title: Id-Direttiva tal-Kummissjoni 98/64/KE tat-3 ta’ Settembru 1998 li jistabbilixxi metodi ta’ analiżi tal-Komunità għad-determinazzjoni ta’ amino-aċidi, żjut mhux raffinati u xaħmijiet, u olaquindox fl-għalf u li temenda d-Direttiva 71/393/KEETest b’relevanza għaż- ŻEE

eurovoc_concepts:
analytical chemistry
animal nutrition
fats
food inspection
organic acid

text: 03/Vol. 23 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 433 31998L0064 L 257/14 IL-ĠURNAL UFFIĊJALI TAL-KOMUNITAJIET EWROPEJ 19. 9. 1998 ID-DIRETTIVA TAL-KUMMISSJONI 98/64/KE tat-3 ta’ Settembru 1998 li jistabbilixxi metodi ta’ analiżi tal-Komunità għad-determinazzjoni ta’ amino-aċidi, żjut mhux raffinati u xaħmijiet, u olaquindox fl-għalf u li temenda d-Direttiva 71/393/KEE (Test b’relevanza għaż- ŻEE) IL-KUMMISSJONI TAL-KOMUNITAJIET EWROPEJ, Billi l-metodi tal-Komunità ta’ analiżi għandhom jiġu stabbiliti sabiex jiġu ċċekkjati dawn is-sustanzi; li kkunsidrat Wara Ewropea, it-Trattat li jistabbilixxi il-Komunità Wara li kkunsidrat id-Direttiva tal-Kunsill 71/373/KEE ta’ l-20 ta’ Lulju 1970 dwar l-introduzzjoni ta’ metodi tal-Komunità ta’ kampjunar u analiżi għall-kontroll uffiċjali l-għalf (1), kif emendat l-aħħar bl-Att ta’ Adeżjoni ta’ l-Awstrija, il-Fillandja u l-Isvezja, u b’mod partikolari l-Artikolu 2 tiegħu, ta’ Billi d-Direttiva 70/373/KEE tistipula kontrolli uffiċċjali ta’ konformità mal-ħtiġijiet li dispożizzjonijiet komposizzjoni kampjunar u analiżi; li għandhom isiru l-għalf għall-għan li tkun iċċekkjata l- jitqajjmu fil-liġijiet, regolamenti u jirregolaw il-kwalità u tal-Komunità ta’ tagħhom bl-użu ta’ metodi amministrattivi li Billi d-Direttiva tal-Kunsill 79/373/KEE tat-2 ta’ April 1979 il-bejgħ ta’ għalf mħallat (2), emendata l-aħħar bid- dwar Direttiva tal-Kummissjoni 97/47/KE (3), u d-Direttiva tal-Kunsill 93/74/KEE tat-13 ta’ Settembru 1993 dwar l-għalf maħsub għall-għanijiet partikolari emendata bid- l-amino-aċidi u żjut mhux Direttiva 96/25/KE (5), tistipula li raffinati u xaħmijiet għandhom jitqiegħdu fuq it-tikketta ta’ l- għalf; ta’ nutriment (4), Billi d-Direttiva tal-Kunsill 70/524/KEE tat-23 ta’ Novembru 1970 li tikkonċerna l-addittivi fl-għalf (6), emendat l-aħħar bid- Direttiva tal-Kummissjoni 98/19/KE (7), tistipula li l-kontenut ta’ olaquindox għandu jkun indikat fuq it-tikketta fejn din is- sustanza tiżdied mal-komposizzjonijiet ta’ għalf; Billi t-tieni Direttiva tal-Kummissjoni 71/393/KEE tat-18 ta’ Novembru 1971 tistabbilixxi metodi tal-Komunità ta’ analiżi l-għalf (8), kif emendat l-aħħar bid- għall-kontroll uffiċjali ta’ tfassal metodi għall- Direttiva tal-Kummissjoni 84/4/KEE (9), analiżi għal, ta’ żjut mhux id-determinazzjoni inter alia, irraffinati u xaħmijiet; billi huwa xieraq li l-metodu deskritt jinbidel; (1) ĠU L 170, tat-3. 8. 1970, p. 2. (2) ĠU L 86, tas-6. 4. 1979, p. 30. (3) ĠU L 211, tal-5. 8. 1997, p. 45. (4) ĠU L 237, tat-22. 9. 1993, p. 23. (5) ĠU L 125, tat-23. 5. 1996, p. 35. (6) ĠU L 270, ta’ l-14. 12. 1970, p. 1. (7) ĠU L 96, tat-28. 3. 1998, p. 39. (8) ĠU L 279, ta’ l-20. 12. 1971, p. 7. (9) ĠU L 15, tat-18. 1. 1984, p. 28. l-miżuri Billi konformi ma’ l-opinjoni tal-Kumitat Permanenti fuq l-Għalf, li hemm maħsuba f’din id-Direttiva huma ADOTTA DIN ID-DIRETTIVA: Artikolu 1 L-Istati Membri għandhom jaraw li l-analiżi magħmula bi varjeta’ għall-kontrolli uffiċjali għall-kontenut ta’ l-aċidu ammi- niku, ta’ żejt mhux raffinat u xaħam, ta’ olaquindox fl-għalf isiru bl-użu ta’ metodi mfassla fl-Anness li jinsab hawn. Artikolu 2 Fl-Anness tad-Direttiva tal-Kummissjoni 71/393/KEE, punt ‘4. Determinazzjoni ta’ żjut mhux raffinati u xaħmijiet’ jinbidel ma’ parti B ta’ l-anness ta’ din id-Direttiva. Artikolu 3 L-Istati Membri għandhom idaħħlu fis-seħħ il-liġijiet, 1. regolamenti u dispożizzjonijiet amministrattivi meħtieġa sabiex jikkonformaw ma’ din id-Direttiva sal-31 ta’ Dieċmbru 1998. Għandhom jgħarrfu lill-Kummissjoni minnufih dwar dan. Għandhom japplikaw dawn id-dispożizzjonijiet mill-1 ta’ Jannar 1999. jadottaw dawn il-miżuri, għandhom Meta l-Istati Membri ikollhom fihom referenza għal din id-Direttiva jew ikunu akkumpanjati minn din ir-referenza fil-ħin tal-pubblikazzjoni uffiċjali tagħhom. Il-proċedura għat-tali referenza għandha tiġi adottata mill-Istati Membri. 434 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 03/Vol. 23 L-Istati Membri għandhom jibagħtu lill-Kummissjoni t-test 2. tad-dispożizzjonijiet ewlenin tal-liġi domestika li jadottaw fil- qasam regolat minn din id-Direttiva. Din id-Direttiva hija ndirizzata lill-Istati Membri. Artikolu 5 Artikolu 4 Din id-Direttiva għandha tidħol fis-seħħ fl-20 jum wara li tiġi ppubblikata fil-Ġurnal Uffiċjali tal-Komunitajiet Ewropej. Għall-Kummissjoni Franz FISCHLER Membru tal-Kummissjoni Magħmul fi Brussel, 3 ta’ Settembru, 1998. 03/Vol. 23 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 435 L-ANNESS PARTI A DETERMIMAZZJONI TA’ AĊIDI AMMINICI 1. Għan u varjetà Dan il-metodu huwa għad-determinazzjoni ta’ aċidi ħielsa (sintetiċi u naturali) u totali (marbutin peptide u ħielsa) fl-għalf, bl-użu ta’ analizzatur ta’ li ġejjin: cycs(e)ine, methionine, lysine, threonine, alanine, arginine, aċidu aspartiku, aċidu glutamiku, glycine, histidne, isoleucine, leucine, phenylalanine, proline, serine, tyrosine u valine. l-aċidu amminiku. Japplika għall-aċidi amminici Il-metodu ma jiddistingwix bejn l-imluħa ta’ l-aċidi amminici u ma jistax jagħmel distinzjoni bejn il-forom D u L ta’ l-aċidi amminici. M’huwiex validu għad-determinazzjoni ta’ analogi ta’ tryptophan jew hydroxy ta’ aċidi amminici. 2. Prinċipju 2. 1. Aċidi amminiċi ħielsa L-aċidi amminici ħielsa jinħarġu bil-hydrochloric acid mħallat. Macromolecules nitroġeniċi koestratti jiġu ppreċipitati bis-sulfosalicylic acid u jitneħħew billi jiġu ffiltrati. Is-soluzzjoni ffiltrata tiġi aġġustata għal pH 2,20. L-aċidi amminici jiġu sseparati bi kromatografija tat-tip ion exchange u jiġu ddeterminati permezz ta’ reazzjoni man-ninhydrin b’detezzjoni fotometrika f’570 nm. 2. 2. Aċidi amminiċi totali Il-proċedura magħżula tiddependi Is-Cyst(e)ine u l- methionine għandhom jiġu ossidizzati għal cysteic acid u methionine sulphone rispettivament qabel ma ssir l-idrolisi. It-tyrosine għandu jiġi ddeterminat f’hydrolysates ta’ kampjuni mhux ossidizzati. L-aċidi amminiċi l-oħra kollha li huma mniżżlin fil-paragrafu 1 jistgħu jiġi ddeterminati sew fil-kampjun ossidizzat u sew f’dak li m’huwiex ossidizzat. jkunu qegħdin jiġu investigati. fuq l-aċidi amminiċi li L-ossidizzazzjoni ssir f’0 °Ċ b’taħlita ta’ performic acid/phenol. Ir-reaġġent li jkun fadal jitkisser b’dissulfat tas- sodju. Il-kampjun ossidizzat jew mhux ossidizzat jiġi idrolizzat bil-hydrochloric acid (ċ = 6 mol/l) għal 23 siegħa. Il-hydrolysate jiġi aġġustat għal pH 2,20. L-aċidi amminiċi jiġu sseparati bi kromatografija tat-tip ion exchange u jiġu ddeterminati permezz ta’ reazzjoni man-ninhydrin b’detezzjoni fotometrika f’570 nm (440 nm għall- proline). 3. Reaġenti Għandu jintuża ilma ddistillat doppju jew ilma ta’ kwalità ekwivalenti (konduttività: 10 lS). 3. 1. 3. 2. 3. 3. 3. 4. 3. 5. 3. 6. 3. 7. 3. 8. 3. 9. Perossidu ta’ idroġenu, w = 30 %. Aċidu formiku, w = 98-100 %. Phenol. Sodium disulfite Hydroxide tas-sodju: 5-Sulfosalicylic acid dihydrate Hydrochloric acid, densità bejn wieħed u ieħor 1,18 g/ml. tri-Sodium citrate dihydrate. 2,2Y-Thiodiethanol (thiodiglycol). 3. 10. Klorat tas-sodju. 3. 11. Ninhydrin. 3. 12. 3. 13. 3. 14. Żejt ħafif mhux raffinat, jiftaħ jagħli bejn 40-60 °Ċ Norleucine, jew komponent ieħor xieraq għall-użu bħala standard intern. Gass tan-nitroġenu (: 10 ppm ossiġnu). 436 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 03/Vol. 23 3. 15. 1-Octanol. 3. 16. Aċidi amminiċi. 3. 16. 1. Sustanzi standard imniżżlin fil-paragrafu 1. Komponenti puri li ma jkunx fihom ilma jew kristallizzazzjoni. Xott taħt vakum fuq P2O5 jew H2SO4 għal ġimgħa qabel l-użu. 3. 16. 2. Cysteic acid 3. 16. 3. Methionine sulphone. 3. 17. Soluzzjoni ta’ idrossidu tas-sodju, ċ = 7,5 mol/l: Dewweb 300 g NaOH (3. 5) fl-ilma u imla sakemm ikollok litru. 3. 18. Soluzzjoni ta’ idrossidu tas-sodju, ċ = 1 mol/l: Dewweb 40 g NaOH (3. 5) fl-ilma u imla sakemm ikollok litru. 3. 19. Soluzzjoni ta’ formic acid-phenol: Ħallat 889 g formic acid (3. 2) ma’ 111 g ilma u żid 4,73 g phenol (3. 3). 3. 20. Taħlita ta’ hydrolysis, ċ = 6 mol HCl/l li jkun fih 1 g phenol/l: Żid 1 g phenol (3. 3) sa 492 ml HCI (3. 7) u żid bl-ilma sakemm ikollok litru. 3. 21. Taħlita għall-estrazzjoni, ċ = 0,1 mol HCI/l li jkun fih 2 % thiodiglycol: Ħu 8,2 ml HCI (3. 7), żid bejn wieħed u ieħor 900 ml ilma, żid 20 ml thiodiglycol (3. 9) u żid bl-ilma sakemm ikollok litru, (tħallatx 3. 7 u 3. 9 direttament). 3. 22. 5-Sulfosalicylic acid, ß = 6 %: Dewweb 60 g 5-sulfosalicylic acid (3. 6) fl-ilma u imla sakemm ikollok litru. 3. 23. Taħlita għall-ossidizzazzjoni (Performic acid-phenol): Ħallat 0,5 ml perossidu ta’ l-idroġenu (3. 1) ma’ 4. 5 ml soluzzjoni ta’ formic acid-phenol (3. 19) f’tazza żgħira. Poġġi f’inkubatur f’temperatura ta’ bejn 20-30!!! error character !!! Β!!! error character !!! Ί Ċ sabiex tifforma l- performic acid, imbagħad kessaħ f’banju ta’ ilma bis-silġ (15-il minuta) qabel ma żżid mal-kampjun. Attenzjoni: Evita l-kuntatt mal-ġilda u ilbes ilbies protettiv. 3. 24. Citrate buffer, ċ = 0,2 mol Na+/l, pH 2,20: Dewweb 19, 61 g sodium citrate (3. 8), 5 ml thiodiglycol (3. 9), 1 g phenol (3. 3) u 16,50 ml HCl (3. 7) f’bejn wieħed u ieħor 800 ml ilma. Aġġusta l-pH għal 2. 20. Żid bl-ilma sakemm ikollok litru. 3. 25. Elution bufferse, ippreparati skond il-kondizzjonijiet ta’ l-analizzatur użat (4. 9). 3. 26. Reaġent tan-ninhydrin, ippreparat skond il-kondizzjonijiet ta’ l-analizzatur użat (4. 9). 3. 27. Soluzzjonijiet standard ta’ aċidi amminiċi. Dawn isoluzzjonijiet għandhom jitpoġġew taħt temperatura ta’ 5 °C. 3. 27. 1. Soluzzjoni standard ta’ amino aċidi jinkiseb kummerċjalment (3. 16. 1). ċ = 2,5 µmol/ml minn kull wieħed fil-hydrochloric acid. Jista’ 3. 27. 2. Soluzzjoni standard ta’ cysteic acid u methionine sulphone, ċ = 1,25 µmol/ml. Dewweb 0,2115 g cysteic acid (3. 16. 2) u 0,2265 g methionine sulphone (3. 16. 3) f’citrate buffer (3. 24) fi flask iggradwat tal-litru u imla sal-marka bis-citrate buffer. Aħżnu f’temperatura taħt il-5 °Ċ għal mhux aktar minn 12- il xahar. Din is-soluzzjoni ma tinużax jekk is-soluzjoni standard (3. 27. 1) ikun fiha cysteic acid u methionine sulphone. 3. 27. 3. Soluzzjoni standard ta’ l-istandard intern eż. norleucine, ċ = 20 µmol/ml. Dewweb 0,6560 g norleucine (3. 13) f’citrate buffer (3. 24) fi flask iggradwat u imla sa 250 ml bis-citrate buffer. Aħżnu f’temperatura taħt il-5 °Ċ għal mhux aktar minn 6 xhur. 3. 27. 4. Soluzzjoni tal-kalibrazzjoni ta’ aċidi standard amminiċi biex jintużaw ma’ hydrolysates, ċ = 5nmol/50µl cysteic acid u methionine sulphone u ċ = 10 nmµl/50 µl ta’ l-aċidi amminiċi l-oħra. 03/Vol. 23 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 437 Dewweb 2,2 g klorat tas-sodju (3. 10) f’tazza ta’ 100 ml ma’ 30 ml citrate buffer (3,24). Żid 4,00 ml soluzzjoni standard ta’ l-aċidi amminiċi (3. 27. 1), 4,00 ml soluzzjoni standard cysteic acid u methionine sulphone (3. 27. 2) u 0,50 ml soluzzjoni standard ta’ l-istandard intern (3. 27. 3) jekk intuża. Aġġġusta l-pH għal 2,20 bis-sodium hydroxide (3. 18). Ittrasferixxi kwantittivament għal ġo flask gradwat ta’ 50ml u imla sal-marka bis-citrate buffer (3. 24) u ħawwad. Aħżnu f’temperatura taħt il-5 °Ċ għal mhux aktar minn 3 xhur. Ara wkoll l-osservazzjonijiet 9. 1. 3. 27. 5. Soluzzjoni ta’ kalibrazzjoni ippreparati skond il- paragrafu 5. 3. 3. 1. u għall-użu ma’ l-estratti (5. 2). Is-soluzzjoni tal-kalibrazzjoni tiġi ppreparata skond 3. 27. 4 mingħajr il-klorat tas-sodju. l-aċidi standard amminiċi għall-użu mal-hydrolysates ta’ Aħżnu f’temperatura taħt il-5 °Ċ għal mhux aktar minn 3 xhur. 4. Apparat 4. 