title: Directive 98/64/CE de la Commission du 3 septembre 1998 portant fixation des méthodes d'analyse communautaires pour la détermination des acides aminés, des matières grasses brutes et de l'olaquindox dans les aliments des animaux et modifiant la directive 71/393/CEE (Texte présentant de l'intérêt pour l'EEE)

text: L 257/14 FR Journal officiel des Communaut(cid:130)s europ(cid:130)ennes 19. 9. 98 DIRECTIVE 98/64/CE DE LA COMMISSION du 3 septembre 1998 portant fixation des m(cid:130)thodes d’analyse communautaires pour la d(cid:130)termination des acides amin(cid:130)s, des mati(cid:138)res grasses brutes et de l’olaquindox dans les aliments des animaux et modifiant la directive 71/393/CEE (Texte pr(cid:130)sentant de l’int(cid:130)r(cid:136)t pour l’EEE) LA COMMISSION DES COMMUNAUT(cid:144)S EUROP(cid:144)ENNES, vu le trait(cid:130) instituant la Communaut(cid:130) europ(cid:130)enne, vu la directive 70/373/CEE du Conseil du 20 juillet 1970 concernant l’introduction de modes de pr(cid:130)l(cid:138)vement d’(cid:130)chantillons et de m(cid:130)thodes d’analyse communautaires pour le contr(cid:147)le officiel des aliments des animaux (1), modifi(cid:130)e en dernier lieu par l’acte d’adh(cid:130)sion de l’Au- triche, de la Finlande et de la Su(cid:138)de, et notamment son article 2, consid(cid:130)rant que la directive 70/373/CEE pr(cid:130)voit que les contr(cid:147)les officiels des aliments des animaux visant (cid:133) cons- tater le respect des conditions prescrites en vertu des dispositions l(cid:130)gislatives, r(cid:130)glementaires ou administratives concernant la qualit(cid:130) et la composition des aliments des animaux sont effectu(cid:130)s selon des modes de pr(cid:130)l(cid:138)vement d’(cid:130)chantillons et des m(cid:130)thodes d’anylse communautaires; consid(cid:130)rant que la directive 79/373/CEE du Conseil du 2 avril 1979 concernant la commercialisation des aliments compos(cid:130)s pour animaux (2), modifi(cid:130)e en dernier lieu par la directive 97/47/CE (3), et la directive 93/74/CEE du Conseil du 13 septembre 1993 concernant les aliments pour animaux visant des objectifs nutritionnels particu- liers (4), modifi(cid:130)e en dernier lieu par la directive 96/25/ CE (5) pr(cid:130)voient la d(cid:130)claration des acides amin(cid:130)s et des mati(cid:138)res grasses brutes dans l’(cid:130)tiquetage des aliments; consid(cid:130)rant par ailleurs que la directive 70/524/CEE du Conseil du 23 novembre 1970 concernant les additifs dans l’alimentation des animaux (6), modifi(cid:130)e en dernier lieu par la directive 98/19/CE (7) de la Commission prescrit que la teneur de l’olaquindox doit (cid:136)tre indiqu(cid:130)e lors de l’(cid:130)tiquetage, lorsque cette substance est ajout(cid:130)e aux aliments compos(cid:130)s des animaux; consid(cid:130)rant que la deuxi(cid:138)me directive 71/393/CEE de la Commission du 18 novembre 1971 portant fixation des m(cid:130)thodes d’analyse communautaires pour le contr(cid:147)le offi- ciel des aliments des animaux (8), modifi(cid:130)e en dernier lieu (1) JO L 170 du 3. 8. 1970, p. 2. (2) JO L 86 du 6. 4. 1979, p. 30. (3) JO L 211 du 5. 8. 1997, p. 45. (4) JO L 237 du 22. 9. 1993, p. 23. (5) JO L 125 du 23. 5. 1996, p. 35. (6) JO L 270 du 14. 12. 1970, p. 1. (7) JO L 96 du 28. 3. 1998, p. 39. (8) JO L 279 du 20. 12. 1971, p. 7. par la directive 84/4/CEE (9), (cid:130)tablit les m(cid:130)thodes d’ana- lyse pour, entre autres, d(cid:130)termination des mati(cid:138)res grasses; le cas (cid:130)ch(cid:130)ant en modifiant la m(cid:130)thode d(cid:130)crite; consid(cid:130)rant qu’il y a lieu d’(cid:130)tablir des m(cid:130)thodes d’analyse communautaires pour le contr(cid:147)le de ces substances; consid(cid:130)rant que les mesures pr(cid:130)vues dans la pr(cid:130)sente directive sont conformes (cid:133) l’avis du comit(cid:130) permanent des aliments des animaux, A ARR(cid:219)T(cid:144) LA PR(cid:144)SENTE DIRECTIVE: Article premier Les (cid:144)tats membres prescrivent que les analyses pr(cid:130)vues pour les contr(cid:147)les officiels des aliments des animaux, en ce qui concerne leur teneur en acides amin(cid:130)s, en mati(cid:138)res grasses brutes et en olaquindox, soient effectu(cid:130)es selon les m(cid:130)thodes correspondantes d(cid:130)crites en annexe. Article 2 Le point «4) D(cid:130)termination des mati(cid:138)res grasses brutes» de l’annexe de la directive de la Commission 71/393/CEE est remplac(cid:130) par la partie B de l’annexe de la pr(cid:130)sente directive. Article 3 1. Les (cid:144)tats membres mettent en vigueur au plus tard le 31 d(cid:130)cembre 1998 les dispositions l(cid:130)gislatives, r(cid:130)glemen- taires et administratives n(cid:130)cessaires pour se conformer (cid:133) la pr(cid:130)sente directive. Ils en informent imm(cid:130)diatement la Commission. Ils appliquent ces dispositions (cid:133) partir du 1er janvier 1999. Lorsque les (cid:144)tats membres adoptent ces dispositions, celles-ci contiennent une r(cid:130)f(cid:130)rence (cid:133) la pr(cid:130)sente directive ou sont accompagn(cid:130)es d’une telle r(cid:130)f(cid:130)rence lors de leur publication officielle. Les modalit(cid:130)s de cette r(cid:130)f(cid:130)rence sont arr(cid:136)t(cid:130)es par les (cid:144)tats membres. (9) JO L 15 du 18. 1. 1984, p. 28. 19. 9. 98 FR Journal officiel des Communaut(cid:130)s europ(cid:130)ennes L 257/15 Les (cid:144)tats membres communiquent (cid:133) la Commission 2. le texte des dispositions essentielles de droit interne qu’ils adoptent dans le domaine r(cid:130)gi par la pr(cid:130)sente directive. Article 5 Les (cid:144)tats sont destinataires de la pr(cid:130)sente d(cid:130)cision. Article 4 Fait (cid:133) Bruxelles, le 3 septembre 1998. La pr(cid:130)sente directive entre en vigueur le vingti(cid:138)me jour suivant celui de sa publication au Journal officiel des Communaut(cid:130)s europ(cid:130)ennes. Par la Commission Franz FISCHLER Membre de la Commission L 257/16 FR Journal officiel des Communaut(cid:130)s europ(cid:130)ennes 19. 9. 98 ANNEXE PARTIE A DOSAGES DES ACIDES AMIN(cid:144)S 1. Objet et domaine d’application La m(cid:130)thode permet de d(cid:130)terminer les acides amin(cid:130)s libres (de synth(cid:138)se et naturels) et totaux (li(cid:130)s dans des peptides et libres) dans les aliments des animaux avec un analyseur d’acides amin(cid:130)s. Elle s’applique aux acides amin(cid:130)s thr(cid:130)onine, alanine, arginine, acide aspartique, acide glutamique, glycine, histidine, isoleucine, leucine, ph(cid:130)nylalanine, proline, serine, tyrosine et valine. suivants: cyst((cid:130))ine, m(cid:130)thionine, lysine, La m(cid:130)thode ne fait pas de distinction entre les sels des acides amin(cid:130)s et ne permet pas de diff(cid:130)rencier les formes D et L des acides amin(cid:130)s. Elle ne convient pas pour le dosage du tryptophane et des analogues hydroxyl(cid:130)s des acides amin(cid:130)s. 2. Principe 2. 1. Acides amin(cid:130)s libres Les acides amin(cid:130)s libres ajout(cid:130)s sont extraits (cid:133) l’aide d’acide chlorhydrique dilu(cid:130). Les macromol(cid:130)cules azot(cid:130)es coextraites sont pr(cid:130)cipit(cid:130)es (cid:133) l’aide d’acide sulfosalicylique et (cid:130)limin(cid:130)es par filtration. La solution filtr(cid:130)e est ajust(cid:130)e (cid:133) pH 2,20. Les acides amin(cid:130)s sont s(cid:130)par(cid:130)s par chromatographie par (cid:130)change d’ions et dos(cid:130)s par r(cid:130)action avec la ninhydrine et d(cid:130)tection photom(cid:130)trique (cid:133) 570 nm. 2. 2. Acides amin(cid:130)s totaux Le mode op(cid:130)ratoire d(cid:130)pend des acides amin(cid:130)s (cid:133) examiner. La cyst((cid:130))ine et la m(cid:130)thionine doivent (cid:136)tre oxyd(cid:130)es pour devenir de l’acide cyst(cid:130)ique et de la m(cid:130)thionine sulfone avant hydrolyse. La tyrosine doit (cid:136)tre dos(cid:130)e dans l’hydrolysat d’(cid:130)chantillons non oxyd(cid:130)s. Tous les autres acides amin(cid:130)s indiqu(cid:130)s au paragraphe 1 peuvent (cid:136)tre dos(cid:130)s soit dans un (cid:130)chantillon oxyd(cid:130) soit dans un (cid:130)chantillon non oxyd(cid:130). L’oxydation s’effectue (cid:133) 0 (cid:190)C (cid:133) l’aide d’un m(cid:130)lange d’acide performique et de ph(cid:130)nol. L’exc(cid:130)dent de r(cid:130)actif d’oxydation est d(cid:130)compos(cid:130) (cid:133) l’aide de disulfite de sodium. L’(cid:130)chantillon oxyd(cid:130) ou non oxyd(cid:130) est hydrolys(cid:130) (cid:133) l’aide d’acide chlorhydrique (c = 6 mol/l) pendant 23 heures. L’hydrolysat est ajust(cid:130) (cid:133) pH 2,20. Les acides amin(cid:130)s sont s(cid:130)par(cid:130)s par chromatographie par (cid:130)change d’ions et dos(cid:130)s par r(cid:130)action (cid:133) la ninhydrine et d(cid:130)tection photom(cid:130)trique (cid:133) 570 nm (440 nm pour la proline). 3. R(cid:130)actifs Utiliser de l’eau bi-distill(cid:130)e ou de l’eau de qualit(cid:130) (cid:130)quivalente (conductivit(cid:130) : 10 lS). 3. 1. 3. 2. 3. 3. 3. 4. 3. 5. 3. 6. 3. 7. 3. 8. 3. 9. Peroxyde d’hydrog(cid:138)ne, 30 % (m/m). Acide formique, 98-100 % (m/m). Ph(cid:130)nol. Disulfite de sodium. Hydroxyde de sodium. Acide 5-sulfosalicylique dihydrat(cid:130). Acide chlorhydrique, densit(cid:130) d’environ 1,18 g/ml. Citrate de tri-sodium dihydrat(cid:130). 