduse suhtes, et vähendada katsetulemuste varieeruvust. 300 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd Võimalusel peaks rasvasisaldust määrama samast bioloogilisest materjalist, millest määrati uuritava aine kontsentratsioon. 1. 4. Uuritava aine andmed Enne biokontsentratsiooni katse teostamist peab uuritava aine kohta teadma järgmisi andmeid: a) lahustuvus vees; b) jaotuskoefitsient oktanool/vesi Pow (tähistatakse ka kui Kow ja määratakse HPLC meetodiga vastavalt punktile A. 8); c) hüdrolüüs; d) fototransformatsioon vees, määratakse päikesekiirguse või simuleeritud päikesekiirguse abil biokont- sentratsiooni katse kiiritustingimustel (3); e) pindpinevus (ainete jaoks, mille log Pow väärtust ei saa määrata); f) aururõhk; g) kohene biolagunduvus (vajadusel), Muu nõutav informatsioon on uuritava aine toksilisus katses kasutatava kalaliigi suhtes, eelistatult asümp- tootiline LC50 (st ajast sõltumatu). Teadaoleva mõõtetäpsusega, kordustäpsusega ja tundlikkusega sobilik meetod uuritava aine kvantitatiivse sisalduse määramiseks katselahustes ja bioloogilises materjalis peab olema kättesaadav koos üksikasjaliku kirjeldusega proovi ettevalmistamise ja säilitamise kohta. Samuti peab teadma testainete analüütilist määramispiiri vees ja kala kudedes. 14C-märgistatud uuritava aine kasutami- sel on vaja teada ka lisanditest tingitud radioaktiivsuse protsenti. 1. 5. Katse kehtivus Katse kehtivuseks peavad olema täidetud alljärgnevad tingimused: — temperatuuride erinevus alla ±2 °C, — lahustunud hapniku sisaldus ei tohi langeda alla 60 % küllastuskontsentratsioonist, — seondumisfaasis hoitakse uuritava aine kontsentratsiooni kambris ±20 % piires mõõdetud väärtuste keskmisest, — suremus või muud ebasoodsad mõjud ja haigused kontroll- ja katserühma kaladel on katse lõpus alla 10 %; kui katse kestab mitmeid nädalaid või kuid, siis surm või muud ebasoodsad mõjud peavad mõle- mas kalade rühmas olema vähem kui 5 % kuu kohta ja mitte ületama kokku 30 %. 1. 6. Võrdlusained Vajadusel on katsemenetluse kontrollimiseks hea kasutada teadaoleva biokontsentratsiooni potentsiaaliga võrdlusaineid. Siiski ei saa veel soovitada konkreetseid aineid. 1. 7. Katsemeetodi kirjeldus 1. 7. 1. Seadmed Katseseadme kõikide osade korral peab vältima materjalide kasutamist, mis võivad lahustuda, sorbeeruda või leostuda ning millel on kaladele ebasoodne mõju. Kasutada võib keemiliselt inertsetest materjalidest val- mistatud standardseid nelinurkseid või silindrilisi mahuteid, mille mahutavus on kooskõlas voolukiiruse- ga. Vältima peaks pehmest plastmassist torude kasutamist. Eelistatult kasutatakse teflonist (R), roosteva- bast et vaja võib minna kõrge torustikku. Kogemustest on teada, absorptsioonikoefitsiendiga aineid, nagu sünteetilised püretroidid, silaniseeritud klaas. Sellistel juhtudel peab seadmed peale kasutamist ära viskama. ja/või klaasist terasest 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 301 1. 7. 2. Vesi Tavaliselt kasutatakse katses looduslikku vett, mida peaks saama saastumata ja ühtlase kvaliteediga allikast. Lahjendusvesi peab olema sellise kvaliteediga, mis tagab valitud kalaliikide ellujäämise aklimatsiooni- ja kat- seperioodide vältel, ilma et tekiks mis tahes ebanormaalse välimuse või käitumise ilminguid. Ideaaljuhul peaks saama näidata, et uuritavad liigid jäävad ellu, kasvavad ja paljunevad lahjendusvees (näiteks labori- kultuur või elutsükli toksilisuse test). Kasutatavas vees peaks eelnevalt määrama vähemalt pH, üldkareduse, tahke jäägi, kogu orgaanilise süsiniku, eelistatult ka ammooniumi, nitriti sisalduse ja mereliikide korral ka soolsuse. Kalade optimaalseks kasvuks vajaminevad parameetrid on hästi teada, kuid lisas 1 on toodud mit- mete parameetrite soovituslikud maksimumkontsentratsioonid mageda ja soolase vee katsetele. Katseperioodi kestel peaks vesi olema konstantse kvaliteediga. Vee pH väärtus peaks olema vahemikus 6,0 kuni 8,5, kuid konkreetse katse ajal ei tohiks muutus olla suurem kui ±0,5 pH ühikut. Selleks, et lahjen- dusvesi ei mõjutaks liialt katsetulemusi (näiteks moodustades uuritava ainega kompleksühendeid) või kalade seisundit, peab teatud ajavahemike järel analüüsima veeproove. Seal kus lahjendusvesi on teada- olevalt suhteliselt püsiva kvaliteediga peaks raskemetallide (näiteks Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), peamiste anioo- nide ja katioonide (näiteks Ca, Mg, Na, K, Cl, SO4), pestitsiidide (näiteks kõik fosfororgaanilised ja kõik kloor- orgaanilised pestitsiidid), üldise orgaanilise süsiniku ja suspendeerunud tahkete ainete sisaldust määrama näiteks iga kolme kuu järel. Kui vee kvaliteet on püsiv vähemalt ühe aasta vältel, siis võib erinevaid para- meetreid analüüsida harvemini ja proovi võtmise ajavahemikke suurendada (näiteks iga kuue kuu järel). Lahjendusvee loodusliku hõljuvaine (tahkete osakeste) sisaldus ja üldine orgaaniline süsinik (TOC) peaks olema võimalikult madalad, et vältida uuritava aine adsorptsiooni orgaanilisele hõljuvainele, mis võib vähendada selle biosaadavust (4). Tahkete osakeste maksimaalne vastuvõetav sisaldus on 5 mg/l (kuivaine, mis ei läbi 0,45 μm filtrit) ja üldise orgaanilise süsiniku sisaldus 2 mg/l (vt lisa 1). Vajadusel peaks vett enne kasutamist filtrima. Kalade (väljaheidete) ja toidujääkide panus orgaanilise süsiniku sisaldusele peaks olema võimalikult madal. Kogu katse kestel ei tohiks orgaanilise süsiniku sisaldus katseanumas ületada uuritavast ainest ja solubiseerijast (kui seda kasutatakse) pärineva orgaanilise süsiniku kontsentratsiooni mitte roh- kem kui 10 mg/l (±20 %) võrra. 