1. 4. 2. 4. 3. 4. 4. 4. 5. 4. 6. Flask bil-qiegħ tond ta’ 100 jew 250 ml li għandu reflux condenser imwaħħal miegħu. Flixkun tal-ħġieġ borosilicate 100 ml bit-tapp bil-kamin b’kisja ta’ gomma/teflon (eż. Duran, Schott) sabiex jintuża fil-forn. Forn b’ventilazzjoni sfurzata u regolatur tat-temperatura b’eżattezza aqwa minn 5 2 °Ċ. pH-meter (tliet postijiet deċimali). Membrane filter (0,2 µm). Magna ċentrifuga. 4. 7. Evaporatur tat-tip rotary vacuum. 4. 8. 4. 9. Shaker mekkaniku jew oġġett li jħawwad manjetiku. Analizzatur ta’ l-aċidi amminiċi jew apparat HPLC b’kolonna għall-ion exchange, tagħmir għan-ninhydrin, post column derivatization u detettur fotometriku. Il-kolonna timtela b’sulfonated polystyrene resins li huma kapaċi li jisseparaw l-aċidi amminiċi minn xulxin u minn materjali li huma ninhydrin-positive. Iċ-ċirkulazzjoni fit-tubi tal-buffer u tan-ninhydrin hija pprovduta minn pompi li għandhom stabilità ta’ ċirkolazzoni ta’ ± 0,5 % fil-perjodu li jkopri sew it-test tal-kalibrazzjoni standard kif ukoll l-analiżi tal-kampjun. ta’ ftit analizzatturi l-aċidu amminiku, fihom il-hydrolysate għandu B’xi konċentrazzjoni ta’ sodju ta’ ċ = 0,8 mol/l u jkun fih il-formic acid li jifdal mill-istadju ta’ l-ossidazzjoni. Oħrajn ma jagħtux separazzjoni sodisfaċenti ta’ ċerti aċidi amminiċi jekk il-hydrolysate ikun fih wisq aċidu formiku u/ jew konċentrazzjonijiet għoljin ta’ sodium ion. F’dan il-każ il-volum ta’ aċidu jitnaqqas permezz ta’ evaporazzjoni għal bejn wieħed u ieħor 5 ml wara l-hydrolysis u qabel l-aġġustament tal-pH. L-evaporazzjoni għandha ssir f’vakwu f’temperatura massima ta’ 40 °Ċ. jistgħu jintużaw proċeduri li 5. Proċedura 5. 1. Preparament tal-kampjun Il-kampjun jintaħan sabiex jgħaddi minn passatur ta’ 0,5 mm. Kampjuni li għandhom ħafna umdità għandhom jew jitnixxfu bl-arja f’temperatura ta’ mhux aktar minn 50 °Ċ jew jitnixxfu permezz ta’ friża qabel jintaħnu. Kampjuni b’kontenut għoli ta’ xaħam għandhom jiġu estratti b’żejt ħafif mhux raffinat (3. 12) qabel ma jintaħnu. 5. 2. Determinazzjoni ta’ aċidi amminiuċi ħielsa fl-għalf u taħlit li jkun sar minn qabel Iżen sa l-eqreb 0,2 mg ammont xieraq (1-5 g) tal-kampjun ippreparat (5. 1), fi flask koniku u żid 100,0 ml mit-taħlita ta’ l-estrazzjoni (3. 21). Ħawwad it-taħlita għal 60 minuta bl-użu ta’ shaker mekkaniku jew stirrer manjetiku (4. 8). Ħalli s-sediment joqgħod u itfa’ bil-pipetta 10,0 mis-supernatant solution f’tazza ta’ 100 ml. 438 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 03/Vol. 23 Żid 5,0 ml sulfosalicylic acid solution (3. 22), mat-taħwid u kompli ħawwad bl-għajnuna ta’ stirrer manjetiku għal 5 minuti. Iffiltra jew iċċentrifuga s-supernatant sabiex jitneħħa kull preċipitat. Qiegħed 10,0 ml mis-soluzzjoni li tirriżulta ġo tazza ta’ 100 ml u aġġusta l-pH għal 2,20 bl-użu ta’ soluzzjoni ta’ sodium hydroxide (3. 18), ittrasferixxi għal flask volumetriku ta’ volum xieraq bl-użu ta’ citrate buffer (3. 24), u imla sal-marka bil-buffer solution (3. 24). Jekk qiegħed jintuża standard intern, żid 1,00ml mill-istandard intern (3. 27. 3) għal kull 100 ml soluzzjoni finali u imla sal-marka bil-buffer solution (3. 24). Kompli għall-pass tal-kromatografija skond il-paragrafu 5. 4. Jekk l-estratti m’humiex qegħdin jiġu eżaminati, għandhom jinħażnu taħt il-5 °Ċ. 5. 3. Determinazzjoni ta’ l-aċidi amminiċi totali 5. 3. 1. Ossi da zzj on i Iżen sa l-eqreb 0,2 mg minn 0,1 sa 1 g mill-kampjun ippreparat (5. 1) f’: — flask bil-qiegħ tond ta’ 100 ml (4. 1) għall-hydrolysis miftuħ (5. 3. 2. 3) jew, — flask ta’ 250 ml bil-qiegħ tond (4. 1) jekk hi meħtieġa konċentrazzjoni baxxa ta’ sodju (5. 3. 3. 1) jew, — flixkun ta’ 100 ml b’tapp bil-kamin (4. 2), (għall-hydrolysis magħluq 5. 3. 2. 4). Il-porzjon tal-kampjun miżun għandu jkollu kontenut ta’ nitroġenu ta’ bejn wieħed u ieħor 10 mg u kontenut ta’ umdità ta’ mhux aktar minn 100 mg. Qiegħed il-flask/flixkun f’banju ilma bis-silġ u kessaħ sa 0 °Ċ, żid 5 ml mit-taħlita ta’ ossidazzjoni (3. 23) u ħawwad bi spatula tal-ħġieġ bil-ponta mibruma. Issiġilla l-flask/flixkun li fih l-ispatula b’rita li ma jgħaddix arja minnha, qiegħed il-banju bl-ilma bis-silġ li fih ir-reċipjent issiġillat fi friġġ f’temperatura ta’ 0 °Ċ u ħalli għal 16- il siegħa. Wara 16-il siegħa neħħi mill-friġġ u skompona r-reaġent eċċessiv ta’ l-ossidazzjoni biż-żieda ta’ 0,84 g sodium disulfite (3. 4). Ipproċedi għal 5. 3. 2. 1. 5. 3. 2. Idr oli ż i 5. 3. 2. 1. Idroliżi ta’ kampjuni ossidizzati Għall-kampun ossidizzat ippreparat skond 5. 3. 1 żid 25 ml taħlita ta’ idroliżi (3. 20) u oqgħod attent li ma taħsilx xi residwu tal-kampjun li jeħel mal-ġnub tar-reċipjent u ta’ l-ispatula. Skond il-proċedura ta’ idroliżi li qiegħda tintuża, kompli skond 5. 3. 2. 3 jew 5. 3. 2. 4. 5. 3. 2. 2. Idroliżi ta’ kampjuni li m’humiex ossidizzati Iżen fi flask bil-qiegħ tond ta’ 100 ml jew 250 ml (4. 1) jew flixkun ta’ 100 ml bit-tapp bil-kamin (4. 2), sa l- eqreb 0,2 mg, minn 0,1 sa 1 g tal-kampjun ippreparat (5. 1). Il-porzjon miżun tal-kampjun għandu jkollu kontenut ta’ nitroġenu ta’ bejn wieħed u ieħor 10 mg. B’attenzjoni żid 25 ml tat-taħlita ta’ l-idroliżi (3. 20) u ħallat mal-kampjun. Kompli skond jew 5. 3. 2. 3 jew 5. 3. 2. 4. 5. 3. 2. 3. Idroliżi miftuħ Żid 3 żibeġ tal-ħġieġ mat-taħlita fil-flask (ippreparat skond 5. 3. 2. 1 jew 5. 3. 2. 2) u għalli kontinwament taħt reflux għal 23 siegħa. Meta jitlesta l-idroliżi, aħsel il-kondensatur b’ 5 ml citrate buffer (3. 24). Skonnettja l-flask u kessħu f’banju ta’ silġ. Kompli skond 5. 3. 3. 5. 3. 2. 4. Idroliżi magħluq Poġġi l-flixkun li jkun fih it-taħlita ppreparata f’konformità ma’ 5. 3. 2. 1 jew 5. 3. 2. 2 f’forn (4. 3) f’temperatura ta’ 110 °Ċ. Waqt l-ewwel siegħa sabiex tipprevjeni milli tiżdied il-pressjoni (minħabba l-evoluzzjoni ta’ sustanzi li fihom il-gass) u sabiex tipprevjeni xi splużjoni, poġġi t-tapp bil-kamin fuq ir-reċipjent. Tagħlaqx ir-reċipjent bit- tapp. Wara siegħa, għalaq ir-reċipjent bit-tapp u ħallih fil-forn (4. 3) għal 23 siegħa. Meta jitlesta l-idroliżi, neħħi l-flixkun mill-forn, iftaħ it-tapp tal-flixkun b’attenzjoni u poġġi l-flixkun f’banju ta’ ilma bis-silġ. Ħalliħ jiksaħ. Skond il-proċedura għall-aġġustament tal-pH (5. 3. 3), ittrasferixxi kwantittivament il-kontenuti tal-flixkun għal ġo tazza ta’ 250 ml jew flask ta’ 250 ml bil-qiegħ tond bl-użu ta’ citrate buffer (3. 24). Kompli skond 5. 3. 3. 5. 3. 3. A ġ ġ u stame nt ta l-p H Skond it-tolleranza tas-sodju ta’ l-analizzatur ta’ l-aċidi amminiċi (4. 9) kompli skond 5. 3. 3. 1 jew 5. 3. 3. 2 għall- aġġustament tal-pH. 5. 3. 3. 1. Għal sistemi kromatografiċi (4. 9) li jeħtieġu konċentrazzjoni baxxa tas-sodju: Huwa rrakkomandat li tintuża soluzzjoni standard interna (3. 27. 3) meta jintużaw l-analizzaturi ta’ amminiċi li jeħtieġu konċentrazzjoni baxxa tas-sodju (meta l-volum ta’ l-aċidu jkollu jitnaqqas). l-aċidi 03/Vol. 23 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 439 F’dan il-każ, żid 2,00 ml mis-soluzzjoni standard interna (3. 27. 3) mal-hydrolysate qabel l-evaporazzjoni. Żid 2 qatriet ta’ octanol (3. 15) mal-hydrolysate miksub f’konformità mal-paragrafu 5. 3. 2. 3 jew 5. 3. 2. 4. Bl-użu ta’ rotary evaporator (4. 7) naqqas il-volum sa 5-10 ml f’vakwu f’temperatura ta’ 40 °Ċ. Jekk il-volum aċċidentalment jitnaqqas għal inqas minn 5 ml il-hydrolysate għandu jintrema u l-analiżi terġa’ tibda. Aġġusta l-pH għal 2,20 bis-soluzzjoni ta’ idrossidu tas-sodju (3. 18) u kompli għall-paragrafu 5. 3. 4. 5. 3. 3. 2. Għall-Analizzaturi ta’ Aċidi Amminiċi l-oħrajn kollha (4. 9) Ħu l-hydrolysates miksuba f’konformità ma’ 5. 3. 2. 3 jew 5. 3. 2. 4 u nnewtralizzahom parzjalment billi żżid filwaqt li tħawwad b’attenzjoni, 17-il ml soluzzjoni ta’ l-idrossidu tas-sodju (3. 17) filwaqt li tiżgura li t-temperatura tinżamm taħt 40°Ċ. Aġġusta l-pH għal 2,20 f’temperatura ambjentali bl-użu tas-soluzzjoni ta’ idrossidu tas-sodju (3. 17) u finalment soluzzjoni ta’ idrossidu tas-sodju (3. 18). Kompli għal 5. 3. 4. 5. 3. 4. Ka mpj u n ta ’ solu zz j oni g ħ all-kromatog ra fi ja Ittrasferixxi kwantittivament il-hydrolysate bil-pH aġġustat (5. 3. 3. 1 jew 5. 3. 3. 2) bis-citrate buffer (3. 24) għal ġo flask iggradwat ta’ 200 ml, u imla sal-marka bil-buffer (3. 24). Jekk ma intużax diġà standard intern, żid 2,00 ml standard inter (3. 27. 3) u imla sal-marka bis-citrate buffer (3. 24). Ħawwad sew. Kompli għall-istadju tal-kromatografija (5. 4). Jekk il-kamjuni tas-soluzzjonijeit m’humiex ser jiġu eżaminati dakinhar stess għandhom jinħażnu taħt il-5 °Ċ. 5. 4. Kromatografija Qabel il-kromatografija ġib l-estratt (5. 2) jew tal-hydrolysate (5. 3. 4) għal temperatura ambjentali. Ħawwad it- taħlita u ffiltra ammont xieraq minn membrane filter ta’ 0,2 µm (4. 5). Is-soluzzjoni ċara li tirriżulta tiġi suġġetta għal kromatografija tat-tip ion exchange bl-użu ta’ analizzatur ta’ l-aċidu amminiku (4. 9). L-injezzjoni tista’ ssir b’mod manwali jew awtomatiku. Huwa importanti li tiżdid l-istess kwantità tas-soluzzjoni l-istandards u kampjuni ħlief meta jintuża standard intern, u li 5 0,5 % mal-kolonna għall-analiżi ta’ l- proporzjonijiet ta’ sodju:aċidu amminiku fis-soluzzjonijiet standard u kampjuni huma simili kemm jista’ jkun. B’mod ġenerali, il-frekwenza tar-runs tal-kalibrazzjoni tiddependi fuq l-istabilità tar-reaġent tan-ninhydrin u s- sistema analitika. L-istandard jew il-kampjun jiġi dilwit bis-citrate buffer (3. 24) sabiex jagħti erja tal-quċċata ta’ l- istandard ta’ 30-200 % ta’ l-erja tal-quċċata tal-kampjun ta’ l-aċidu amminiku. l-aċidi amminiċi Is-sistema Il-kromatografija ta’ magħżula għandha tkun kapaċi li tissepara l-aċidi miniċi minn xulxin u mill-materjali li huma posittivi fin- ninhydrin. Fil-varjetà ta’ ħidma, is-sistema kromatografika għandha tagħti rispons lineari lit-tibdil fl-ammonti ta’ aċidi amminiċi miżjuda mal-kolonna. l-analizzatur u r-reżina wżati. tvarja ftit skond it-tip ta’ Waqt l-istadju tal-kromatografija japplikaw il-proporzjonijiet ta’ wied:quċċata msemmija hawn taħt, meta tiġi analizzata soluzzjoni ekwimolari (ta’ l-aċidi amminiċi li qegħdin jiġu ddeterminati). Is-soluzzjoni ekwimolari għandha jkollha mill-inqas 30 % tat-tagħbija massima ta’ kull aċidu amminiku li jista’ jitkejjel b’mod preċiż bis- sistema ta’ l-analizzatur ta’ l-aċidu amminiku(4. 9). Għas-separazzjoni tat-threonine-serine l-proporzjon tal-wied:quċċata ta’ li huma overlapping fuq il-kromatogram ma għandux ikun aktar minn 2:10 (jekk huma ddeterminati biss is- insuffiċjenti minn qċaċet qrib xulxin tinfluwenza d- threonine u lysine, separazzjoni cyst(e)ine, methionine, l-oħra kollha s-separazzjoni għandha tkun aħjar minn determinazzjoni b’mod ħażin). Għall-aċidi amminiċi 1:10. l-anqas minn żewġ aċidi amminiċi Is-sistema għandha tiżgura li l-lysine huwa sseparat mill-‘lysine artifacts u ornithine. 6. Kalkulazzjoni tar-riżultati L-erja tal-kampjun u l-qċaċet standard titkejjel għal kull aċidu amminiku individwali u jiġi kkalkulat l-ammont, fi g aċidu amminiku għal kull kg kampjun. g aċidu amminiku għal kull kg kampjun ¼ A x E x MW x F B x W x 1 000 Jekk jintuża standard intern immultiplika b’: D C 440 MT A B C D Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 03/Vol. 23 = erja ta’ quċċata, hydrolysate jew estratt = erja ta’ quċċata, soluzzjoni standard ta’ kalibrazzjoni = erja ta’ quċċata, standard intern f’hydrolysate jew estratt = erja ta’ quċċata, standard intern, soluzzjoni ta’ kalibrazzjoni standard MW = piż molekulari ta’ l-aċidu amminiku li qiegħed jiġi ddeterminat E = konċentrazzjoni ta’ standard f’lmol/ml W = piż tal-kampjun (g) (ikkoreġut għall-piż oriġinali jekk huwa mnixxef jew bix-xaħam imneħħi) F = ml hydrolysaet totali (5. 3. 4) jew kalkulazzjoni ml tal-volum ta’l-estratt totali dilwit (6. 