2,2Y-Thiodi(cid:130)thanol (thiodiglycol). 3. 10. Chlorure de sodium. 3. 11. Ninhydrine. 3. 12. Ether de p(cid:130)trole, intervalle d’(cid:130)bullition de 40 (cid:133) 60 (cid:190)C. 3. 13. Norleucine ou autres compos(cid:130)s pouvant (cid:136)tre utilis(cid:130)s comme (cid:130)talons internes. 3. 14. Azote gazeux (: 10 ppm d’oxyg(cid:138)ne). 19. 9. 98 FR Journal officiel des Communaut(cid:130)s europ(cid:130)ennes L 257/17 3. 15. 1-Octanol. 3. 16. Acides amin(cid:130)s. 3. 16. 1. Substances (cid:130)talons vis(cid:130)es au paragraphe 1. Compos(cid:130)s purs ne contenant pas d’eau de cristallisation. S(cid:130)cher sous vide sur P2O5 ou H2SO4 pendant une semaine avant utilisation. 3. 16. 2. Acide cyst(cid:130)ique. 3. 16. 3. M(cid:130)thionine sulfone. 3. 17. Solution d’hydroxyde de sodium c = 7,5 mol/l: dissoudre 300 g de NaOH (3. 5) dans de l’eau et porter (cid:133) 1 litre. 3. 18. Solution d’hydroxyde de sodium, c = 1 mol/l: dissoudre 40 g de NaOH (3. 5) dans de l’eau et porter (cid:133) 1 litre. 3. 19. Solution d’acide formique-ph(cid:130)nol: m(cid:130)langer 889 g d’acide formique (3. 2) et 111 g d’eau en ajoutant 4,73 g de ph(cid:130)nol (3. 3). 3. 20. M(cid:130)lange (cid:133) hydrolyser, c = 6 mol HCl/l contenant 1 g de ph(cid:130)nol/l: ajouter 1 g de ph(cid:130)nol (3. 3) (cid:133) 492 ml de HCl (3. 7) et porter (cid:133) 1 l avec de l’eau. 3. 21. M(cid:130)lange d’extraction, c = 0,1 mol HCl/l contenant 2 % de thiodiglycol: prendre 8,2 ml de HCl (3. 7), m(cid:130)langer dans environ 900 ml d’eau, ajouter 20 ml de thiodiglycol (3. 9) et porter (cid:133) 1 l avec de l’eau (ne pas m(cid:130)langer directement 3. 7 et 3. 9). 3. 22. Acide 5-sulfosalicylique, ß = 6 %: dissoudre 60 g d’acide 5-sulfosalicylique (3. 6) dans de l’eau et porter (cid:133) 1 l avec de l’eau. 3. 23. M(cid:130)lange d’oxydation (acide performique-ph(cid:130)nol): m(cid:130)langer 0,5 ml de p(cid:130)roxyde d’hydrog(cid:138)ne (3. 1) avec 4,5 ml d’une solution de ph(cid:130)nol et d’acide formique (3. 19) dans un petit b(cid:130)cher. Incuber (cid:133) une temp(cid:130)rature de 20 (cid:133) 30 (cid:190)C pendant une heure pour obtenir de l’acide performique, laisser refroidir ensuite sur un bain d’eau glac(cid:130)e (15 min) avant de l’ajouter (cid:133) l’(cid:130)chantillon. Attention: (cid:130)viter le contact avec la peau et porter des v(cid:136)tements de protection. 3. 24. Tampon au citrate, c = 0,2 mol de Na+/l, pH = 2,20: dissoudre 19,61 g de citrate de sodium (3. 8), 5 ml thiodiglycol (3. 9), 1 g de ph(cid:130)nol (3. 3) et 16,50 ml de HCl (3. 7) dans environ 800 ml d’eau. Ajuster le pH (cid:133) 2,20. Porter (cid:133) 1 l avec de l’eau. 3. 25. Tampons d’(cid:130)lution pr(cid:130)par(cid:130)s conform(cid:130)ment aux prescriptions pr(cid:130)vues pour l’analyseur (4. 9). 3. 26. R(cid:130)actif (cid:133) la ninhydrine pr(cid:130)par(cid:130) conform(cid:130)ment aux prescriptions pr(cid:130)vues pour l’analyseur (4. 9). 3. 27. Solutions (cid:130)talons d’acides amin(cid:130)s. Conserver ces solutions (cid:133) une temp(cid:130)rature inf(cid:130)rieure (cid:133) 5 (cid:190)C. 3. 27. 1. Solution (cid:130)talon m(cid:138)re d’acides amin(cid:130)s (3. 16. 1). c = 2,5 lmol/l de chacun dans l’acide chlorydrique. S’obtient dans le commerce. 3. 27. 2. Solution (cid:130)talon m(cid:138)re d’acide cyst(cid:130)ique et de m(cid:130)thionine sulfone. c = 1,25 lmol/ml. Dissoudre 0,2115 g d’acide cyst(cid:130)ique (3. 16. 2) et 0,2265 g de m(cid:130)thionine sulfone (3. 16. 3) dans du tampon au citrate (3. 24) dans une fiole jaug(cid:130)e de 1 l et porter au trait avec du tampon au citrate (3. 24). Conserver (cid:133) une temp(cid:130)rature inf(cid:130)rieure (cid:133) 5 (cid:190)C pendant 12 mois au maximum. Cette solution n’est pas utilis(cid:130)e si la solution (cid:130)talon (3. 27. 1) contient de l’acide cyst(cid:130)ique et de m(cid:130)thionine sulfone. 3. 27. 3. Solution (cid:130)talon interne, par exemple norleucine. c = 20 lmol/l. Dissoudre 0,6560 g de norleucine (3. 13) dans du tampon au citrate (3. 24) et porter (cid:133) 250 ml (cid:133) l’aide du tampon au citrate (3. 24). Conserver (cid:133) une temp(cid:130)rature inf(cid:130)rieure (cid:133) 5 (cid:190)C pendant 6 mois au maximum. 3. 27. 4. Solution d’(cid:130)talonnage des acides amin(cid:130)s (cid:133) utiliser avec des hydrolysats, c = 5 nmol/50 ll d’acide cyst(cid:130)ique et de m(cid:130)thionine sulfone et c = 10 nmol/50 ll des autres acides amin(cid:130)s. L 257/18 FR Journal officiel des Communaut(cid:130)s europ(cid:130)ennes 19. 9. 98 Dissoudre 2,2 g de chlorure de sodium (3. 10) dans un b(cid:130)cher de 100 ml avec 30 ml de tampon au citrate (3. 24). Ajouter 4,00 ml de la solution (cid:130)talon d’acides amin(cid:130)s (3. 27. 1), 4,00 ml de solution (cid:130)talon d’acide cyst(cid:130)ique et de m(cid:130)thionine de sulfone (3. 27. 2) et 0,50 ml de solution d’(cid:130)talon interne (3. 27. 3) le cas (cid:130)ch(cid:130)ant. Ajuster le pH (cid:133) 2,20 avec de l’hydroxyde de sodium (3. 18). Transf(cid:130)rer dans une fiole jaug(cid:130)e de 50 ml et porter au trait avec du tampon au citrate (3. 24) et m(cid:130)langer. Conserver (cid:133) une temp(cid:130)rature inf(cid:130)rieure (cid:133) 5 (cid:190)C pendant 3 mois au maximum. Voir aussi les observations du point 9. 1. 3. 27. 5. Solution d’(cid:130)talonnage des acides amin(cid:130)s (cid:133) utiliser avec des hydrolysats pr(cid:130)par(cid:130)s conform(cid:130)ment au paragraphe 5. 3. 3. 1 et destin(cid:130)s (cid:133) (cid:136)tre utilis(cid:130)s avec des extraits (5. 2). Pr(cid:130)parer la solution d’(cid:130)talonnage conform(cid:130)ment au point 3. 27. 4 mais sans chlorure de sodium. Conserver (cid:133) une temp(cid:130)rature inf(cid:130)rieure (cid:133) 5 (cid:190)C pendant 3 mois au maximum. 4. Appareillage 4. 1. Ballon sph(cid:130)rique de 100 ou 250 ml pourvu d’un condenseur (cid:133) reflux. 4. 2. Flacon en verre de borosilicate de 100 ml avec bouchon (cid:133) vis avec garniture de caoutchouc/teflon (par exemple Duran, Schott) pouvant (cid:136)tre utilis(cid:130) dans une (cid:130)tuve 5 2 (cid:190)C. 4. 3. (cid:144)tuve (cid:133) ventilation forc(cid:130)e et r(cid:130)gulation de la temp(cid:130)rature d’une pr(cid:130)cision sup(cid:130)rieure (cid:133) 5 2 (cid:190)C. 4. 4. pH-m(cid:138)tre ((cid:133) graduation (cid:133) trois d(cid:130)cimales). 4. 5. Filtre membrane (0,2 lm diam(cid:138)tre des pores). 4. 6. Centrifugeuse. 4. 7. Evaporateur rotatif (cid:133) vide. 4. 8. Agitateur m(cid:130)canique ou magn(cid:130)tique. 4. 9. Analyseur d’acides amin(cid:130)s ou (cid:130)quipement pour CLHP avec colonne (cid:130)changeuse d’ions, dispositif pour ninhydrine, d(cid:130)rivatisation postcolonne et d(cid:130)tecteur photom(cid:130)trique. La colonne est remplie avec des r(cid:130)sines de polystyr(cid:138)ne sulfon(cid:130)es pour s(cid:130)parer les diff(cid:130)rents acides amin(cid:130)s les uns des autres et d’autres produits r(cid:130)agissant (cid:133) la ninhydrine. Le flux du tampon et du r(cid:130)actif de ninhydrine est assur(cid:130) par des pompes dont le degr(cid:130) de stabilit(cid:130) du flux est approximativement de 0,5 % dans la p(cid:130)riode couvrant l’analyse de la solution d’(cid:130)talonnage et l’analyse de l’(cid:130)chantillon. Avec certains analyseurs d’acides amin(cid:130)s, on peut utiliser des m(cid:130)thodes d’hydrolyse dans lesquelles l’hydrolysat a une concentration de sodium de c = 0,8 mol/l et contient tout l’acide formique r(cid:130)siduel provenant de l’oxydation. D’autres appareils ne donnent pas une s(cid:130)paration satisfaisante de certains acides amin(cid:130)s si l’hydrolysat contient trop d’acide formique et/ou pr(cid:130)sente des concentrations (cid:130)lev(cid:130)es d’ions sodium. Dans ce cas, le volume de l’acide est r(cid:130)duit par (cid:130)vaporation (cid:133) environ 5 ml apr(cid:138)s l’hydrolyse et avant l’ajustement du pH. L’(cid:130)vaporation doit (cid:136)tre faite sous vide (cid:133) 40 (cid:190)C au maximum. 5. Mode op(cid:130)ratoire 5. 1. Pr(cid:130)paration de l’(cid:130)chantillon Broyer l’(cid:130)chantillon pour le r(cid:130)duire (cid:133) une granulom(cid:130)trie de 0,5 mm. Les (cid:130)chantillons (cid:133) forte teneur en humidit(cid:130) doivent (cid:136)tre s(cid:130)ch(cid:130)s (cid:133) l’air (cid:133) une temp(cid:130)rature de 50 (cid:190)C au maximum ou par lyophilisation avant broyage. Les (cid:130)chantillons (cid:133) forte teneur en mati(cid:138)res grasses doivent (cid:136)tre extraits par l’(cid:130)ther de p(cid:130)trole (3. 12) avant broyage. 5. 2. Dosage des acides amin(cid:130)s libres dans les aliments du b(cid:130)tail et les pr(cid:130)m(cid:130)langes Peser (cid:133) 0,2 mg pr(cid:138)s une quantit(cid:130) ad(cid:130)quate (1-5 g) de l’(cid:130)chantillon pr(cid:130)par(cid:130) (5. 1) dans un erlenmeyer et ajouter 100 ml du m(cid:130)lange d’extraction (3. 21). Agiter le m(cid:130)lange pendant 60 min (cid:133) l’aide d’un agitateur m(cid:130)canique ou magn(cid:130)tique (4. 8). Laisser d(cid:130)canter le s(cid:130)diment et pr(cid:130)lever (cid:133) la pipette 10,0 ml de la solution surnageante dans un b(cid:130)cher de 100 ml. 19. 9. 98 FR Journal officiel des Communaut(cid:130)s europ(cid:130)ennes L 257/19 Ajouter 5,0 ml de la solution d’acide sulfosalicylique (3. 