title: Komisjoni direktiiv 2000/33/EÜ, 25. aprill 2000, millega kohandatakse kahekümne seitsmendat korda tehnika arenguga nõukogu direktiivi 67/548/EMÜ ohtlike ainete liigitamist, pakendamist ja märgistamist käsitlevate õigus- ja haldusnormide ühtlustamise kohtaEMPs kohaldatav tekst.

eurovoc_concepts:
analytical chemistry
approximation of laws
chemical product
cytology
toxicology

text: 242 ET Euroopa Liidu Teataja 13/25. kd 32000L0033 8. 6. 2000 EUROOPA ÜHENDUSTE TEATAJA L 136/90 KOMISJONI DIREKTIIV 2000/33/EÜ, 25. aprill 2000, millega kohandatakse kahekümne seitsmendat korda tehnika arenguga nõukogu direktiivi 67/548/EMÜ ohtlike ainete liigitamist, pakendamist ja märgistamist käsitlevate õigus- ja haldusnormide ühtlustamise kohta (*) (EMPs kohaldatav tekst) EUROOPA ÜHENDUSTE KOMISJON, ON VASTU VÕTNUD KÄESOLEVA DIREKTIIVI: võttes arvesse Euroopa Ühenduse asutamislepingut, Artikkel 1 võttes arvesse nõukogu 27. juuni 1967. aasta direktiivi 67/548/EMÜ ohtlike ainete liigitamist, pakendamist ja märgista- mist käsitlevate õigus- ja haldusnormide ühtlustamise kohta, (1) viimati muudetud Euroopa Parlamendi ja nõukogu direktiiviga 1999/33/EÜ, (2) eriti selle artiklit 28, ning arvestades järgmist: (1) (2) (3) (4) Direktiivi 67/548/EMÜ V lisas on sätestatud ainete ja val- mististe füüsikalis-keemiliste omaduste, toksilisuse ning ökotoksilisuse määramise meetodid. Kõnealust lisa on vaja kohandada tehnika arenguga. Vastavalt nõukogu 24. novembri 1986. aasta direktiivi 86/609/EMÜ (katseteks ja muudel teaduslikel eesmärkidel kasutatavate loomade kaitsega seotud liikmesriikide õigus- ja haldusnormide ühtlustamise kohta) (3) artikli 7 punktile 2 ei kasutata katsete tegemisel loomi, kui on olemas teine teaduslikult rahuldav meetod tulemuse saamiseks mõistli- kul ja praktilisel viisil. Komisjon kavatseb kehtestada direktiivi 67/548/EMÜ V lisas teatavad alternatiivsed uurimismeetodid, milles loomi ei kasutata, et need meetodid oleksid kättesaadavad kemikaalide katsetamisel vastavalt direktiivi 67/548/EMÜ artikli 3 lõikele 1. Käesolevas direktiivis sätestatud meetmed on kooskõlas ohtlike ainete ja valmististe tehniliste kaubandustõkete kõr- valdamist käsitlevaid direktiive tehnika arenguga kohan- dava komitee arvamusega, Käesoleva direktiivi I ja II lisa tekst lisatakse direktiivi 67/548/EMÜ V lisa B osale. Artikkel 2 1. Liikmesriigid jõustavad käesoleva direktiivi järgimiseks vajali- kud õigus- ja haldusnormid hiljemalt 1. oktoobriks 2001. Nad teatavad sellest viivitamata komisjonile. Kui liikmesriigid need sätted vastu võtavad, lisavad nad nendesse või nende ametliku avaldamise korral nende juurde viite käes- olevale direktiivile. Sellise viitamise viisi näevad ette liikmesriigid. 2. Liikmesriigid edastavad komisjonile käesoleva direktiiviga reguleeritavas valdkonnas nende poolt vastuvõetud siseriiklikud põhilised õigusnormid ning käesoleva direktiivi ja vastuvõetud siseriiklike normide vahelise vastavustabeli. Artikkel 3 Käesolev direktiiv jõustub kolmandal päeval pärast avaldamist Euroopa Ühenduste Teatajas. selle Artikkel 4 Käesolev direktiiv on adresseeritud liikmesriikidele. Brüssel, 25. aprill 2000 Komisjoni nimel komisjoni liige Margot WALLSTRÖM (*) Vastu võetud enne kahekümne kuuendat kohandamist. (1) EÜT 196, 16. 8. 1967, lk 1. (2) EÜT L 199, 30. 7. 1999, lk 57. (3) EÜT L 358, 18. 12. 1986, lk 1. 13/25. kd ET Euroopa Liidu Teataja 243 I LISA “B. 40. NAHASÖÖVITUS 1. MEETOD 1. 1. Sissejuhatus Alternatiivsete meetodite valideerimise Euroopa keskus (ECVAM, Ühisuuringute Keskus, Euroopa komis- jon) on kiitnud heaks kaks nahasöövituse in vitro katset (roti naha transkutaanse elektrilise takistuse (TER) määramine ja inimnaha mudelit kasutav katse) kui teaduslikult tõesed (1) (2) (3). ECVAMi valideerimis- uuring näitas, et mõlema katsega on võimalik teha usaldusväärselt vahet naha tuntud söövitavate ainete ja mittesöövitavate ainete vahel. Lisaks sellele võimaldab inimese naha mudelil põhineva katse protokoll teha korrektset vahet söövitava toime määrade vahel (tuntud tugevad nahka söövitavad ained, R35, ja muud nahka söövitavad ained, R34) (2). Mõlema katse kirjeldused ja protseduurid on ära toodud, valik selle kohta, millist katset kasutada, oleneb spetsiifilistest nõuetest ja kasutaja eelistusest. Vt ka üldise sissejuhatuse B osa. 1. 2. Mõisted Nahasöövitus — naha kudede pöördumatu kahjustuse tekkimine pärast uuritava materjali pealekandmist. 1. 3. Võrdlusained Ei ole määratletud, kuid vt punkte 1. 5. 3. 4 ja 1. 7. 2. 3. 1. 4. Uurimismeetodi põhimõte — roti naha TERi määramine Uuritav materjal kantakse kuni 24 tunniks humaanselt hukatud noorte rottide karvadega toornahast võe- tud nahaketaste epidermisele. Söövitavad materjalid tehakse kindlaks nende võime alusel põhjustada nor- maalse sarvkihi terviklikkuse ja kaitsefunktsiooni kadumist, mida määratakse iseloomuliku TER vähene- misega alla läviväärtust (5 kΩ) (4) (5). Ärritavad ja mitteärritavad materjalid ei vähenda TERi alla läviväärtust. Pindaktiivsete ainete ja neutraalsete orgaaniliste ühendite (vt määratlust viitest (6)) uurimise protseduuri võib kaasata värvaine sidumisetapi nende keemiliste ühendite korral (2) (7) saadavate spet- siifiliselt valede positiivsete tulemuste arvu vähendamiseks. 1. 5. Uurimismeetodi kirjeldus — roti naha TERi määramine 1. 5. 1. Loomad Nahaketaste valmistamiseks vajatakse noori (20–23 päeva vanuseid) rotte (Wistar või samaväärne liin). Dorsaal- ja küljekarvad eemaldatakse hoolikalt väikeste loomade jaoks mõeldud kääridega. Seejärel pes- takse loomad ettevaatliku üle pühkides, kattes piirkonna antibiootikumi lahusega (mis sisaldab näiteks streptomütsiini, penitsilliini, klooramfenikooli ja amfoteritsiini kontsentratsioonides, mis toimivad bak- terite kasvule inhibeerivalt). Seejärel pestakse loomad antibiootikumidega uuesti kolmandal või neljandal päeval pärast esimest pesemist ning neid kasutatakse mitte hiljem kui kolme päeva pärast (loomad ei tohi toornaha preparaadi ettevalmistamisel olla vanemad kui 31 päeva). 1. 5. 2. Nahaketaste ettevalmistamine Loomad hukatakse humaansel viisil. Seejärel eemaldatakse iga looma dorsaalnahk ja eemaldatakse liigne rasv seda nahalt ettevaatlikult ära koorides. Nahk paigutatakse polütetrafluoroetüleenist (PTFE) toru otsale nii, et epidermiskiht on toruga kontaktis. Kummist rõngastihend surutakse toru otsale eesmärgiga hoida nahk kohal ning liigne kude lõigatakse maha. Toru ja rõngastihendi mõõtmed on toodud joonisel 1. See- järel tihendatakse kummist rõngastihendi ja PTFE-toru otsa liitekoht ettevaatlikult vaseliiniga. Toru hoiab magneesiumsulfaadi lahust (154 mM) sisaldavas vastuvõtukambris kohal vedruklamber (joonis 2). 1. 5. 3. Katsemenetlus 1. 5. 3. 1. U u r i t a v a m a t e r j a l i r a k e n d a m i n e Vedelad uuritavad ained (150 μl) kantakse torus (joonis 2) olevale epidermisele. Kui uuritakse tahkeid materjale, siis kantakse kettale piisav kogus tahket ainet ja tagatakse kogu epidermise pinna katmine sel- lega. Seejärel lisatakse tahke aine pinnale deioniseeritud vett (150 μl) ja torusid loksutatakse ettevaatli- kult. Uuritavad ained peavad olema nahaga võimalikult täielikus kontaktis. Mõnede tahkete ainete korral võib seda saavutada soojendamisel kuni 30 °Cni selleks, et uuritavat ainet sulatada, või jahvatamisega sel- leks, et saada granuleeritud materjali või pulbrit. 244 ET Euroopa Liidu Teataja 13/25. kd Iga uuritava aine korral kasutatakse kolme nahaketast. Uuritavad ained kantakse peale 24 tunniks (vt ka 1. 5. 3. 4). Uuritav aine eemaldatakse pesemisel kraanivee joaga temperatuuril kuni 30 °C seni, kuni ei eemaldu enam mingit materjali. Torus tahkestunud uuritavate ainete eemaldamist saab kiirendada pese- misel ligikaudu 30 °C temperatuuriga sooja vee joaga. 1. 5. 3. 