1). Is-Cystine u s-cysteine t-tnejn li huma huma ddeterminati bħala cicteic acid fil-hydrolysates ta’ kampjun ossidizzat, iżda huma kkalkulati bħala cyctine (C6H12N2O4S2, MW 240,30 billi jintuża MW 120,15 (= 0,5 x 240,30). Il-methionine huwa ddeterminat bħala methionine sulphone f’hydrolysates ta’ kampjun ossidizzat iżda kkalkulat bħala methionine billi jintuża MW tal-methionine: 149,21. Methionine ħieles miżjud huwa ddeterminat wara l-estrazzjoni bħala methionine, għall-kalkulazzjoni jintuża l- istess MW. 6. 1. Il-volum totali dilwit ta’ estratti (F) għad-determinazzjoni ta’ aċidi amminiċi ħielsa (5. 2) ikkalkulat kif ġej: F ¼ 100 ml x ð Þ 10 ml þ 5 ml 10 ml x V ml 10 ml V = volum ta’ estratt finali 7. Evalwazzjoni tal-metodu Il-metodu ġie ittestjat meta pparagunat f’livell internazzjoni fl-1990 billi intużaw erba’ tipi differenti ta’ għalf (għalf tal-majjali mħallat, komposizzjoni tal-brojlers, konċentrazzjoni ta’ proteini,taħlit minn qabel). Ir-riżultati, wara eliminazzjoni ta’ dawk li jvarjaw ħafna, ta’ devjazzjoni medja u standard jingħataw fil-werrej ta’ hawn taħt: Medji f’g/kg Materjal Għalf tal-majjali mħallat Komposizzjoni tal-brojlers Konċentrat ta’ proteini Taħlit minn qabel Aċidu amminiku Threonine Cyst(e)ine Methionine Lysine 6,94 n = 15 9,31 n = 16 22,32 n = 16 58,42 n = 16 3,01 n = 17 3,92 n = 18 5,06 n = 17 __ 3,27 n = 17 5,08 n = 18 12,01 n = 17 90,21 n = 16 9,55 n = 13 13,93 n = 16 47,74 n = 15 98,03 n = 16 n = numru ta’ laborotorji parteċipanti 7. 1. Ripetittività Ir-ripetittività espressa bħala ‘fi ħdan l-istandard ta’ devjazzjoni tal-laboratorju’ tal-paragonar imsemmi hawn fuq jingħata fil-werrej ta’ hawn taħt: 03/Vol. 23 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 441 Fi ħdan id-devjazzjoni standard tal-laboratorju (Sr) fi g/kg Materjal għar-referenza Għalf tal-majjali mħallat Komposizzjoni tal-brojlers Konċentrat ta’ proteini Taħlit minn qabel n = numru ta’ laborotorji parteċipanti Aċidu amminiku Threonine Cyst(e)ine Methionine Lysine 0,13 n = 15 0,20 n = 16 0,48 n = 16 1,30 n = 16 0,10 n = 17 0,11 n = 18 0,13 n = 17 __ 0,11 n = 17 0,16 n = 18 0,27 n = 17 2,19 n = 16 0,26 n = 13 0,28 n = 16 0,99 n = 15 2,06 n = 16 Koeffiċjent ta’ varjazzjoni ( %) għad-devjazzjoni standard fi ħdan il-laboratorju (Sc) Materjal għar-referenza Għalf tal-majjali mħallat Komposizzjoni tal-brojlers Konċentrat ta’ proteini Taħlit minn qabel Aċicu amminiku Threonine Cyst(e)ine Methionine Lysine 1,9 n = 15 2,1 n = 16 2,7 n = 16 2,2 n = 16 3,3 n = 17 2,8 n = 18 2,6 n = 17 __ 3,4 n = 17 3,1 n = 18 2,2 n = 17 2,4 n = 16 2,8 n = 13 2,1 n = 16 2,4 n = 15 2,1 n = 16 n = numru ta’ laboratorji parteċipanti 7. 2. Riproduċibilità Ir-riżultati għal bejn id-devjazzjoni standard tal-laboratorju mal-paragonar imsemmi hawn fuq huma mogħtija fil-werrej ta’ hawn taħt: Devjazzjoni standard bejn il-laboratorji (SR) f’g/kg Materjal għar-referenza Għalf tal-majjali mħallat Komposizzjoni tal-brojlers Konċentrat ta’ proteini Taħlit minn qabel n = numru ta’ laboratorji parteċipanti Aċidu amminiku Threonine Cyst(e)ine Methionine Lysine 0,28 n = 15 0,48 n = 16 0,85 n = 16 2,49 n = 16 0,30 n = 17 0,34 n = 18 0,62 n = 17 __ 0,23 n = 17 0,55 n = 18 1,57 n = 17 6,20 n = 16 0,30 n = 13 0,75 n = 16 1,24 n = 15 6,62 n = 16 442 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 03/Vol. 23 Koeffiċjent ta’ varjazzjoni ( %) għad-devjazzjoni standard bejn il-laboratorji (Sg) Materjal għar-referenza Għalf tal-majjali mħallat Komposizzjoni tal-brojlers Konċentrat ta’ proteini Taħlit minn qabel Aċidu amminiku Threonine Cyst(e)ine Methionine Lysine 4,1 n = 15 5,2 n = 16 3,8 n = 16 4,3 n = 16 9,9 n = 17 8,8 n = 18 12,3 n = 17 __ 7,0 n = 17 10,9 n = 18 13,0 n = 17 6,9 n = 16 3,2 n = 13 5,4 n = 16 3,0 n = 15 6,7 n = 16 n = numru ta’ laborotorji parteċipanti 8. Użu ta’ materjali għar-referenza L-applikazzjoni korretta tal-metodu għandha tiġi vverifikata billi jsir kejl ripetut ta’ materjali għar-referenza ċċertifikati meta huma disponibbli. Kalibrazzjoni b’kalibrazzjoni ċċertifikata ta’ aċidu amminiku hija rrakommandata. 9. Osservazzjoni 9. 1. Minħabba differenzi bejn l-analizzaturi ta’ l-aċidi amminiċi l-konċentrazzjonijiet finali tas-soluzzjonijiet ta’ l- istandar ta’ aċidi amminiċi (ara 3. 27. 4 u 3. 27. 5) u tal-hydrolysate (ara 5. 3. 4) għandhom jittieħdu bħala gwida. Il-varji rispons lineari ta’ l-apparat għandu jiġi ċċekkjat għall-aċidi amminiċi kollha. Is-soluzzjoni standard tiġi dilwita bis-citrate buffer sabiex tagħti l-qċaċet f’nofs il-varjetà. 9. 2. 9. 3. Fejn jintuża tagħmir ta’ kromatografija likwida ta’ esekuzzjoni għolja sabiex jiġu analizzati kondizzjonijiet manifattur. esperimentali għandhom jiġu ottimizzati f’konformità mar-rakkommandazzjonijiet l-hydrolysates, il- tal- Meta tintuża’ l-applikazzjoni tal-metodu lill-għalf li jkun fih aktar minn 1 % klorat (konċentrat, għalf minerali, għalf supplimentari) jista’ jkun hemm nuqqas ta’ stima korretta tal-methionine u għandu jsir trattament speċjali. PARTI B DETERMINAZZJONI TA’ ŻJUT MHUX RAFFINATI U XAĦMIJIET 1. Għan u varjetà Dan il-metodu huwa għad-determinazzjoni ta’ żjut mhux raffinati u xaħmijiet fl-għalf. Ma jkoprix l-analiżi ta’ żerriegħa taż-żejt u frott oleaġinuż definit fir-Regolament tal-Kunsill 136/66/KEE tat-22 ta’ Settembru 1966. L-użu taż-żewġ proċeduri deskritti hawn taħt jiddependi fuq in-natura u l-komposizzjoni ta’ l-għalf u r-raġuni għaliex tkun saret l-analiżi. 1. 1. Proċedura A - Żjut mhux raffinati u xaħmijiet li jistgħu jiġi estratti direttament Dan il-metodu huwa applikabbli għall-materjali ta’ għalf li joriġinaw mill-pjanti, ħlief dawk inklużi fil-varjeta’ tal-proċedura B. 1. 2. Proċedura B - Żjut mhux raffinati u xaħmijiet kollha Dan il-metodu japplika lill-materjali li joriġinaw mill-annimali u lill-komposizzjonijiet ta’ għalf kollha. Għandu jintuża għall-materjali kollha li minnhom ma jistgħux jiġu estratti ż-żjut u x-xaħmijiet mingħajr idroliżi minn qabel (eż glutini, ħmira, proteini tal-patata u prodotti soġġetti għall-proċessi bħalma huma l-estrużjoni, taqxir biċċa biċċa, u tisħin). 03/Vol. 23 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 443 1. 3. Interpretazzjoni ta’ riżultati Fil-każijiet kollha fejn jinkiseb riżultat ogħla billi tintuża l-Proċedura B milli bil-Proċedura A, ir-riżultat miksub mill-Proċedura A għandu jkun aċċettat bħala l-valur veru. 2. Prinċipju 2. 1. Proċedura A Il-kampjun jiġi estratt b’żejt mhux raffinat ħafif. Is-solvent jiġi ddistillat u r-residwu mnixxef u miżun. 2. 2. Proċedura B Il-kampjun jiġi ttrattat bit-tisħin bil-hydrochloric acid. It-taħlita titkessaħ u ffiltrata. Ir-residwu jinħasel u jitnixxef u jiġi sottomess għad-determinazzjoni skond il-Proċedura A. Reaġenti Żejt mhux raffinat ħafif, varjetà ta’ togħlija: 40 sa 60 °Ċ. Il-valur ta’ bromu għandu jkun anqas minn 1 u r- residwu ta’ evaporazzjoni inqas minn 2 mg/100ml. Sulfat tas-sodju, anidru. Hydrochloric acid, ċ = 3 mol HCl/l Għajnuna għal-filtrazzjoni, eż. Kieselguhr, Hyflo-supercel. Apparat Apparat għall-estrazzjoni. li jipproduċi xi 10 ċikli fis-siegħa; jekk huwa tat-tip mingħajr sifun, ir-rata ta’ rifluss għandha tkun xi 10 ml fil- minuta. Jekk mgħammar b’sifun (apparat Soxhlet), ir-rata tar-rifluss għandu jkun tali Vajlori għall-estrazzjoni, ħielsa minn materja li ddub f’żejt mhux raffinat ħafif u li għandhom porosità konsistenti mal-ħtiġijiet tal-punt 4. 1. Forn għat-tnixxif, f’temperatura ta’ 100 °Ċ ± 3°Ċ. jew forn tal-vakwu ssettjat f’temperatura ta’ 75 °Ċ ± 3°Ċ jew forn ta’ l-arja ssettjat 3. 3. 1. 3. 2. 3. 3. 3. 4. 4. 4. 1. 4. 2. 4. 3. 5. Proċedura 5. 1. Proċedura A (ara l-punt 8. 1) Iżen 5 g mill-kampjun sa l-eqreb 1 mg, ittrasferixxih għal ġo vajlora ta’ l-estrazzjoni (4. 2) u għattih b’biċċa tajjar mingħajr xaħam. Poġġi l-vajlora f’estrattur (4. 1) u estratta għal sitt sigħat b’żejt mhux raffinat ħafif (3. 1). Iġbor l-estratt taż-żejt ħafif mhux raffinat fi flask xott, miżun li jkun fih frak tal-ħaffiefa (1). Iddistilla s-solvent. Nixxef ir-residwu billi żżomm il-flask fil-forn tat-tnixxif għal siegħa u nofs (4. 3). Ħallih jiksah f’dissikatur u iżen. Erġa nixxef għal 30 minuta sabiex tiżgura li l-piż taż-żjut u x-xaħmijiet jibqa’ kostanti (telf ta’ piż bejn żewġ użin suċċessivi għandu jkun inqas minn 1mg). 5. 2. Proċedura B Iżen 2,5 g mill-kampjun sa l-eqreb 1 mg (ara l-punt 8. 2), poġġi f’tazza ta’ 400 ml jew flask koniku ta’ 300 ml u żid 100 ml hydrochloric acid (3. 3) u frak tal-ħaffiefa. Għatti t-tazza bi ħġieġa jew waħħal kondenser tar-rifluss mal-flask koniku. Saħħan it-taħlita sakemm tagħli bil-mod fuq nar baxx jew fuq pjanċa taħraq u ħalliha hemm għal siegħa. Tħallix il-prodott jeħel mal-ġnub tar-reċipjent. Kessaħ u żid kwantità mill-għajnuna tal-filtrazzjoni (3. 4) biżżejjed biex jipprevjeni kull telf ta’ żejt u xaħam waqt il-filtrazzjoni. Iffiltra minn karta tal-filtru doppja, niedja, mingħajr xaħam. Aħsel ir-residwu f’ilma kiesaħ sakemm jinkiseb filtrat naturali. Iċċekkja li l-filtrat ma jkun fih l-ebda żjut jew xaħmijiet. Il-preżenza tagħhom tindika li l-kampjun għandu jinħareġ b’żejt ħafif mhux raffinat, bl-użu tal-Proċedura A, qabel il-hydrolysis. Poġġi l-karta tal-filtru doppja li jkun fiha r-residwu fuq ħġieġa u nixxef għal siegħa u nofs fil-forn ta’ l-arja (4. 3) 100 °Ċ ± 3 °Ċ. Poġġi l-karta doppja tal-filtru li jkun fiha r-residwu xott f’vajlora ta’ l-estrazzjoni (4. 2) u għatti b’biċċa tajjar mingħajr xaħam. Poġġi l-vajlora fl-estrattur (4. 1) u kompli kif indikat fit-tieni u t-tielet paragrafi tal-punt 5. 1. (1) Billi ż-żejt jew xaħam għandu jgħaddi minn testijiet sussegwenti għall-kwalità, ibdel il-frak tal-ħaffiefa b’żibeġ tal-ħġieġ. 444 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 03/Vol. 23 6. Qari ta’ riżultat Esprimi l-piż tar-residwu bħala persentaġġ tal-kampjun. 7. Ripetittività Id-differenza bejn ir-riżultati taż-żewġ determinazzjonijiet paralleli analista ma għandhiex tkun aktar minn: li jsiru fuq l-istess kampjun mill-istess — 0,2 % f’valur assolut, għal kontenuti ta’ żjut mhux raffinati u xaħmijiet anqas minn 5 %. — 4,0 % relattiv għall-ogħla riżultat għall-kontenuti ta’ 5 sa 10 %, — 0,4 % f’valur assolut, għal kontenuti l-fuq minn 10 %. 8. Osservazzjonijiet 8. 1. Għal prodotti b’kontenut għoli ta’ żjut u xaħmijiet, li huma diffiċli biex jintaħnu jew m’humiex xierqa biex minnhom jinħareġ kampjun għat-test imnaqqas b’mod omoġenu, kompli kif ġej. Iżen 20 g mill-kampjun sa l-eqreb 1 mg u ħallat ma’ 10 g jew aktar mis-sulfat tas-sodju anidru (3. 2). Oħroġ b’żejt ħafif mhux raffinat (3. 1) kif indikat fil-punt 5. 1. Imla l-estratt miksub sa 500 ml b’żejt ħafif mhux raffinat (3. 1) u ħawwad. Ħu 50 ml mis-soluzzjoni u poġġi fi flask żgħir, xott, miżun li jkun fih frak tal-ħaffiefa (2). Iddistilla s-solvent, ixxuttah u kompli kif indikat fl-aħħar paragrafu tal-punt 5. 1. Elimina s-solvent mir-residwu ta’ l-estrazzjoni li jifdalfil-vajlora, farrak ir-residwu għal finezza ta’ 1 mm, erġa’ qiegħdu fil-vajlora ta’ l-estrazzjoni (iżżidx sulfat tas-sodju) u kompli kif indikat għat-tieni u t-tielet paragrafi tal- punt 5. 1. Ikkalkula l-kontenut taż-żjut u x-xaħmijiet bħala persentaġġ tal-kampjun billi tuża l-formula li ġejja: (10 a + b) x 5 fejn: a = l-massa fi grammi tar-residwu wara l-ewwel estrazzjoni (parti aliquot ta’ l-estratt), b = massa fi grammi tar-residwu wara t-tieni estrazzjoni. Għall-prodotti baxxi fiż-żjut u x-xaħmijiet il-kampjun għat-test jista’ jiżdied għal 5 g. Ikel ta’ l-annimali tad-dar li jkun fih kontenut għoli ta’ ilma jista’ jkun hemm il-bżonn li jitħalltu mas-sulfat tas- sodju anidru qabel il-hydrolysis u l-estrazzjoni bħal ma hemm fil-proċedura B. Fil-paragrafu 5. 2 jista’ jkun effettiv aktar li jintuża ilma jaħraq minflok ilma kiesaħ sabiex jinħasel ir-residwu wara l-filtrazzjoni. Il-ħin għat-tnixxif ta’ siegħa u nofs jista’ jkollu bżonn jittawwal għal xi għalf. Tnixxif eċċessiv għandu jiġi evitat għax dan jista’ jwassal għal riżultati baxxi. Jista’ jintuża microwave oven ukoll. L-estrazzjoni minn qabel permezz tal-Proċedura A qabel l-idroliżi u r-riestrazzjoni hija rrakommandata permezz tal-Proċedura B jekk il-konteut ta’ żejt mhux raffinat/xaħam huwa akbar minn 15 %. Dan jiddependi xi ftit fuq in-natura ta’ l-għalf u n-natura taż-żejt-xaħam fl-għalf. 