22) tout en remuant et poursuivre l’agitation pendant 5 min (cid:133) l’aide de l’agitateur magn(cid:130)tique. Filtrer ou centrifuger la phase surnageante en vue d’en s(cid:130)parer le pr(cid:130)cipitat (cid:130)ventuel. Verser 10,0 ml de la solution obtenue dans un b(cid:130)cher de 100 ml, ajuster le pH (cid:133) 2,20 (cid:133) l’aide d’une solution d’hydroxyde de sodium (3. 18), transf(cid:130)rer le tout dans une fiole jaug(cid:130)e d’un volume appropri(cid:130) (cid:133) l’aide du tampon au citrate (3. 24) et porter au trait avec la solution tampon (3. 24). Si un (cid:130)talon interne est utilis(cid:130), ajouter 1,00 ml de l’(cid:130)talon interne (3. 27. 3) par fraction de 100 ml de la solution finale et porter au trait (cid:133) l’aide de la solution tampon (3. 24). Passer (cid:133) la chromatographie conform(cid:130)ment au point 5. 4. Si les extraits ne sont pas chromatographi(cid:130)s le m(cid:136)me jour, les conserver (cid:133) une temp(cid:130)rature inf(cid:130)rieure (cid:133) 5 (cid:190)C. 5. 3. Dosage des acides amin(cid:130)s totaux 5. 3. 1. O x y d a t i o n Peser (cid:133) 0,2 mg pr(cid:138)s, de 0,1 g (cid:133) 1 g de l’(cid:130)chantillon pr(cid:130)par(cid:130) (5. 1) dans: — un ballon sph(cid:130)rique de 100 ml (4. 1) pour hydrolyse ouverte (5. 3. 2. 3), ou — un ballon sph(cid:130)rique de 250 ml (4. 1) pour hydrolyse ouverte (5. 3. 3. 1), si l’on a besoin d’une faible concentration de sodium, ou — un flacon de 100 ml (cid:133) bouchon (cid:133) vis (4. 2) (pour hydrolyse ferm(cid:130)e 5. 3. 2. 4). La fraction de l’(cid:130)chantillon pes(cid:130)e devrait avoir une teneur en azote d’environ 10 mg et une teneur en humidit(cid:130) de 100 mg au plus. Placer le ballon sph(cid:130)rique ou le flacon dans un bain d’eau glac(cid:130)e et refroidir (cid:133) 0 (cid:190)C; ajouter 5 ml du m(cid:130)lange (cid:133) oxyder (3. 23) et m(cid:130)langer (cid:133) l’aide d’une spatule de verre (cid:133) bout courb(cid:130). Fermer herm(cid:130)tiquement le ballon/le flacon contenant la spatule (cid:133) l’aide d’un film imperm(cid:130)able (cid:133) l’air, placer le bain d’eau glac(cid:130)e avec le r(cid:130)cipient ainsi ferm(cid:130) dans un r(cid:130)frig(cid:130)rateur (cid:133) 0 (cid:190)C et l’y laisser s(cid:130)journer pendant 16 heures. Enlever ensuite le produit du r(cid:130)frig(cid:130)rateur et d(cid:130)composer l’exc(cid:138)s de r(cid:130)actif d’oxydation par addition de 0,84 g de disulfite de sodium (3. 4). Passer (cid:133) l’op(cid:130)ration du point 5. 3. 2. 1. 5. 3. 2. H y d r o l y s e 5. 3. 2. 1. Hydrolyse des (cid:130)chantillons oxyd(cid:130)s (cid:211) l’(cid:130)chantillon oxyd(cid:130) pr(cid:130)par(cid:130) conform(cid:130)ment (cid:133) 5. 3. 1, ajouter 25 ml du m(cid:130)lange d’hydrolyse (3. 20) en prenant soin d’(cid:130)liminer par rin(cid:135)age tout r(cid:130)sidu de l’(cid:130)chantillon adh(cid:130)rant aux parois du r(cid:130)cipient et (cid:133) la spatule. Selon la m(cid:130)thode d’hydrolyse utilis(cid:130)e, appliquer la m(cid:130)thode vis(cid:130)e au point 5. 3. 2. 3 ou 5. 3. 2. 4. 5. 3. 2. 2. Hydrolyse des (cid:130)chantillons non oxyd(cid:130)s Peser dans un ballon sph(cid:130)rique de 100 ml ou 250 ml (4. 1) ou dans un tube de 100 ml pourvu d’un bouchon (cid:133) vis (4. 2), (cid:133) 0,2 mg pr(cid:138)s, de 0,1 (cid:133) 1 g de l’(cid:130)chantillon pr(cid:130)par(cid:130) (5. 1). La fraction de l’(cid:130)chantillon pes(cid:130)e devrait avoir une teneur en azote d’environ 10 mg. Ajouter avec pr(cid:130)caution 25 ml du m(cid:130)lange (cid:133) hydrolyser (3. 20) et m(cid:130)langer avec l’(cid:130)chantillon. Poursuivre selon la proc(cid:130)dure du point 5. 3. 2. 3 ou du point 5. 3. 2. 4. 5. 3. 2. 3. Hydrolyse ouverte Ajouter 3 billes de verre au m(cid:130)lange contenu dans le ballon (pr(cid:130)par(cid:130) conform(cid:130)ment (cid:133) 5. 3. 2. 1 ou 5. 3. 2. 2) et faire bouillir en bouillonnement constant pendant 23 heures exactement. Apr(cid:138)s l’hydrolyse rincer le condenseur au moyen de 5 ml du tampon au citrate (3. 24). D(cid:130)connecter le ballon et le faire refroidir dans un bain glac(cid:130). Poursuivre conform(cid:130)ment au point 5. 3. 3. 5. 3. 2. 4. Hydrolyse ferm(cid:130)e Placer le flacon contenant le m(cid:130)lange pr(cid:130)par(cid:130) conform(cid:130)ment au point 5. 3. 2. 1 ou 5. 3. 2. 2 dans une (cid:130)tuve (4. 3) r(cid:130)gl(cid:130)e (cid:133) 110 (cid:190)C. Pendant la premi(cid:138)re heure, en vue de pr(cid:130)venir toute pression (due (cid:133) l’(cid:130)volution des substances gazeuses) et pour pr(cid:130)venir toute explosion, poser le bouchon (cid:133) vis sur le r(cid:130)cipient. Ne pas fermer le r(cid:130)cipient en vissant le bouchon. Apr(cid:138)s 1 heure, fermer le r(cid:130)cipient (cid:133) l’aide du bouchon (cid:133) vis et laisser reposer (cid:133) l’(cid:130)tuve (4. 3) pendant 23 heures. Apr(cid:138)s l’hydrolyse, enlever le flacon de l’(cid:130)tuve, ouvrir avec pr(cid:130)caution le bouchon et placer le flacon dans un bain d’eau glac(cid:130)e. Laisser refroidir. Selon la proc(cid:130)dure adopt(cid:130)e pour l’ajustement du pH (5. 3. 3) transf(cid:130)rer quantitativement le contenu du flacon dans un b(cid:130)cher de 250 ml ou dans un ballon sph(cid:130)rique de 250 ml (cid:133) l’aide du tampon au citrate (3. 24). Poursuivre conform(cid:130)ment au point 5. 3. 3. 5. 3. 3. A j u s t e m e n t d u p H En fonction de la tol(cid:130)rance des analyseurs d’aicdes amin(cid:130)s en sodium (4. 9) proc(cid:130)der selon la m(cid:130)thode 5. 3. 3. 1 ou 5. 3. 3. 2 pour l’ajustement du pH. 5. 3. 3. 1. Pour des syst(cid:138)mes chromatographiques (4. 9) demandant une faible concentration de sodium Il est recommand(cid:130) d’utiliser un (cid:130)talon interne (3. 27. 3) si on utilise des analyseurs d’acides amin(cid:130)s demandant une faible concentration de sodium (lorsque le volume d’acide doit (cid:136)tre r(cid:130)duit). L 257/20 FR Journal officiel des Communaut(cid:130)s europ(cid:130)ennes 19. 9. 98 Dans ce cas, ajouter 2,00 ml de la solution d’(cid:130)talon interne (3. 27. 3) (cid:133) l’hydrolysat avant (cid:130)vaporation. Ajouter 2 gouttes de 1-Octanol (3. 15) (cid:133) l’hydrolysat obtenu conform(cid:130)ment (cid:133) la proc(cid:130)dure du point 5. 3. 2. 3 ou 5. 3. 2. 4. (cid:211) l’aide d’un (cid:130)vaporateur rotatif (4. 7) r(cid:130)duire sous vide (cid:133) 40 (cid:190)C le volume (cid:133) 5 ou 10 ml. Si le volume est accidentellement r(cid:130)duit (cid:133) moins de 5 ml l’hydrolysat doit (cid:136)tre rejet(cid:130) et l’analyse recommenc(cid:130)e. Ajuster le pH (cid:133) 2,20 (cid:133) l’aide d’une solution d’hydroxyde de sodium (3. 18) et poursuivre conform(cid:130)ment (cid:133) la proc(cid:130)dure du point 5. 3. 4. 5. 3. 3. 2. Pour tous les autres analyseurs d’acides amin(cid:130)s (4. 9) Recueillir les hydrolysats obtenus conform(cid:130)ment (cid:133) 5. 3. 2. 3 ou 5. 3. 2. 4 et les neutraliser partiellement en ajoutant avec pr(cid:130)caution, tout en agitant, 17 ml d’une solution d’hydroxyde de sodium (3. 17), la temp(cid:130)rature restant inf(cid:130)rieure (cid:133) 40 (cid:190)C. L’ajustement du pH final (cid:133) 2,20 s’effectue (cid:133) temp(cid:130)rature ambiante au moyen d’une solution d’hydroxyde de sodium (3. 17) et d’une solution d’hydroxyde de sodium (3. 18). Poursuivre conform(cid:130)ment au point 5. 3. 4. 5. 3. 4. S o l u t i o n d e l ’ (cid:130) c h a n t i l l o n p o u r c h r o m a t o g r a p h i e Transf(cid:130)rer quantitativement l’hydrolysat (cid:133) pH ajust(cid:130) (5. 3. 3. 1 ou 5. 3. 3. 2) avec le tampon au citrate (3. 24) dans une fiole jaug(cid:130)e de 200 ml et porter (cid:133) la marque (cid:133) l’aide du tampon (3. 24). Si l’(cid:130)talon interne n’a pas encore (cid:130)t(cid:130) utilis(cid:130), en ajouter 2,00 ml (3. 27. 3) et porter au trait avec du tampon au citrate (3. 24). M(cid:130)langer soigneusement. Poursuivre par la chromatographie (5. 4). Si les solutions des (cid:130)chantillons ne sont pas chromatographi(cid:130)es le m(cid:136)me jour, les conserver (cid:133) une temp(cid:130)rature inf(cid:130)rieure (cid:133) 5 (cid:190)C. 5. 4. Chromatographie Avant la chromatographie, porter l’extrait (5. 2) ou l’hydrolysat (5. 3. 4) (cid:133) temp(cid:130)rature ambiante. Agiter le m(cid:130)lange et filtrer une partie appropri(cid:130)e (cid:133) travers un filtre membrane de 0,2 lm (4. 5). La solution claire obtenue est soumise (cid:133) une chromatographie par (cid:130)change d’ions au moyen d’un appareil analyseur d’acides amin(cid:130)s (4. 9). L’injection peut (cid:136)tre op(cid:130)r(cid:130)e manuellement ou automatiquement. Il importe que la m(cid:136)me quantit(cid:130) de solution (5 0,5 %) soit toujours ajout(cid:130)e (cid:133) la colonne pour l’analyse des solutions de r(cid:130)f(cid:130)rence ou des (cid:130)chantillons, sauf lorsque l’(cid:130)talon interne est utilis(cid:130), et que les rapports sodium/acide amin(cid:130) dans les solutions d’(cid:130)talonnage et les solutions des (cid:130)chantillons soient aussi voisins que possible. La fr(cid:130)quence des injections de la solution d’(cid:130)talonnage d(cid:130)pend de la stabilit(cid:130) du r(cid:130)actif ninhydrine et du syst(cid:138)me d’analyse en g(cid:130)n(cid:130)ral. La solution (cid:130)talon ou d’(cid:130)chantillon est dilu(cid:130)e avec un tampon au citrate (3. 