2. TERi mõõtmised TER mõõdetakse madalpingelise vahelduvvoolusilla abil (näiteks AIM 401 või 6401 või samaväärsed). Enne elektritakistuse määramist vähendatakse naha pindpinevust, lisades epidermise katmiseks piisava ruumala 70 %list etanooli. Mõne sekundi pärast eemaldatakse etanool, pöörates toru ümber ja kude hüdraaditakse 3 ml magneesiumsulfaadi lahuse (154 mM) lisamisega. Silla elektroodid paigaldatakse nahaketta mõlemale poolele takistuse määramiseks ühikutes kΩ nahaketta kohta (joonis 2). Elektroodi mõõtmed ja elektroodi krokodillklemmist allpool oleva isoleerimata osa pikkus on toodud joonisel 1. Sisemine (jäme) elektroodiklamber lasub takistuse mõõtmise ajal PTFE-toru peal, millega tagatakse mag- neesiumsulfaadilahusesse uputatud elektroodi pikkuse konstantsus. Välimine (õhuke) elektrood paikneb vastuvõtukambris siis selliselt, et lebab kambri põhjas. Vedruklambri aluse ja PTFE-toru põhja vaheline kaugus hoitakse konstantsena (joonis 1), sest see kaugus mõjutab määratava takistuse väärtust. Tuleb märkida, et kui mõõdetud takistuse väärtus on üle 20 kΩ, siis võib see olla tingitud nahaketta epi- dermisel oleva uuritava aine kattekihist. Seda kattekihti võib püüda eemaldada näiteks PTFE-toru sulge- misel kindasõrme kujulise kattega ja ligikaudu 10 sekundi jooksul loksutamisega, magneesiumsulfaadi- lahus valatakse ära ning takistuse määramist korratakse katset värske magneesiumsulfaadilahusega. Vastuvõetavad on TERi keskmised tulemused tingimusel, et kaasnevad positiivsed ja negatiivsed kont- rollväärtused langevad meetodi jaoks vastuvõetavatesse piiridesse. Soovitatavad kontrollained ja nendega seostatavad vastuvõetavad takistused siinkirjeldatud metodoloogia ja aparatuuri jaoks on: Kontrollimine Aine Positiivne Negatiivne 10 M vesinikkloriidhape (36 %) Destilleeritud vesi Takistuse vahemik (kΩ) 0,5–1,0 10–25 1. 5. 3. 3. M o d i f i t s e e r i t u d p r o t s e d u u r p i n d a k t i i v s e t e a i n e t e j a n e u t r a a l s e t e o r g aa n i l i s t e ü h e n - d i t e k o r r a l Kui uuritavateks aineteks on pindaktiivsed ained või neutraalsed orgaanilised ühendid ja TERi määratud väärtused on väiksemad või võrdsed 5 kΩ, siis tuleb hinnata värvainete sissetungi ulatust kudedes. See protseduur määrab, kas tulemused on vale-positiivsed (2). 1. 5. 3. 3. 1. Värvaine sulforodamiin B pealekandmine ja eemaldamine Pärast esialgset töötlemist uuritava ainega kantakse iga nahaketta epidermise pinnale 2 tunniks 150 μl 10 % (massi-/mahuprotsent) värvaine sulforodamiin B lahjendust destilleeritud vees. Seejärel pestakse nahakettaid toatemperatuurilise kraanivee joaga ligikaudu 10 sekundi jooksul mis tahes liigse/seostumatu värvaine eemaldamiseks. Iga nahaketas eemaldatakse ettevaatlikult PTFE-torult ja paigutatakse viaali (nt klaasist 20 ml stiintsillatsiooniviaali), mis sisaldab destilleeritud vett. Viaale loksutatakse ettevaatlikult 5 minutit mis tahes liigse/seostumata värvaine eemaldamiseks. Seejärel korratakse loputusprotseduuri, pärast mida nahaketta eemaldatakse ja viiakse viaalidesse, mis sisaldavad 5 ml 30 % (massi- /mahuprotsent) naatriumdodetsüülsulfaati destilleeritud vees ja inkubeeritakse ööpäev temperatuuril 60 °C. Pärast inkubeerimist eemaldatakse nahakettad ja visatakse ära ning järelejäänud lahust tsentrifuu- gitakse 8 minutit temperatuuril 21 °C (suhteline tsentrifugaaljõud ˜175). Seejärel lahjendatakse superna- tandist võetud 1 ml proovi 5 korda (maht/maht) (st 1 ml + 4 ml) 30 %lise (massi/mahuprotsent) SDSiga destilleeritud vees. Lahuse optiline tihedus mõõdetakse lainepikkusel ligikaudu 565 nm. 1. 5. 3. 3. 2. Värvaine sisalduse arvutamine Värvaine sulforodamiin B sisalduskettas arvutatakse OD väärtustest (värvaine sulforodamiin B molaarne neeldetegur lainepikkusel 565 nm = 8,7 × 104; molekulmass = 580). Värvaine sulforodamiin B sisaldus määratakse iga nahaketta jaoks ning seejärel arvutatakse värvaine keskmine sisaldus täpsetes koopiates. Värvaine seostumise keskmised tulemused on vastuvõetavad tingimusel, et kaasnevad kontrollväärtused langevad meetodi jaoks vastuvõetavatesse piiridesse. Soovitatavad vastuvõetavad värvaine sisalduse pii- rid kontrollainete jaoks siinkirjeldatud metodoloogia ja aparatuuri korral on: 13/25. kd ET Euroopa Liidu Teataja 245 Kontrollimine Aine Positiivne Negatiivne 10 M vesinikkloriidhape (36 %) Destilleeritud vesi 1. 5. 3. 4. L i s a t e a v e Värvaine sisalduse vahemik (μg/ketas) 40–100 15–35 Uuritavaid aineid võib nahaketastele kanda ka lühemateks ajavahemikeks (nt 2 tunniks) eesmärgiga iden- tifitseerida tugevalt söövitavaid materjale. Valideerimisega seotud uurimise käigus on siiski leitud, et TERi määramisel on kalduvus saada mitmesuguste uuritavate kemikaalide pealekandmisel ülehinnatud söövi- tusvõime nende toimel nahaketastele 2 tunni vältel (2), kuigi see katse võimaldab õigesti identifitseerida söövitavaid ja mittesöövitavaid kemikaale pärast nende 24 tunnilist toimet. Katseseadme omadused ja mõõtmed ning kasutatav eksperimentaalne protseduur võivad mõjutada saa- davaid TERi väärtusi. Söövituse läviväärtus 5 kΩ töötati välja käesolevas meetodis kasutatud eriseadme ja protseduuri abil saadud andmete põhjal. Kui katsetingimusi on olulisel määral muudetud, siis võib kasutada erinevad lävi- ja kontrollväärtusi. Seega on soovitav, et nii metodoloogia kui ka takistuse lävi- väärtused kalibreeritakse valideerimise uurimisel kasutatud kemikaalide hulgast valitud võrdlusstandar- dite seeria uuringute põhjal (3). 1. 6. Uurimismeetodi põhimõte — katse inimese naha mudeliga Uuritav materjal pannakse pindmiselt kuni 4 tunniks inimnaha kolmemõõtmelisele mudelile, mis kuju- tab endast imiteerivat epidermis funktsioneerivat sarvkihti. Söövitavad materjalid identifitseeritakse nende võime alusel põhjustada rakkude eluvõimelisuse vähenemist (määratletud näiteks MTT vähenemise kat- ses) allapoole määratletud läviväärtust kindlate toimeaegade jooksul. Määramise põhimõte on kooskõlas hüpoteesiga, et söövitavad kemikaalid on need, mis on võimelised sarvkihti sisse tungima (difusiooni või erosiooni teel) ning mis on piisavalt tsütotoksilised selleks, et põhjustada allolevates rakukihtides olevate rakkude hukkumist. 1. 7. Uurimismeetodi kirjeldus — katse inimese naha mudeliga 1. 7. 1. Inimese naha mudelid Inimese naha mudelid võivad olla erineva päritoluga, kuid need peavad vastama teatavatele kriteeriumi- dele. Mudelis peab olema funktsioneeriv sarvkest koos alloleva elusrakkude kihiga. Sarvkihi kaitsefunkt- sioon peab olema adekvaatne. Seda saab näidata, demonstreerides mudeli vastupanuvõimet tsütotoksi- lisusele pärast ainete pealekandmist, mis on tuntud omaduse poolest olla rakkudele tsütotoksiline, kuid mis tavaliselt ei läbi sarvkihti. Mudeli korral peab olema näidatud reprodutseerivate tulemuste saamine kindlaksmääratud eksperimentaalsetes tingimustes. Mudelis olevate elusrakkude eluvõimelisus peab olema piisavalt kõrge, et teha selget vahet positiivsete ja negatiivsete kontrollainete vahel. Rakkude eluvõimelisus (mõõdetud näiteks MTT vähenemise kaudu, st OD väärtus) pärast allutamist negatiivse kontrollaine toimele peab olema konkreetse mudeli jaoks vas- tuvõetavates piirides. Analoogiliselt peab rakkude eluvõimelisus positiivse kontrollaine korral (võrreldes selle väärtusega negatiivse kontrolli suhtes) olema kindlaksmääratud piirides. Kõige olulisem on see, et kasutatava prognoosiva mudeli korral peab olema näidatud selle vastavus rahvusvahelisele valideerimis- standardile (2). 1. 7. 2. Katsemenetlus 1. 7. 2. 1. U u r i t a v a m a t e r j a l i p e a l e k a n d m i n e Vedelate materjalide korral tuleb piisav kogus uuritavat ainet kanda naha pinnale (minimaalselt 25 μl/cm2). Tahkete materjalide korral tuleb piisav kogus uuritavat ainet kanda naha pinnale ning seda tuleb seejärel niisutada, et oleks tagatud hea kokkupuude nahaga, seejuures tuleb vastavaid tahkeid aineid enne pealekandmist jahvatada pulbriks. Peab olema näidatud pealekandmiseks kasutatava meetodi adek- vaatsus keemiliste tüüpide laia valiku korral (2). Toimimisaja lõpul tuleb uuritav materjal naha pinnalt füsioloogilise lahusega ettevaatlikult maha pesta. 1. 7. 2. 2. R a k u e l u v õ i m e l i s u s e m ä ä r a m i s e d Raku eluvõimelisuse määramiseks võib kasutada mis tahes kvantitatiivset valideeritud meetodit. Kõige sagedamini kasutatavaks määramiseks on MTT vähenemine, mille korral on näidatud erinevates labora- tooriumides täpsete ja reprodutseeruvate tulemuste saamine (2). Nahaketas paigutatakse temperatuuril 20–28 °C 3 tunniks MTT lahusesse kontsentratsiooniga 0,3 mg/ml. Seejärel ekstraheeritakse (solvent- ekstraktsioon) sadestunud sinine formasaansaadus ning formasaani kontsentratsioon määratakse OD mõõtmisega vahemikus 545 ja 595 nm oleval lainepikkusel. 246 ET Euroopa Liidu Teataja 13/25. kd 1. 7. 2. 3. L i s a t e a v e Kasutatav naha mudel ning mõjutamise täpne eeskiri ja pesemismenetlus jms omavad suurt mõju raku eluvõime kohta saadud tulemustele. On soovitav, et nii metodoloogia ja prognoosiv mudel kalibreeri- takse ECVAM valideerimise uurimisel kasutatud kemikaalide hulgast valitud võrdlusstandardite seeria kat- setuste põhjal (3). Otsustavaks on see, et näidatud oleks kasutatud meetodi reprodutseeritavus nii ühes laboratooriumis kui ka erinevates laboratooriumides kemikaalide laia valiku suhtes kooskõlas rahvusva- heliste standarditega. Minimaalseks on see, et meetod peab vastama eelnevalt määratletud teadusliku valiidsuse kriteeriumidele (2) ning taolise valideerimise tulemused tuleb publitseerida kitsa valdkonna tea- duslikus ajakirjas. 