8. 2. 8. 3. 8. 4. 8. 5. 8. 6. PARTI Ċ DETERMINAZZJONI TA’ OLAQUINDOX (2-[N-2’-(hydroxyethyl)carbamoyl]-3-methylquinoxaline-N1,N4-dioxyde) 1. Għan u varjetà Dan il-metodu huwa għad-determinazzjoni ta’ olaquindox fl-għalf. 5 mg/kg. Il-limitu baxx ta’ determinazzjoni huwa 2. Prinċipju Il-kampjun jiġi estratt b’taħlita ta’ ilma u methanol. Il-kontenut ta’ olaquindox jiġi ddeterminat b’eżekuzjoni għolja ta’ kromatografija likwida fil-fażi kontrarja (HPLC) bl-użu ta’ detettur tal-UV. 03/Vol. 23 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 445 3. 3. 1. 3. 2. 3. 3. 3. 4. Reaġenti Methanol. Methanol, grad ta’ HPLC Ilma, grad ta’ HPLC Fażi mobili għall-HPLC Taħlita ta’ ilma (3. 3)-methanol (3. 2), 900 + 100 (V + V). 3. 5. Sustanza standard: olaquinox pura 2-[N-2’-(hydroxyethyl)carbamoyl]-3-methylquinoxaline-N1,N4-diossidu, E 851. 3. 5. 1. Soluzzjoni standard ta’ olaquindox maħżuna, 250 µg/ml l-eqreb 0,1 mg 50 mg olaquindox (3. 5) fi flask iggradwat ta’ 200 ml u żid ċirka 190 ml Iżen sa’ ilma. Imbagħad qiegħed il-flask f’banju ultrasoniku (4. 1) għal 20 min. Wara t-trattament ultrasoniku ġib is-soluzzjoni f’tempeatura ambjentali, imla sal-marka bl-ilma u ħawwad. Iksi l-flask b’fojl ta’ l-aluminju u aħżnu fi friġġ. Is- soluzzjoni għandha titħejja friska kull xahar. 3. 5. 2. Soluzzjoni standard intermedjarja ta’ olaquindox, 25 µg/ml Ittrasferixxi 10,0 ml mis-soluzzjoni standard maħżuna (3. 5. 1) fi flask iggradwat ta’ 100 ml, imla sal-marka bil- fażi mobbli (3. 4) u ħawwad. Iksi l-flask b’fojl ta’ l-aluminju u aħżnu fi friġġ. Is-soluzzjoni għandha titħejja friska kuljum. 3. 5. 3. Soluzzjonijiet għall-kalibrazzjoni Ittrasferixxi f’serje ta’ flasks iggradwati ta’ 50 ml 1,0, 2,0, 5,0, 10,0, 15,0 u 20,o ml mis-soluzzjoni standard Is- intermedjarja (3. 5. 2). soluzzjonijiet jaqblu ma’ 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 7,5 u 10,0 µg ta’ aquindox kull ml rispettivament. Imla sal-marka bil-fażi mobbli (3. 4) u ħawwad. l-flask b’fojl ta’ l-aluminju. Iksi Dawn is-soluzzjonijiet għandhom jitħejjew friski kuljum. Apparat Banju ultrasoniku Shaker mekkaniku Tagħmir ta’ HPLC b’ditekter ultra-vjola ta’ wavelength varjabbli jew didekter diode array 4. 4. 1. 4. 2. 4. 3. 4. 3. 1. Kolonna kromatografika likwida, 250mm x 4 mm, imballaġġ ta’ Ċ18, 10 µm, jew ekwivalenti. 4. 4. Membrane filters, 0,45 µm 5. Proċedura Notament: L-olaquindox huwa sensittiv għad-dawl. Agħmel il-proċeduri taħt dawl baxx jew uża affarijiet tal-ħġieġ sofor. 5. 1. Ġenerali 5. 1. 1. Għandu jiġi analizzat għalf mingħajr kampjun sabiex ikun iċċekkjat li la l-olquindox u lanqas sustanzi li jtellfu m’huma presenti. 5. 1. 2. Għandu jsir test ta’ rikupru billi jiġi analizzat l-għalf mingħajr kampjun li ssaħħaħ permezz ta’ żieda ta’ kwantità ta’ olaquindox, simili għal dik presenti fil-kampjun. Sabiex issaħħaħ f’livell ta’ 50 mg/kg, ittrasferixxi 10,0 ml mis-soluzzjoni standard maħżuna (3. 5. 1) għal ġo flask koniku u evapora s-soluzzjoni għal ċirka 0,5 ml. Żid 50 g mill-għalf mingħajr kampjun, ħawwad sew u ħallih għal 10 minuti u erġa’ ħawwad għal ħafna drabi qabel tkompli bil-pass ta’ l-estrazzjoni (5. 2). Notament: Għall-għan ta’ dan il-metodu l-għalf mingħaajr kampjun għandu jkun simili fit-tip għal dak tal- kampjun u l-olaquindox m’għandux jinqabad. 5. 2. Estrazzjoni Iżen sa’ l-eqreb 0,01 g, bejn wieħed u ieħor 50 g mill-kampjun. Ittrasferixxi għal ġo flask koniku ta’ 1 000 ml, żid 100 ml methanol (3. 1) u poġġi l-flask għal 5 minuti f’banju ultrasoniku (4. 1). Żid 410 ml ilma u ħalli fil- banju ultrasoniku għal 15-il minuta oħra. Neħħi l-flask mill-banju ultrasoniku, ħawdu għal 30 minuta fix-shaker (4. 2) u ffiltra minn filtru mitwi. Ittrasferixxi 10,0 ml mill-filtrat fi flask iggradwat ta’ 20 ml, imla sal-marka bl- ilma u ħawwad. Alikwot (Ara 9. Osservazzjoni) Kompli għad- determinazzjoni HPLC (5. 3). ffiltrat minn membrane filter (4. 4). jiġi 446 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 03/Vol. 23 5. 3. Determinazzjoni ta’ l-HPLC 5. 3. 1. Pa r a m etr i : Il-kondizzjonijiet li ġejjin qegħdin offruti bħala gwida, jistgħu jintużaw kondizzjonijiet oħra sakemm jagħtu l- istess riżultati. Kolonna analitika (4. 3. 1) taħlita ta' ilma (3. 3) – methanol(3. 2), 900 + 100 (V + V) Fażi mobbli (3. 4): Rata ta' ċirkulazzjoni: 1,5-2 ml/min. Detection wavelength 380 nm Volum ta' injezzjoni: 20 µl-100 µl Iċċekkja l-istabbilità tas-sistema kromatografika, billi tinjetta ħafna drabi s-soluzzjoni ta’ kalibrazzjoni (3. 5. 3) li jkun fihom 2,5 µg/ml, sakemm jinkisbu għoli ta’ qċaċet u ħinijiet ta’ retenzjoni kostanti. 5. 3. 2. Gr a ff ta l-k a li br a zz j on i Injetta kull soluzzjoni tal-kalibrazzjoni (3. 5. 3) ħafna drabi u stabbilixxi l-għoli medju tal-quċċata (erji) għal kull kalibrazzjoni. Pinġi ta’ tuża’ (erji) kalibrazzjoni bħala ordinati u l-konċentrazzjonijiet korrespondenti f’µg/ml bħala l-axxiżi. ta’ kalibrazzjoni billi l-għoli medji tas-soluzzjonijiet tal-qċaċet l-graff 5. 3. 3. Ka pmp j un ta ’ solu z zj oni Injetta il-kampjun ta’ kalibrazzjoni u stabbilixxi l-għoli medju tal-quċċata (erja) tal-qċaċet ta’ olaquindox. (5. 2) ħafna drabi billi l-estratt tuża’ l-istess volum meħud għas-soluzzjonijiet ta’ 6. Kalkulazzjoni tar-riżultati Mill-għolji medju (erja) tal-qċaċet ta’ olaquindox tal-kampjun ta’ soluzzjoni stabbilixxi kampjun ta’ soluzzjoni f’µg/ml b’referenza għall-graff ta’ kalibrazzjoni (5. 3. 2). l-konċentrazzjoni tal- Il-kontenut ta’ olaquindox w f’mg’kg tal-kampjun jingħata bil-formula li ġejja: w ¼ c x 1 000 m li fiha: c = konċentrazzjoni ta’ olaquindox tal-kampjun ta’ estratt (5. 2) f’µg/ml. m = massa tal-kampjun tat-test fi g (5. 2). 7. Validazzjoni tar-riżultati 7. 1. Identità L-identità ta’ l-analità tista’ tiġi kkonfermata permezz ta’ ko-kromatografija, jew billi jintuża’ didekter diode-array li bih l-ispettra tal-kampjun estratt (5. 2) u s-soluzzjoni ta’ kalibrazzjoni (3. 5. 2) li fih 5,0 µg/ml huma mqabbla. 7. 1. 1. C o - kroma tog r a fi ja Kampjun estratt (5. 2) jissaħħaħ biż-żieda ta’ ammont xieraq mis-soluzzjoni ta’ kalibrazzjoni (3. 5. 3). L-ammont ta’ olaquindox miżjud għandu jkun simili għall-ammont ta’ olaquindox li jinsab fil-kampjun estratt. L-għoli tal-quċċata ta’ l-olaquindox biss għandu jkun imsaħħaħ wara li jkunu kkunsidrati sew l-ammont miżjud u sew id-dilwit ta’ l-estratt. Il-wisgħa tal-quċċata, f’nofs l-għoli tagħha, għandha tkun fi ħdan ± 10 % tal-wisgħa oriġinali tal-quċċata ta’ olaquindox tal-kampjun estratt mhux imsaħħaħ. 7. 1. 2. L -Iskop er ta D i o d e ar r a y Ir-riżultati jiġu evalwati skond il-kriterji li ġejjin: (a) Il-mewġa manjetika ta’ assorbazzjoni massima tal-kampjun u ta’ l-ispettra standard, irrekordjat fl-apiċi tal- quċċata fuq il-kromatogramma, għandha tkun fi ħdan marġini stabbilita mis-saħħa tas-sistema ta’ detezzjoni li ssolvi. Għall-iskoperta diode-array dan huwa tipikament fi ħdan ± 2 nm. 03/Vol. 23 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea 447 (b) Bejn 220 u 400 nm, il-kampjun u spettra standard irrekordjati fil-quċċata ta’ l-apiċi tal-kromatogramma, ma għandhomx ikunu differenti għal dawk il-partijiet ta’ jvarjaw bejn l-10-100 % ta’ assorbazzjoni relattiva. Din il-kriterja tintlaħaq meta l-istess massimi huma preżenti u d-devjazzjoni bejn iż-żewġ spektra fl-ebda punt osservat ma taqbeż il-15 % ta’ l-assorbazzjoni ta’ l-analità standard. l-ispektrum li (ċ) Bejn 220 u 400 nm, l-ispektra tat-telgħa, apiċi u niżla tal-quċċata prodotti mill-istess kampjun estratt ma għandhomx ikunu differenti minn xulxin għal dawk il-partijiet ta’ l-ispektrum fi ħdan il-varjazzjoni 10- 100 % ta’ l-assorbazzjoni relattiva. Din il-kriterja tintlaħaq meta l-istess massimi huma preżenti u meta fil- punti osservati kollha d-devjazzjoni bejn l-ispektra ma taqbiżx il-15 % ta’ l-assorbazzjoni ta’ l-ispektrum tal-quċċata ta’ l-apiċi. Jekk ma tintlaħaqx waħda minn dawn il-kriterji l-preżenza ta’ l-analità ma tkunx ġiet ikkonfermata. 7. 2. 7. 3. 8. Ripetittività Id-differenza bejn ir-riżultati ta’ żewġ determinazjzonijeit paralelli għandux jaqbeż il-15 % relattiv ma’ l-ogħla riżultat għall-kontenuti ta’ olaquindox bejn 10 u 20 mg/kg. jkunu saru fuq l-istess kampjun ma li Rikupru Għal kampjun vojt imsaħħaħ ir-rikupru għandu jkun ta’ l-anqas 90 %. Riżultati ta’ studju kollaborattiv Ġie rranġat studju kollaborattiv tal-KE li fih erba’ kampjuni ta’ għalf tal-qżieqeż li jinkludu għalf vojt ġew analizzati minn 13-il laboratorju. Ir-riżultati jingħataw hawn taħt: Kampjun 1 Kampjun 2 Kampjun 3 Kampjun 4 L n medja (mg/kg) (Sr) (mg/kg) (SR) (mg/kg) CVr (%) CVR (%) Kontenut nominali (mg/kg) rikupru. (%) 13 40 __ __ __ __ __ __ __ 10 40 14,6 0,82 1,62 5,6 11,1 15 97,3 11 44 48,0 2,05 4,28 4,3 8,9 50 96,0 11 44 95,4 6,36 8,42 6,7 8,8 100 95,4 L n Sr SR CVr CVR : numru ta’ laboratorji : numru ta’ valuri singli : devjazzjoni standard ta’ ripetittività : devjazzjoni standard ta’ riproduċibbiltà : koeffiċjent tal-varjazzjoni ta’ ripetittività : koeffiċjent ta’ varjazzjoni ta’ riproduċibbiltà 9. Osservazzjoni Għalkemm il-metodu ma ġiex ivvalidat għal għalf li fih aktar minn 100 mg/kg olaquindox, jista’ jkun possibbli li jinkisbu riżultati sodisfaċenti billi jittieħed piż iżgħar tal-kampjun u/jew billi l-estratt jiġi dilwit (5. 2) sabiex tintlaħaq konċentrazzjoni fi ħdan il-varjetà tal-graff ta’ kalibrazzjoni (5. 3. 2)


title: QUESTION ECRITE no 2751/98 de Hiltrud BREYER à la Commission. Sécurité des enfants dans les avions

eurovoc_concepts:
Rhineland-Palatinate
air safety
child
civil aviation
research
safety device

formats: html pdf print

text: C 118/134 Journal officiel des CommunautØs europØennes FR 29. 4. 1999 Sur base des considØrations exposØes ci-dessus et des informations fournies par les Honorables Parlementaires, la Commission ne manquera pas de s(cid:146)adresser aux autoritØs nØerlandaises en vue de s(cid:146)informer sur la portØe de la loi et de la circulaire en question (koppelingswet). (1) Voir arrŒt du 8 avril 1976, affaire C-48/75, (Royer), Rec. p. 497. (1999/C 118/166) QUESTION (cid:201)CRITE E-2746/98 posØe par Caroline Jackson (PPE) (cid:224) la Commission (3 septembre 1998) Objet: L(cid:146)attitude de l(cid:146)UE (cid:224) l(cid:146)Øgard de Trinitad-et-Tobago et les droits de l(cid:146)homme Selon les informations, Trinitad-et-Tobago s(cid:146)est retirØe de la Convention amØricaine sur les droits de l(cid:146)homme. La Commission peut-elle indiquer si cela est susceptible d(cid:146)avoir un impact sur le statut de TrinitØ-et-Tobago en temps que pays ACP actuellement bØnØficiaire d(cid:146)une aide de l(cid:146)UE? RØponse donnØe par M. Pinheiro au nom de la Commission (30 septembre 1998) La Commission croit savoir que TrinitØ-et-Tobago a rØcemment dØposØ un instrument juridique dont l(cid:146)effet sera son retrait de la convention amØricaine sur les droits de l(cid:146)homme (cid:224) compter du 26 mai 1999. Il semble que cette action vise (cid:224) limiter les possibilitØs de procØdures d(cid:146)appel souvent longues bloquant l(cid:146)application de la peine de mort par les autoritØs de TrinitØ-et-Tobago. Cette attitude s(cid:146)inscrit dans la stratØgie des autoritØs pour adopter une attitude ferme sur les dØlits pØnaux. La Commission est prØoccupØe par cette Øvolution et a pris part (cid:224) des dØmarches europØennes en vue de persuader les autoritØs de ne pas adopter de telles mesures. Pour le moment, la Commission ne considŁre cependant pas que la dØcision de TrinitØ-et-Tobago puisse avoir un impact sur son statut en tant qu(cid:146)(cid:201)tat d(cid:146)Afrique, des Cara(cid:239)bes et du Pacifique ou sur l(cid:146)actuel programme d(cid:146)aide au dØveloppement. (1999/C 118/167) QUESTION (cid:201)CRITE E-2751/98 posØe par Hiltrud Breyer (V) (cid:224) la Commission (3 septembre 1998) Objet: SØcuritØ des enfants dans les avions 1. La Commission sait-elle que, dŁs le mois d(cid:146)aoßt 1992, les services de contr(cid:244)le technique de RhØnanie (T(cid:220)V Rheinland) ont dØmontrØ, (cid:224) l(cid:146)aide d(cid:146)essais effectuØs sur un mannequin, que l(cid:146)utilisation de la ceinture de type «loop-belt» Øtait dangereuse pour les enfants? La Commission sait-elle que, le 1er avril dernier, les autoritØs europØennes de l(cid:146)aviation civile ont 2. adoptØ le rŁglement «JAR-OPS1» qui impose l(cid:146)utilisation de la ceinture de type «loop-belt» (cid:224) bord des appareils des (cid:201)tats membres, bien que ce systŁme soit depuis longtemps interdit en AmØrique? Quelles mesures d(cid:146)urgence la Commission va-t-elle prendre afin de prØvenir le danger que ce type de 3. ceinture prØsente pour la vie des enfants? Quand la Commission va-t-elle veiller (cid:224) ce que diffØrents dispositifs de maintien adaptØs (cid:224) l(cid:146)(cid:226)ge des 4. enfants soient obligatoirement prØvus dans les avions? 5. La Commission a-t-elle allouØ des crØdits pour la mise au point de tels dispositifs? Dans l(cid:146)affirmative, quel est le montant des crØdits mis (cid:224) disposition? Dans la nØgative, pourquoi ne l(cid:146)a-t-elle pas fait?