24) pour donner une surface de pic de la solution (cid:130)talon de 30 (cid:133) 200 % de la surface de pic de l’acide amin(cid:130) dans l’(cid:130)chantillon. La chromatographie des acides amin(cid:130)s varie l(cid:130)g(cid:138)rement selon le type d’analyseur employ(cid:130) ainsi que la r(cid:130)sine utilis(cid:130)e. Le syst(cid:138)me retenu doit permettre de s(cid:130)parer les acides amin(cid:130)s les uns des autres et des substances r(cid:130)agissant (cid:133) la ninhydrine. Au cours de l’op(cid:130)ration, le syst(cid:138)me chromatographique devrait donner une r(cid:130)ponse lin(cid:130)aire (cid:133) des variations des quantit(cid:130)s d’acides amin(cid:130)s ajout(cid:130)s dans la colonne. Pendant la phase de chromatographie, les rapports de hauteur entre creux et sommets de pics mentionn(cid:130)s ci-dessous sont applicables lorsqu’une solution (cid:130)quimolaire des acides amin(cid:130)s est analys(cid:130)e. Cette solution (cid:130)quimolaire doit contenir au moins 30 % de la charge maximale de chaque acide amin(cid:130) qui peut (cid:136)tre d(cid:130)termin(cid:130)e avec pr(cid:130)cision (cid:133) l’aide du syst(cid:138)me analyseur d’acides amin(cid:130)s (4. 9). Pour la s(cid:130)paration thr(cid:130)onine-s(cid:130)rine, le rapport de hauteur entre la vall(cid:130)e et le sommet du plus bas des deux acides amin(cid:130)s chevauchant, dans le chromatogramme, ne devrait pas d(cid:130)passer 2:10 (si le dosage porte seulement sur la cyst((cid:130))ine, la m(cid:130)thionine, la thr(cid:130)onine et la lysine, une s(cid:130)paration insuffisante des pics voisins aura une influence d(cid:130)favorable sur le dosage). Pour tous les autres acides amin(cid:130)s, la s(cid:130)paration doit (cid:136)tre meilleure que 1:10. Le syst(cid:138)me doit garantir que la lysine soit s(cid:130)par(cid:130)e des «artefacts de lysine» et de l’ornithine. 6. Calcul des r(cid:130)sultats La surface des pics de l’(cid:130)chantillon et de la solution de r(cid:130)f(cid:130)rence est mesur(cid:130)e pour chaque acide amin(cid:130) particulier et la quantit(cid:130), exprim(cid:130)e en grammes d’acide amin(cid:130) par kg d’(cid:130)chantillon, est calcul(cid:130)e selon la formule: = g d’acide amin(cid:130) par kg d’(cid:130)chantillon A (cid:253) E (cid:253) PM (cid:253) F B (cid:253) P (cid:253) 1 000 Si un (cid:130)talon interne est utilis(cid:130), multiplier par D C. 19. 9. 98 FR Journal officiel des Communaut(cid:130)s europ(cid:130)ennes L 257/21 A = surface de pic, hydrolysat ou extrait B = surface de pic, solution d’(cid:130)talonnage C = surface de pic, (cid:130)talon interne dans l’hydrolysat ou l’extrait D = surface de pic, (cid:130)talon interne, solution d’(cid:130)talonnage PM = poids mol(cid:130)culaire E = concentration de l’(cid:130)talon en lmol/l P = poids en grammes d’(cid:130)chantillon (corrig(cid:130) pour obtenir le poids initial si le produit est s(cid:130)ch(cid:130) ou d(cid:130)graiss(cid:130)) F = ml d’hydrolysat total (5. 3. 4) ou ml du volume de l’extrait dilu(cid:130) total calcul(cid:130) (6. 1). La cystine et la cyst(cid:130)ine sont dos(cid:130)es toutes deux sous forme d’acide cyst(cid:130)ique dans les hydrolysats de l’(cid:130)chantillon oxyd(cid:130) mais calcul(cid:130)es sous forme de cystine (C , MG 240,30) en utilisant un 6 PM de 120,15 (= 0,5 (cid:253) 240,30). N 2 S 4 H O 12 2 La m(cid:130)thionine est dos(cid:130)e sous forme de m(cid:130)thionine sulfone dans les hydrolysats de l’(cid:130)chantillon oxyd(cid:130), mais calcul(cid:130)e sous forme de m(cid:130)thionine en utilisant un PM de 149,21 pour la m(cid:130)thionine. La m(cid:130)thionine libre ajout(cid:130)e est dos(cid:130)e apr(cid:138)s extraction sous forme de m(cid:130)thionine; pour le calcul, appliquer la m(cid:136)me valeur (cid:133) PM. 6. 1. Le volume de la dilution totale des extraits (F) pour le dosage des acides amin(cid:130)s libres (5. 2) est calcul(cid:130) comme suit: F = 100 ml (cid:253) (10 ml + 5ml) 10 ml (cid:253) Vml 10 ml V = volume de l’extrait final 7. (cid:144)valuation de la m(cid:130)thode La m(cid:130)thode a (cid:130)t(cid:130) test(cid:130)e dans une comparaison interlaboratoire internationale faite en 1990 sur la base de quatre aliments diff(cid:130)rents (aliment compos(cid:130) pour porc, aliment compos(cid:130) pour poulet de chair, concentr(cid:130) prot(cid:130)ique, pr(cid:130)m(cid:130)lange). La moyenne et l’(cid:130)cart-type des r(cid:130)sultats, apr(cid:138)s (cid:130)limination des aberrants, figurent au tableau suivant: Moyennes en g/kg Substance de r(cid:130)f(cid:130)rence Aliment compos(cid:130) pour porcs Aliment compos(cid:130) pour poulets de chair Concentr(cid:130) prot(cid:130)ique Pr(cid:130)m(cid:130)lange Acide amin(cid:130) Thr(cid:130)onine Cyst((cid:130))ine M(cid:130)thionine Lysine 6,94 n=15 9,31 n=16 22,32 n=16 58,42 n=16 3,01 n=17 3,92 n=18 5,06 n=17 (cid:190) 3,27 n=17 5,08 n=18 12,01 n=17 90,21 n=16 9,55 n=13 13,93 n=16 47,74 n=15 98,03 n=16 n=nombre de laboratoires participants 7. 1. R(cid:130)p(cid:130)tabilit(cid:130) Chiffres de r(cid:130)p(cid:130)tabilit(cid:130) pour les acides amin(cid:130)s test(cid:130)s. La r(cid:130)p(cid:130)tabilit(cid:130), exprim(cid:130)e sous forme d’«(cid:130)cart-type (cid:133) l’int(cid:130)rieur du laboratoire» de la comparaison interlaboratoire susvis(cid:130)e, est indiqu(cid:130)e dans les tableaux ci-dessous: L 257/22 FR Journal officiel des Communaut(cid:130)s europ(cid:130)ennes 19. 9. 98 (cid:144)cart-type (cid:133) l’int(cid:130)rieur du laboratoire (Sr) en g/kg Substance de r(cid:130)f(cid:130)rence Aliment compos(cid:130) pour porcs Aliment compos(cid:130) pour poulets de chair Concentr(cid:130) prot(cid:130)ique Pr(cid:130)m(cid:130)lange n=nombre de laboratoires participants Acide amin(cid:130) Thr(cid:130)onine Cyst((cid:130))ine M(cid:130)thionine Lysine 0,13 n=15 0,20 n=16 0,48 n=16 1,30 n=16 0,10 n=17 0,11 n=18 0,13 n=17 (cid:190) 0,11 n=17 0,16 n=18 0,27 n=17 2,19 n=16 0,26 n=13 0,28 n=16 0,99 n=15 2,06 n=16 Coefficient de variation (%) pour l’(cid:130)cart-type (cid:133) l’int(cid:130)rieur du laboratoire (Sr) Substance de r(cid:130)f(cid:130)rence Aliment compos(cid:130) pour porcs Aliment compos(cid:130) pour poulets de chair Concentr(cid:130) prot(cid:130)ique Pr(cid:130)m(cid:130)lange Acide amin(cid:130) Thr(cid:130)onine Cyst((cid:130))ine M(cid:130)thionine Lysine 1,9 n=15 2,1 n=16 2,7 n=16 2,2 n=16 3,3 n=17 2,8 n=18 2,6 n=17 (cid:190) 3,4 n=17 3,1 n=18 2,2 n=17 2,4 n=16 2,8 n=13 2,1 n=16 2,4 n=15 2,1 n=16 n=nombre de laboratoires participants 7. 2. Reproductibilit(cid:130) Les r(cid:130)sultats relatifs (cid:133) l’(cid:130)cart-type entre laboratoires pour la comparaison interlaboratoire mentionn(cid:130)e ci-dessus figurent au tableau ci-dessous. (cid:144)cart-type entre laboratoires (S R ) en g/kg Substance de r(cid:130)f(cid:130)rence Aliment compos(cid:130) pour porcs Aliment compos(cid:130) pour poulets de chair Concentr(cid:130) prot(cid:130)ique Pr(cid:130)m(cid:130)lange n=nombre de laboratoires participants Acide amin(cid:130) Thr(cid:130)onine Cyst((cid:130))ine M(cid:130)thionine Lysine 0,28 n=15 0,48 n=16 0,85 n=16 2,49 n=16 0,30 n=17 0,34 n=18 0,62 n=17 (cid:190) 0,23 n=17 0,55 n=18 1,57 n=17 6,20 n=16 0,30 n=13 0,75 n=16 1,24 n=15 6,62 n=16 19. 9. 98 FR Journal officiel des Communaut(cid:130)s europ(cid:130)ennes L 257/23 Coefficient de variation (%) relatif (cid:133) l’(cid:130)cart-type entre laboratoires (SR) Substance de r(cid:130)f(cid:130)rence Aliment compos(cid:130) pour porcs Aliment compos(cid:130) pour poulets de chair Concentr(cid:130) prot(cid:130)ique Pr(cid:130)m(cid:130)lange Acide amin(cid:130) Thr(cid:130)onine Cyst((cid:130))ine M(cid:130)thionine Lysine 4,1 n=15 5,2 n=16 3,8 n=16 4,3 n=16 9,9 n=17 8,8 n=18 12,3 n=17 (cid:190) 7,0 n=17 10,9 n=18 13,0 n=17 6,9 n=16 3,2 n=13 5,4 n=16 3,0 n=15 6,7 n=16 n=nombre de laboratoires participants 8. Utilisation de mat(cid:130)riaux de r(cid:130)f(cid:130)rence L’application correcte de la m(cid:130)thode est v(cid:130)rifi(cid:130)e par r(cid:130)p(cid:130)tition des mesures des mat(cid:130)riaux de r(cid:130)f(cid:130)rence certifi(cid:130)s (cid:130)ventuellement disponibles. L’(cid:130)talonnage au moyen d’une solution d’(cid:130)talonnage certifi(cid:130)e d’acides amin(cid:130)s est recommand(cid:130)e. Remarques Par suite des diff(cid:130)rences entre appareils analyseurs d’acides amin(cid:130)s, les concentrations finales des solutions d’(cid:130)talonnage des acides amin(cid:130)s (cf. 3. 27. 4 et 3. 27. 5) et de l’hydrolysat (cf. 5. 3. 4) ont un caract(cid:138)re indicatif. Le champ de la r(cid:130)ponse lin(cid:130)aire de l’appareillage doit (cid:136)tre v(cid:130)rifi(cid:130) pour tous les acides amin(cid:130)s. La solution de r(cid:130)f(cid:130)rence est dilu(cid:130)e avec un tampon au citrate pour donner des surfaces de pic se situant au milieu du champ. Dans les cas o(cid:151) un appareillage de chromatographie liquide (cid:133) haute performance est utilis(cid:130) pour analyser aux recommandations du fabricant. les conditions d’essai doivent (cid:136)tre optimis(cid:130)es conform(cid:130)ment les hydrolysats, L’application de la m(cid:130)thode aux aliments des animaux contenant plus de 1 % de chlorure (cocnentr(cid:130), aliments min(cid:130)raux, aliments compl(cid:130)mentaires) pourrait entra(cid:140)ner une sous-estimation de la m(cid:130)thionine et un traitement sp(cid:130)cial est (cid:133) pr(cid:130)voir. 9. 