2. ANDMED 2. 1. Tulemuste töötlemine 2. 1. 1. Roti naha TERi määramine Uuritava materjali, positiivse ja negatiivse kontrolli ning mis tahes võrdluskemikaali korral saadud takis- tuse väärtused (kΩ) tuleb esitada tabeli kujul, sealhulgas andmed dubleerivate/korduseksperimentide, kesk- väärtused ja saadud klassifikatsiooni kohta. 2. 1. 2. Määramine inimnaha mudeli korral Uuritava materjali, positiivse ja negatiivse kontrolli ning mis tahes võrdluskemikaali korral saadud OD väärtused ja raku eluvõimelisuse kohta arvutatud protsendilised andmed tuleb esitada tabeli kujul, seal- hulgas andmed dubleerivate/korduseksperimentide, keskväärtuste ja saadud klassifikatsiooni kohta. 2. 2. Tulemuste hindamine ja tõlgendamine 2. 2. 1. Roti naha TERi määramine Kui uuritava aine korral on mõõdetud TERi keskmine väärtus üle 5 kΩ, siis on see aine mittesöövitav. Kui TERi väärtus on väiksem kui 5 kΩ või sellega võrdne ning uuritav aine ei ole pindaktiivne või neut- raalne orgaaniline ühend, siis on tegemist söövitava ainega. Pindaktiivsete ainete või neutraalsete orgaaniliste ühendite korral, kui TERi määratud väärtused on väik- semad või võrdsed 5 kΩ, võib läbi viia värvaine imendumise katse. Kui kettas on värvaine keskmine sisal- dus suurem kui ketta keskmine värvaine sisaldus samaaegselt määratud positiivses kontrollis 36 % vesi- nikkloriidhappes või sellega võrdne, siis on uuritav aine tõeliselt positiivne ning seega söövitav. Kui kettas on värvaine keskmine sisaldus väiksem kui ketta keskmine värvaine sisaldus samaaegselt määratud posi- tiivses kontrollis 36 % vesinikkloriidhappes või sellega võrdne, siis on uuritav aine vale-positiivne ning seega mittesöövitav. 2. 2. 2. Määramine inimese naha mudeli korral Negatiivse kontrolli korral saadud OD väärtused vastavad rakkude 100 % eluvõimelisusele, seega saab iga uuritava proovi korral saadud OD väärtusi kasutada eluvõimelisuse protsendi arvutamiseks negatiivse kontrolli suhtes. Raku eluvõimelisuse protsendi piirväärtus, mis eraldab söövitavat uuritavat materjali mittesöövitavast (või mis eristab erinevad söövitusklasse), peab olema prognoosivas mudelis enne mee- todi valideerimist selgelt määratletud, järgnev valideerimisuuring peab näitama, kas see piirväärtus on sobiv (2). 3. ARUANDLUS Uuringuprotokoll Uuringuprotokoll peab sisaldama vähemalt järgmist teavet: Uuritav aine — identifitseerimiseks vajalikud andmed, agregaatolek ning olulisuse korral ka füüsikalis-keemilised omadused. Analoogiline teave tuleb esitada ka kasutatud võrdlusainete kohta. Katsetingimused: — kasutatud katsemenetluse üksikasjad, — mis tahes modifikatsioonide kirjeldus ja põhjendus. 13/25. kd ET Euroopa Liidu Teataja 247 Tulemused: — uuritava materjali, positiivse ja negatiivse kontrolli ning mis tahes standardse võrdluskemikaali kor- ral saadud takistuse väärtused (TERi määramine) ja raku eluvõimelisuse kohta arvutatud protsendi- lised andmed tabeli kujul, sealhulgas andmed dubleerivate/korduseksperimentide ja keskväärtuste kohta, — mis tahes muude täheldatud toimete kirjeldus. Tulemuste arutelu. Järeldused. 4. VIITED (1) ECVAM (1998), ECVAM News & Views, ATLA 26, pp. 275–280. (2) Fentem, J. H. , Archer, G. E. B. , Balls, M. , Botham, P. A. , Curren, R. D. , Earl, L. K. , Esdaile, D. J. , Holz- hutter, H-G. & Liebsch, M. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team, Toxicology in Vitro 12, pp. 483–524. (3) Barratt, M. D. , Brantom, P. G. , Fentem, J. H. , Gerner, I. , Walker, A. P. & Worth, A. P. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 1. Selection and distribu- tion of the test chemicals, Toxicology in Vitro 12, pp. 471–482. (4) Oliver, G. J. A. , Pemberton, M. A. & Rhodes, C. (1986), An in vitro skin corrosivity test — modifica- tions and validation, Food & Chemical Toxicology 24, pp. 507–512. (5) Botham, P. A. , Hall, T. J. , Dennett, R. , McCall, J. C. , Basketter, D. A. , Whittle, E. , Cheeseman, M. , Esdai- le, D. J. & Gardner, J. (1992), The skin corrosivity test in vitro: results of an interlaboratory trial, Toxi- cology in Vitro 6, pp. 191–194. (6) Worth, A. P. , Fentem, J. H. , Balls, M. , Botham, P. A. , Curren, R. D. , Earl, L. K. , Esdaile, D. J. & Liebsch, M. (1998), An evaluation of the proposed OECD testing strategy for skin corrosion, ATLA 26, pp. 709–720. (7) Botham, P. A. , Chamberlain, M. , Barratt, M. D. , Curren, R. D. , Esdaile, D. J. , Gardner, J. R. , Gordon, V. C. , Hildebrand, B. , Lewis, R. W. , Liebsch, M. , Logemann, P. , Osborne, R. , Ponec, M. , Regnier, J. F. , Stei- ling, W. , Walker, A. P. & Balls, M. (1995), A prevalidation study on in vitro skin corrosivity testing. The report and recommendations of ECVAM workshop 6, ATLA 23, pp. 219–255. 248 ET Euroopa Liidu Teataja 13/25. kd Joonis 1 ” 13/25. kd ET Euroopa Liidu Teataja 249 Joonis 2 250 ET Euroopa Liidu Teataja 13/25. kd II LISA “B. 41. FOTOTOKSILISUS — IN VITRO 3T3 NRU FOTOTOKSILISUSE KATSE 1. MEETOD 1. 1. Sissejuhatus Fototoksilisus on määratletud kui toksiline reaktsioon, mis on esile kutsutud pärast teatava kemikaali esmast toimet nahale ja järgnevat valgustamist, või kui see on indutseeritud analoogiliselt naha kiiritami- sega pärast kemikaali süsteemset manustamist. In vitro 3T3 NRU fototoksilisuse katsest saadavat teavet kasutatakse uuritava aine fototoksilisuse potent- siaali identifitseerimiseks, st võimaliku ohu, mis tekib tõenäoliselt uuritavast ainest seoses allumisega UV-kiirguse ja nähtava valguse toimele, olemasolu või selle puudumist. Kuna in vitro katse toksikoloogiliseks lõppeesmärgiks on kemikaali ja valguse kombineeritud toimest indut- seeritud fototoksilisuse määramine, siis saab uuringu põhjal identifitseerida nii ühendeid, mis on fototok- silised in vivo pärast süsteemset manustamist ja jaotumist nahas, kui ka ühendeid, mis toimivad fotoärri- tajatena pärast pindmist manustamist nahale. In vitro 3T3 NRU fototoksilisuse katse töötati välja ja valideeriti EL/COLIPA ühisprojekti raames aastatel 1992–1997 (1) (2) (3) eesmärgiga luua valiidne in vitro alternatiiv erinevatele kasutuses olevatele in vivo uuringutele. 1996. aastal soovitas OECD seminar fototokilisuse hindamiseks in vitro katsete astmelist lähe- nemisviisi (4). in vivo ägeda In vitro 3T3 NRU fototoksilisuse katse tulemusi võrreldi fototoksilisuse/fotoärritatavuse toimega ning uuringutest ilmnes nende efektide suurepärane prognoosita- vus. Katse eesmärgiks ei ole mitte muude negatiivsete toimete ennustamine, mis võivad tuleneda kemikaali ja valguse kombineeritud toimest, nt fotogenotoksilisus, fotoallergia ja fotokantserogeensus, kuigi mõned nende spetsiifiliste omadustega kemikaalid annavad positiivse reaktsiooni ka in vitro 3T3 NRU fototoksi- lisuse uuringus. Lisaks ei ole katse ette nähtud fototoksilisuse potentsi hindamiseks. loomade ja inimeste korral Kemikaalide fototoksilisuse uurimise järjestikuline käsitlus on sätestatud liites. 1. 2. Mõisted Kiiritustihedus — pinnale langeva ultraviolettkiirguse (UV) või nähtava valguse intensiivsus, mõõdetud W/m2 või mW/cm2. Valgusdoos — pinnale langeva ultraviolettkiirguse (UV) või nähtava kiirguse hulk (= intensiivsus × aeg), aval- datud džaulides (W × s) pinnaühiku kohta, nt J/m2 või J/cm2. UV-kiirguse lainealad — CIE (Comission Internationale de L’Eclairage) soovituslikud tähistused on: UVA (315—400 nm), UVB (280–315 nm) ja UVC (100–280 nm). Samuti kasutatakse teisi klassifikatsioone: vahe UVB ja UVA vahel paigutatakse sageli 320 nm juurde ning UVA võib jagada UV-A1ks ja UV-A2ks piiriga 340 nm juures. Raku eluvõimelisus — parameeter, mis mõõdab rakupopulatsiooni summaarset aktiivsust (nt vitaalvärvi neut- raalpuna kaasahaaret raku lüsosoomidesse), mis olenevalt mõõdetavast lõpp-punktist ja kasutatud katse kavandamisest korreleerub rakkude koguarvu ja/või vitaalsusega. Raku suhteline eluvõimelisus — raku eluvõimelisus, mis on avaldatud negatiivse (lahusti) kontrollkatse suh- tes, millega on läbitud kogu katsemenetlus (kas + UV või –UV), kuid mille korral ei ole kasutatud töötle- mist uuritava kemikaaliga. Prognoosiv mudel — algoritm, mida kasutatakse toksilisuse katse tulemuste teisendamiseks toksilise potent- siaali ennustamiseks. Käesolevas uuringujuhendis võib kasutada in vitro 3T3 NRU fototoksilisuse katse tule- muste teisendamiseks fototoksilisuse potentsiaali ennustamiseks PIFi ja MPEd. PIF (fotoärritatavuse tegur) — tegur, mis on saadud uuritava kemikaali kahe võrdse efektiivsusega tsütotok- silise kontsentratsiooni (EC50) võrdlemisel UVA/nähtava valgusega mittetsütotoksilise kiirituse puudumi- sel (– UV) ja olemasolul (+ UV). MPE (keskmine fotoefekt) — uudne mõõdetav suurus, mis on saadud UVA/nähtava valgusega mittetsüto- toksilise kiirituse puudumisel (– UV) ja olemasolul (+ UV) määratud kahe kontsentratsioonilise tunnuskõ- vera täiskuju matemaatilisel analüüsil. 