title: Директива 98/64/ЕО на Комисията от 3 септември 1998 година за установяване на общностни методи за анализ за определяне съдържанието на аминокиселини, сурови масла и мазнини и олахиндокс в храните за животни и за изменение на Директива 71/393/ЕИОтекст от значение за ЕИП.

formats: html pdf print xhtml

text: 03/т. 25 BG Официален вестник на Европейския съюз 177 31998L0064 L 257/14 ОФИЦИАЛЕН ВЕСТНИК НА ЕВРОПЕЙСКИТЕ ОБЩНОСТИ 19. 9. 1998 ДИРЕКТИВА 98/64/ЕО НА КОМИСИЯТА от 3 септември 1998 година за установяване на общностни методи за анализ за определяне съдържанието на аминокиселини, сурови масла и мазнини и олахиндокс в храните за животни и за изменение на Директива 71/393/ЕИО (текст от значение за ЕИП) КОМИСИЯТА НА ЕВРОПЕЙСКИТЕ ОБЩНОСТИ, като взе предвид Договора за създаване на Европейската общност, като взе предвид Директива 70/373/ЕИО на Съвета от 20 юли 1970 г. относно въвеждането на общностни методи за вземане на проби и анализ за целите на официалния контрол на храните за животни (1), последно изменена с Договора за присъединяване на Австрия, Финландия и Швеция, и по-специално член 2 от нея, методи за анализ за целите на официалния контрол на храните за животни (8), последно изменена с Директива 84/4/ЕИО на Комисията (9), определя методи за анализ за определяне съдържа- нието на сурови масла и мазнини; като има предвид, че е уместно описаният метод да бъде изменен; като има предвид, че задължително следва да се определят методи за анализ за проверката на тези вещества; като има предвид, че предвидените в настоящата директива мерки са съобразени със становището на Постоянния комитет по храните за животни, че Директива 70/373/ЕИО определя като има предвид, официалният контрол на храните за животни, предназначен да провери доколко те отговарят на изискванията, които произтичат от законовите, подзаконовите и административните разпоредби които определят тяхното качество и състав, да се осъществява посредством общностни методи за вземане на проби и анализ; ПРИЕ НАСТОЯЩАТА ДИРЕКТИВА: Член 1 като има предвид, че Директива 79/373/ЕИО на Съвета от 2 април 1979 г. относно търговията с комбинирани фуражи (2), последно изменена с Директива 97/47/ЕО на Комисията (3) и Директива 93/74/ЕИО на Съвета от 13 септември 1993 г. относно храните за животни, предназначени за специални хранителни цели (4), последно изменена с Директива 96/25/ЕО (5), определят на етикетите на бъдат изписвани аминокиселините и суровите масла и мазнини; за животни да храните като има предвид, че Директива 70/524/ЕИО на Съвета от 23 ноември 1970 г. относно добавките в храните за животни (6), последно изменена с Директива 98/19/ЕО на Комисията (7) опре- делят на етикетите на храните за животни да бъде изписвано съдържанието на олахиндокс когато това вещество се използва като добавка в тях; Държавите-членки осигуряват анализите, осъществявани във връзка с упражняването на официален контрол на съдържанието на аминокиселини, сурови масла и мазнини и олахиндокс в животинските храни, да се извършват по методите, определени в приложението към настоящата директива. Член 2 В приложението към Директива 71/393/ЕИО на Комисията, точка „4. Определяне на суровите масла и мазнини“ се заменя с част Б на приложението към настоящата директива. Член 3 1. Държавите-членки въвеждат в сила законовите, подзаконовите или административните разпоредби, необходими, за да се съобразят с настоящата директива, преди 31 декември 1998 година. Те незабавно информират Комисията за това. като има предвид, че втората Директива 71/393/ЕИО на Коми- сията от 18 ноември 1971 г. относно установяване на общностни Те прилагат мерките от 1 януари 1999 година. (1) ОВ L 170, 3. 8. 1970 г. , стр. 2. (2) ОВ L 86, 6. 4. 1979 г. , стр. 30. (3) ОВ L 211, 5. 8. 1997 г. , стр. 45. (4) ОВ L 237, 22. 9. 1993 г. , стр. 23. (5) ОВ L 125, 23. 5. 1996 г. , стр. 35. (6) ОВ L 270, 14. 12. 1970 г. , стр. 1. (7) ОВ L 96, 28. 3. 1998 г. , стр. 39. Когато държавите-членки приемат тези разпоредби, в тях се съдържа позоваване на настоящата директива или то се извършва при официалното им публикуване. Условията и редът на позова- ване се определят от държавите-членки. (8) ОВ L 279, 20. 12. 1971 г. , стр. 7. (9) ОВ L 15, 18. 1. 1984 г. , стр. 28. 178 BG Официален вестник на Европейския съюз 03/т. 25 2. Държавите-членки съобщават на Комисията текста на основ- ните разпоредби от националното си законодателство, които те приемат в областта, уредена с настоящата директива. Адресати на настоящата директива са държавите-членки. Член 5 Член 4 Съставено в Брюксел на 3 септември 1998 година. Настоящата директива влиза в сила на двадесетия ден след публикуването ѝ(cid:65) в Официален вестник на Европейските общности. За Комисията Franz FISCHLER Член на Комисията 03/т. 25 BG Официален вестник на Европейския съюз 179 ПРИЛОЖЕНИЕ ЧАСТ А ОПРЕДЕЛЯНЕ СЪДЪРЖАНИЕТО НА АМИНОКИСЕЛИНИ 1. Цел и обхват Настоящият метод служи за определяне съдържанието на свободните аминокиселини (синтетични и естествени) и общото съдържание на аминокиселини (участващи в пептидна връзка и свободни) в животинските храни посредством анализатор за аминокиселини. Методът е приложим за следните аминокиселини: цистеин, метионин, лизин, треонин, аланин, аргинин, аспарагинова киселина, глутаминова киселина, глицин, хистидин, изо-левцин, левцин, фенил-аланин, пролин, серин, тирозин и валин. Методът не разграничава видовете соли на аминокиселините и не различава D- и L-формите на аминокиселините. Той не важи за определяне съдържанието на триптофан или на хидроксилни аналози на аминокиселините. 2. Принцип 2. 1. Свободни аминокиселини Свободните аминокиселини се извличат с разредена солна киселина. Извлечените паралелно с тях азотисти макромолекули се утаяват със сяро-салицилова киселина и отстраняват посредством филтриране. Филтрираният разтвор се коригира до pH 2,20. Аминокиселините се отделят посредством йонообменна хроматография и съдържанието им се определя посредством нинхидринова реакция с фотометрично отчитане при 570 nm. 2. 2. Общо съдържание на аминокиселини Процедурата, която ще бъде избрана зависи от вида на аминокиселините, които се изследват. Цистеинът и метионинът трябва да бъдат окислени съответно до цистеинова киселина и метионин сулфон преди хидролизата. Тирозинът трябва да се определя в продукти на хидролизата в неокислени проби. Всички останали аминокиселини, изброени в параграф 1, могат да бъдат определени както в окислените, така и в неокислените проби. Окисляването се извършва при 0 °С със смес от пероксимравчена киселина и фенол. Излишният реагент от окисляването се разлага с натриев дисулфит. Окислената или неокислена проба се подлага на хидролоза със солна киселина (c = 6 mol/l) в продължение на 23 часа. Продуктът на хидролизата се коригира до pH 2,20. Аминокиселините се отделят посредством йонообменна хроматография и се определят посредством нинхидринова реакция с фотометрично отчитане при 570 nm (440 nm за пролина). 3. Реактиви Трябва да се използва двойно дестилирана вода, или вода със сходно качество (проводимост < 10 µS). 3. 1 3. 2 3. 3 3. 4 3. 5 3. 6 3. 7 3. 8 3. 9 Водороден прекис, w = 30 %. Мравчена киселина, w = 98—100 %. Фенол. Натриев дисулфит. Натриева основа. Дихидрат на 5-сулфосалициловата киселина. Солна киселина, плътност приблизително 1,18 g/ml. Дихидрат на три-натриев цитрат. 2,2′Y-тиодиетанол (тиодигликол). 3. 10 Натриев хлорид. 3. 11 Нинхидрин. 3. 12 Петролеев етер, диапазон на кипене 40—60 °С. 3. 13 Норлевцин, или друго съединение подходящо за целта според местните стандарти. 3. 14 Азот — газ (< 10 ppm кислород). 180 BG Официален вестник на Европейския съюз 03/т. 25 3. 15 1-октанол. 3. 16 Аминокиселини. 3. 16. 1 Стандартните вещества изброени в параграф 1. Чисти съединения без съдържание на вода от кристализация. Изсушени под вакуум над P2O5 или H2SO4 в продължение на 1 седмица преди употреба. 3. 16. 2. Цистеинова киселина. 3. 16. 3. Метионин сулфон. 3. 17. Разтвор на натриева основа, c = 7,5 mol/l: Разтворете 300 g NaOH (3. 5) във вода и долейте до 1 литър. 3. 18. Разтвор на натриева основа, c = 1 mol/l: Разтворете 40 g NaOH (3. 5) във вода и долейте до 1 литър. 3. 19. Разтвор на мравчена киселина и фенол: Смесете 889 g мравчена киселина (3. 2) със 111 g вода и добавете 4,73 g фенол (3. 3). 3. 20. Смес за хидролизата, c = 6 mol HCl/l със съдържание на 1 g фенол/l: Добавете 1 g фенол (3. 3) към 492 ml HCl (3. 7) и долейте вода до 1 литър. 3. 21. Смес за екстракцията, c = 0,1 mol HCl/l със съдържание на 2 % тиодигликол: Вземете 8,2 ml HCl (3. 7), разредете с приблизително 900 ml вода, добавете 20 ml тиодигликол (3. 9) и долейте вода до 1 литър (не смесвайте 3. 7 директно с 3. 9). 3. 22. 5-сулфосалицилова киселина, β = 6 %: Разтворете 60 g 5-сулфосалицилова киселина (3. 6) във вода и долейте вода до 1 литър. 3. 23. Окислителна смес (Пероксимравчена киселина-фенол): Смесете 0,5 ml водороден прекис (3. 1) с 4. 5 ml разтвор на мравчена киселина и фенол (3. 19) в малка бекерова чаша. Дръжте в термостат при 20-30 °C в продължение на 1 час, за да се получи пероксимравчена киселина, след това охладете във вана с ледена вода (15 минути) преди да добавите към пробата. Внимание: Избягвайте контакти с кожата и носете защитно облекло. 3. 24. Цитратен буферен разтвор, c = 0,2 mol Na+/l, pH 2,20: Разтворете 19,61 g натриев цитрат (3. 8), 5 ml тиодигликол (3. 9), 1 g фенол (3. 3) и 16,50 ml HCl (3. 7) в приблизително 800 ml вода. Коригирайте до pH 2,20. Долейте с вода до 1 литър. 3. 25. Отмиващи буферни разтвори, приготвени според условията за използвания анализатор (4. 9). 3. 26. Нинхидринов реактив, подготвен според условията за използвания анализатор (4. 9). 3. 27. Стандартни разтвори на аминокиселини. Тези разтвори трябва да се съхраняват под 5 °С. 3. 27. 1. Основен стандартен разтвор на аминокиселини (3. 16. 1). c = 2,5 μmol/ml от всяка в солна киселина. Могат да се набавят и готови. 3. 27. 2. Основен стандартен разтвор на цистеинова киселина, c = 1,25 μmol/ml. Разтворете 0,2115 g цистеинова киселина (3. 16. 2) и 0,2265 g метионин сулфон (3. 16. 3) в цитратен буферен разтвор (3. 24) в еднолитрова градуирана колба и долейте цитратен буферен разтвор до маркировката. Съхранявайте не повече от 12 месеца при температура под 5 °С. Този разтвор не се използва ако основния стандартен разтвор (3. 27. 1) съдържа цистеинова киселина и метионин сулфон. 3. 27. 