9. 1. 9. 2. 9. 3. PARTIE B 4. DOSAGE DES MATI(cid:221)RES GRASSES BRUTES 1. Objet et domaine d’application La m(cid:130)thode est destin(cid:130)e (cid:133) d(cid:130)terminer la teneur en mati(cid:138)res grasses brutes des aliments des animaux. Elle ne concerne pas l’analyse des graines et fruits ol(cid:130)agineux d(cid:130)finie dans le r(cid:138)glement no 136/66/CEE du Conseil du 22 septembre 1966. L’application des deux proc(cid:130)d(cid:130)s d(cid:130)crits ci-apr(cid:138)s d(cid:130)pend de la nature et de la composition des aliments des animaux et de la raison pour laquelle l’analyse est effectu(cid:130)e. 1. 1. Proc(cid:130)d(cid:130) A — Mati(cid:138)res grasses directement extractibles Ce proc(cid:130)d(cid:130) est applicable aux aliments simples d’origine v(cid:130)g(cid:130)tale (cid:133) l’exception de ceux inclus dans le domaine d’application du proc(cid:130)d(cid:130) B. 1. 2. Proc(cid:130)d(cid:130) B — Mati(cid:138)res grasses brutes totales Ce proc(cid:130)d(cid:130) est applicable aux aliments simples d’origine animale et (cid:133) tous les aliments compos(cid:130)s. Il doit (cid:136)tre utilis(cid:130) pour tous les aliments dont les mati(cid:138)res grasses ne sont pas compl(cid:138)tement extractibles sans hydrolyse pr(cid:130)alable, par exemple les glutens, les levures, les prot(cid:130)ines de pomme de terre et les aliments soumis (cid:133) des proc(cid:130)d(cid:130)s tels que l’extrusion, la floconnisation et le chauffage. L 257/24 FR Journal officiel des Communaut(cid:130)s europ(cid:130)ennes 19. 9. 98 1. 3. Interpr(cid:130)tation des r(cid:130)sultats Dans tous les cas o(cid:151) l’application du proc(cid:130)d(cid:130) B donne un r(cid:130)sultat sup(cid:130)rieur (cid:133) celui r(cid:130)sultant de l’application du proc(cid:130)d(cid:130) A, le r(cid:130)sultat obtenu par le proc(cid:130)d(cid:130) B sera accept(cid:130) comme valeur r(cid:130)elle. 2. Principe 2. 1. Proc(cid:130)d(cid:130) A L’(cid:130)chantillon est extrait par de l’(cid:130)ther de p(cid:130)trole. Le solvant est distill(cid:130) et le r(cid:130)sidu est s(cid:130)ch(cid:130) et pes(cid:130). 2. 2. Proc(cid:130)d(cid:130) B L’(cid:130)chantillon est trait(cid:130) (cid:133) chaud par de l’acide chlorhydrique. Le m(cid:130)lange est refroidi et filtr(cid:130). Apr(cid:138)s avoir (cid:130)t(cid:130) lav(cid:130) et s(cid:130)ch(cid:130), le r(cid:130)sidu est soumis (cid:133) l’analyse selon le proc(cid:130)d(cid:130) A. 3. R(cid:130)actifs 3. 1. (cid:144)ther de p(cid:130)trole, intervalle d’(cid:130)bullition: de 40 (cid:133) 60 (cid:190)C. L’indice de brome doit (cid:136)tre inf(cid:130)rieur (cid:133) 1 et le r(cid:130)sidu apr(cid:138)s (cid:130)vaporation inf(cid:130)rieur (cid:133) 2 mg/100 ml. 3. 2. Sulfate de sodium, anhydre. 3. 3. Acide chlorhydrique 3 M. 3. 4. Adjuvant de filtration par exemple terre de diatom(cid:130)e, Hyflo-supercel. 4. Appareillage 4. 1. Extracteur. Si l’appreil est muni d’un siphon (appareil de Soxhlet), le d(cid:130)bit du reflux doit (cid:136)tre r(cid:130)gl(cid:130) de fa(cid:135)on (cid:133) obtenir dix cycles au moins par heure. S’il s’agit d’un appareil sans siphon, le d(cid:130)bit de liquide reflu(cid:130) doit (cid:136)tre de 10 ml environ par minute. 4. 2. Cartouches d’extraction, exemptes de mati(cid:138)re soluble dans l’(cid:130)ther de p(cid:130)trole, dont la porosit(cid:130) est compatible avec les exigences du point 4. 1. 4. 3. (cid:144)tuve (cid:133) dessiccation, soit par le vide (cid:133) 75 (cid:190)C 5 3 (cid:190)C, soit (cid:133) pression atmosph(cid:130)rique (cid:133) 100 (cid:190)C 5 3 (cid:190)C. 5. Mode op(cid:130)ratoire 5. 1. Proc(cid:130)d(cid:130) A (voir observation 8. 1) Peser, (cid:133) 1 mg pr(cid:138)s, 5 g de l’(cid:130)chantillon, les introduire dans une cartouche (cid:133) extraction (4. 2) et les recouvrir d’un tampon de coton d(cid:130)graiss(cid:130). Placer la cartouche dans un extracteur (4. 1) et extraire durant 6 heures par de l’(cid:130)ther de p(cid:130)trole (3. 1). Recueillir l’extrait dans un ballon sec, muni de quelques fragments de pierre ponce (1) et tarer. (cid:144)liminer le solvant par distillation. S(cid:130)cher le r(cid:130)sidu en pla(cid:135)ant le ballon pendant une heure et demie dans une (cid:130)tuve (cid:133) dessiccation (4. 3). Laisser refroidir dans un dessiccateur et peser. S(cid:130)cher (cid:133) nouveau pendant 30 minutes pour s’assurer que le poids de la mati(cid:138)re grasse reste constant (la perte de poids entre deux pes(cid:130)es successives doit (cid:136)tre inf(cid:130)rieure (cid:133) 1 mg). 5. 2. Proc(cid:130)d(cid:130) B Peser, (cid:133) 1 mg pr(cid:138)s, 2,5 g de l’(cid:130)chantillon (voir observation 8. 2), les introduire dans un cylindre de 400 ml ou une fiole conique de 300 ml et ajouter 100 ml d’acide chlorhydrique 3 M (3. 3) et quelques fragments de pierre ponce. Recouvrir le cylindre d’un verre de montre ou munir la fiole conique d’un r(cid:130)frig(cid:130)rant (cid:133) reflux. Amener le m(cid:130)lange (cid:133) (cid:130)bullition douce, (cid:133) l’aide d’une petite flamme ou d’une plaque chauffante, et l’y maintenir durant une heure. (cid:144)viter que le produit adh(cid:138)re aux parois du r(cid:130)cipient. Refroidir et ajouter une quantit(cid:130) d’ajuvant de filtration (3. 4) suffisante pour (cid:130)viter toute perte de mati(cid:138)res grasses lors de la filtration. Filtrer sur un double papier filtre mouill(cid:130), exempt de mati(cid:138)res grasses. Laver le r(cid:130)sidu (cid:133) l’eau froide jusqu’(cid:133) neutralit(cid:130) du filtrat. V(cid:130)rifier que le filtrat ne contient pas de mati(cid:138)res grasses. La pr(cid:130)sence de celles-ci indique qu’une extraction de l’(cid:130)chantillon par l’(cid:130)ther de p(cid:130)trole, selon le proc(cid:130)d(cid:130) A, doit (cid:136)tre effectu(cid:130)e pr(cid:130)alablement (cid:133) l’hydrolyse. Placer le double papier-filtre contenant le r(cid:130)sidu sur un verre de montre et s(cid:130)cher durant une heure et demie dans l’(cid:130)tuve (cid:133) 100 (cid:190)C 5 3 (cid:190)C. Introduire le double papier-filtre contenant le r(cid:130)sidu sec dans une cartouche (cid:133) extraction (4. 2) et le recouvrir d’un tampon de coton d(cid:130)graiss(cid:130). Placer la cartouche dans un extracteur (4. 1) et poursuivre le mode op(cid:130)ratoire comme indiqu(cid:130) en 5. 1, deuxi(cid:138)me et troisi(cid:138)me alin(cid:130)as. (1) Remplacer les fragments de pierre ponce par des perles de verre lorsque la mati(cid:138)re grasse doit faire l’objet d’examens qualitatifs ult(cid:130)rieurs. 19. 9. 98 FR Journal officiel des Communaut(cid:130)s europ(cid:130)ennes L 257/25 6. Calcul des r(cid:130)sultats Exprimer le r(cid:130)sultat de la pes(cid:130)e en parts pourcent d’(cid:130)chantillon. 7. R(cid:130)p(cid:130)tabilit(cid:130) La diff(cid:130)rence entre les r(cid:130)sultats de deux d(cid:130)terminations parall(cid:138)les effectu(cid:130)es sur un m(cid:136)me (cid:130)chantillon par le m(cid:136)me analyste ne doit pas d(cid:130)passer: — 0,2 %, en valeur absolue, pour les teneurs en mati(cid:138)res grasses brutes inf(cid:130)rieures (cid:133) 5 %, — 4 % du r(cid:130)sultat le plus (cid:130)lev(cid:130) pour les teneurs de 5 (cid:133) 10 %, — 0,4 %, en valeur absolue, pour les teneurs sup(cid:130)rieures (cid:133) 10 %. Observations Pour les produits (cid:133) teneur (cid:130)lev(cid:130)e en mati(cid:138)res grasses, difficiles (cid:133) broyer ou non appropri(cid:130)s au pr(cid:130)l(cid:138)vement d’une prise d’essais r(cid:130)duite homog(cid:138)ne, proc(cid:130)der comme suit: Peser, (cid:133) 1 mg pr(cid:138)s, 20 g de l’(cid:130)chantillon et les m(cid:130)langer (cid:133) 10 g ou plus de sulfate de sodium anhydre (3. 2). Extraire par l’(cid:130)ther de p(cid:130)trole (3. 1) comme indiqu(cid:130) en 5. 1. Compl(cid:130)ter l’extrait obtenu (cid:133) 500 ml avec de l’(cid:130)ther de p(cid:130)trole (3. 1) et m(cid:130)langer. Introduire 50 ml de la solution dans un petit ballon sec, muni de quelques fragments de pierre ponce (1) et tarer. (cid:144)liminer le solvant par distillation, s(cid:130)cher et poursuivre le mode op(cid:130)ratoire comme indiqu(cid:130) en 5. 1, dernier alin(cid:130)a. (cid:144)liminer le solvant du r(cid:130)sidu d’extraction se trouvant dans la cartouche, broyer le r(cid:130)sidu (cid:133) la finesse de 1 mm, le placer (cid:133) nouveau dans la cartouche (ne pas ajouter de sulfate de sodium) et poursuivre le mode op(cid:130)ratoire comme indiqu(cid:130) en 5. 1, deuxi(cid:138)me et troisi(cid:138)me alin(cid:130)as. La teneur en mati(cid:138)res grasses brutes en parts pourcent d’(cid:130)chantillon est donn(cid:130)e par la formule: (10 a + b) (cid:253) 5 dans laquelle: a = masse, en grammes, du r(cid:130)sidu de la premi(cid:138)re extraction (partie aliquote de l’extrait), b = masse, en grammes, du r(cid:130)sidu de la seconde extraction. La prise d’essai des produits pauvres en mati(cid:138)res grasses peut (cid:136)tre port(cid:130)e (cid:133) 5 g. Les aliments pour animaux de compagnie ayant une teneur (cid:130)lev(cid:130)e en eau peuvent devoir (cid:136)tre m(cid:130)lang(cid:130)s avec du sulfate de sodium anhydre pr(cid:130)alablement (cid:133) l’hydrolyse et (cid:133) l’extraction selon le proc(cid:130)d(cid:130) B. 8. 