13/25. kd ET Euroopa Liidu Teataja 251 Fototoksilisus — äge toksiline reaktsioon, mis ilmneb pärast nahale teatava kemikaaliga toimimist ja järg- nevat mõjustamist valguskiirgusega, või reaktsioon, mis on indutseeritud analoogiliselt naha kiiritamisest pärast kemikaali süsteemset manustamist. Fotoärritus — mõiste “fototoksilisus” alammõiste, mida kasutatakse üksnes sellist fototoksiliste reaktsioo- nide kirjeldamiseks, mis tekivad nahal pärast kemikaalidega kokkupuutumist (pindmiselt või suukaudselt). Selliste fototoksiliste reaktsioonidega kaasneb alati rakkude mittespetsiifiline kahjustus (päikesepõletuse- laadsed reaktsioonid). Fotoallergia — omandatud immunoloogiline reageerimisvõime, mis ei esine esmasel kokkupuutel kemi- kaali ja valgusega ja mis vajab ühe kuni kahe nädala pikkust induktsiooniperioodi enne nahareaktsiooni avaldumist. Fotogenotoksilisus — geneetilise tagajärjega genotoksiline vastureaktsioon, mis ilmneb pärast rakkude kok- kupuudet UV-kiirguse/nähtava valguse mittegenotoksilise doosi ja mittegenotoksilise kemikaaliga. Fotokantserogeensus — valguse ja kemikaali korduva toime tagajärjel indutseeritud kantserogeensus. Termi- nit “foto-kokantserogeensus” kasutatakse juhul, kui UV-kiirgusest indutseeritud kantserogeensus võimen- dub kemikaali toimel. 1. 3. Võrdlusained Lisaks positiivse kontrolli kemikaalile kloorpromasiinile, mida tuleb paralleelselt uurida igas määramises, soovitatakse hiljuti kehtestatud 3T3 NRU fototoksilisuse katses kasutada võrdluskemikaalidena käesoleva uuringu interlaboratoorsetel katsetustel kasutatavate kemikaalide hulgast valitud allkomplekti (1) (3) (13). 1. 4. Esialgsed kaalutlused Fototoksilisuse indutseerimisest on teateid mitut tüüpi kemikaalide korral (5) (6) (7) (8). Nende ainsaks ühi- seks tunnuseks on nende võime absorbeerida valgusenergiat päikesevalguse piirkonnas. Vastavalt fotokee- mia esimesele seadusele (Grotthaus-Draperi seadus) on fotoreaktsiooni toimumiseks vaja valguskvantide neeldumist piisaval hulgal. Seega tuleb arvestada, et enne bioloogiliste uuringute läbiviimist vastavalt käes- olevale uuringujuhendile tuleb määrata uuritava kemikaali neeldumisspekter (nt vastavalt OECD Test Gui- deline 101-le). Kui molaarne ekstinktsioon/neeldetegur on väiksem kui 10 liiter × mol– 1 × cm– 1, siis puu- dub kemikaalil fotoreaktiivne potentsiaal ning seda ei ole vaja uurida in vitro 3T3 NRU fototoksilises katses või mis tahes muus bioloogilises katses ebasoovitavate fotokeemiliste mõjude suhtes (Liide). 1. 5. Uurimismeetodi põhimõte Kindlaks on tehtud neli mehhanismi, mille abil valguse neeldumine (keemilise) kromofoori poolt võib põh- justada fototoksilise reaktsiooni (7). Nende kõigi tulemuseks on raku kahjustumine. Seega põhineb in vitro 3T3 NRU fototoksilisuse katse kemikaali tsütotoksilisuse võrdlemisel, kui seda on uuritud mittetsütotok- silise UVA-kiirguse/nähtava valguse toimel ja selle puudumisel. Selles katses avaldatakse tsütotoksilisus vitaalvärvi neutraalpuna (NR) (9) kaasahaarde kontsentratsioonist sõltuva vähenemisega 24 tundi pärast mõjutamist uuritava kemikaali ja kiirgusega. Kultiveerimiskeskkonnas hoitakse Balb/c 3T3 rakke 24 tundi kuni monokihi tekkimiseni. Kaht 96süvendi- list plaati iga uuritava kemikaali jaoks inkubeeritakse eelnevalt 1 tund kemikaali kaheksa erineva kontsent- ratsiooni juures. Seejärel toimitakse kahest plaadist ühele UVA-kiirguse/nähtava valguse mittetsütotoksi- lise doosiga 5 J/cm2 UVA (+ UV eksperiment), seejuures hoitakse teine plaat pimeduses (– UV eksperiment). Seejärel asendatakse mõlemal plaadil mõjutuskeskkond kultiveerimiskeskkonnaga ning pärast teist 24 tun- nist inkubeerimist määratakse raku eluvõimelisus neutraalpuna kaasahaardega (NRU) 3 tunni jooksul. Raku suhteline eluvõimelisus, väljendatuna protsentides, mõjutamata negatiivse kontrolli suhtes, arvutatakse iga uuritud kaheksa kontsentratsiooni jaoks. Fototoksilisuse potentsiaali prognoosimiseks võrreldakse kiirgu- sega (+ UV) ja kiirguseta (– UV) katsetes saadud kontsentratsioonsõltuvusi, tavaliselt tasemel EC50, st sellise kontsentratsiooni juures, mis inhibeerib rakkude eluvõimelisust 50 % võrra mõjutamata kontrollkatse suh- tes. 1. 6. Kvaliteedinõuded Rakkude UVA tundlikkus, ajaloolised andmed – rakke tuleb regulaarselt kontrollida nende tundlikkuse suhtes UVA-kiirgusele. Rakud külvatakse sellise tihedusega, nagu see on in vitro 3T3 NRU fototoksilisuse katses, kiiritatakse järgmisel päeval UVA-kiirguse doosiga 1–9 J/cm2 ja rakkude eluvõimelisus määratakse üks päev hiljem NRU katse abil. Rakud vastavad kvaliteedinõuetele siis, kui nende eluvõimelisus pärast kiiritamist UVA-kiirgusega doosiga 5 J/cm2 ei ole alla 80 % pimekontrolli eluvõimelisusest. Suurima UVA- kiirgusdoosiga 9 J/cm2 ei tohi eluvõimelisus olla alla 50 % pimekontrolli omast. Kontrolli tuleb korrata pärast iga 10. rakkude passaaži. Negatiivsete kontrollrakkude UVA tundlikkus, käesolev katse — uuring vastab kvaliteedinõuetele siis, kui nega- tiivse kontrollis (rakud Earli tasakaalustatud soolalahuses (EBSS) kas 1 % dimetüülsulfoksiidi (DMSO) või 1 % etanooliga (EtOH) või ilma nendeta) on + UVA eksperimendi korral eluvõimelisus vähemalt 80 % kii- ritamata rakkude omast samas lahustis samaaegses pimekatses (– UVA). 252 ET Euroopa Liidu Teataja 13/25. kd Negatiivse kontrolli eluvõimelisus — negatiivse kontrolli NR ekstraktis mõõdetud absoluutne optiline tihedus (OD540 NRU) näitab, kas igasse süvendisse külvatud 1 × 104 rakku on kasvanud normaalse kahekordistu- misajaga kaks päeva kestva uuringu ajal. Katse vastab vastuvõetavuse kriteeriumile, kui keskmine OD540 NRU väärtus mõjutamata kontrolli korral on ≥ 0,2. Positiivne kontroll — igas in vitro 3T3 NRU fototoksilisuse katses tuleb samaaegselt uurida ka tuntud foto- toksilist kemikaali. EL/COLIPA valideerimisuuringus kasutati positiivse kontrollina kloorpromasiini (CPZ) ning seega on see soovitatav. Standardse eeskirjaga in vitro 3T3 NRU fototoksilisuse katses uuritava CPZ jaoks määratleti järgmised uuringu vastuvõetavuse kriteeriumid: kiiritatud CPZ (+ UVA): EC50 = 0,1 kuni 2,0 μg/ml, CPZ kiiritamata (– UVA): EC50 = 7,0 kuni 90,0 μg/ml. Fotoärritusetegur (PIF), st EC50 nihe peab olema vähemalt 6. Teisi tuntud fototoksilisi kemikaale, mis sobivad oma keemilise klassi või lahustuvust iseloomustavate suu- ruste poolest hindamisele kuuluva uuritava kemikaaliga, võib kasutada samaaegse positiivse kontrollina CPZ asemel. Sellisel juhul tuleb eelnevate andmete alusel adekvaatselt määratleda EC50 ja PIF või MPE (kesk- mine fotoefekt) kui katse vastuvõetavuse kriteeriumid. 1. 7. Uurimismeetodi kirjeldus 1. 7. 1. Valmistised 1. 7. 1. 1. R ak ud Valideerimisuuringus kasutati hiire fibroblasti raku püsiliini — Balb/c 3T3, kloon 31 — kas ATCCst või ECACCst, seetõttu on see liin soovitatav. Sama katse-eeskirja korral võib edukalt kasutada teisi rakke või rakuliine juhul, kui kultiveerimistingimused on kohandatud rakkude spetsiifilistele vajadustele, kuid sama- väärsus peab olema tõestatud. Rakke tuleb regulaarselt kontrollida mükoplasmaga saastatuse suhtes ning neid võib kasutada üksnes siis, kui taolise kontrolli tulemused on rahuldavad. Kuna rakkude UVA-tundlikkus võib kasvada passaažide arvu suurenemisega, siis tuleb kasutada väikseima täheldatud passaažide arvuga Balb/c 3T3 rakke, eelistatavalt alla 100. On oluline, et Balb/c 3T3 rakkude UVA tundlikkust kontrollitaks regulaarselt vastavalt selles juhendis kirjeldatud kvaliteedikontrolli menet- lusele. 1. 7. 1. 2. K e s k k o n n a d j a k u l t i v e e r i m i s t i n g i m u s e d Tavapärase rakupassaaži ja katse protseduuride käigus tuleb kasutada sobivaid kultiveerimiskeskkondi ja inkubeerimistingimusi. Balb/c 3T3 rakkude korral on nendeks DMEM, millele on lisatud 10 % vastsündi- nud vasika seerumit, 4 mM glutamiini, penitsilliini ja streptomütsiini, ning niisutatult inkubeerimine 37 °C/7,5 % CO2 juures. Eelkõige on oluline see, et raku kultiveerimistingimused tagaksid kasutatavate rak- kude või kasutatava rakuliini jaoks normaalsesse ajaloolisse vahemikku sattuva elueaga rakud. 1. 7. 1. 3. K u l t u u r i d e e t t e v a l m i s t a m i n e Kultiveerimiskeskkonda külvatakse külmutatud varukultuurist pärinevad rakud sobiva tihedusega ja neist võetakse enne nende kasutamist in vitro 3T3 NRU fototoksilisuse katse vähemalt üks osakultuur. Fototoksilisuse katse jaoks külvati rakud kultiveerimiskeskkonda sellise tihedusega, et kultuurid ei saavu- taks konfluentsust uuringu lõpuks, st ajaks, mil rakkude eluvõimelisus määratakse 48 tundi pärast rakkude külvamist. 