3. Основен стандартен разтвор според вътрешните норми, например норлевцин, c = 20 μmol/ml. Разтворете 0,6560 g норлевцин (3. 13) в цитратен буферен разтвор (3. 24) в градуирана колба и долейте буферен разтвор до 250 ml. Съхранявайте не повече от 6 месеца при температура под 5 °С. 3. 27. 4. Калибриращ разтвор на стандартни аминокиселини, който да се използва за продукти на хидролизата, c = 5 nmol/50 μl цистеинова киселина и метионин сулфон и c = 10 nmol/50 μ за останалите аминокиселини. 03/т. 25 BG Официален вестник на Европейския съюз 181 Разтворете 2,2 g натриев хлорид (3. 10) в бекерова чаша от 100 ml с 30 ml цитратен буферен разтвор (3,24). Добавете 4,00 ml основен стандартен разтвор на аминокиселини (3. 27. 1), 4,00 ml основен стандартен разтвор на цистеинова киселина и метионин сулфон (3. 27. 2) и 0,50 ml основен стандартен разтвор според вътрешните норми (3. 27. 3), когато се използва. Коригирайте pH до 2,20 като използвате натриева основа (3. 18). Прехвърлете количествено в градуирана колба от 50 ml и долейте цитратен буферен разтвор (3. 24) до маркировката, след което разбъркайте. Съхранявайте не по-дълго от 3 месеца при температура под 5 °С. Вижте също и наблюденията, описани в т. 9. 1. 3. 27. 5. Калибриращ разтвор на стандартни аминокиселини, който се използва с продуктите от хидролизата приготвени съгласно параграф 5. 3. 3. 1. и с екстрактите (5. 2). Калибриращият разтвор се приготвя както 3. 27. 4, но без натриевия хлорид. Съхранявайте не по-дълго от 3 месеца при температура под 5 °С. 4. Апаратура 4. 1. Колба с обло дъно от 100 или 250 ml с кондензатор за обратния поток. 4. 2. Шише от боратно стъкло от 100 ml с винтова капачка с каучуково/тефлоново уплътнение (например от вида Duran, Schott) за поставяне в сушилнята. 4. 3. Сушилня с допълнителна вентилация и терморегулатор с точност по-голяма от ± 2 °С. 4. 4. pH-метър (три десетични знака). 4. 5. Мембранен филтър (0,2 µm). 4. 6. Центрофуга. 4. 7. Ротационен вакуумен изпарител. 4. 8. Механичен вибратор или магнитна бъркалка. 4. 9. Анализатор на аминокиселини или уред HPLC с йонообменна колона, устройство за нинхидрин, следколонна дериватизация и фотометричен детектор. Колоната е пълна със сулфонирани полистиролни смоли, които могат да отделят аминокиселините една от друга и от останалите нинхидрин-положителни материали. Циркулацията на потока в буферните и нинхидриновите линии се осигурява от помпи с устойчивост на потока ± 5 % за целия период както на стандартното времетраене на калибрирането, така и на извършване на анализа на пробата. При някои анализатори на аминокиселини може да се използва хидролизна процедура при която продуктът на хидролизата е с концентрация на натрий с = 0. 8 mol/l и съдържа цялата остатъчна мравчена киселина от етапа на окисляването. Други не осигуряват задоволително отделяне на някои определени аминокиселини когато продуктът на хидролизата съдържа излишък от мравчена киселина и/или високи концентрации на натриеви йони. В този случай количеството на киселината се намалява чрез изпарение до приблизително 5 ml след хидролизата и преди коригиране на киселинността. Изпарението трябва да се извършва във вакуумна среда при максимум 40 °С. 5. Процедура 5. 1 Подготовка на пробата Пробата се смила, за да може да преминава през сито от 0,5 mm. Преди смилането пробите с високо съдържание на влага трябва да бъдат изсушени във въздушна среда при температура не по-висока от 50 °С или чрез замразяване. Преди смилане пробите с високо съдържание на мазнини трябва да бъдат подложени на екстракция с петролеев етер (3. 12). 5. 2 Определяне на свободни аминокиселини в животински храни и предварителни смеси. Претеглете до най-близките 0,2 mg едно достатъчно количество (1-5 g) от така подготвената проба (5. 1) в конусообразна колба и добавете 100,0 ml от сместа за екстракцията (3. 21). Разбийте сместа в продължение на 60 минути като използвате механичния вибратор или магнитната бъркалка (4. 8). оставете да се утаи и с пипета отмерете 10,0 ml от супернатантен разтвор в бекерова чаша от 100 ml. 182 BG Официален вестник на Европейския съюз 03/т. 25 Добавете 5,0 ml разтвор на сулфосалицилова киселина (3. 22) като разбърквате и продължете разбъркването още 5 минути с помощта на магнитната бъркалка. Филтрирайте или пуснете в центрофугата супернатант за да отстраните утайката. Изсипете 10,0 ml от получения в резултат разтвор в бекерова чаша от 100 ml и коригирайте pH до 2,20 като използвате разтвор на натриева основа (3. 18), прехвърлете в мерителна колба с подходящ обем като използвате цитратния буферен разтвор (3. 24) и долейте буферен разтвор (3. 24) до маркировката. Когато се използва вътрешен стандартен разтвор, добавете по 1,00 ml от този стандартен разтвор (3. 27. 3) на всеки 100 ml от крайния разтвор и долейте буферен разтвор (3. 24) до маркировката. Пристъпете към хроматографския етап съгласно параграф 5. 4. Ако екстрактите не бъдат изследвани същия ден, те трябва да се съхраняват при температура под 5 °С. 5. 3 Определяне на общото съдържание на аминокиселини 5. 3. 1 О к и с л я в а н е Претеглете до най-близките 0,2 mg от 0,1 до 1 g от така приготвената проба (5. 1) в: — колба с обло дъно (4. 1) от 100 ml за открита хидролиза (5. 3. 2. 3), или — колба с обло дъно (4. 1) от 250 ml ако е необходимо да има ниска концентрация на натрий (5. 3. 3. 1), или — шише от 100 ml с винтова капачка (4. 2) (за затворена хидролиза 5. 3. 2. 4). Претеглената част от пробата трябва да бъде с азотно съдържание от около 10 mg и съдържание на влага не повече от 100 mg. Поставете колбата/шишето във вана с ледена вода и охладете до 0 °С, добавете 5 ml от сместа за окисляването (3. 23) и разбъркайте със стъклена шпатула с извит край. Затворете колбата/шишето с шпатулата с херметизиращо фолио, поставете ваната с ледената вода в която е поставен херметизирания съд в хладилник при 0 °С и оставете така 16 часа. След 16 часа извадете от хладилника и разградете излишния окислителен реактив като добавите 0,84 g натриев дисулфит (3. 4). Продължете с 5. 3. 2. 1. 5. 3. 2. Х и д р о л и з а 5. 3. 2. 1. Хидролиза на окислените проби Добавете 25 ml от сместа за хидролозата (3. 20) към окислената проба, приготвена съгласно 5. 3. 1, като се стараете да отмиете всеки остатък от пробата, който може да е полепнал по стените на съда и по шпатулата. Според хидролизната процедура, която ще се използва, пристъпете към 5. 3. 2. 3 или 5. 3. 2. 4. 5. 3. 2. 2. Хидролиза на неокислени проби Претеглете до най-близките 0,2 mg в колба с обло дъно (4. 1) от 100 ml или 250 ml, или в шише с винтова капачка (4. 2) от 100 ml от 0,1 до 1 g от подготвената проба (5. 1). Претегленото количество от пробата трябва да бъде с азотно съдържание от около 10 mg. Внимателно добавете 25 ml от сместа за хидролизата (3. 20) и разбъркайте с пробата. Преминете към 5. 3. 2. 3 или 5. 3. 2. 4. 5. 3. 2. 3. Открита хидролиза Добавете 3 стъклени топчета в сместа в колбата (подготвена съгласно 5. 3. 2. 1 или 5. 3. 2. 2) и сварете при непрекъснато кипене с обратно стичане в продължение на 23 часа. След приключване на хидролизата измийте кондензатора с 5 ml цитратен буферен разтвор (3. 24). Свалете колбата от статива и я охладете в ледена вана. Преминете към 5. 3. 3. 5. 3. 2. 4. Затворена хидролиза Поставете шишето с приготвената съгласно 5. 3. 2. 1 или 5. 3. 2. 2 смес в сушилня (4. 3) при 110 °C. За да избегнете покачване на налягането (поради отделянето на газообразни вещества) и за да се предотврати избухване през първия час поставете капачето върху гърлото на съда без да го затваряте. След един час затворете съда с капачката и оставете в сушилнята (4. 3) в продължение на 23 часа. След приключване на хидролизата, извадете съда от сушилнята, внимателно отворете капачката и поставете шишето в ледена вана. Оставете да се охлади. В зависимост от процедурата за коригиране на pH (5. 3. 3), количествено прехвърлете съдържанието на шишето в бекерова чаша от 250 ml или колба с обло дъно от 250 ml като използвате цитратния буферен разтвор (3. 24). Преминете към 5. 3. 3. 5. 3. 3. К о р и г и р а н е н а p H В зависимост от натриевия толеранс на анализатора на аминокиселини (4. 9), преминете към 5. 3. 3. 1 или 5. 3. 3. 2 за да коригирате pH. 5. 3. 3. 1. За хроматографските системи (4. 9) изискващи ниски натриеви концентрации Когато се използват анализатори на аминокиселини, изискващи ниски концентрации на натрий, (и количеството на киселината трябва да се намали) е препоръчително да се използва основен разтвор по вътрешни стандарти (3. 27. 3). 03/т. 25 BG Официален вестник на Европейския съюз 183 В конкретния случай, добавете 2,00 ml основен разтвор по вътрешен стандарт (3. 27. 3) към продукта на хидролизата преди да извършите изпарението. Добавете 2 капки 1-октанол (3. 15) към продукта на хидролизата, получен съгласно параграф 5. 3. 2. 3 или 5. 3. 2. 4. Като използвате ротационен изпарител (4. 7), намалете обема до 5-10 ml във вакуум при температура 40 °С. Ако обемът инцидентно бъде намален до под 5 ml, продуктът от хидролизата трябва да се изхвърли и анализът да бъде повторен. Коригирайте pH до 2,20 с разтвор на натриева основа (3. 18) и пристъпете към параграф 5. 3. 4. 5. 3. 3. 2. За всички останали видове анализатори на аминокиселини (4. 9) Вземете продуктите на хидролизата, получени в 5. 3. 2. 3 или 5. 3. 2. 4 и частчно ги неутрализирайте, като внимателно добавяте докато разбърквате 17 ml разтвор на натриева основа (3. 17), като осигурете температурата да се запази под 40 °С. Коригирайте pH до 2,20 при стайна температура, като използвате разтвор на натриева основа (3. 17) и накрая разтвор на натриева основа (3. 18). Преминете към 5. 3. 4. 5. 3. 4. П р о б е н р а з т в о р з а х р о м а т о г р а ф и я т а Количествено прехвърлете продукта на хидролизата с коригираната киселинност (5. 3. 3. 1 или 5. 3. 3. 2) като използвате цитратен буферен разтвор (3. 24) в градуирана колба от 200 ml и долейте буферен разтвор (3. 24) до маркировката. Ако вече не е използван основен разтвор по вътрешен стандарт, добавете 2,00 ml основен разтвор по вътрешен стандарт (3. 27. 3) и долейте цитратен буферен разтвор (3. 24) до маркировката. Разбъркайте добре. Преминете към хроматографския метод (5. 4). Ако екстрактите не бъдат изследвани същия ден, те трябва да се съхраняват при температура под 5 °С. 5. 4. Хроматография Преди хроматографията уеднаквете температурата на екстракта (5. 2) или продукта на хидролизата (5. 3. 4) със стайната температура. Разклатете сместа и филтрирайте едно подходящо количество през мембранен филтър 0,2 µm (4. 5). Полученият в резултат от това бистър разтвор се подлага на йонообменна хроматография като за целта се използва анализатор на аминокиселини (4. 9). Впръскването може да се извърши както ръчно, така и автоматично. Важното е, в колоната за анализ на стандартните разтвори и пробните разтвори да се добавя едно и също количество разтвор ± 0. 5 %, освен когато се използва основен разтвор по вътрешен стандарт, и отношенията натрий:амино киселини в стандартния и пробния разтвор да бъдат възможно най-близки. В общия случай, честотата на калибриране зависи от устойчивостта на нинхидриновият реактив и от аналитичната система. Стандартният или пробен разтвор се разрежда с цитратен буферен разтвор (3. 24) до постигане на зоната на максимума на стандартния разтвор 30—200 % от зоната на максимума на пробната аминокиселина. Хроматографията на аминокиселините малко се различава при различните видове анализатори и смоли, които се използват. Избраната система трябва да е в състояние да отделя аминокиселините една от друга и от нинхидрин-положителните материали. В рамките на работния си диапазон хроматографската система трябва да дава линейна честотна характеристика на измененията в количествата добавяни в колоната аминокиселини. По време на хроматографския етап отношенията максимум-минимум се прилагат когато се анализира равномоларен разтвор (на аминокиселините, чието съдържание се определя). Равномоларният разтвор задължително трябва да съдържа най-малко 30 % от максималното съдържание на всяка аминокиселина, което може да бъде прецизно измерено със системата за анализ на аминокиселини (4. 