8. 1. 8. 2. 8. 3. 8. 4. Au paragraphe 5. 2, il peut (cid:136)tre plus efficace d’utiliser de l’eau chaude au lieu d’eau froide pour laver le r(cid:130)sidu apr(cid:138)s filtration. 8. 5. Il se peut que le temps de s(cid:130)chage (1 h 30) doive (cid:136)tre allong(cid:130) pour certains aliments des animaux. Un temps de s(cid:130)chage excessif devrait (cid:136)tre (cid:130)vit(cid:130) dans la mesure o(cid:151) il peut donner de faibles r(cid:130)sultats. Un four (cid:133) micro-ondes peut (cid:130)galement (cid:136)tre utilis(cid:130). 8. 6. Une premi(cid:138)re extraction selon le proc(cid:130)d(cid:130) A pr(cid:130)alablement (cid:133) l’hydrolyse et (cid:133) une deuxi(cid:138)me extraction selon le proc(cid:130)d(cid:130) B est recommand(cid:130)e si la teneur en mati(cid:138)res grasses brutes est sup(cid:130)rieure (cid:133) 15 %. Dans une certaine mesure, cela d(cid:130)pend de la nature des aliments des animaux et de la nature des mati(cid:138)res grasses contenues dans lesdits aliments. PARTIE C DOSAGE DE L’OLAQUINDOX (2-[N-2Y-(hydroxyethyl)carbamoyl]-3-methylquinoxaline-N1,N4-dioxide) 1. Objet et domaine d’application La pr(cid:130)sente m(cid:130)thode permet de doser l’olaquindox dans les aliments des animaux. La limite inf(cid:130)rieure de dosage est de 5 mg/kg. 2. Principe L’(cid:130)chantillon est soumis (cid:133) une extraction par un m(cid:130)lange eau/m(cid:130)thanol. La teneur en olaquindox est d(cid:130)termin(cid:130)e par chromatographie liquide haute performance (CLHP) en phase invers(cid:130)e, avec d(cid:130)tection UV. (1) Remplacer les fragments de pierre ponce par des perles de verre lorsque la mati(cid:138)re grasse doit faire l’objet d’examens qualitatifs ult(cid:130)rieurs. L 257/26 FR Journal officiel des Communaut(cid:130)s europ(cid:130)ennes 19. 9. 98 3. R(cid:130)actifs 3. 1. M(cid:130)thanol 3. 2. M(cid:130)thanol de qualit(cid:130) CLHP 3. 3. Eau, de qualit(cid:130) CLHP 3. 4. Phase mobile pour CLHP M(cid:130)lange d’eau (3. 3)-M(cid:130)thanol (3. 2), 900 + 100 (V + V) 3. 5. Substance dioxyde, E 851. (cid:130)talon: olaquindox pur 2-[N-2Y-(hydroxyethyl)carbamoyl]-3-methylquinoxaline-N1,N4- 3. 5. 1. Solution (cid:130)talon m(cid:138)re d’olaquindox, 250 lg/ml Peser (cid:133) 0,1 mg pr(cid:138)s, 50 mg d’olaquindox (3. 5) dans un ballon jaug(cid:130) de 200 ml et ajouter environ 190 ml d’eau. Placer le ballon pendant 20 minutes dans un bain ultrasonique (4. 1). Apr(cid:138)s traitement ultrasonique, porter la solution (cid:133) temp(cid:130)rature ambiante, porter le contenu jusqu’au trait avec de l’eau et m(cid:130)langer. Envelopper le ballon d’une feuille d’aluminium et le placer au r(cid:130)frig(cid:130)rateur. Renouveler les solutions chaque mois. 3. 5. 2. Solution (cid:130)talon interm(cid:130)diaire d’olaquindox, 25 lg/ml Transf(cid:130)rer 10,0 ml de solution (cid:130)talon m(cid:138)re (3. 5. 1) dans un ballon jaug(cid:130) de 100 ml, porter au trait avec la phase mobile (3. 4) et m(cid:130)langer. Envelopper le ballon d’une feuille d’aluminium et le placer au r(cid:130)frig(cid:130)rateur. Renouveler les solutions chaque jour. 3. 5. 3. Solutions (cid:130)talon de travail Dans une s(cid:130)rie de ballons gradu(cid:130)s de 50 ml transf(cid:130)rer 1,0, 2,0, 5,0, 10,0, 15,0 et 20,0 ml de solution (cid:130)talon interm(cid:130)diaire (3. 5. 2). Porter au trait avec la phase mobile (3. 4) et m(cid:130)langer. Envelopper les ballons avec une feuille d’aluminium. Ces solutions correspondent respectivement (cid:133) 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 7,5 et 10,0 lg d’olaquindox par ml. Renouveler les solutions chaque jour. 4. Appareillage 4. 1. Bain ultrasonique 4. 2. Agitateur m(cid:130)canique 4. 3. (cid:144)quipement CLHP (cid:133) d(cid:130)tecteur UV de longueur d’onde variable ou un d(cid:130)tecteur (cid:133) barrettes de diodes 4. 3. 1. Colonne de chromatographie de 250 mm (cid:253) 4 mm, C18, particules de 10 lm, ou (cid:130)quivalent 4. 4. Filtre (cid:133) membrane (cid:133) 0,45 lm. 5. Mode op(cid:130)ratoire NB: l’olaquindox est sensible (cid:133) la lumi(cid:138)re. Effectuer toutes les op(cid:130)rations sous lumi(cid:138)re diffuse ou utiliser du verre ambr(cid:130). 5. 1. G(cid:130)n(cid:130)ralit(cid:130)s 5. 1. 1. Analyser un aliment t(cid:130)moin pour v(cid:130)rifier l’absence d’olaquindox ou de substances interf(cid:130)rentes. 5. 1. 2. Effectuer un test de r(cid:130)cup(cid:130)ration par analyse d’un aliment t(cid:130)moin auquel il a (cid:130)t(cid:130) ajout(cid:130) une quantit(cid:130) d’olaquindox, similaire (cid:133) celle pr(cid:130)sente dans l’(cid:130)chantillon. Pour obtenir une concentration de 50 mg/kg, transf(cid:130)rer 10,0 ml de la solution par (cid:130)talon m(cid:138)re (3. 5. 1) dans un ballon conique de 250 ml et concentrer la solution par (cid:130)vaporation (cid:133) environ 0,5 ml. Ajouter 50 g de l’aliment t(cid:130)moin, m(cid:130)langer soigneusement et attendre 10 minutes tout en m(cid:130)langeant de nouveau plusieurs fois avant de proc(cid:130)der (cid:133) l’extrac- tion (5. 2) NB: Aux fins de la pr(cid:130)sente m(cid:130)thode, l’aliment t(cid:130)moin doit (cid:136)tre d’un type similaire (cid:133) celui de l’(cid:130)chantillon et aucune pr(cid:130)sence d’olaquindox ne doit y (cid:136)tre d(cid:130)tect(cid:130)e. 5. 2. Extraction Peser (cid:133) 0,01 g pr(cid:138)s, environ 50 g de l’(cid:130)chantillon. Transf(cid:130)rer dans un ballon conique de 1 000 ml, ajouter 100 ml de m(cid:130)thanol (3. 1) et placer le ballon pendant 5 minutes dans un bain ultrasonique (4. 1). Ajouter 410 ml d’eau et laisser dans le bain ultrasonique pendant 15 minutes encore. Enlever le ballon du bain ultrasonique, l’agiter pendant 30 minutes sur l’agitateur (4. 2) et filtrer (cid:133) travers un filtre pliss(cid:130). Transf(cid:130)rer 10,0 ml du filtrat dans un ballon jaug(cid:130) de 20 ml, port(cid:130) jusqu’au trait (cid:133) l’aide d’eau et m(cid:130)langer une partie aliquote et (Voir point 9 Observation. ) Proc(cid:130)der au dosage CLHP (5. 3). filtr(cid:130)e au travers d’un filtre (cid:133) membrane (4. 4). 19. 9. 98 FR Journal officiel des Communaut(cid:130)s europ(cid:130)ennes L 257/27 5. 3. Dosage CLHP 5. 3. 1. P a r a m (cid:138) t r e s Les conditions suivantes sont propos(cid:130)es (cid:133) titre indicatif, d’autres conditions peuvent (cid:136)tre appliqu(cid:130)es si elles donnent des r(cid:130)sultats (cid:130)quivalents. Colonne d’analyse (4. 3. 1) Phase mobile (3. 4): D(cid:130)bit: Longueur d’onde de d(cid:130)tection: Volume d’injection: m(cid:130)lange d’eau (3. 3) (cid:190) et de m(cid:130)thanol (3. 2), 900+100 (V+V) 1,5 (cid:133) 2 ml/min 380 nm 20 ll-100 ll V(cid:130)rifier la stabilit(cid:130) du syst(cid:138)me chromatographique en injectant plusieurs fois la solution (cid:130)talon de travail (3. 5. 3) contenant 2,5 lg/ml jusqu’(cid:133) obtention de hauteurs de pic et de temps de r(cid:130)tention constants. 5. 3. 2. C o u r b e d e c a l i b r a t i o n Injecter chaque solution de travail (3. 5. 3) plusieurs fois et d(cid:130)terminer les hauteurs (surfaces) de pic moyennes pour chaque concentration. (cid:144)tablir une courbe de calibration en utilisant les hauteurs (surfaces) de pic moyennes des les concentrations correspondantes en lg/ml comme abscisses. solutions de travail comme ordonn(cid:130)es et 5. 3. 3. S o l u t i o n d e l ’ (cid:130) c h a n t i l l o n Injecter l’extrait de l’(cid:130)chantillon (5. 2) plusieurs fois en utilisant le m(cid:136)me volume que celui retenu pour les solutions de travail et d(cid:130)terminer la hauteur moyenne (surface) des pics de l’olaquindox. 6. Expression des r(cid:130)sultats (cid:211) partir de la hauteur (surface) moyenne des pics de l’olaquindox de la solution de l’(cid:130)chantillon, d(cid:130)terminer la concentration de la solution de l’(cid:130)chantillon en lg/ml par r(cid:130)f(cid:130)rence (cid:133) la courbe de calibration (5. 3. 2). La teneur t en olaquindox, exprim(cid:130)e en mg/kg de l’(cid:130)chantillon, est donn(cid:130)e par la formule suivante: t = c (cid:253) 1 000 m formule dans laquelle: c = la concentration en olaquindox dans l’extrait de l’(cid:130)chantillon (5. 2) en lg/ml m = la masse de la prise d’essai en g. 7. Validation des r(cid:130)sultats 7. 1. Identit(cid:130) L’identit(cid:130) de l’analyte peut (cid:136)tre confirm(cid:130)e par co-chromatographie ou (cid:133) l’aide d’un d(cid:130)tecteur (cid:133) barrettes de diodes qui permet de comparer les spectres de l’extrait de l’(cid:130)chantillon (5. 2) et de la solution de travail (3. 5. 3) contenant 5,0 lg/ml. 7. 1. 1. C o c h r o m a t o g r a p h i e Un extrait de l’(cid:130)chantillon (5. 2) est additionn(cid:130) d’une quantit(cid:130) appropri(cid:130)e de la solution de travail (3. 5. 