96süvendilises plaadis kasvanud Balb/c 3T3 rakkude jaoks on soovitav rakkude tihedus 1 × 104 rakku süvendis. Iga uuritava kemikaali jaoks külvatakse rakud ühtmoodi kahte eraldiolevasse 96 süvendiga plaati, mida hoi- takse kogu uuringu ajal samaaegselt samasugustes kultiveerimistingimustes, välja arvatud see aeg, kui üht plaati kiiritatakse (+ UVA/nähtav) ja teist pimedas hoitakse (– UVA/nähtav). 1. 7. 1. 4. M e t a b o o l n e a k t i v e e r i m i n e Arvestades et metaboliseeruvate süsteemide kasutamine on genotoksilise ja kantserogeense potentsiaali prognoosimisel tavaliseks nõudeks kõigi in vitro katsete korral, ei ole kuni tänaseni fototoksikoloogias teada ühtki kemikaali, mille jaoks oleks vaja metaboolset muundumist, et kemikaal toimiks fototoksiinina kas in vivo või in vitro. Seega pole vaja midagi eeldada ega teaduslikult põhjendada, et seda katset läbi viia meta- boolse aktiveerimise süsteemis. 13/25. kd ET Euroopa Liidu Teataja 253 1. 7. 1. 5. U u r i t a v k e m i k a a l / e t t e v a l m i s t a m i n e Uuritavad kemikaalid peavad olema värskelt valmistatud vahetult enne kasutamist, vaatamata sellele, et andmed püsivuse kohta näitavad vastuvõetavust hoiustamisele. Vajalikuks võib osutuda valmistamine punase valguse käes juhul, kui tõenäoliselt võib toimuda kiire fotodegradatsioon. Uuritavad kemikaalid tuleb lahustada puhverdatud soolalahustes, nt Earli tasakaalustatud soolalahuses, (EBSS) või fosfaatpuhvriga füsioloogilises lahuses (PBS), mis peab kiiritamise ajal segava toime vältimiseks olema vaba valgulistest komponentidest ja valgust absorbeerivast värvilisest H-indikaatorist. Vees piiratud lahustuvusega uuritavad kemikaalid tuleb lahustada sobivates lahustites 100kordses soovi- tud lõppkontsentratsioonis ning seejärel lahjendada vahekorras 1:100 puhverdatud soolalahusega. Kui kasutatakse lahustit, siis peab see esinema kõikides kultuurides konstantses ruumalas 1 % (mahuprotsent), st nii negatiivses kontrollis kui ka uuritava kemikaali kõikide kontsentratsioonide korral. Soovitatavad lahustid on dimetüülsulfoksiid (DMSO) ja etanool (EtOH). Sobivad võivad olla ka teised madala tsütotoksilisusega lahustid (nt atsetoon), kuid neid tuleb põhjalikult hinnata spetsiifiliste omaduste alusel, nt reaktsioonid uuritava kemikaaliga, fototoksilise efekti kustutamine, radikaali püüdvad omadu- sed. Solubiliseerimise soodustamiseks võib vajadusel kasutada keerissegamist ja/või ultraheliga kiiritamist ja/või soojendamist temperatuurini 37 °C. 1. 7. 1. 6. K i i r i t a m i n e U V - g a / e t t e v a l m i s t a m i n e Valgusallikas — sobiva valgusallika valik ja sobiv filter on fototoksilisuse määramisel kõige olulisemad tegurid. UVA ja nähtava valguse piirkonnad assotsieeruvad tavaliselt fotosensibilisatsiooniga (7) (10), see- juures on UVB vähem oluline ning on otseselt väga tsütotoksiline, selle tsütotoksilisus suureneb 1 000 korda üleminekul lainepikkuselt 313 nm lainepikkusele 280 nm (11). Sobiva valgusallika valiku kriteeriu- mid peavad sisaldama põhilise nõudena seda, et valgusallikas kiirgaks lainepikkustel, mis neelduvad uuri- tavas kemikaalis, ning et valguskiirguse doos (tagatud mõistliku aja piires) on piisav tuntud fotosensibili- saatorite avastamiseks. Lisaks ei tohi kasutatava lainepikkusega valgus ja doosid olla liigselt kahjulikud uuritava süsteemi suhtes, siia kuulub ka soojuslik emissioon (infrapunane piirkond). Optimaalse valgusallikana käsitletakse päikesevalguse imiteerimist solaarsimulaatoritega. Solaarsimulaato- rites kasutatakse nii ksenoonkaarlampe kui ka (dopeeritud) elavhõbe-metallhalogeniidkaarlampe. Viimaste eeliseks on väiksem soojuskiirgus ja odavus, kuid sarnasus päikesevalgusega jätab soovida. Kuna kõik solaarsimulaatorid kiirgavad märgatavas ulatuses ka UVB kiirgust, siis tuleb see sobival viisil filtrida, et nõr- gendada ülimalt tsütotoksilise UVB kiirgusele vastavaid lainepikkusi. In vitro 3T3 NRU fototoksilisuse katses tuleb kasutada kiirgusspektrit, mis on praktiliselt vaba UVB osast (UVA:UVB- 1:20). Trükis on avaldatud in vitro 3T3 NRU katses valideerimisuuringus kasutatud solaarsi- mulaatori filtritud kiirguse spektraaljaotus (3). Dosimeetria — valguse intensiivsust (kiirkiiritustihedust) tuleb enne iga fototoksilisuse määramist regu- laarselt kontrollida, kasutades sobivat lairiba UV-meetrit. UV-meeter peab olema kalibreeritud vastavalt alli- kale. UV-meetri tööd tuleb kontrollida ning selleks on soovitatav teise, samatüübilise ja samamoodi kalib- reeritud võrdlus-UV-meetri kasutamine. Ideaalne oleks pikemate ajavahemike järel spektroradiomeetri kasutamine valgusallika filtritud kiirguse spektri mõõtmiseks ja lairiba-UV-meetri kalibratsiooni kontrolli- miseks, kuid taolised seadmed vajavad vilunud käsitsemist vastava väljaõppe saanud töötajate poolt. Valideerimisuuringus määratleti doos 5 J/cm2 (UVA) olevat mittetsütotoksiline Balb/c 3T3 rakkude suhtes nii piisavalt võimekas ergastama isegi nõrgalt fototoksilisi kemikaale. Selleks, et 50 min jooksul saada 5 J/cm2, peab kiiritustihedus olema 1,666 mW/cm2. Kui kasutatakse teist rakuliini või erinevat valgusalli- kat, siis võib osutuda vajalikuks UVA doosi mõningane kohandamine, kasutades selleks kriteeriumit, et kiir- gus ei tohi olla kahjulik rakkudele ja peab samas olema piisav standardsete fototoksiinide avastamiseks. Vajalik valguse toimeaeg arvutatakse järgmiselt: 1. 7. 2. Katsetingimused Uuritava kemikaali maksimaalne kontsentratsioon ei tohi ületada 100 μg/ml, sest kõik fototoksilised kemi- kaalid on avastatud madalamatel kontsentratsioonidel, kuna suuremate kontsentratsioonide korral suure- neb vale-positiivsete tulemuste (ülehinnanguliste) esinemissagedus (13). Uuritava kemikaali suurimale kont- sentratsioonile vastav pH peab olema rahuldava väärtusega (pH vahemik: 6,5–7,8). 254 ET Euroopa Liidu Teataja 13/25. kd Valguskiirgusega (+ UVA) ja selle puudumisel (– UVA) uuritava kemikaali kontsentratsioonide vahemik tuleb adekvaatselt kindlaks määrata kontsentratsioonivahemiku kindlakstegemiseks mõeldud eelnevate eks- perimentidega. Kontsentratsioonivahemik ja kontsentratsiooniseeriat iseloomustavad sirglõigud tuleb valida selliselt, et vastureaktsiooni kontsentratsioonsõltuvused vastaksid olulisel määral eksperimentaalse- tele andmetele. Kontsentratsiooniseeriates tuleb kasutada geomeetrilist jada (konstantse lahjendusteguri- ga). 1. 7. 3. Katsemenetlus (1) 1. 7. 3. 1. Esimene päev Valmistage rakususpensioon 1 × 105 rakku/ml kultiveerimiskeskkonnas ja jaotage 100 μl kultiveerimis- keskkonda ainult 96 süvendiga koekultuuri mikrotiiterplaatide äärmistesse süvenditesse (= tühikatse). Üle- jäänud süvenditesse jaotage igasse 100 μl suspensiooni, milles on 1 × 105 rakku/ml (= 1 × 104 rakku/süvendis). Iga kemikaali jaoks valmistage ette kaks plaati: üks tsütotoksilisuse (– UVA) määramiseks, teine fototsütotoksilisuse (+ UVA) määramiseks. Inkubeerige rakke 24 tundi (7,5 % CO2, 37 °C) kuni poolkonfluentse monokihi moodustumiseni. Inku- batsiooniperiood võimaldab rakkude taastumist ja kokkukleepumist ning eksponentsiaalset kasvu. 1. 7. 3. 2. T e i n e pä e v Pärast inkubeerimist dekanteerige kultiveerimiskeskkond rakkudelt ära ja peske iga süvendit kaks korda 150 μl EBSS/PBSiga. Lisage 100 μl sobivas kontsentratsioonis uuritavat kemikaali sisaldavat EBSS/PBSi või ainult lahustit (negatiivne kontroll). Kasutage uuritava kemikaali 8 erinevat kontsentratsiooni. Inkubeerige rakke koos uuritav kemikaaliga pimedas 60 minuti jooksul (7,5 % CO2, 37 °C). Uuringu (+ UVA) osa tegemiseks kiiritage rakke toatemperatuuril 50 minutit läbi 96 süvendiga plaadi kaane UVA kiirgusega 1,7 mW/cm2 (= 5 J/cm2). Tuulutage ventilaatoriga, vältimaks H2O kondenseerumist kaane all. Hoidke dubleerivaid plaate (– UVA) toatemperatuuril pimedas kastis 50 minutit (= UVAga kiiritamise aeg). Dekanteerige uuritav lahus ära ning peske kaks korda 150 μl EBSS/PBSiga. Asendage EBSS/PBS kultivee- rimiskeskkonnaga ja inkubeerige (7,5 % CO2, 37 °C) ööpäeva jooksul (18–22 tundi). 1. 7. 3. 