9). За отделянето на треонин-серин отношението максимум-минимум на по-ниската от двете припокриващи се аминокиселини от хроматограмата не трябва да надвишава 2:10 (ако се определя съдържанието само на цистеин, метионин, треонин и лизин, недостатъчното отделяне от съседни максимуми ще влоши резултата от определянето). За всички останали аминокиселини, отделянето трябва да бъде по-добро от 1:10. Системата трябва да осигурява отделянето на лизина от „лизиновия продукт“ и орнитина. 6. Изчисляване на резултатите За всяка отделна аминокиселина се измерва зоната на максимума на пробата и стандарта и се изчислява количеството аминокиселина в грамове за всеки килограм от пробата. A × E × MW × F B × W × 1000 = g аминокиселина на килограм проба. Когато се използва основен разтвор по вътрешен стандарт, умножете по D C. 184 BG Официален вестник на Европейския съюз 03/т. 25 A = зона максимим на продукта на хидролизата или екстракта, B C = зона максимум на калибриращия стандартен разтвор, = зона максимум на вътрешния стандартен разтвор в продукта на хидролизата или екстракта, D = зона максимум на вътрешния стандартен разтвор, калибриращия стандартен разтвор, MW = молекулно тегло на аминокиселината, чието съдържание се определя, E = концентрация на стандарта в µmol/ml, W = тегло на пробата (g) (коригирано до първоначалното ако е била изсушавана или обезмаслявана), F = ml общо продукт на хидролизата (5. 3. 4) или ml изчислен общ разтворен обем на екстракта (6. 1). Цистинът и цистеинът се определят като цистеинова киселина в продукти на хидролизата на окислена проба, но се изчисляват като цистин (C6H12N2O4S2, MW 240,30 като се използва MW 120,15 (= 0,5 × 240,30). Метионинът се определя като метионин сулфон в продуктите на хидролизата на окислената проба, но се изчислява като метионин като се използва MW на метионина: 149,21. Добавеният свободен метионин се определя след екстракция като метионин, като за изчисленията се използва същото MW. 6. 1. Общият разтворен обем на екстрактите (F) за определянето на аминокиселините (5. 2) се изчислява, както следва: F = 100 ml × (10 ml + 5 ml) 10 ml × V ml 10 ml V = количеството на окончателния екстракт 7. Оценка на метода Методът е изпробван чрез взаимно сравнение направено на международно ниво през 1990 година като за целта са използвани четири различни животински храни (хранителна смеска за свине, смеска за бройлери, белтъчен концентрат, предварителна смеска). На долната таблица са дадени резултатите за средното и стандартно отклонение след като са елиминирани стойностите, които рязко се отличават от повечето останали замервания. Средни стойности в g/kg. Материал Аминокиселини Треонин Цистеин Метионин Хранителна смеска за свине Смеска за бройлери Белтъчен концентрат Предварителна смеска 6,94 n = 15 9,31 n = 16 22,32 n = 16 58,42 n = 16 3,01 n = 17 3,92 n = 18 5,06 n = 17 — 3,27 n = 17 5,08 n = 18 12,01 n = 17 90,21 n = 16 Лизин 9,55 n = 13 13,93 n = 16 47,74 n = 15 98,03 n = 16 n = брой на участвалите лаборатории 7. 1. Повторяемост Повторяемостта на гореспоменатото сравнително изпитание, изразена като „стандартно лабораторно отклонение“, е дадена на следващите таблици: 03/т. 25 BG Официален вестник на Европейския съюз 185 В рамките на стандартното лабораторно отклонение (Sr) в g/kg Материал Аминокиселини Треонин Цистеин Метионин Хранителна смеска за свине Смеска за бройлери Белтъчен концентрат Предварителна смеска 0,13 n = 15 0,20 n = 16 0,48 n = 16 1,30 n = 16 0,10 n = 17 0,11 n = 18 0,13 n = 17 — 0,11 n = 17 0,16 n = 18 0,27 n = 17 2,19 n = 16 n = брой на участвалите лаборатории Коефициент на изменение (%) на стандартното лабораторно отклонение (Sr) Материал Аминокиселини Треонин Цистеин Метионин Хранителна смеска за свине Смеска за бройлери Белтъчен концентрат Предварителна смеска 1,9 n = 15 2,1 n = 16 2,7 n = 16 2,2 n = 16 3,3 n = 17 2,8 n = 18 2,6 n = 17 — 3,4 n = 17 3,1 n = 18 2,2 n = 17 2,4 n = 16 Лизин 0,26 n = 13 0,28 n = 16 0,99 n = 15 2,06 n = 16 Лизин 2,8 n = 13 2,1 n = 16 2,4 n = 15 2,1 n = 16 n = брой на участвалите лаборатории 7. 2. Възпроизведимост На долната таблица са дадени резултатите за стандартното отклонение между лабораториите при гореспменатото сравнение. Стандартно отклонение между лабораториите (SR) в g/kg Материал Аминокиселини Треонин Цистеин Метионин Хранителна смеска за свине Смеска за бройлери Белтъчен концентрат Предварителна смеска n = брой на участвалите лаборатории 0,28 n = 15 0,48 n = 16 0,85 n = 16 2,49 n = 16 0,30 n = 17 0,34 n = 18 0,62 n = 17 — 0,23 n = 17 0,55 n = 18 1,57 n = 17 6,20 n = 16 Лизин 0,30 n = 13 0,75 n = 16 1,24 n = 15 6,62 n = 16 186 BG Официален вестник на Европейския съюз 03/т. 25 Коефициент изменение (%) за стандартното отклонение между лабораториите (SR) Материал Аминокиселини Треонин Цистеин Метионин Хранителна смеска за свине Смеска за бройлери Белтъчен концентрат Предварителна смеска 4,1 n = 15 5,2 n = 16 3,8 n = 16 4,3 n = 16 9,9 n = 17 8,8 n = 18 12,3 n = 17 — 7,0 n = 17 10,9 n = 18 13,0 n = 17 6,9 n = 16 Лизин 3,2 n = 13 5,4 n = 16 3,0 n = 15 6,7 n = 16 n = брой на участвалите лаборатории 8. Използване на еталонни материали Точното прилагане на метода трябва да се проверява с повтаряне на измерванията върху утвърдени еталонни материали, когато има налични такива. Препоръчва се калибриране с утвърден калибриращ разтвор на аминокиселини. 9. 9. 1 9. 2 9. 3 Наблюдения Поради различията между отделните анализатори на аминокиселини, за ръководни се считат окончателните концентрации на калибриращите разтвори на стандартни аминокиселини (виж 3. 27. 4 и 3. 27. 5) и на продукта на хидролизата (виж 5. 3. 4). Диапазона на линейната характеристика на апарата трябва да се провери за всички аминокиселини. Стандартният разтвор се разрежда с цитратен буфер, за да могат зоните на максимума да се получат в средата на диапазона. Когато за анализиране на продукти на хидролизата се използва течно хроматографско оборудване с високи експлоатационни качества, експерименталните условия трябва да бъдат оптимизирани според препоръките на производителя. При прилагането на метода за животински храни съдържащи повече от 1 % хлорид (концентрати, минерални храни, хранителни добавки) е възможно да се получат твърде ниски стойности за метионина и затова се налага специална обработка. ОПРЕДЕЛЯНЕ СЪДЪРЖАНИЕТО НА СУРОВИ МАСЛА И МАЗНИНИ ЧАСТ Б 1. Цел и обхват Този метод служи за определяне съдържанието на сурови масла и мазнини в животинските храни. Той не обхваща анализа на маслодайни семена и плодове, дефинирани в Регламент № 136/66/ЕИО на Съвета от 22 септември 1966 година. Използването на двете процедури разгледани по-долу зависи от характера и състава на храните и причината за извършване на анализа. 1. 1. Процедура А – Директно екстрактируеми природни масла и мазнини Този метод е приложим за хранителни материали с растителен произход, с изключение на включените в обхвата на процедура Б. 1. 2. Процедура Б – Общо съдържание на сурови природни масла и мазнини Този метод е приложим за хранителни материали с животински произход и за всички смесени храни. Той трябва да се използва за всички материали, от които маслата и мазнините не могат да бъдат извлечени напълно без преди това да се осъществи хидролиза (т. е. глутени, мая, картофени протеини и продукти подлежащи на преработка, като екструдиране, наслояване и нагряване). 03/т. 25 BG Официален вестник на Европейския съюз 187 1. 3. Обсъждане на резултатите Във всички случаи когато се получава по-висок резултат когато се използва процедура Б в сравнение с този от процедура А, за действителни се приемат резултатите от процедура Б. 2. Принцип 2. 1. Процедура А Пробата се отделя с петролеев етер. Разтворителят се отделя чрез дестилация и остатъка се изсушава и претегля. 2. 2. Процедура Б Пробата се обработва със солна киселина под действието на топлина. Сместа се охлажда и флитрира. Утайката се измива и изсушава и подлага на определяне на съдържанието съгласно процедура А. Реактиви Петролеев етер с диапазон на кипене: 40 до 60°. Бромното число трябва да бъде под 1 и утайката при изпарение – под 2 mg/100 ml. Натриев сулфат, безводен. Солна киселина, с = 3 mol HCl/l. Средство улесняващо филтрирането, например кизелгур, супер-клетъчно средство Hyflo. Апаратура Екстракционна апаратура. Когато е снабдена със сифон (апарат на Сокслет), скоростта на обратния поток трябва да бъде такава, че да се получават около 10 цикъла на час; когато апаратът не е сифонен тип, скоростта на обратния поток трябва да бъде около 10 ml в минута. Екстракционни гилзи, свободни от разтворими в петролеев етер вещества и с порьозност, която отговаря на изискванията на точка 4. 1. Сушилня – вакуумна сушилня регулирана на 75 °С ± 3 °С или въздушна сушилня регулирана на 100 °С ± 3 °С. 3. 3. 1. 3. 2. 3. 3. 3. 4. 4. 4. 1. 4. 2. 4. 3. 5. Процедура 5. 1. Процедура А (виж точка 8. 1) Претеглете 5 g от пробата до най-близкия 1 mg, прехвърлете я в една екстракционна гилза (4. 2) и закрийте с памучен тампон, по който не трябва да има мазнини. Поставете гилзата в екстрактора (4. 1) и екстрактирайте в продължение на шест часа с петролеев етер (3. 1). Съберете петролеевия етерен екстракт в суха градуирана колба, в която има частици пемза на късове (1). Отстранете разтворителя чрез дестилация. Изсушете утайката, като оставите колбата за час и половина в сушилнята (4. 3). Оставете да изстине в изпарител и претеглете. Изсушете отново за 30 минути, за да сте сигурни, че теглото на маслата и мазнините остава постоянно (загубата в теглото между две последователни претегляния трябва да бъде по-малка от 1 mg). 5. 2. Процедура Б Претеглете 2,5 g от пробата до най-близкия 1 mg (виж точка 8. 2), поставете в бекерова чаша от 400 ml или конусообразна колба от 300 ml и добавете 100 ml солна киселина (3. 3) и частици пемза на късове. Закрийте бекеровата чаша със стъкло за наблюдение или поставете на конусообразната колба кондензатор за обратния поток. Оставете сместа да заври леко над слаб пламък или котлон и я задръжте така един час. Не позволявайте на продукта да полепне по стените на съда. Охладете и добавете малко количество средство за подпомагане на филтрирането (3. 4), достатъчно да не позволи загуба на масло и мазнини по време на филтрирането. Филтрирайте през навлажнена, несъдържаща мазнини, двойна филтърна хартия. Измийте утайката в студена вода до получаване на неутрален филтрат. Проверете дали филтратът не съдържа масла и мазнини. Наличието им означава, че преди хидролизата пробата трябва да бъде екстрактирана с петролеев етер, като се използва процедура А. Поставете двойната филтърна хартия с утайката върху стъкло за наблюдения и изсушете в продължение на час и половина във въздушната сушилня (4. 3) 100 °С ± 3 °С. Поставете двойната филтърна хартия със сухата утайка в екстракционна гилза (4. 2) и покрийте с памучен тампон без съдържание на мазнини. Поставете гилзата в екстрактор (4. 1) и продължете както е указано във втория и третия параграф на точка 5. 1. (1) Когато маслото или мазнините трябва след това да бъдат подложени на изпитания за качество, вместо пемза на късове използвайте стъклени сачми. 188 BG Официален вестник на Европейския съюз 03/т. 25 6. 7. 8. 8. 1. 8. 2. 8. 3. 8. 4. 8. 5. 8. 6 Изразяване на резултатите Изразете теглото на утайката като процент от това на пробата. Повторяемост Разликата между резултатите на две паралелни определяния на съдържанието, извършени върху една и съща проба от един и същ лаборант, не трябва да надвишава: — 0. 2 % в абсолютна стойност, за съдържание на сурови природни масла и мазнини по-малко от 5 %, — 4. 0 % спрямо най-високия резултат за съдържания от 5 до 10 %, — 0. 