3). La quantit(cid:130) d’olaquindox ajout(cid:130)e doit (cid:136)tre semblable (cid:133) la quantit(cid:130) d’olaquindox constat(cid:130)e dans l’extrait de l’(cid:130)chantillon. Seule la hauteur du pic de l’olaquindox doit (cid:136)tre augment(cid:130)e compte tenu de la quantit(cid:130) ajout(cid:130)e et de la dissolution de l’extrait. La largeur du pic (cid:133) mi-hauteur, doit se situer (cid:133) 5 10 % de la largeur initiale du pic d’olaquindox de l’extrait de l’(cid:130)chantillon non suppl(cid:130)ment(cid:130). 7. 1. 2. D (cid:130) t e c t i o n p a r b a r r e t t e s d e d i o d e s (cid:144)valuer les r(cid:130)sultats conform(cid:130)ment aux crit(cid:138)res suivants: a) la longueur d’onde d’absorption maximale des spectres de l’(cid:130)chantillon et de l’(cid:130)talon, enregistr(cid:130)e (cid:133) l’apex du pic sur le chromatogramme doit s’(cid:130)tablir dans une marge d(cid:130)termin(cid:130)e par le pouvoir de r(cid:130)solution du syst(cid:138)me de d(cid:130)tection. Il est g(cid:130)n(cid:130)ralement de 5 2 nm; L 257/28 FR Journal officiel des Communaut(cid:130)s europ(cid:130)ennes 19. 9. 98 b) entre 220 et 400 nm, les spectres de l’(cid:130)chantillon et de l’(cid:130)talon enregistr(cid:130)s (cid:133) l’apex du pic du chromatogramme, ne doivent pas (cid:136)tre diff(cid:130)rents pour les parties du spectre situ(cid:130)es entre 10 et 100 % de l’absorbance relative. Ce crit(cid:138)re est rempli lorsque les m(cid:136)mes maxima sont pr(cid:130)sents et que, nulle part, l’(cid:130)cart observ(cid:130) entre les spectres ne d(cid:130)passe 15 % de la densit(cid:130) optique du spectre au sommet du pic; c) entre 220 en 400 nm, les spectres de la courbe ascendante, de l’apex et de la courbe descendante du pic produits par l’extrait de l’(cid:130)chantillon ne doivent pas (cid:136)tre diff(cid:130)rents les uns des autres pour les parties du spectre situ(cid:130)es entre 10 et 100 % de l’absorbance relative. Ce crit(cid:138)re est rempli lorsque les m(cid:136)mes maxima sont pr(cid:130)sents et qu’en tous point observ(cid:130)s, la d(cid:130)viation entre les spectres ne d(cid:130)passe pas 15 % de l’absorbance du spectre de l’apex du pic. Si l’un de ces crit(cid:138)res n’est pas rempli, la pr(cid:130)sence de l’analyte n’est pas confirm(cid:130)e. 7. 2. R(cid:130)p(cid:130)tabilit(cid:130) La diff(cid:130)rence entre les r(cid:130)sultats de deux dosages parall(cid:138)les effectu(cid:130)s sur le m(cid:136)me (cid:130)chantillon ne doit pas d(cid:130)passer 15 % du r(cid:130)sultat sup(cid:130)rieur pour les teneurs en olaquindox entre 10 et 200 mg/kg. 7. 3. Rendement Pour un (cid:130)chantillon suppl(cid:130)ment(cid:130), le rendement doit (cid:136)tre au moins de 90 %. 8. R(cid:130)sultats d’une (cid:130)tude interlaboratoire Une (cid:130)tude interlaboratoire communautaire a (cid:130)t(cid:130) organis(cid:130)e au cours de laquelle 4 (cid:130)chantillons d’aliment pour porcelets, y compris un aliment t(cid:130)moin ont (cid:130)t(cid:130) analys(cid:130)s par 13 laboratoires. Les r(cid:130)sultats de l’(cid:130)tude figurent ci-apr(cid:138)s: L n moyenne [mg/kg] Sr [mg/kg] [mg/kg] S R CVr [%] [%] CV R Contenu nominal [mg/kg] rendement (%) (cid:144)chantillon 1 (cid:144)chantillon 2 (cid:144)chantillon 3 (cid:144)chantillon 4 13 40 (cid:190) (cid:190) (cid:190) (cid:190) (cid:190) (cid:190) (cid:190) 10 40 14,6 0,82 1,62 5,6 11,1 15 97,3 11 44 48,0 2,05 4,28 4,3 8,9 50 96,0 11 44 95,4 6,36 8,42 6,7 8,8 100 95,4 : nombre de laboratoires L : nombre de valeurs individuelles n S : (cid:130)cart type de la r(cid:130)p(cid:130)tabilit(cid:130) r : (cid:130)cart type de la reproductibilit(cid:130) SR CV : coefficient de variation de l’(cid:130)cart type de la r(cid:130)p(cid:130)tabilit(cid:130) CVR : coefficient de variation de l’(cid:130)cart type de la reproductibilit(cid:130). r 9. Observation Bien que la m(cid:130)thode n’ait pas (cid:130)t(cid:130) valid(cid:130)e pour les aliments contenant plus de 100 mg/kg d’olaquindox, on peut obtenir des r(cid:130)sultats satisfaisants en utilisant une prise d’essai plus faible et/ou en diluant l’extrait (5. 2) de fa(cid:135)on telle que sa concentration se situe dans la zone de la courbe de calibration (5. 3. 2)


title: Kommissionens forordning (EF) nr. 1891/98 af 3. september 1998 om fastsættelse af landbrugsomregningskurserne for visse støtteforanstaltninger i Det Forenede Kongerige og Sverige og de heraf følgende lofter over udligningsstøtten

eurovoc_concepts:
EU aid
Sweden
United Kingdom
aid to agriculture
monetary compensatory amount
representative rate

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text: L 245/30 DA De Europæiske Fællesskabers Tidende 4. 9. 98 KOMMISSIONENS FORORDNING (EF) Nr. 1891/98 af 3. september 1998 om fastsættelse af landbrugsomregningskurserne for visse støtteforanstaltninger i Det Forenede Kongerige og Sverige og de heraf følgende lofter over udlignings- støtten KOMMISSIONEN FOR DE EUROPÆISKE FÆLLESSKABER HAR (cid:190) under henvisning til Europæiske Fællesskab, traktaten om oprettelse af Det under henvisning til R(cid:134)dets forordning (EØF) nr. 724/97 af 22. april 1997 om foranstaltninger og udligning i forbindelse med væsentlige revalueringer, der p(cid:134)virker landbrugsindkomsterne (1), ændret ved forordning (EF) nr. 942/98 (2), særlig artikel 7, og ud fra følgende betragtninger: Efter artikel 3, stk. 1, første afsnit, i forordning (EF) nr. 724/97 nedsættes landbrugsomregningskurserne for støt- teforanstaltningerne i artikel 7 i R(cid:134)dets forordning (EØF) nr. 3813/92 af 28. december 1992 om den regningsenhed og de omregningskurser, der skal anvendes i den fælles landbrugspolitik (3), senest ændret ved forordning (EF) nr. 150/95 (4), med hensyn til pund sterling og den svenske krone ikke som følge af væsentlige revalueringer af de p(cid:134)gældende valutaer; i artikel 3, stk. 1, andet afsnit, i forordning (EF) nr. 724/97 er der dog fastsat en nedsæt- telse af landbrugsomregningskursen for en af støtteforan- staltningerne i artikel 7 i forordning (EØF) nr. 3813/92, n(cid:134)r landbrugsomregningskursen p(cid:134) grund af foranstalt- ninger, der er truffet efter en væsentlig revaluering, over- stiger den gældende landbrugsomregningskurs med mere end 11,5 %; i s(cid:134) tilfælde er den landbrugsomregnings- kurs, der skal anvendes, lig med den gældende landbrugs- omregningskurs forhøjet med 11,5 %; landbrugsomregningskurserne for pund sterling og den svenske krone for nogle af støtteforanstaltningerne i artikel 7 i forordning (EØF) nr. 3813/92 blev nedsat fra den 1. juli 1998 for at undg(cid:134) forskelle p(cid:134) over 11,5 % fra de landbrugsomregningskurser, der var gældende p(cid:134) nævnte dato; for at lette administrationen af de p(cid:134)gæl- dende støtteforanstaltninger bør de landbrugsomregnings- kurser, der gælder for dem fra den 1. juli 1998, specifi- ceres og fastsættes; i artikel 4, stk. 2, i forordning (EF) nr. 724/97 er der fastsat udligning af virkningerne af nedsættelsen af landbrugs- omregningskurserne for støtteforanstaltningerne i artikel i Kommissionens 7 i forordning (EF) nr. 805/97 af 2. maj 1997 om gennemfø- relsesbestemmelser for udligning som følge af væsentlige revalueringer (5), senest ændret ved forordning (EF) nr. forordning (EØF) nr. 3813/92; (1) EFT L 108 af 25. 4. 1997, s. 9. (2) EFT L 132 af 6. 5. 1998, s. 1. (3) EFT L 387 af 31. 12. 1992, s. 1. (4) EFT L 22 af 31. 1. 1995, s. 1. (5) EFT L 115 af 3. 5. 1997, s. 13. 1425/98 (6), er der fastsat supplerende beløb for udlig- ningsstøtte ud over nævnte udligning; loftet over det supplerende beløb af første rate af udligningsstøtten for nedsættelsen af støtten i artikel 7 i forordning (EØF) nr. 3813/92, for hvilken den udløsende begivenhed fandt sted den 1. juli 1998, bør fastsættes for Det Forenede Konge- rige og Sverige; de i denne forordning fastsatte foranstaltninger er i over- ensstemmelse med udtalelse fra alle de berørte forvalt- ningskomit(cid:130)er (cid:190) UDSTEDT FØLGENDE FORORDNING: Artikel 1 1. Den landbrugsomregningskurs p(cid:134) 1 ECU = 0,803724 pund sterling, der den 30. juni 1998 var gældende for støtteforanstaltningerne i artikel 7 i forord- ning (EØF) nr. 3813/92, for hvilke den udløsende begi- venhed fandt sted den 1. juli 1998, erstattes fra sidst- nævnte dato med landbrugsomregningskursen p(cid:134) 1 ECU = 0,755249 pund sterling for de berørte støtteforanstalt- ninger. 2. Den landbrugsomregningskurs p(cid:134) 1 ECU = 9,90747 svenske kroner, der den 30. juni 1998 var gældende for støtteforanstaltningerne i artikel 7 i forordning (EF) nr. 3813/92, for hvilke den udløsende begivenhed fandt sted den 1. juli 1998, erstattes fra sidstnævnte dato med land- brugsomregningskursen p(cid:134) 1 ECU = 9,80430 svenske kroner for de berørte støtteforanstaltninger. Artikel 2 1. Loftet over det supplerende beløb af første rate af udligningsstøtten, der kan ydes som følge af nedsættelse af landbrugsomregningskursen som omhandlet i artikel 1, stk. 1, er 110,98 mio. ECU for Det Forenede Kongerige. 2. Loftet over det supplerende beløb af første rate af udligningsstøtten, der kan ydes som følge af nedsættelsen af landbrugsomregningskursen som omhandlet i artikel 1, stk. 2, er 4,43 mio. ECU for Sverige. Artikel 3 Denne forordning træder i kraft p(cid:134) syvendedagen efter offentliggørelsen i De Europæiske Fællesskabers Tidende. (6) EFT L 190 af 4. 7. 1998, s. 16. 4. 9. 98 DA De Europæiske Fællesskabers Tidende L 245/31 Denne forordning er bindende i alle enkeltheder og gælder umiddelbart medlemsstat. i hver Udfærdiget i Bruxelles, den 3. september 1998. P(cid:134) Kommissionens vegne Franz FISCHLER Medlem af Kommissionen