3. K o l m a s p ä e v Mikroskoopiline hinnang Uurige rakke faasikontrastimikroskoobi abil. Märkige üles uuritava kemikaali tsütotoksilisest toimest põh- justatud muutused rakkude morfoloogias. See kontroll on soovitatav katsevigade välistamiseks, kuid neid andmeid ei kasutata tsütotoksilisuse või fototoksilisuse hindamisel. Neutraalpuna kaasahaarde katse Peske rakke 150 μl eelsoojendatud EBSS/PBSiga. Eemaldage pesemislahus ettevaatlikult ära valades. Lisage 100 μl NR keskkonda ja inkubeerige 3 tundi temperatuuril 37 °C niiskes atmosfääris, mis sisaldab 7,5 % CO2. Pärast inkubeerimist eemaldage NR keskkond, peske rakke 150 μl EBSS/PBSiga. Dekanteerige ja blottige EBSS/PBS täielikult. (Vajadusel: tsentrifuugige pöördplaat. ) Lisage täpselt 150 μl NRi desorbeerimislahust (äsjavalmistatud etanool/äädikhape). Loksutage mikrotiiterplaati kiiresti 10 minutit mikrotiiterplaatide jaoks mõeldud loksutusseadmes, kuni NR on rakkudest ekstraheeritud ja on moodustunud homogeenne lahus. Määrake NR ekstrakti optiline tihedus spektrofotomeetriga lainepikkusel 540 nm, kasutades võrdlusena pimekatse süvendeid. Salvestage andmed sobivas failiformaadis (nt ASCII) järgneva analüüsi tarbeks. 13/25. kd ET Euroopa Liidu Teataja 255 2. ANDMED 2. 1. Andmete kvaliteet ja hulk Andmed peavad võimaldama UVA/nähtava valguskiirgusega ja selle puudumisel saadud kontsentratsioon- sõltuvuse mõtestatud analüüsi. Tsütotoksilisuse esinemisel tuleb nii kontsentratsioonide vahemik kui ka üksikutele kontsentratsioonsõltuvustele vastavad sirglõigud valida selliselt, et oleks võimalik eksperimen- taalsete andmete lähendamine kõveraga. Tingituna asjaolust, et uuritavad kemikaalid võivad pimekatses (– UVA) mitte olla tsütotoksilised kuni kindla piirkontsentratsioonini 100 μg/ml, kuid väga tsütotoksilised kiiritamisel (+ UVA), võib osutuda vajalikuks andmete kvaliteedi adekvaatsuse nõude täitmiseks kasutada eksperimendi mõlemas osas mitme suurusjärgu võrra erinevaid uuritavaid kontsentratsioone. Kui tsüto- toksilisust ei leitud eksperimendi mõlemas osas (– UVA ja + UVA), siis piisab katsete läbiviimisest pikima sirglõiguga juhul üksikdoosist suurima kontsentratsioonini. Seejuures puudub vajadus ühese positiivse tulemuse verifitseerimiseks korduskatse läbiviimisega. Lisaks ei ole vaja verifitseerida üheselt negatiivset tulemust eeldusel, et uuritava kemikaaliga tehti katse piisavalt suure kontsentratsiooni juures. Taolistel juhtudel piisab ühest põhikatsest, mida kinnitab üks või enam eelkatset sobiva vahemiku leidmiseks. Katsed rajajoonele vastavate tulemustega prognoosiva mudeli kehtivusraja läheduses kuuluvad verifitsee- rimiseks kordamisele. Kui korduskatseid peetakse vajalikuks, siis võib osutuda ühese tulemuse saamiseks vajalikuks katsetingi- muste varieerimine. Selles katses on olulisimaks muutujaks uuritava kemikaali lahuste valmistamine. Seega võib katse kordamisel olla kõige olulisem nende tingimuste (kaaslahusti, tritureerimine, ultrahelitöötlus) varieerimine. Alternatiivselt võib kõne alla tulla kiirituseelse inkubatsiooniaja varieerimine. Lühem aeg võib olla oluline vees ebapüsivate kemikaalide korral. 2. 2. Tulemuste töötlemine Võimaluse korral tuleb alati määrata uuritava kemikaali kontsentratsioon, mis vastab rakulise NRU 50 %li- sele inhibeerimisele (EC50). Seda võib teha mis tahes sobiva mittelineaarse regressioonanalüüsi alusel (eelis- tatavalt Hilli funktsioon või logistiline regressioon) kontsentratsioonsõltuvuse andmete põhjal või kasuta- des muid lähendusmeetodeid (14). Enne EC50 kasutamist edasistes arvutustes tuleb hoolikalt kontrollida lähenduse headust. Alternatiivselt võib EC50 arvutamiseks kasutada ka graafilisi lähendusmeetodeid. Sel juhul on soovitav tõenäosuspaberi kasutamine (x-telg: log, y-telg: probit), sest paljudel juhtudel muutub kontsentratsioonsõltuvus pärast sellist teisendust lineaarseks. 2. 3. Tulemuste hindamine (prognoosivad mudelid) 2. 3. 1. Prognoosiv mudel, versioon 1: fotoärritatavuse tegur (PIF) Kui mõlemal juhul, nii valguskiirguse esinemisel (+ UVA) kui ka selle puudumisel (– UVA), on saadud täie- likud kontsentratsioonsõltuvused, siis saab fotoärritatavuse tegurit (PIF) arvutada järgmise valemi abil: PIF < 5 korral ei prognoosita fototoksilist potentsiaali, kuna PIF ≥ 5 korral prognoositakse fototoksilise potentsiaali olemasolu. Kui kemikaal osutub tsütotoksiliseks üksnes + UVA korral ning ei ole tsütotoksiline — UVA katsetes, siis ei saa PIFi väärtust arvutada, kuigi see tulemus viitab fototoksilisele potentsiaalile. Taolistel juhtudel saab arvutada “> PIF” juhul, kui (– UV) tsütotoksilisuse katse on tehtud kuni maksimaalse kontsentratsioonini (Cmax) ning seda väärtust kasutatakse suuruse “> PIF” arvutamiseks; Kui määrata saab üksnes “> PIF”, siis prognoosib mis tahes väärtus, mis on > 1, fototoksilist potentsiaali. Kui nii EC50 (– UV) kui ka EC50 (+ UV) ei saa arvutada tingituna asjaolust, et kemikaalil ei ilmne mingit tsütotoksilisust kuni katsetes kasutatud suurima kontsentratsioonini, siis on see fototoksilise potentsiaali puudumise tunnuseks. Taolistel juhtudel kasutatakse tulemuse iseloomustamiseks formaalset väärtust “PIF = *1”; 256 ET Euroopa Liidu Teataja 13/25. kd Kui määrata saab üksnes “PIF = *1”, siis prognoosib see fototoksilise potentsiaali puudumist. Juhtudel b ja c tuleb in vitro 3T3 NRU fototoksilisuse katses saavutatud kontsentratsioonid fototoksilise potentsiaali prognoosimisel hoolikalt arvesse võtta. 2. 3. 2. Prognoosiv mudel, versioon 2: keskmine fotoefekt (MPE) Alternatiivselt võib kasutada fototoksilise potentsiaali prognoosimisel mudeli uudset versiooni, mis töötati välja EL/COLIPA valideerimisuuringu (15) andmete põhjal ja uuriti pimekatse tingimustes järgnevas UV fil- terkemikaalide in vitro fototoksilisuse uuringus (13). See mudel on vaba PIF-mudeli piirangutest juhtudel, kus ei ole võimalik määrata EC50. Mudel kasutab “keskmist fotoefekti”, väärtust, mis põhineb täielike kont- sentratsioonsõltuvuste võrdlusel. MPE mudeli rakendamiseks töötati Humboldti nim. Ülikoolis (Berliin) välja spetsiaalne arvutitarkvara, mida on sealt võimalik hankida. 2. 4. Tulemuste tõlgendamine Positiivne tulemus in vitro 3T3 NRU fototoksilisuse katse (PIF ≥ 5 või MPE ≥ 0,1) viitab sellele, et uuritav aine omab fototoksilist potentsiaali. Kui see tulemus on saadud kontsentratsioonidel alla 10 μg/ml, siis on uuritav kemikaal võimeline toimima erinevates kokkupuutetingimustes ka in vivo tingimustes fototoksii- nina. Kui positiivne tulemus saadi üksnes kõige suurema uuritava kontsentratsiooni, 100 μg/ml korral, võib edasise seisukohtade jaoks osutuda vajalikuks riskianalüüs või fototoksiline võime. Sinna hulka võivad kuu- luda sissetungimist iseloomustavad andmed, imendumine ja kemikaali kuhjumine nahas või kemikaali uuri- mine alternatiivses kinnitavas katses, nt kasutades inimnaha in vitro inimnaha mudelit. Negatiivne tulemus in vitro 3T3 NRU fototoksilisuse katses (PIF < 5 või MPE < 0,1) viitab sellele, et uuritav aine ei olnud kultiveeritud imetajarakkudele kasutatud tingimustes fototoksiline. Juhtudel, kus kemikaali saab uurida kuni suurima kontsentratsioonini 100 μg/ml, viitab negatiivne tulemus sellele, et kemikaal ei oma fototoksilist potentsiaali ja fototoksilisuse esinemine in vivo on ebatõenäoline. Juhtudel, kus kontsent- ratsioontoksilisuse identset sõltuvust (EC50 + UV ja EC50 – UV) täheldati madalamate kontsentratsioonide juures, on andmete tõlgendamine samasugune. Kui aga toksilisust ei ilmnenud (+ UV ja – UV) ja kui vees lahutuvuse tõttu on piirkontsentratsioon alla 100 μg/ml, siis on uuritava aine katses kasutamine küsitav ning kaaluda tuleb kinnitavate uuringute läbiviimist (nt kas in vitro naha mudeli või ex vivo naha mudeli või in vivo katsete alusel). 3. ARUANDLUS Uuringuprotokoll Uuringuprotokoll peab sisaldama järgmist teavet: Uuritav kemikaal: — identifitseerimisandmed ja CASi nr, kui see on teada, — füüsikaline loomus ja puhtus, — uuringu tegemise seisukohalt olulised füüsikalis-keemilised omadused, — püsivus ja fotostabiilsus, kui see on teada. Lahusti: — lahusti valiku põhjendus, — uuritava kemikaali lahustuvus selle lahustis, — lahusti protsendiline sisaldus töötluskeskkonnas (EBSS või PBS). Rakud: — tüüp ja rakkude päritolu, — mükoplasma puudumine, — rakupassaažide arv, kui see on teada, — rakkude UVA-tundlikkus, mis on määratud in vitro 3T3 NRU fototoksilisuse katses kasutatud kiiritus- seadmega. Katsetingimused (a) — inkubeerimine enne ja pärast töötlemist: — kultiveerimiskeskkonna tüüp ja koostis, — inkubeerimistingimused (CO2 kontsentratsioon, temperatuur, niiskus), — inkubeerimise kestus (eelinkubeerimine, järelinkubeerimine). 