4 % в абсолютна стойност, за съдържания над 10 %. Наблюдения При продукти с високо съдържание на масла и мазнини, които трудно се трошат или не са подходящи за получаване на хомогенна редуцирана тестова проба, процедирайте както следва: Претеглете 20 g от пробата до най-близкия 1 mg и смесете с 10 g или повече безводен натриев сулфат (3. 2). Екстрактирайте с петролеев етер (3. 1), както е указано в точка 5. 1. Долейте към получения екстракт петролеев етер (3. 1) до 500 ml и смесете. Вземете 50 ml от разтвора и поставете в малка, суха, градуирана колба, в която има частици пемза на късове (1). Отстранете разтворителя чрез дестилация, изсушете и продължете както е указано в последния параграф на точка 5. 1. Отстранете разтворителя от утайката от екстракцията, която е останала в гилзата, натрошете пробата до едрина 1 мм, върнете я в екстракционната гилза (не добавяйте натриев сулфат) и продължете както е указано във втория и третия параграф на точка 5. 1. Изчислете съдържанието на масла и мазнини като процент от пробата, като за целта използвате следната формула: (10 a + b) × 5, където: а = масата в грамове на утайката след първата екстракция (аликвотна част от екстракта), b = масата в грамове на утайката след втората екстракция. При продукти с ниско съдържание на мазнини, тестовата проба може да се увеличи на 5 g. Преди хидролизата и екстракцията, съгласно процедура Б, може да е необходимо храните за домашни любимци, които са с високо водно съдържание, да се смесят с безводен натриев сулфат. В параграф 5. 2, за измиване на утайката след филтрирането може да е по-ефикасно да се използва топла вода вместо студена. За някои видове храни може да се наложи времето за сушене от 1,5 часа да бъде увеличено. Трябва да се избягва прекалено изсушаване, тъй като това може да доведе до занижени резултати. Може да се използва също и микровълнова печка. Когато съдържанието на сурови масла/мазнини е по-голямо от 15 % се порепоръчва преди хидролизата да се направи предварителна екстракция съгласно процедура А и повторна екстракция съгласно процедура Б. Това донякъде зависи от характера на храните и характера на маслата/мазнините в храните. ЧАСТ В ОПРЕДЕЛЯНЕ СЪДЪРЖАНИЕТО НА ОЛАХИНДОКС (2-[N-2′-(хидроксиетил)карбамоил]-3-метилхиноксалин-N1,N4-диоксид) 1. Цел и обхват Методът служи за определяне съдържанието на олахиндокс в храни за животни. Долната граница на определено съдържание е 5 mg/kg. 2. Принцип Пробата се екстрактира посредством смес от вода и метанол. Съдържанието на олахиндокс се определя посредством течна хроматография в обратна фаза (HPLC), като се използва UV детектор. (1) Когато маслото или мазнините трябва след това да бъдат подложени на изпитания за качество, вместо пемза на късове използвайте стъклени сачми. 03/т. 25 BG Официален вестник на Европейския съюз 189 3. 3. 1. 3. 2. 3. 3. 3. 4. 3. 5. Реактиви Метанол Метанол, тип HPLC Вода, тип HPLC Невискозна фаза за HPLC: Смес от вода (3. 3) и метанол (3. 2), 900 + 100 (V + V). Стандартно вещество: чист олахиндокс 2-[N-2′-(хидроксиетил)карбамоил]-3-метилхиноксалин-N1, N4- диоксид, Е 851. 3. 5. 1 Основен стандартен разтвор на олахиндокс, 250 µg/ml. Претеглете до най-близките 0,1 mg 50 mg олахиндокс (3. 5) в градуирана колба от 200 ml и добавете ca. 190 ml. След това поставете колбата в ултразвукова вана (4. 1) в продължение на 20 минути. След обработката с ултразвук, охладете разтвора до стайна температура, долейте вода до маркировката и разбъркайте. Завийте колбата в алуминиево фолио и съхранявайте в хладилник. Този разтвор трябва да се приготвя ежемесечно, за да е пресен. 3. 5. 2 Междинен стандартен разтвор на олахиндокс, 25 µg/ml. Прехвърлете 10,0 ml от основния стандартен разтвор (3. 5. 1) в градуирана колба от 100 ml, долейте невискозната фаза (3. 4) до маркировката и разбъркайте. Завийте колбата в алуминиево фолио и съхранявайте в хладилник. Този разтвор трябва да се приготвя ежедневно, за да е пресен. 3. 5. 3 Решения за калибрирането: Последователно прехвърлете в градуирана колба от 50 ml 1,0, 2,0, 5,0, 10,0, 15,0 и 20,0 ml от междинния стандартен разтвор (3. 5. 2). Долейте невискозната фаза (3. 4) до маркировката и разбъркайте. Завийте колбата в алуминиево фолио. Тези разтвори съответстват съответно на 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 7,5 и 10,0 µg олахиндокс на ml. Тези разтвори трябва да се приготвят ежедневно, за да са пресни. 4. 4. 1. 4. 2. 4. 3. Апаратура Ултразвукова вана Механичен вибратор Оборудване за HPLC с ултравиолетов детектор или детектор със система от диоди с варираща дължина на вълната 4. 3. 1. Течна хроматографска колона, 250 mm × 4 mm, C18, 10 µm обшивка или подобна. 4. 4. Мембранни филтри, 0,45 µm. 5. Процедура Забележка: Олахиндоксът е светочувствителен. Извършвайте всички процедури под убита светлина или използвайте кехлибарена стъклария. 5. 1. Общо 5. 1. 1. 5. 1. 2. Анализира се празна проба за да се провери дали по нея няма олахиндокс или други влияещи върху нея вещества. Извършва се регенерационен тест посредством анализиране на празната проба като се обогатява с добавянето на известно количество олахиндокс, равно на наличното количество в пробата. За обогатяване до нивото от 50 mg/kg прехвърлете 10,0 ml от основния стандартен разтвор (3. 5. 1) в конусообразна колба от 250 ml и изпарете разтвора до ca. 0,5 ml. Добавете 50 g празна проба, разбъркайте добре и оставете 10 минути като разбърквате няколко пъти преди да продължите с етапа на екстракция (5. 2). Забележка: За целите на този метод празната проба трябва да бъде сходна по вид с действителната проба и не трябва да се отчита наличие на олахиндокс. 5. 2. Екстракция Претеглете до най-близките 0. 01 g приблизително 50 g от пробата. Прехвърлете в конусообразна колба от 1000 ml, добавете 100 ml метанол (3. 1) и поставете колбата в ултарзвукова вана (4. 1) за 5 минути. Добавете 410 ml вода и оставете в ултразвуковата вана още 15 минути. Извадете колбата от ултразвуковата вана, разклатете в продължение на 30 минути с вибратора (4. 2) и филтрирайте през нагънат филтър. Прехвърлете 10,0 ml от отфилтрувания материал в градуирана колба от 20 ml, долейте вода до маркировката и разбъркайте. Една аликвотна част се филтрира през мембранен филтър (4. 4) (виж 9. Наблюдения) Преминете към определяне на съдържанието посредством HPLC (5. 3). 190 BG Официален вестник на Европейския съюз 03/т. 25 5. 3. Определяне съдържанието посредством HPLC 5. 3. 1 П а р а м е т р и Като ориентир предлагаме следните условия, но могат да се използват и други, при условие че дават същите резултати: Аналитична колона (4. 3. 1) Мобилна фаза (3. 4): смес от вода (3. 3) и метанол (3. 2), 900 + 100 (V + V) Дебит: 1,5—2 ml/min. Дължина на вълната на отчитане: 380 nm Обем на впръскване: 20 µl—100 µl Проверете устойчивостта на хроматографската система, като няколко пъти впръскате хроматографския разтвор (3. 5. 3), в който се съдържат 2,5 µg/ml, докато се постигнат постоянни височини на максимума и постоянни времена на задържане. 5. 3. 2 К а л и б р и р а щ а г р а ф и к а Впръскайте всеки калибриращ разтвор (3. 5. 3. ) няколко пъти и определете средната височина на максимума (площта) за всяка концентрация. Начертайте калибрираща графика като нанесете средната височина на максимума (площта) на калибриращите разтвори на ординатата, а съответната концентрация в µg/ml — на абцисата. 5. 3. 3 П р о б е н р а з т в о р Впръскайте пробния екстракт (5. 2) няколко пъти като използвате същия обем както за калибриращите разтвори и определете средната височина на максимума (площта) за максимумите за олахиндокса. 6. Изчисление на резултатите От средната височина (площ) на максимумите за олахиндокса в пробния разтвор определете концентрацията на пробния разтвор в µg/ml спрямо калибриращата графика (5. 3. 2). Съдържанието на олахиндокс w в mg/kg в пробата се определя по формулата: w = c ×1000 m където: с = концентрацията на олахиндокс на пробния екстракт (5. 2) в µg/ml m = масата на пробната порция в g (5. 2). 7. Проверка на резултатите 7. 1. Идентичност Идентичността на анализираната проба може да бъде проверена посредством извършване на паралелна хроматография или с детектор със система от диоди с варираща дължина на вълната, с помощта на който се сравняват спектрите на пробния екстракт (5. 2) и на калибриращия разтвор (3. 5. 3), съдържащ 5,0 µg/ml. 7. 1. 1. П а р а л е л н а х р о м а т о г р а ф и я Един екстракт от пробата (5. 2) се обогатява с добавяне на подходящо количество калибриращ разтвор (3. 5. 3). Добавеното количество олахиндокс трябва да бъде равно на количеството олахиндокс в пробата. Трябва да се увеличи само височината на максимума на олахиндокса след като се вземе предвид както добавеното количество, така и разреждането на екстракта от пробата. Широчината на максимума по средата на височината му трябва да бъде в рамките от ± 10 % от първоначалната широчина на максимума на олахиндокса в необогатената проба. 7. 1. 2. О т ч и т а н е с ъ с с и с т е м а о т д и о д и с в а р и р а щ а д ъ л ж и н а н а в ъ л н а т а Резултатите се оценяват според следните критерии: а) Дължината на вълната при максимална оптична плътност на пробата и на стандартните спектри, отчетени на върха на максимума на хроматограмата, трябва да бъдат в рамките на диапазона, определен от разрешаващата способност на отчитащата система. За отчитане със система от диоди с варираща дължина на вълната този диапазон обикновено е в рамките на ± 2 nm. 03/т. 25 BG Официален вестник на Европейския съюз 191 б) Между 220 и 400 nm, спектрите на пробата и на еталона, отчетени на върха на максимума на хроматограмата не трябва да се различават за онези части от спектъра, които са в рамките от 10 до 100 % от относителната оптична плътност. Този критерий е спазен когато имаме едни и същи максимуми и отклонението между двата спектъра в която и да е точка не надвишава 15 % от оптичната плътност на анализирания еталон. в) Между 220 и 400 nm, спектрите на точките от изкачващата се страна, върха и слизащата страна на кривата за пробния екстракт не трябва да се различават един от друг за онези част от спектъра, които попадат в рамките на диапазона от 10—100 % от относителната оптична плътност. Този критерий е спазен когато имаме едни и същи максимуми и отклонението между спектрите, в която и да е точка, не надвишава 15 % от оптичната плътност на спектъра на върха на максимума. Когато не е спазен един от тези критерии, наличието на анализираното съдържание не може да бъде потвърдено. 7. 2. Повторяемост Разликата между резултатите от две успоредни определяния на съдържанието, извършени върху една и съща проба, не трябва да надвишава 15 % спрямо по-високия резултат за съдържание на олахиндокс между 10 и 200 mg/kg. 7. 3. Регенериране За една обогатена празна проба регенерирането трябва да бъде най-малко 90 %. 8. Резултати от едно съвместно проучване Организирано бе съвместно проучване, при което 13 лаборатории анализираха четири проби от храна за малки прасенца, включително една празна проба. Резултатите са обобщени по-долу: Проба 1 Проба 2 Проба 3 Проба 4 L n средно (mg/kg) (Sr) (mg/kg) (SR) (mg/kg) CVr (%) CVR (%) Номинално съдържание(mg/kg) Регенериране (%) L: брой на лабораториите 13 40 — — — — — — — 10 40 14,6 0,82 1,62 5,6 11,1 15 97,3 11 44 48,0 2,05 4,28 4,3 8,9 50 96,0 11 44 95,4 6,36 8,42 6,7 8,8 100 95,4 брой на единичните стойности стандартно отклонение на повторяемостта n: Sr: SR: CVr: коефициент на изменение на повторяемостта CVR: коефициент на изменение на възпроизводимостта. стандартно отклонение на възпроизводимостта 9. Наблюдения Въпреки че методът още не проверен за храни със съдържание на олахиндокс повече от 100 mg/kg, възможно е да се постигнат задоволителни резултати като се вземе проба с по-малко тегло и/или екстракта (5. 2) се разтвори до постигане на концентрация в рамките на диапазона на калибриращата крива (5. 3. 2)