title: Κανονισμός (ΕΚ) αριθ. 1890/98 της Επιτροπής της 3ης Σεπτεμβρίου 1998 για την τροποποίηση του κανονισμού (ΕΚ) αριθ. 1780/97 για τον καθορισμό των λεπτομερειών εφαρμογής του κανονισμού (ΕΚ) αριθ. 723/97 του Συμβουλίου για την υλοποίηση των προγραμμάτων δράσης των κρατών μελών στον τομέα των ελέγχων των δαπανών του ΕΓΤΠΕ, τμήμα Εγγυήσεων

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agricultural expenditure
aid to agriculture

text: L 245/28 EL Ep(cid:148)sglg Evgleq(cid:148)da tym Euqypa(cid:152)j(cid:150)m Joimot(cid:147)tym 4. 9. 98 JAMOMISLOS (EJ) aqih. 1890/98 TGS EPITQOPGS tgr 3gr Septelbq(cid:148)ou 1998 cia tgm tqopopo(cid:148)gsg tou jamomislo(cid:151) (EJ) aqih. 1780/97 cia tom jahoqisl(cid:149) tym keptole- qei(cid:150)m evaqloc(cid:147)r tou jamomislo(cid:151) (EJ) aqih. 723/97 tou Sulbouk(cid:148)ou cia tgm ukopo(cid:148)gsg tym pqocqall(cid:145)tym dq(cid:145)sgr tym jqat(cid:150)m lek(cid:150)m stom tol(cid:146)a tym ek(cid:146)cwym tym dapam(cid:150)m tou ECTPE, tl(cid:147)la Eccu(cid:147)seym G EPITQOPG TYM EUQYPA(cid:136)JYM JOIMOTGTYM, (cid:130)womtar up(cid:149)xg: tg sumh(cid:147)jg cia tgm (cid:148)dqusg tgr Euqypa(cid:152)j(cid:147)r Joim(cid:149)tgtar, tom jamomisl(cid:149) (EJ) aqih. 723/97 tou Sulbouk(cid:148)ou, tgr 22ar Apqik(cid:148)ou 1997, cia tgm ukopo(cid:148)gsg tym pqocqall(cid:145)tym dq(cid:145)sgr tym jqat(cid:150)m lek(cid:150)m stom tol(cid:146)a tym ek(cid:146)cwym tym dapam(cid:150)m tou ECTPE, tl(cid:147)la eccu(cid:147)seym (1), jai id(cid:148)yr to (cid:145)qhqo 6, Ejtil(cid:150)mtar: (cid:149)ti o jamomisl(cid:149)r (EJ) aqih. 1780/97 tgr Epitqop(cid:147)r (2), pou jahoq(cid:148)fei tir keptol(cid:146)qeier evaqloc(cid:147)r tou jamomislo(cid:151) (EJ) aqih. 723/97, hesp(cid:148)fei letan(cid:151) (cid:145)kkym sta (cid:145)qhqa 2 jai 3 tom tq(cid:149)po jai tir pqohesl(cid:148)er pkgqyl(cid:147)r tgr joimotij(cid:147)r wqgla- tij(cid:147)r sulletow(cid:147)r sta jq(cid:145)tg l(cid:146)kg· (cid:149)ti o tq(cid:149)por pou pqo- bk(cid:146)petai cia ev(cid:145)pan et(cid:147)sia pkgqyl(cid:147) pou peqikalb(cid:145)mei to up(cid:149)koipo tou pqogcoul(cid:146)mou (cid:146)tour jai tgm pqojatabok(cid:147) tou epol(cid:146)mou (cid:146)tour diapist(cid:150)hgje (cid:149)ti e(cid:148)mai d(cid:151)sjoko ma evaqloshe(cid:148) stgm pq(cid:145)ng jai epipk(cid:146)om dem kalb(cid:145)mei up(cid:149)xg tir pist(cid:150)seir pou emejq(cid:148)hgsam cia to ep(cid:149)lemo (cid:146)tor ap(cid:149) tgm aql(cid:149)dia aqw(cid:147) tou pqo(cid:153)pokocislo(cid:151)· (cid:149)ti cia ma bektiyhe(cid:148) g diawe(cid:148)qisg tym l(cid:146)tqym, oi pqojato- bok(cid:146)r pou ha pkgqyho(cid:151)m sta jq(cid:145)tg l(cid:146)kg s(cid:151)lvyma le to (cid:145)qhqo 7 tou jamomislo(cid:151) (EJ) aqih. 269/96 tgr Epi- tqop(cid:147)r (3), (cid:149)pyr tqopopoi(cid:147)hgje tekeuta(cid:148)a ap(cid:149) tom jamomi- sl(cid:149) (EJ) aqih. 1391/97 (4), dem lpoqo(cid:151)m ma avaiqeho(cid:151)m ap(cid:149) ta pos(cid:145) pou dem wqgsilopoi(cid:147)hgjam jat(cid:145) tom pqogco(cid:151)lemo wq(cid:149)mo akk(cid:145) aut(cid:145) pou dem wqgsilopoi(cid:147)hgjam tom pqopeqa- sl(cid:146)mo wq(cid:149)mo jai epipk(cid:146)om o jahoqisl(cid:149)r tou lec(cid:148)stou poso(cid:151) tgr wqglatij(cid:147)r sulletow(cid:147)r tgr Joim(cid:149)tgtar dem lpo- qe(cid:148) ma c(cid:148)mei pqim ecjqiho(cid:151)m oi pist(cid:150)seir ap(cid:149) tgm aqw(cid:147) tou pqo(cid:153)pokocislo(cid:151)· (cid:149)ti ta l(cid:146)tqa pou pqobk(cid:146)pomtai stom paq(cid:149)mta jamomisl(cid:149) e(cid:148)mai s(cid:151)lvyma le tg cm(cid:150)lg tgr epitqop(cid:147)r tou ECTPE, ENEDYSE TOM PAQOMTA JAMOMISLO: (cid:129)qhqo 1 de(cid:151)teqou l(cid:147)ma pou (cid:146)petai tgr gleqolgm(cid:148)ar h(cid:146)sgr se isw(cid:151) tou paq(cid:149)mtor jamomislo(cid:151). L(cid:149)mom oi dap(cid:145)mer pou pqaclatopoi(cid:147)hgjam let(cid:145) tgm 1g Iamouaq(cid:148)ou 1997 e(cid:148)mai epik(cid:146)niler cia sucwqglatod(cid:149)tgsg ap(cid:149) tgm Joim(cid:149)tgta. Cia ta ep(cid:149)lema (cid:146)tg ta pqocq(cid:145)llata dq(cid:145)sgr upob(cid:145)kko- mtai s(cid:151)lvyma le tg diadijas(cid:148)a pou pqobk(cid:146)petai sto (cid:145)qhqo 2 paq(cid:145)cqavoi 1 jai 2 tou pqoamaveqh(cid:146)mtor jamo- mislo(cid:151). Oi ejtil(cid:147)seir jataqt(cid:148)fomtai s(cid:151)lvyma le tom p(cid:148)maja tou paqaqt(cid:147)lator. 2. Jat(cid:145) tg di(cid:145)qjeia tou lgm(cid:149)r pou (cid:146)petai tgr ecjq(cid:148)- seyr tou cemijo(cid:151) pqo(cid:153)pokocislo(cid:151) tym Euqypa(cid:152)j(cid:150)m Joi- mot(cid:147)tym cia to swetij(cid:149) oijomolij(cid:149) (cid:146)tor, g Epitqop(cid:147) jahoq(cid:148)fei, le b(cid:145)sg tir paqaswehe(cid:148)ser pkgqovoq(cid:148)er ap(cid:149) ta jq(cid:145)tg l(cid:146)kg, to l(cid:146)cisto pos(cid:149) tgr wqglatodotij(cid:147)r sulletow(cid:147)r tgr Joim(cid:149)tgtar, ejvqaf(cid:149)lemo sto m(cid:149)lisla j(cid:145)he jq(cid:145)tour l(cid:146)kour. G Epitqop(cid:147) emgleq(cid:150)mei ta emdiaveq(cid:149)lema jq(cid:145)tg l(cid:146)kg swetij(cid:145) le j(cid:145)he dap(cid:145)mg pou dem c(cid:148)metai apodejt(cid:147) cia joimotij(cid:147) wqglatod(cid:149)tgsg jah(cid:150)r jai cia tour k(cid:149)cour tgr apoqq(cid:148)xeyr. 3. To aqc(cid:149)teqo (cid:146)yr tir 31 La(cid:155)ou j(cid:145)he (cid:146)tour, jq(cid:145)tor l(cid:146)kor upob(cid:145)kkei stgm Epitqop(cid:147) l(cid:148)a d(cid:147)kysg tym dapam(cid:150)m pou pkgq(cid:150)hgjam jat(cid:145) tg di(cid:145)qjeia tou pqog- co(cid:151)lemou gleqokociajo(cid:151) (cid:146)tour. To l(cid:146)cisto pos(cid:149) tgr wqglatodotij(cid:147)r sulletow(cid:147)r tgr Joim(cid:149)tgtar, pou jaho- q(cid:148)fetai (cid:149)pyr pqobk(cid:146)petai sto (cid:145)qhqo 4 paq(cid:145)cqavor 2 tou pqoamaveqh(cid:146)mtor jamomislo(cid:151), evaql(cid:149)fetai se aut(cid:147) tg dap(cid:145)mg jai peqioq(cid:148)fetai sta pos(cid:145) pou upobk(cid:147)hgjam sta pqocq(cid:145)llata dq(cid:145)sgr jai pou dem heyq(cid:147)hgjam lg epik(cid:146)nila ap(cid:149) tgm Epitqop(cid:147). Yst(cid:149)so, cia to 1997 yr pqohesl(cid:148)a cia tgm ejt(cid:146)kesg tym pkgqyl(cid:150)m jahoq(cid:148)fetai g 31g Auco(cid:151)stou 1998, jai g d(cid:147)kysg tym dapam(cid:150)m pou pkgq(cid:150)hgjam pq(cid:146)pei ma peqi(cid:146)khei stgm Epitqop(cid:147) (cid:146)yr tir 31 Ojtybq(cid:148)ou 1998. G d(cid:147)kysg aut(cid:147) sumt(cid:145)ssetai s(cid:151)lvyma le tom p(cid:148)maja tou paqaqt(cid:147)lator. » O jamomisl(cid:149)r (EJ) aqih. 1780/97 tqopopoie(cid:148)tai yr en(cid:147)r: 2. To (cid:145)qhqo 3 amtijah(cid:148)statai ap(cid:149) to aj(cid:149)kouho je(cid:148)lemo: 1. Sto (cid:145)qhqo 2 oi paq(cid:145)cqavoi 1, 2 jai 3 amtijah(cid:148)stamtai ap(cid:149) to aj(cid:149)kouho je(cid:148)lemo: «(cid:129)qhqo 3 «1. Ta jq(cid:145)tg l(cid:146)kg upob(cid:145)kkoum ta pqocq(cid:145)llata dq(cid:145)sgr tour cia to pq(cid:150)to jai de(cid:151)teqo (cid:146)tor evaqloc(cid:147)r tou jamomislo(cid:151) (EJ) aqih. 723/97 pqim ap(cid:149) to t(cid:146)kor tou (1) EE L 108 tgr 25. 4. 1997, s. 6. (2) EE L 252 tgr 16. 9. 1997, s. 20. (3) EE L 39 tgr 17. 2. 1996, s. 5. (4) EE L 190 tgr 19. 7. 1997, s. 20. To l(cid:146)cisto pos(cid:149), pou jahoq(cid:148)fetai (cid:149)pyr pqobk(cid:146)petai sto (cid:145)qhqo 4 paq(cid:145)cqavor 2 tou jamomislo(cid:151) (EJ) aqih. 723/97, ap(cid:149) to opo(cid:148)o avaiqe(cid:148)tai opoiod(cid:147)pote pos(cid:149) dem (cid:146)wei wqgsilopoighe(cid:148) jai (cid:146)wei pkgqyhe(cid:148) jat(cid:145) tom pqope- qasl(cid:146)mo wq(cid:149)mo, heyqe(cid:148)tai yr dap(cid:145)mg pou pqobk(cid:146)petai sto (cid:145)qhqo 7 tou jamomislo(cid:151) (EJ) aqih. 296/96 cia to l(cid:147)ma jat(cid:145) tom opo(cid:148)o jahoq(cid:148)stgje ap(cid:149) tgm Epitqop(cid:147). » 4. 9. 98 EL Ep(cid:148)sglg Evgleq(cid:148)da tym Euqypa(cid:152)j(cid:150)m Joimot(cid:147)tym L 245/29 3. Pqost(cid:148)hetai to aj(cid:149)kouho (cid:145)qhqo 3a: «(cid:129)qhqo 3a 4. G k(cid:146)ng «pqaclatopoigho(cid:151)m» tgr tekeuta(cid:148)ar paqacq(cid:145)- vou stoiwe(cid:148)o 5 tou paqaqt(cid:147)lator tou jamomislo(cid:151) amti- jah(cid:148)statai ap(cid:149) tg k(cid:146)ng «pkgqyho(cid:151)m». Cia ta d(cid:151)o tekeuta(cid:148)a wq(cid:149)mia evaqloc(cid:147)r tou paq(cid:149)mtor jamomislo(cid:151) to lg wqgsilopoigh(cid:146)m pos(cid:149) jatab(cid:145)kketai sto ECTPE stgm jat(cid:145)kkgkg h(cid:146)sg tou pqo(cid:153)pokocislo(cid:151), sta pka(cid:148)sia tym dapam(cid:150)m tou lgm(cid:149)r Ioum(cid:148)ou tou oijomo- lijo(cid:151) (cid:146)tour pou (cid:146)petai tou (cid:146)tour tgr evaqloc(cid:147)r. » (cid:129)qhqo 2 O paq(cid:150)m jamomisl(cid:149)r aqw(cid:148)fei ma isw(cid:151)ei tgm tq(cid:148)tg gl(cid:146)qa ap(cid:149) tg dglos(cid:148)eus(cid:147) tou stgm Ep(cid:148)sglg Evgleq(cid:148)da tym Euqy- pa(cid:152)j(cid:150)m Joimot(cid:147)tym. O paq(cid:150)m jamomisl(cid:149)r e(cid:148)mai desleutij(cid:149)r yr pqor (cid:149)ka ta l(cid:146)qg tou jai isw(cid:151)ei (cid:145)lesa se j(cid:145)he jq(cid:145)tor l(cid:146)kor. Bqun(cid:146)kker, 3 Septelbq(cid:148)ou 1998. Cia tgm Epitqop(cid:147) Franz FISCHLER L(cid:146)kor tgr Epitqop(cid:147)r