13/25. kd ET Euroopa Liidu Teataja 257 Katsetingimused (b) — kemikaaliga töötlemine: — UV–/nähtava valguskiirgusega ja ilma selleta kasutatud uuritava kemikaali kontsentratsioonide valiku põhjendus, — uuritava kemikaali piiratud lahustuvuse ja tsütotoksilisuse puudumisel suurima uuritud kontsentrat- siooni põhjendus, — töötlemiskeskkonna tüüp ja koostis (puhverdatud soolalahus), — kemikaaliga töötlemise kestus. Katsetingimused (c) — kiiritus: — kasutatud valgusallika valiku põhjendus, — valgusallika kiirgustiheduse spektraalkarakteristikud, — kasutatud filtri(te) läbilaskvus-/neeldumiskarakteristikud, — kiirgusmõõturite karakteristikud ja nende kalibreerimise üksikasjad, — valgusallika kaugus uuritavast süsteemist, — UVA kiirgustihedus sellel kaugusel, ühikutes mW/cm2, — UV-/nähtava valguskiirguse toime kestus, — UVA kiirgusdoos (kiirgustihedus × aeg), ühikutes J/cm2, — rakukultuuride temperatuur kiiritamise ajal ja samal ajal pimedas hoitud rakukultuuride temperatuur. Katsetingimused (d) — NRU-katse: — NR keskkonna koostis, — NR inkubeerimise kestus, — inkubeerimistingimused (CO2 kontsentratsioon, temperatuur, niiskus), — NR ekstraheerimistingimused (ekstrahent, kestus), — NR optilise tiheduse spektrofotomeetrilisel määramisel kasutatud lainepikkus, — teine lainepikkus (võrdlus), kui seda on kasutatud, — spektrofotomeetri tühja küveti sisu, kui seda on kasutatud. Tulemused: — rakkude eluvõimelisus uuritava kemikaali igal kontsentratsioonil, avaldatuna protsentides kontroll- proovi keskmisest eluvõimelisusest, — kontsentratsioonsõltuvuse kõverad, (teljestikus uuritava kemikaali kontsentratsioon — rakkude suhte- line eluvõimelisus), määratud samaaegsetes + UVA ja – UVA eksperimentides, — kontsentratsioonsõltuvuskõverate analüüs: võimaluse korral EC50 (+ UVA) arvutus/määramine, ja EC50 (– UVA) — UVA–/nähtava valguskiirguse esinemisel ja selle puudumisel mõõdetud kahe kontsentratsioonsõltu- vuskõvera võrdlemine kas fotoärritatavusteguri (PIF) määramise või keskmise fotoefekti (MPE) määra- mise abil, — fototoksilise potentsiaali klassifitseerimine, — katse vastuvõtu kriteerium (a) — samaaegne negatiivne kontroll: — kiiritatud ja kiiritamata rakkude absoluutne eluvõimelisus (optiline tihedus või NR ekstrakt), — eelnevad andmed negatiivse kontrolli, keskväärtuse ja standardhälbe kohta, — katse vastuvõtu kriteerium (a) — samaaegne positiivne kontroll: — positiivse kontrolli kemikaali EC50 (+ UVA) ja EC50 (– UVA) ning PIF, — eelnevad andmed positiivse kontrolli kemikaali kohta: EC50 (+ UVA) ja EC50 (– UVA) ning PIF, kesk- väärtus ja standardhälve. Tulemuste arutelu. Järeldused. 258 ET Euroopa Liidu Teataja 13/25. kd 4. VIITED (1) Spielmann, H. , Balls, M. , Döring, B. , Holzhütter, H. G. , Kalweit, S. , Klecak, G. , L’Eplattenier, H. , Liebsch, M. , Lovell, W. W. , Maurer, T. , Moldenhauer, F. , Moore, L. , Pape, W. , Pfannbecker, U. , Potthast, J. , De Silva, O. , Steiling, W. and Willshaw, A. (1994), EEC/COLIPA project on in vitro phototoxicity testing: First results obtained with a Balb/c 3T3 cell phototoxicity assay, Toxicology in Vitro 8, pp. 793–796. (2) Anon (1998), Statement on the scientific validity of the 3T3 NRU PT test (an in vitro test for photo- toxicity), European Commission, Joint Research Centre: ECVAM and DGXI/E/2, 3 November 1997, ATLA 26, pp. 7–8. (3) Spielmann, H. , Balls, M. , Dupuis, J. , Pape, W. J. W. , Pechovitch, G. , De Silva, O. , Holzhütter, H. G. , Clothier, R. , Desolle, P. , Gerberick, F. , Liebsch, M. , Lovell, W. W. , Maurer, T. , Pfannenbecker, U. , Pot- thast, J. M. , Csato, M. , Sladowski, D. , Steiling, W. and Brantom, P. (1998), EU/COLIPA “In vitro pho- totoxicity” validation study, results of phase II (blind trial), part 1: the 3T3 NRU phototoxicity test, Toxicology in Vitro 12, pp. 305–327. (4) OECD Test Guidelines Programme, ENV/MC/CHEM/TG(96)9: Final Report of the OECD Workshop on Harmonisation of Validation and Acceptance Criteria of Alternative Toxicological Test Methods, OECD Publications Office, Paris, 1996. (5) (6) (7) Lovell, W. W. (1993), A scheme for in vitro screening of substances for photoallergenic potential, Toxi- cology in Vitro 7, pp. 95–102. Santamaria, L. and Prino, G. (1972), List of the photodynamic substances, Research progress in organic, biological and medicinal chemistry Vol. 3 Part 1, North Holland Publishing Co, Amsterdam, pp. XI–XXXV. Spielmann, H. , Lovell, W. W. , Hölzle, E. , Johnson, B. E. , Maurer, T. , Miranda, M. A. , Pape, W. J. W. , Sapora, O. and Sladowski, D. (1994), In vitro phototoxicity testing: The report and recommendations of ECVAM workshop 2, ATLA 22, pp. 314–348. (8) Spikes, J. D. (1989), Photosensitization, The science of photobiology, edited by KC Smith, Plenum Press, New York, 2nd edition, pp. 79–110. (9) Borenfreund, E. and Puerner, J. A. (1985), Toxicity determination in vitro by morphological altera- tions and neutral red absorption, Toxicology Letters 24, pp. 119–124. (10) Lambert, L. A, Warner, W. G. and Kornhauser, A. (1996), Animal models for phototoxicity testing, Dermatotoxicology, edited by FN Marzulli and HI Maibach, published by Taylor & Francis, Washington DC, 5th Edition, pp. 515–530. (11) Tyrrell, R. M. and Pidoux, M. (1987), Action spectra for human skin cells: estimates of the relative cytotoxicity of the middle ultraviolet, near ultraviolet and violet regions of sunlight on epidermal kera- tinocytes, Cancer Research 47, pp. 1825–1829. (12) ZEBET/ECVAM/COLIPA, Standard Operating Procedure: Balb/c 3T3 NRU Phototoxicity Test, drafted 23 December 1997 by M. Liebsch and approved 6 March 1998 by the Management Team of the EU/COLIPA project “In Vitro Photoirritation”. (13) Spielmann, H. , Balls, M. , Dupuis, J. , Pape, W. J. W. , De Silva, O. , Holzhütter, H. G. , Gerberick, F. , Liebsch, M. , Lovell, W. W. and Pfannenbecker (1998), A Study on the Phototoxic Potential of UV Fil- ter Chemicals from Annex VII of the EU Directive 76/768/EEC in the 3T3 NRU In Vitro Phototoxicity Test, ATLA 26, pp. 679–708. (14) Holzhütter, H. G. and Quedenau, J. (1995), Mathematical modelling of cellular responses to external signals, Journal of Biological Systems 3, pp. 127–138. (15) Holzhütter, H. G. (1997), A general measure of in vitro phototoxicity derived from pairs of dose- response curves and its use for predicting the in vivo phototoxicity of chemicals, ATLA 25, pp. 445–462. 13/25. kd ET Euroopa Liidu Teataja 259 Liide (1) Täiendavaid üksikasju võib leida viites 12. ”


title: Forslag til Rådets forordning om ændring af Rådets forordning (EF) nr. 603/1999 om indførelse af en endelig antidumpingtold på importen af binde- og pressegarn af polypropylen med oprindelse i Polen, Tjekkiet og Ungarn og om endelig opkrævning af den midlertidige told

eurovoc_concepts:
anti-dumping duty
import
manufactured goods
originating product
plastics

formats: html pdf

text: KOMMISSIONEN FOR DE EUROPÆISKE FÆLLESSKABER Bruxelles, den 25. 04. 2000 KOM(2000) 235 endelig Forslag til RÅDETS FORORDNING om ændring af Rådets forordning (EF) nr. 603/1999 om indførelse af en endelig antidumpingtold på importen af binde- og pressegarn af polypropylen med oprindelse i Polen, Tjekkiet og Ungarn og om endelig opkrævning af den midlertidige told (forelagt af Kommissionen) BEGRUNDELSE 1. 2. 3. 4. Ved forordning (EF) nr. 603/1999 indførte Rådet en endelig antidumpingtold på importen af binde- og pressegarn af polypropylen med oprindelse i bl. a. Polen, undtagen hvis varen fremstilles og eksporteres eller faktureres direkte til et importerende selskab i Fællesskabet af WKI Isoliertechnik Spolka z. o. o. , hvis individuelle pristilsagn er godtaget af Kommissionen ved afgørelse 1999/215/EF. Selskabet har imidlertid nu trukket sit tilsagn tilbage efter at have haft vanskeligheder ved at overholde visse betingelser i tilsagnet. Vedlagte forordning indeholder derfor et forslag om at ophæve den fritagelse for antidumpingtold, der er indrømmet dette selskab. Sideløbende med denne forordning fremsættes der forslag om en afgørelse om ændring af listen over de parter, hvis tilsagn er godtaget i nævnte procedure. 2 Forslag til RÅDETS FORORDNING om ændring af Rådets forordning (EF) nr. 603/1999 om indførelse af en endelig antidumpingtold på importen af binde- og pressegarn af polypropylen med oprindelse i Polen, Tjekkiet og Ungarn og om endelig opkrævning af den midlertidige told RÅDET FOR DEN EUROPÆISKE UNION HAR - under henvisning til traktaten om oprettelse af Det Europæiske Fællesskab, under henvisning til Rådets forordning (EF) nr. 384/96 af 22. december 1995 om beskyttelse mod dumpingimport fra lande, der ikke er medlemmer af Det Europæiske Fællesskab1, ændret ved forordning (EF) nr. 905/982 af 27. april 1998, særlig artikel 8, stk. 9, og artikel 9, under henvisning til forslag fremsat af Kommissionen efter høring af Det Rådgivende Udvalg, og ud fra følgende betragtninger: A. TIDLIGERE PROCEDURE (1) (2) Efter en undersøgelse, der blev indledt ved en meddelelse offentliggjort i De Europæiske Fællesskabers Tidende3, indførte Rådet ved forordning (EF) nr. 603/19994 en endelig antidumpingtold på importen af binde- og pressegarn af polypropylen med oprindelse i Polen, Tjekkiet og Ungarn. Inden for rammerne af denne undersøgelse godtog Kommissionen endvidere ved afgørelse 1999/215/EF af 16. marts 19995 pristilsagn fra bl. a. det polske selskab WKI Isoliertechnik Spolka z. o. o. (i det følgende benævnt "selskabet"). 