1. 7. 3. Katselahused Uuritava aine põhilahus valmistatakse sobiva kontsentratsiooniga. Põhilahus valmistatakse eelistatult uuri- tava aine segamisel või loksutamisel lahjendusvees. Lahustite või dispergeerijate (solubiliseerijate) kasuta- mine ei ole soovitatav, siiski võib see olla mõningatel juhtudel vajalik piisavalt kontsentreeritud põhilahuse valmistamisel. Sobivad lahustid on etanool, metanool, etüleenglükool monometüüleeter, etüleenglükool dimetüüleeter, dimetüülformamiid ja trietüleenglükool. Sobivad dispergaatorid on Cremophor RH40, Tween 80, metüültselluloos 0,01 % ja HCO-40. Kergesti biolagunevate ühendite kasutamisega tuleb olla ettevaatlik, kuna need võivad läbivoolu katsetes põhjustada probleeme bakterite kasvuga. Uuritav aine võib olla radiomärgistatud ja ta peaks olema kõrgeima puhtusastmega (näiteks eelistatult > 98 %). Läbivoolu katsete jaoks on nõutav süsteem (näiteks mõõtepump, proportsionaalne lahjendaja, küllasta- missüsteem), mis jaotab ja lahjendab pidevalt uuritava aine põhilahust katsekambritesse. Katsekambris peaks vesi eelistatult vahetuma vähemalt viis kambri mahtu ööpäevas. Eelistatud on läbivoolurežiim, kuid kus see pole võimalik (näiteks mõjutab see katseorganisme kahjulikult), võib kasutada poolseisva veega kat- set eeldusel, et valideerimisnõuded on täidetud. Põhilahuse ja lahjendusvee voolukiiruseid peab kontrol- lima 48 tundi enne katset ja seejärel vähemalt iga päev katse vältel. Voolukiiruse kontroll peab hõlmama igat katsekambrit ja sellega tagatakse, et voolukiirus ei varieeru rohkem kui 20 % ühe katsekambri piires või katsekambrite vahel. 302 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 1. 7. 4. Liikide valik Liikide valikukriteeriumiteks on kättesaadavus, sobiv suurus ja võimalus kalu laboritingimustes rahulda- valt pidada. Muud kalaliikide valikukriteeriumid hõlmavad harrastuslikku, kaubanduslikku ja ökoloogilist väärtust, aga ka samaväärset tundlikkust, varasemat edukat kasutamist jms. Soovitatavad katseloomade liigid on toodud lisas 2. Kasutada võib ka muid liike, kuid see võib eeldada kat- semenetluse kohandamist sobivate katsetingimuste loomiseks. Sellisel juhul tuleb esitada liikide ja katse- meetodi valiku põhjendused. 1. 7. 5. Kalade pidamine Kalavarude populatsioon peab aklimatiseeruma vähemalt kaks nädalat katse temperatuuril oleva veega ja saama piisavalt sööta, mis on sama tüüpi katses kasutatava söödaga. Peale 48tunnist sisseelamisperioodi märgitakse kalade suremus ja rakendatakse järgmisi kriteeriume: — suremus on suurem kui 10 % populatsioonist seitsme päeva jooksul: terve partii loetakse sobimatuks, — suremus on 5 % kuni 10 % populatsioonist seitsme päeva jooksul: kalu jälgitakse veel seitse päeva, — suremus on vähem kui 5 % populatsioonist seitsme päeva jooksul: kalad loetakse sobivaks, kuid kui järgmise seitsme päeva jooksul ületab suremus 5 %, siis loetakse terve partii sobimatuks. Eelnevalt peab veenduma, et katsetes kasutatavatel kaladel ei ole märgatavaid haigusi ja väärarenguid. Kõik haigestunud kalad tuleb jätta kõrvale. Kalu ei tohi ravida kaks nädalat enne katset või katse ajal. 1. 8. Katse tegemine 1. 8. 1. Eelkatse Eelkatse läbiviimine on vajalik selleks, et optimiseerida lõpliku katse tingimusi, nagu näiteks uuritava aine kontsentratsioonid, seondumis- ja puhastumisfaaside kestus. 1. 8. 2. Ekspositsioonitingimused 1. 8. 2. 1. Se on dum is faas i k est us Seondumisfaasi kestust saab ennustada praktilisele kogemusele tuginedes (näiteks eelnevast uuringust või sarnase kemikaali akumulatsiooni andmetest) või teatud empiiriliste seoste põhjal, milles kasutatakse uuri- tava aine lahustuvust vees või jaotuskoefitsienti oktanool/vesi (vt lisa 3). Seondumisfaas kestab 28 päeva või kuni tasakaalu püstitumiseni. Kui püsiolekut ei saavutata 28 päeva jooksul, siis peab seondumisfaasi pikendama ja sooritama lisamõõtmisi, kuni püsioleku saavutamiseni või 60 päeva, sõltuvalt kumb neist esimesena saavutatakse. 1. 8. 2. 2. Puhastum isfaasi k estus Ajavahemik, mis võrdub poolega seondumisfaasi kestusest, on tavaliselt piisav aine sobivaks vähenemi- seks (näiteks 95 %) kehakaalu kohta (vt lisa 3, hinnangute selgitused). Kui 95 % kao saavutamiseks vaja- minev ajavahemik on ebapraktiliselt pikk, ületades näiteks kaks korda seondumisfaasi normaalset kestust (st üle 56 päeva), siis võib kasutada lühemat perioodi (st kuni testaine kontsentratsioon on alla 10 % püsi- oleku kontsentratsioonist). Ainete korral, mille seondumine ja puhastumine on palju keerulisema skeemi- ga, kui esimest järku kineetikaga ühekambriline kaladega mudel, on aine kadumise kiiruskonstantide mää- ramiseks vajalik pikem puhastumisfaas. Nimetatud perioodi pikkus võib olla piiratud ajavahemikuga, mille kestel uuritava aine kontsentratsioon kalas jääb veel ülespoole analüütilisest määramispiirist. 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 303 1. 8. 2. 3. Ka l a d e a r v Kalade arv uuritava kontsentratsiooni kohta valitakse nii, et minimaalselt neli kala on proovi kohta iga proovivõtu korra jaoks. Suurema statistilise usaldusväärsuse tagamiseks on vaja proovi kohta suuremat kalade arvu. Täiskasvanud kalade kasutamisel tuleb üles märkida katses kasutatud kalade sugu. Kui katses kasutatakse mõlemast soost kalu, siis peab enne ekspositsiooni algust dokumentaalselt näitama, et sugudevahelised ras- vasisaldused ei erine märkimisväärselt; kusjuures vajalik võib olla kõikide isaste ja emaste kalade puulimi- ne. Iga üksiku katse jaoks peab valima sarnase kaaluga kalu, nii et kõige väiksemad kalad moodustaksid vähe- malt kaks kolmandikku kõige suuremate kalade kaalust. Kõik kalad peaksid olema ühevanused ja päri- nema ühest allikast. Kuna kalade kaal ja vanus mõjutavad mõnikord märkimisväärselt BCF väärtust (1), siis peab sellised üksikasjad täpselt kirja panema. Soovitatavalt võetakse enne katse algust kalavarudest väiksem valim, et hinnata kalade keskmist kaalu. 1. 8. 2. 4. Si s s e l a s k m i n e Katse alguses kalade lisamisest põhjustatud Cw vähenemise minimiseerimiseks ja lahustunud hapniku kont- sentratsiooni alanemise vältimiseks kasutatakse suurt vee ja kalade suhet. Sisselaskmiskiirus peab sobima katses kasutatavatele liikidele. Kõikidel juhtudel soovitatakse normaalselt sisselaskmiskiirust 0,1 kuni 1,0 g kala (märgkaal) liitri vee kohta päevas. Kui uuritava aine nõutavat kontsentratsiooni saab hoida ±20 % pii- rides ja lahustunud hapniku kontsentratsioon ei lange alla 60 % küllastumiskontsentratsioonist, siis võib kasutada ka suuremaid kiiruseid. Sobivate sisselaskmisrežiimide valikul arvestatakse liigi normaalset looduslikku elukohta. Näiteks veekogu põhjas elavad kalad vajavad suuremat akvaariumi põhja pindala sama vee mahu korral võrreldes avamere liikidega. 1. 8. 2. 5. Toi t m i ne Aklimatsiooni ja katseperioodi vältel toidetakse kalu sobiva toiduga, mille rasva- ja valgusisaldus on teada ning mille kogus on piisav, et hoida neid tervetena ja säilitada kehakaalu. Kalu söödetakse iga päev kogu aklimatsiooniperioodi ja katse vältel sellises koguses, mis on umbkaudu 1—2 % kehakaalust; see hoiab katse ajal enamuse kalaliikide rasvasisalduse suhteliselt püsival tasemel. Toidu kogust peab ümber arvu- tama näiteks korra nädalas, et säilitada ühtlast kehakaalu ja rasvasisaldust. Selle arvutuse jaoks võib kalade kaalu igas katsekambris hinnata viimati võetud kalaproovi kaalu põhjal. Kambrisse jäävaid kalu ei tohi kaa- luda. Söömata toit ja väljaheited imetakse sifooniga katsekambrist välja iga päev koheselt peale toitmist (30 minutit kuni tund). Katse ajal hoitakse kambreid nii puhtana kui võimalik, et orgaanilise aine kont- sentratsioon oleks võimalikult madal, kuna orgaanilise süsiniku sisaldus võib piirata uuritava aine biosaa- davust (1). Kuna paljud toidusegud valmistatakse kalalihast, siis peab neis eelnevalt analüüsima uuritava aine sisal- dust. Lisaks on soovitatav analüüsida toidus pestitsiide ja raskemetalle. 1. 8. 2. 6. Va l gus j a temperatuur Valgustusperiood on tavaliselt 12 kuni 16 tundi ja temperatuur (±2 °C) peaks olema sobilik katses kasu- tatavatele liikidele (vt lisa 2). Valgustuse tüüp ja omadused peavad olema teada. Ettevaatlik peab olema uuri- tava aine võimaliku fototransformatsiooni suhtes katses kasutatavatel valgustustingimustel. Vältimaks kalade kokkupuudet mittelooduspärase valguskiirgusega, peab kasutama sobivat valgustusallikat. Osadel juhtudel võib kasutada filtrit, mis neelab ultraviolettkiirgust lainepikkusega alla 290 nm. 1. 8. 2. 7. Uu r i t a v a d k o n t s e n t r a t s i o o n i d Kalu eksponeeritakse läbivoolu tingimustel vähemalt kahele uuritava aine kontsentratsioonile vees. Tava- liselt valitakse uuritava aine kõrge (või kõrgeim) kontsentratsioon, mis oleks umbes 1 % selle akuutsest asümptootilisest LC50 väärtusest ja see peaks olema vähemalt 10 korda kõrgem kui selle aine määramispiir vees kasutatava analüütilise meetodiga. 304 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd Kõrgeima katses kasutatava kontsentratsiooni määramiseks võib akuutse 96 tunni LC50 väärtuse jagada sobiva akuutse ja kroonilise väärtuse suhtega (sobivad suhted võivad mõnede kemikaalide jaoks olla 3 kuni 100). Võimalusel tuleb kontsentratsioonid valida nii, et nad erineksid ülaltoodust 10 korda. Kui see ei ole võimalik 1 % LC50 kriteeriumi ja analüütilise määramispiiri tõttu, siis peab kasutama väiksemat kordajat kui 10 või kaaluma 14C-märgistatud uuritava aine kasutamist. Kasutatav kontsentratsioon ei tohi olla suu- rem kui uuritava aine lahustuvus. Solubiliseerija kasutamisel ei tohi selle kontsentratsioon olla suurem kui 0,1 ml/l ja see peab olema ühe- sugune kõigis katseanumates. Solubiliseerija ja testaine osakaalu üldise orgaanilise süsiniku sisaldusest kat- ses kasutatavas vees peab teadma. Siiski tuleb võimalusel vältida selliste ainete kasutamist. 1. 8. 2. 8. K o n t r o l l k a t s e d Lisaks katseseeriatele tuleb teostada üks lahjendusvee kontrollkatse või üks kontrollkatse solubiliseerijaga eeldusel, et kasutatav ühend ei mõjuta kalu. Kui ühendi mõju pole kindel, siis peab tegema mõlemad kont- rollkatsed. 1. 8. 3. Veekvaliteedi mõõtmise sagedus Katse ajal peaks kõikides kambrites mõõtma lahustunud hapniku, TOC, pH ja temperatuuri väärtusi. Vaja- dusel peaks mõõtma lisaks üldkaredust ja soolsust kontrollkatsetes ja ühes kõrge (või kõrgeima) kontsent- ratsiooniga kambris. Minimaalselt peaks lahustunud hapnikku ja soolsust mõõtma kolm korda — seon- dumisperioodi alguses, keskel ja lõpus ning puhastumisperioodi ajal korra nädalas. TOC peaks mõõtma katse alguses (24 tundi ja 48 tundi enne seondumisfaasi algust), enne kalade lisamist ja korra nädalas nii seondumis- kui ka puhastumisfaaside ajal. Temperatuuri peaks mõõtma iga päev, pH-d iga perioodi algu- ses ja lõpus ning karedust üks kord iga katse ajal. Eelistatult peaks temperatuuri jälgima pidevalt vähemalt ühes katseanumas. 1. 8. 4. Kalade ja vee proovide võtmine ning analüüs 1. 8. 4. 1. Kal a de j a v ee pr oov ivõ t mis e ajakav a Katsekambritest võetakse veeproove uuritava aine kontsentratsiooni määramiseks enne kalade sisselask- mist ning seondumis- ja puhastumisfaaside ajal. Minimaalselt võetakse veeproove samal ajal kalaproovi- dega ning enne toitmist. Seondumisfaasi ajal määratakse uuritava aine kontsentratsiooni selleks, et kont- rollida vastavust valideerimisnõuetele. Kalaproove võetakse vähemalt viiel korral seondumisfaasi ajal ja vähemalt neljal korral puhastumisfaasi ajal. Kuna osadel juhtudel on keeruline arvutada rahuldava täpsusega BCF väärtuse hinnangut sellise arvu proo- vide põhjal, eriti kui tegemist ei ole esimest järku puhastumiskineetikaga, siis on soovitatav sagedasem proovivõtmine mõlema perioodi ajal (vt lisa 4). Lisaproove säilitatakse ja analüüsitakse vaid siis, kui esi- mese ringi analüüsitulemused ei ole piisavad BCF arvutamiseks soovitud täpsusega. Vastuvõetava proovivõtu ajakava näide on toodud lisas 4. Muid ajakavasid saab hõlpsasti arvutada kasu- tades Pow oletatavaid väärtusi, et arvutada 95 % seondumiseks vajaminevat ekspositsiooniaega. Proovivõtmist jätkatakse seondumisfaasi ajal kuni püsioleku saavutamiseni või 28 päeva möödumiseni, vastavalt kumb on lühem ajavahemik. Kui püsiolekut ei saavutata 28 päeva jooksul, siis peab seondumis- faasi pikendama kuni püsioleku saavutamiseni või 60 päeva möödumiseni, sõltuvalt kumb neist esime- sena saavutatakse. Enne puhastumisfaasi viiakse kalad puhastesse mahutitesse. 1. 8. 4. 2. Pro o v i v õ t t j a pr o o v i e t t e v a l m i s t u s Analüüsimiseks imetakse veeproov sifooniga läbi inertse torustiku katsekambri keskosast. Kuna filtrimine või tsentrifuugimine ei lahuta alati uuritava aine mitte-biosaadavat fraktsiooni biosaadavast osast (eriti superlipofiilsed kemikaalid, näiteks mille log Pow > 5) (1) (5), siis alati ei tohi neid meetodeid kasutada. 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 305 Selle asemel peab kasutama meetmeid mahutite hoidmiseks võimalikult puhtana ja orgaanilise süsiniku sisaldust peaks jälgima nii seondumis- kui ka puhastumisfaaside ajal. Iga proovivõtuga eemaldatakse katsekambritest sobiv arv kalu (tavaliselt minimaalselt neli). Proovivõtu käi- gus püütud kalu loputatakse kiiresti veega, kuivatatakse, tapetakse koheselt kõige sobivamal ja humaanse- mal viisil ning seejärel kaalutakse. Eelistatult analüüsitakse kalu ja vett koheselt peale proovivõtmist, et vältida lagunemist või muid kadusid, ja katse jätkudes arvutatakse umbkaudsed seondumis- ja puhastumiskiirused. Kohene analüüs hoiab ära ka viivituse platoo saavutamise kindlaksmääramisel. Kui kohene analüüs ei ole võimalik, siis säilitatakse proove sobival meetodil. Enne uuringu algust tehakse kindlaks sobiv meetod uuritava aine säilitamiseks, näiteks sügavkülmutamine, 4 °C juures hoidmine, säi- litamise kestus, ekstraktsioon jms. 1. 8. 4. 3. Ana l üüs i me e t odi kv a l i t e e t Kuna kogu protseduuri täpsuse määrab peamiselt ära uuritava aine määramiseks kasutatava analüüsimee- todi mõõtetäpsus, kordustäpsus ja tundlikkus, siis peab eksperimentaalselt kontrollima, kas keemilise ana- lüüsi täpsus ja korratavus ning uuritava aine eraldamine veest ja kaladest rahuldab selle meetodi tingimusi. Lisaks peab kontrollima, et lahjendusvees ei oleks uuritavat ainet määramispiiri ületavas koguses. Vajadusel parandatakse katsest saadud Cw ja Cf väärtusi kontrollkatsetest saadud saagise ja foonilise kont- sentratsiooni väärtustega. Kala ja vee proove käsitletakse nii, et saastumine ja kaod (näiteks adsorptsioon proovivõtuseadmesse) oleks võimalikult väikesed. 1. 8. 4. 4. Kal ap r oov ide anal üüs Kui katses kasutatakse radiomärgistatud aineid, siis on võimalik analüüsida kogu radioaktiivsust (st läh- teainete ja metaboliitide) või puhastada proovi nii, et lähteainet saaks eraldi analüüsida. Peamisi metabo- liite võib määrata püsiolekus või seondumisfaasi lõpus, sõltuvalt kumb neist saabub varem. Kui BCF on üldiste radiomärgistatud jääkide osas ≥ 1 000 %, siis võib olla mõistlik (osade kemikaalide kategooriate nagu pestitsiidid jaoks tungivalt soovitatav) nende laguproduktide identifitseerimine ja kvantitatiivne ana- lüüs, mis moodustavad püsiolekus ≥ 10 % kogu jääkidest kala kudedes. Laguproduktide, mis moodustavad ≥ 10 % kõikidest radiomärgistatud jääkidest kala kudedes, identifitseerimisel ja kvantitatiivsel analüüsil on soovitatav identifitseerida ja määrata nende kogus ka katsevees. Igas kaalutud kalas peab määrama uuritava aine kontsentratsiooni. Kui see ei ole võimalik, siis võib iga proovivõtmise proovid liita (puulida), kuid selline liitmine piirab andmetega tehtavaid statistilisi arvutusi. Kui teatud statistilisi arvutusi ja suurt andmehulka peetakse tähtsaks, siis peab katses kasutama piisaval arvul kalu, et rahuldada soovitud liitmisprotseduuri ja andmehulga nõudeid (6) (7). BCF esitatakse kogu märgkaalu funktsioonina ja kõrge lipofiilsusega ainete jaoks rasvasisalduse funktsioo- nina. Kalade rasvasisaldus määratakse võimalusel iga proovivõtu käigus. Rasvasisalduse määramiseks kasu- tatakse sobivaid meetodeid (lisa 3 viited 8 ja 2). Standardmeetodina võib soovitada kloroformi/metanooli ekstraktsioonitehnikat (9). Kuna erinevad meetodid ei anna samaseid tulemusi (10), siis on tähtis viidata kasutatavale meetodile. Võimalusel peaks rasvasisaldust analüüsima samas ekstraktis, mida kasutatakse uuritava aine analüüsiks, kuna lipiidid eemaldatakse sageli ekstraktist enne kromatograafilist analüüsi. Kala rasvasisaldus (mg/kg, märgkaal) ei tohiks katse lõpus erineda katse alguse väärtusest mitte rohkem kui ±25 %. Kudede tahke jäägi sisalduse peab samuti ära märkima, et rasva kontsentratsiooni märgkaalus oleks võimalik ümber arvutada kala kuivkaalu kohta. 306 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd 2. ANDMED 2. 1. Tulemuste töötlemine Uuritava aine seondumiskõver saadakse seondumisfaasi kontsentratsiooni kalas või kala pinnal (või kind- laksmääratud kudedes) ja aja funktsioonina aritmeetilises skaalas. Kui kõver saavutab platoo ehk muutub ligikaudu asümptootiliseks ajateljega, siis arvutatakse püsioleku BCFSS järgmisest valemist: püsioleku Cf (keskmine) püsioleku Cw (keskmine) Kui püsiolekut ei saavutata, siis on võimalik ohtlikkuse hindamiseks arvutada BCFSS piisava täpsusega “pü- siolekust”, mis on 80 % tasakaaluolekust (1,6/k2) või 95 % tasakaaluolekust (3,0/k2). Lisaks saab määrata biokontsentratsiooni teguri (BCFk) kahe esimest järku kineetiliste konstantide k1/k2 suhtena. Puhastumise kiiruskonstant (k2) määratakse tavaliselt puhastumiskõveralt (st testaine kontsent- ratsiooni vähenemine kalades aja jooksul). Seondumise kiiruskonstant (k1) arvutatakse k2 ja Cf väärtuse jär- gi, mis leitakse seondumiskõveralt (vt lisa 5). Eelistatud meetod BCFk ja kiiruskonstantide k1 ja k2 määra- miseks on mittelineaarne parameetrite hindamine arvutusprogrammiga (11). k1 ja k2 arvutamiseks võib kasutada ka graafilisi meetodeid. Kui puhastumiskõver ei ole ilmselgelt esimest järku, siis peab kasutama keerulisemaid mudeleid (vt lisa 3 viiteid) ja biostatistika spetsialistide abi. 2. 2. Tulemuste tõlgendamine Tulemuste tõlgendamisel peab olema ettevaatlik, kui uuritava lahuse mõõdetud kontsentratsioonitasemed on analüüsimeetodi määramispiiri ligidal. Selgelt määratletud seondumis- ja puhastumiskõverad viitavad hea kvaliteediga biokontsentratsiooni and- metele. Seondumis- ja puhastumiskonstantide varieerumine kahe uuritava kontsentratsiooni vahel ei tohiks ületada 20 %. Täheldatud märkimisväärsed erinevused kahe kontsentratsiooni seondumis- ja puhastumis- kiiruste vahel peab üles märkima ja andma võimalikud seletused. Üldiselt läheneb BCF usalduspiir hästi kavandatud uuringutes ±20 %. 3. ARUANDLUS Katsetulemused peavad sisaldama järgmist informatsiooni: 3. 1. Uuritav aine — füüsikaline olek ja vajadusel füüsikalis-keemilised omadused, — keemilised identifitseerimisandmed (sealhulgas vajadusel orgaanilise süsiniku sisaldus), — radiomärgistatud ühendite puhul märgistatud aatomite täpne asukoht ja lisanditega seotud radioak- tiivsuse protsent. 3. 2. Katses kasutatavad liigid — teaduslik nimetus, liin, allikas, olemasolul eeltöötlused, aklimatiseerumine, suuruste vahemik jms. 3. 3. Katse tingimused — kasutatav katsemenetlus (läbivoolava või poolseisva veega), — kasutatava valgustuse tüüp ja omadused ning valgustuse kestus(ed), — katse ülesehitus (näiteks katsekambrite arv ja suurus, vee vahetumise kiirus, paralleelkatsete arv, kalade arv paralleelkatsetes, uuritud kontsentratsioonide arv, seondumis- ja puhastumisfaaside pikkus, vee ja kala proovide võtmise sagedus), 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 307 — põhilahuste valmistamismeetod ja uuendamise sagedus (solubiliseerija kasutamisel peab tooma selle kontsentratsiooni ja mõju orgaanilise süsiniku sisaldusele katsevees), — nominaalsed uuritud kontsentratsioonid, mõõdetud väärtuste keskmised ja nende standardhälbed kat- senõudes ning nende saamismeetod, — lahjendusvee allikas, eeltöötluse kirjeldus, tõendid selle kohta, et kalad suudavad selles vees elada, ja vee omadused: pH, karedus, temperatuur, lahustunud hapniku kontsentratsioon, kloori jääksisaldus (kui mõõdeti), üldine orgaaniline süsinik, hõljuvained, katsekeskkonna soolsus (kui on asjakohane) ja muud sooritatud mõõtmised, — vee kvaliteet katseanumates, pH, karedus, TOC, temperatuur ja lahustunud hapniku kontsentratsioon, — üksikasjalik informatsioon kalade toitmise kohta (toidu tüüp, allikas, koostis (kui võimalik, siis vähe- malt rasva- ja valgusisaldus), toidu kogus ja toitmise sagedus), — andmed kala ja vee proovide töötlemise kohta, sealhulgas valmistamise üksikasjad, säilitamine, eks- traktsioon ning testaine ja rasvasisalduse (kui mõõdeti) analüütilised protseduurid (ja täpsus). 3. 4. Tulemused — eeluuringute tulemused (kui teostati), — kontrollkatse ja iga katsekambri kalade suremus ning mis tahes täheldatud ebanormaalne käitumine, — kalade rasvasisaldus (kui määratakse katses), — kõverad (sealhulgas mõõdetud andmed), mis näitavad uuritava aine seondumist ja puhastumist kala- des, aeg püsioleku saavutamiseks, — Cf ja Cw väärtused (kui asjakohane, siis ka standardhälve ja määramispiirkond) kõikide proovivõtmis- aegade jaoks (Cf ühik on μg/g märgkaal (ppm) terve keha või teatud kudede jaoks, nagu rasvad, ja Cw ühik on μg/ml (ppm)), lisaks peab esitama kontrollkatsete Cw väärtused (samuti peab esitama fooni määramise katse andmed), — püsioleku biokontsentratsiooni tegur (BCFSS) ja/või kineetiline biokontsentratsiooni tegur (BCFk) ja sobivuse korral seondumise ja puhastumise (kao) kiiruskonstantide 95 % usalduspiirid (kõiki väljenda- takse terve kala suhtes ja kui mõõdeti, siis looma või teatud kudede kogu rasvasisaldus), võimalusel usalduspiirid ja standardhälve ning uuritava aine iga kontsentratsiooni jaoks kasutatud arvutusmeetod ja andmetöötlus, — radiomärgistatud ühendite kasutamisel võib vajadusel esitada andmed mis tahes määratud metabolii- tide akumuleerumise kohta, — kõik ebatavaline katse kohta, mis tahes kõrvalekaldumine protseduuridest ja muu asjakohane infor- matsioon. Tulemusi stiilis “ei määratud määramispiiri läheduses” peab vältima eelkatse meetodi arendamise ja ekspe- rimentaalse ülesehitusega, kuna selliseid tulemusi ei saa kasutada kiiruskonstandi arvutamisel. 4. VIITED (1) Connell D. W. (1988). Bioaccumulation behaviour of persistent chemicals with aquatic organisms. Rev. Environ. Contam. Toxicol. 102, pp. 117–156. (2) Bintein S. , Devillers J. and Karcher W. (1993). Non-linear dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water partition coefficient. SAR and QSAR in Environmental Research, 1, pp. 29–390. (3) OECD, Paris (1996). Direct phototransformation of chemicals in water. Environmental Health and Safety Guidance Document Series on Testing and Assessment of Chemicals. No 3. (4) Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of bioconcentration factors derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate organic matter to the bioavailability of che- micals. Water Quality Institute, Denmark. 308 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd (5) US EPA 822-R-94-002 (1994) Great Lake Water Quality Initiative Technical Support Document for the Procedure to Determine Bioaccumulation Factors. July 1994. (6) US FDA (Food and Drug Administration) Revision. Pesticide analytical manual, 1, 5600 Fisher’s Lane, Rockville, MD 20852, July 1975. (7) US EPA (1974). Section 5, A(1). Analysis of Human or animal Adipose Tissue, in Analysis of Pesti- cide Residues in Human and Evironmental Samples, Thompson J. F. (ed. ) Research Triangle Park, N. C. 27711. (8) Compaan H. (1980) in “The determination of the possible effects of chemicals and wastes on the aqua- tic environment: degradation, toxicity, bioaccumulation”, Ch. 2. 3, Part II. Government Publishing Office, the Hague, Netherlands. (9) Gardner et al, (1995). Limn. & Oceanogr. 30, pp. 1099–1105. (10) Randall R. C. , Lee H. , Ozretich R. J. , Lake J. L. and Pruell R. J. (1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Envir. Toxicol. Chem. 10, pp 1431–1436. (11) CEC, Bioconcentration of chemical substances in fish: the flow-through method- Ring Test Prog- ramme, 1984 to 1985. Final report March 1987. Authors: P. Kristensen and N. Nyholm. (12) ASTM E-1022-84 (Reapproved 1988). Standard Practice for conducting Bioconcentration Tests with Fishes and Saltwater Bivalve Molluscs. 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 309 Lisa 1 Kasutuskõlbliku lahjendusvee keemilised omadused Aine Piirkontsentratsioon 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Osakesed Üldine orgaaniline süsinik Ioniseerumata ammoniaak Kloori jäägid Fosfororgaanilised pestitsiidid, üldsisaldus Kloororgaanilised pestitsiidid ja polükloreeritud bifenüülid, üldsisaldus Orgaanilise kloori üldsisaldus Alumiinium Arseen Kroom Koobalt Vask Raud Plii Nikkel Tsink Kaadmium Elavhõbe Hõbe 5 mg/l 2 mg/l 1 μg/l 10 μg/l 50 ng/l 50 ng/l 25 ng/l 1 μg/l 1 μg/l 1 μg/l 1 μg/l 1 μg/l 1 μg/l 1 μg/l 1 μg/l 1 μg/l 100 ng/l 100 ng/l 100 ng/l 310 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd Lisa 2 Katsetamiseks soovitatavad kalaliigid Soovitatav liik Soovitatav katse- temperatuuride vahemik (°C) Soovitatav katse- isendi täispikkus (cm) 1 2 3 4 5 6 7 8 Danio rerio (1) (Teleostei, Cyprinidae) (Hamilton-Buchanan) Sebra- kala 20–25 3,0 ± 0,5 Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae) (Rafinesque) Pakspea lepamaim 20–25 5,0 ± 2,0 Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae) (Linnaeus) Karpkala Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae) (Temminck and Schlegel) Rii- sikala Poccilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae) (Peters) Gupi Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchidae) (Rafinesque) Suur päikeseahven 20–25 20–25 20–25 20–25 5,0 ± 3,0 4,0 ± 1,0 3,0 ± 1,0 5,0 ± 2,0 Oncorhynchus mykiss (Teleostei, Salmonidae) (Walbaum) Vikerfo- rell 13–17 8,0 ± 4,0 Gasterosteus aculeatus (Teleostei, Gasterosteidae) (Linnaeus) Harilik ogalik 18–20 3,0 ± 1,0 (1) Meyer A. , Orti G. (1993) Proc. Royal Society of London, Series B. , Vol. 252, p. 231. Erinevates riikides on kasutatud mitmesuguseid suudmeala ja merelisi liike, näiteks: Kotkaskalalane Sheepshead minnow Hõbekülg Leiostomus xanthurus Cyprinodon variegatus Menidia beryllina Punnkõht (kirevahvenlane) Cymatogaster aggregata Inglise merikeel Sarvikvõldas Harilik ogalik Meriahven Harilik viidikas Parophrys vertulus Leptocottus armatus Gasterosteus aculeatus Dicentracus labrax Alburnus alburnus Kogumine Tabelis toodud mageveekalasid on lihtne kasvatada ja/või nad on laialt kättesaadavad aastaringselt, kuna aga mere- liste ja suudmealade liikide kättesaadavus on piiratud vastavate riikidega. Neid saab kasvatada ja kultiveerida kalafar- mides või laboratooriumis, haiguste ja parasiitide suhtes kontrollitud tingimustel nii, et katseloomad on terved ja tea- daolevat päritolu. Need kalad on kättesaadavad paljudes maailma piirkondades. 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 311 Lisa 3 Seondumis- ja puhastumisfaaside kestuse hindamine 1. Seondumisfaasi kestuse hindamine Enne katse tegemist saab k2 ja seeläbi aega, mis on vajalik püsioleku saavutamiseks, hinnata empiirilisest seosest k2 ja jaotuskoefitsiendi n-oktanool/vesi (Pow) või k2 ja vees lahustuvuse (s) vahel. k2 (päev-1) võib hinnata näiteks järgmisest empiirilisest seosest (1): log10k2 = –0,414 log10(Pow) + 1,47 (r2 = 0,95) (võrrand 1) Muude seoste kohta vaata viidet 2. Kui jaotuskoefitsient (Pow) ei ole teada, siis võib hinnang põhineda (3) kasutatava aine vesilahustuvusel (s): log10(Pow) = 0,862 log10(s) + 0,710 (r2 = 0,994) (võrrand 2) kus s = lahustuvus (mol/l): (n = 36). Need seosed kehtivad vaid kemikaalidele, mille log Pow väärtused on vahemikus 2–6,5 (4). Aega, mis kulub püsioleku mingi protsendi saavutamiseks, võib leida seondumist ja puhastumist kirjeldavast üldi- sest kineetilisest võrrandist (esimest järku kineetika) saadud k2-hinnangu rakendamisel: või kui Cw on konstant: Püsioleku saavutamisel (t ∞) võib võrrandit 3 taandada (5) (6): Siis läheneb k1/k2∙Cw kontsentratsioonini “püsiolekus” (Cf,s). Võrrandit 3 võib esitada järgmiselt: Cf = Cf,s(1 – e t –k 2 ) või = 1 – e t –k 2 Cf Cfs (võrrand 4) Võrrandi 4 rakendamisel võib püsioleku mingi protsendi saavutamise aega hinnata siis, kui k2 väärtust on eel- nevalt hinnatud võrrandi 1 või 2 põhjal. Seondumisfaasi statistiliselt optimaalne kestus statistiliselt vastuvõetavate andmete (BCFk) saamiseks on selline ajavahemik, mis on vajalik, et uuritava aine kontsentratsiooni logaritmi ja lineaarse aja funktsiooni kujutav kõver saavutab keskpunkti või 1,6/k2 või 80 % püsiolekust, kuid mitte rohkem kui 3,0/k2 või 95 % püsiolekust (7). Aeg, mis kulub püsioleku 80 % saavutamiseks (võrrand 4): 0,80 = 1 – e t –k 80 2 või t80 = 1,6 k2 (võrrand 5) 312 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd Sarnaselt on 95 % püsiolekust: t95 = 3,0 k2 (võrrand 6) Näiteks seondumisfaasi (up) kestus testaine jaoks, mille log Pow = 4, oleks (kasutades võrrandeid 1, 5 ja 6): log10k2 = –0,414 ∙ (4) + 1,47 k2 = 0,652 päeva–1 up (80 %) = 1,6/0,652, s. o 2,45 päeva (59 tundi) või up (95 %) = 3,0/0,652, s. o 4,60 päeva (110 tundi). Seondumisfaasi (up) kestus testaine jaoks, mille s = 10—5 mol/l (log(s) = 5,0), oleks (kasutades võrrandeid 1, 2, 5 ja 6): log10 (Pow) = –0,862 (—5,0) + 0,710 = 5,02 log10k2 k2 = –0,414 (5,02) + 1,47 = 0,246 päeva–1 up (80 %) = 1,6/0,246, s. o 6,5 päeva (156 tundi) või up (95 %) = 3,0/0,246, s. o 12,2 päeva (293 tundi). Alternatiivselt võib võrrandit: teq = 6,54 × 10–3 Pow + 55,31 (tundi) kasutada efektiivse püsioleku saavutamiseks vajamineva aja arvutamiseks (4). 2. Puhastumisfaasi kestuse hindamine Aega, mis kulub testaine vähenemiseks kalas mõne protsendi võrra esialgsest kontsentratsioonist, saab hinnata üldvõrrandiga, mis kirjeldab seondumist ja puhastumist (esimest järku kineetika) (1) (8). Puhastumisfaasi jaoks eeldatakse, et Cw on null. Võrrandit võib taandada: kus Cf,o on kontsentratsioon puhastumisperioodi alguses. Siis 50 % puhastumine saavutatakse ajaga (t50): Sarnaselt saavutatakse 95 % puhastumine ajaga: Kui esimese perioodi jaoks kasutatakse 80 % seondumist (1,6/k2) ja 95 % kadu puhastumisfaasis (3,0/k2), siis puhastumisfaas on umbkaudu kaks korda pikem kui seondumisfaas. Tähtis on märkida, et hinnangud põhinevad eeldusel, et seondumise ja puhastumise skeemid järgivad esimest järku kineetikat. Kui see aga ei vasta ilmselgelt esimest järku kineetikale, siis peab kasutama keerulisemaid mude- leid (näiteks viide 1). 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 313 Viited (lisa 3) (1) Spacie A. and Hamelink J. L. (1982). Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. and Chem. 1, pp. 309–320. (2) Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of BCFs derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate matter to the bioavailability of chemicals. Danish Water Quality Institute. (3) Chiou C. T. and Schmedding D. W. (1982). Partitioning of organic compounds in octanol-water systems. Envi- ron. Sci. Technol. 16 (1), pp. 4–10. (4) Hawker D. W. and Connell D. W. (1988). Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on biocon- centration kinetics with fish. Wat. Res. 22 (6), pp. 701–707. (5) Branson D. R. , Blau G. E. , Alexander H. C. and Neely W. B. (1975). Transactions of the American Fisheries Socie- ty, 104 (4), pp. 785–792. (6) Ernst W. (1985). Accumulation in Aquatic organisms. In: Appraisal of tests to predict the environmental beha- viour of chemicals. Ed. by Sheehman P. , Korte F. , Klein W. and Bourdeau P. H. Part 4. 4, pp. 243—255. SCOPE, 1985, John Wiley & Sons Ltd N. Y. (7) Reilly P. M. , Bajramovic R. , Blau G. E. , Branson D. R. and Sauerhoff M. W. (1977). Guidelines for the optimal design of experiments to estimate parameters in first order kenetic models, Can. J. Chem. Eng. 55, pp. 614–622. (8) Könemann H. and Van Leeuwen K. (1980). Toxicokinetics in fish: Accumulation and Elimination of six Chloro- benzenes by Guppies. Chemosphere, 9, pp. 3–19. 314 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd Ainete, mille log Pow = 4, biokontsentratsioonikatsete proovivõtu ajakava teoreetiline näide Lisa 4 Kala proovivõtmine Seondumisfaas 1. 2. 3. 4. 5. Puhastumisfaas 6. 7. 8. 9. Proovivõtu ajakava Minimaalne nõutav sagedus (päeva) Lisa proovivõtmine Veeproovide arv Kalade arv proovi kohta – 1 0 0,3 0,6 1,2 2,4 4,7 5,0 5,9 9,3 14,0 0,4 0,9 1,7 3,3 5,3 7,0 11,2 17,5 2 (*) 2 2 (2) 2 (2) 2 (2) 2 (2) 2 Lisa 45 kuni 80 kala 4 (4) 4 (4) 4 (4) 4 (4) 6 Vii kalad uuritavast ainest vabasse vette 4 (4) 4 (4) 4 (4) 6 (4) (*) Vee proov võtta pärast seda, kui vesi on vahetunud vähemalt kolme kambri mahu võrra. Sulgudes esitatud väärtused on lisa proovivõtmise korral võetav proovide (vesi, kalad) arv. NB: Katse-eelne k2 väärtuse hindamise tulemus log Pow = 4,0 jaoks on 0,652 päeva–1. Eksperimendi kogupikkus on 3 × up = 3 × 4,6 päeva, s. o 14 päeva. Seondumisfaasi (up) hindamise kohta vaata lisa 3. 13/21. kd ET Euroopa Liidu Teataja 315 Lisa 5 Mudeli valimine biokontsentratsiooni Enamusi lihtsa kahekambrilise/kaheparameetrilise mudeliga, mida esitab sirgjoon, mis läheneb kalas puhastumisfaasi ajal määratud kontsentratsiooni punktideni, kui need kantakse poollogaritmilisele graafikule. (Kui neid punkte ei saa kanda sirg- joonele, peab kasutama keerulisemaid mudeleid, vt näiteks Spacie ja Hamelink, viide 1, lisa 3). eeldatavalt “piisavalt” kirjeldada andmeid hästi saab Puhastumise (kao) kiiruskonstandi k2 graafiline määramismeetod Igas kalaproovis määratud uuritava aine kontsentratsioon esitatakse aja funktsioonina poollogaritmilisel graafikul. Saadud joone tõus on k2. k2 = ln (Cf1/Cf2) t2 – t1 Peab mainima, et kõrvalekalded sirgjoonest võivad viidata keerulisemale puhastumise skeemile kui seda on esimest järku kineetika. Puhastumise kõrvalekaldumisel esimest järku kineetikast võib kasutada graafilist meetodit, et kind- laks teha selle kõrvalekaldumise tüüpe. Seondumise kiiruskonstandi k1 graafiline määramismeetod Antud k2 korral arvutatakse k1 järgmiselt : x Cf väärtus saadakse tasase seondumiskõvera keskpunktist, mis saadi kontsentratsiooni logaritmi ja aja funktsiooni graafilisel kujutamisel (aritmeetilisel skaalal). 316 ET Euroopa Liidu Teataja 13/21. kd Seondumise ja puhastumise (kao) kiiruskonstantide määramine arvutiprogrammiga Eelistatud meetodid biokontsentratsiooni teguri ja kiiruskonstantide k1 ja k2 määramiseks on mittelineaarne para- meetrite hindamismeetod arvutiprogrammiga. Need programmid leiavad k1 ja k2 jaoks väärtusi järjestikuse aja ja kontsentratsiooni andmete ja mudeli põhjal. Cf = Cw∙ k1 k2 x (l –e –k 2 t) Cf = Cw∙ k1 k2 kus tc = aeg seondumisfaasi lõpus. x (e –k 2(t –t c) – e –k 2 t) 0 < t < tc (võrrand 2) t < tc (võrrand 3) See meetod annab k1 ja k2 standardhälvete hinnangu. Kuna k2 saab enamusel juhtudel hinnata puhastumiskõveralt suhteliselt kõrge täpsusega ja kuna kahe parameetri k1 ja k2 vahel on tugev korrelatsioon, siis samaaegsel määramisel on soovitatav esmalt arvutada k2 puhastumisandme- test ja seejärel arvutada k1 seondumisandmetest, kasutades mittelineaarset regressiooni