1 2 3 4 5 EFT L 56 af 6. 3. 1996, s. 1. EFT L 128 af 30. 4. 1998, s. 18. EFT C 1 af 3. 1. 1998, s. 10. EFT L 75 af 20. 3. 1999, s. 1 EFT L 75 af 20. 3. 1999, s. 34 3 (3) (4) (5) (6) (7) (8) B. TILBAGETRÆKNING AF TILSAGN Selskabet har imidlertid nu trukket sit vanskeligheder ved at overholde visse betingelser i tilsagnet. tilsagn tilbage efter at have haft I betragtning af denne tilbagetrækning skal den fritagelse for antidumpingtold, som er indrømmet dette selskab, derfor ophæves, og der skal indføres endelig told, jf. artikel 8, stk. 9, og artikel 9 i forordning (EF) nr. 384/96. C. ENDELIG TOLD Undersøgelsen, som førte til selskabets tilsagn, afsluttedes med, at der ved forordning (EF) nr. 603/1999 blev truffet en endelig afgørelse vedrørende dumping og skade. i forordning (EF) nr. 384/96 skal den I henhold til artikel 8, stk. 9, antidumpingtold, der nu skal indføres over for selskabet, derfor fastlægges på grundlag af de oplysninger, som blev konstateret i forbindelse med den tilsagnet. I denne forbindelse findes det med undersøgelse, der førte til henvisning til betragtning (15), (71) og (75) i forordning (EF) nr. 603/1999 passende, at den endelige antidumpingtold fastsættes til en værditold på 15,7%. D. ÆNDRING AF FORORDNING (EF) NR. 603/1999 Forordning (EF) nr. 603/1999 bør derfor ændres, så selskabet slettes på listen over selskaber, der er fritaget fra antidumpingtolden på binde- eller pressegarn af polypropylen med oprindelse i bl. a. Polen, og så det pålægges en endelig antidumpingtold på 15,7%. Sideløbende med denne forordning har Kommissionen ved afgørelse 2000/xxxx/EF6 ændret afgørelse 1999/215/EF og fjernet selskabet fra listen over parter, hvis tilsagn er blevet godkendt - UDSTEDT FØLGENDE FORORDNING: Artikel 1 Artikel 1, stk. 2, i Rådets forordning (EF) nr. 603/1999 affattes således: Den endelige antidumpingtold fastsættes til følgende af prisen, netto, frit fremstillet af nedennævnte for varer, der er 2. Fællesskabets grænse, ufortoldet, selskaber: 6 EFT L [nr. ] af [dato], s. [side]. 4 Land Selskab Toldsats Polen BZLP Bezalin PAT Defalin s. a. Industrial Chemistry Research Institute Terplast sp z. o. o. WKI Isoliertechnik Spolka z. o. o. Tjekkiet Ungarn Alle andre selskaber Alle selskaber Alle selskaber Artikel 2 (%) 17,2 16,3 12,8 6,1 15,7 20,3 24,8 32,9 Taric- tillægskode 8450 8569 8578 8579 A091 8900 8900 8900 Artikel 2, stk. 2, i Rådets forordning (EF) nr. 603/1999 affattes således: Import i henhold til afgivne og godtagne tilsagn angives under følgende Taric- 2. tillægskoder: Land Selskab Tjekkiet Juta a. s. Lanex a. s. Ungarn Partium ’70 Rt Tiszai Vegyi Kombinat Rt Elso Magyar Kenderfono Rt Artikel 3 Taric- tillægskode 8596 8580 8581 8582 8583 Denne forordning træder i kraft dagen efter offentliggørelsen i De Europæiske Fællesskabers Tidende. Denne forordning er bindende i alle enkeltheder og gælder umiddelbart i hver medlemsstat. Udfærdiget i Bruxelles, den På Rådets vegne Formand 5


title: 2000/324/EC: Commission Decision of 25 April 2000 amending Decision 1999/215/EC accepting undertakings offered in connection with the anti-dumping proceedings concerning imports of polypropylene binder or baler twine originating in Poland, the Czech Republic and Hungary and terminating the proceeding in respect of such imports originating in Saudi Arabia (notified under document number C(2000) 1058)

eurovoc_concepts:
anti-dumping duty
import
manufactured goods
originating product
plastics
third country

formats: html pdf print

text: 11. 5. 2000 EN Official Journal of the European Communities L 112/65 II (Acts whose publication is not obligatory) COMMISSION COMMISSION DECISION of 25 April 2000 amending Decision 1999/215/EC accepting undertakings offered in connection with the anti- dumping proceedings concerning imports of polypropylene binder or baler twine originating in Poland, the Czech Republic and Hungary and terminating the proceeding in respect of such imports originating in Saudi Arabia (notified under document number C(2000) 1058) (2000/324/EC) THE COMMISSION OF THE EUROPEAN COMMUNITIES, Having regard to the Treaty establishing the European Community, Having regard to Council Regulation (EC) No 384/96 of 22 December 1995 on protection against dumped imports from countries not members of the European Community (1), as last amended by Regulation (EC) No 905/98 (2), and in particular Article 8(9) thereof, After consulting the Advisory Committee, Whereas: A. PREVIOUS PROCEDURE (1) (2) Following an investigation initiated by means of a notice published in the Official Journal of the European Communities (3), imposed definitive anti-dumping duties on imports of polypropylene binder or baler twine originating in Poland, the Czech Republic and Hungary. the Council, by Regulation (EC) No 603/1999 (4), Also within the framework of this investigation, the Commission, by Decision 1999/215/EC of 16 March 1999 (5), accepted a price undertaking offered by, inter alia, the Polish company WKI Isoliertechnik Spolka z. o. o. (hereinafter the ‘company’). B. WITHDRAWAL OF UNDERTAKING (3) The company has, however, now withdrawn its undertaking following difficulties in observing certain conditions laid down therein. (1) OJ L 56, 6. 3. 1996, p. 1. (2) OJ L 128, 30. 4. 1998, p. 18. (3) OJ C 1, 3. 1. 1998, p. 10. (4) OJ L 75, 20. 3. 1999, p. 1. (5) OJ L 75, 20. 3. 1999, p. 34. L 112/66 EN Official Journal of the European Communities 11. 5. 2000 (4) (5) Accordingly, in view of this withdrawal, Decision 1999/215/EC should be amended so as remove the name of the company from the list of companies from which undertakings are accepted in this proceeding. In parallel to this Decision, the Council, by Regulation (EC) No 968/2000 (1) has withdrawn the exemption from the anti-dumping duties granted to this company and has imposed a definitive anti-dumping duty against it, HAS ADOPTED THIS DECISION: Article 1 Article 1(1) of Decision 1999/215/EC is hereby replaced by the following. The undertakings offered by the producers mentioned below, ‘1. in the framework of the anti- dumping proceedings concerning imports into the Community of polypropylene binder or baler twine originating in Poland, the Czech Republic and Hungary, are hereby accepted. Czech Republik Hungary Country Company Juta a. s. Lanex a. s. Partium (cid:1)70 Rt Tiszai Vegyi Kombinat Rt Elso Magyar Kenderfono Rt Article 2 TARIC additional code 8596 8580 8581 8582 8583’ This Decision shall take effect on the day following its publication in the Official Journal of the European Communities. Done at Brussels, 25 April 2000. For the Commission Pascal LAMY Member of the Commission (1) See page 1 of this Official Journal


title: 2000/332/EG: Entscheidung der Kommission vom 25. April 2000 zur Änderung der Entscheidung 97/20/EG mit der Liste der Drittländer, welche die Bedingungen der Gleichwertigkeit der Produktions- und Vermarktungsbedingungen für lebende Muscheln, Stachelhäuter, Manteltiere und Meeresschnecken erfüllen (Bekanntgegeben unter Aktenzeichen K(2000) 1052) (Text von Bedeutung für den EWR)

eurovoc_concepts:
Vietnam
health control
import
marketing
mollusc
third country

text: L 114/40 DE Amtsblatt der Europäischen Gemeinschaften 13. 5. 2000 ENTSCHEIDUNG DER KOMMISSION vom 25. April 2000 zur Änderung der Entscheidung 97/20/EG mit der Liste der Drittländer, welche die Bedingungen der Gleichwertigkeit der Produktions- und Vermarktungsbedingungen für lebende Muscheln, Stachelhäuter, Manteltiere und Meeresschnecken erfüllen (Bekanntgegeben unter Aktenzeichen K(2000) 1052) (Text von Bedeutung für den EWR) (2000/332/EG) DIE KOMMISSION DER EUROPÄISCHEN GEMEINSCHAFTEN — gestützt auf den Vertrag zur Gründung der Europäischen Gemeinschaft, (3) Republik Vietnam in den Teil I der Liste aufgenommen werden. Die in dieser Entscheidung vorgesehenen Maßnahmen entsprechen der Stellungnahme des Ständigen Veterinär- ausschusses — HAT FOLGENDE ENTSCHEIDUNG ERLASSEN: Artikel 1 Der Anhang der Entscheidung 97/20/EG wird durch den Anhang der vorliegenden Entscheidung ersetzt. Diese Entscheidung ist an alle Mitgliedstaaten gerichtet. Artikel 2 Brüssel, den 25. April 2000 Für die Kommission David BYRNE Mitglied der Kommission gestützt auf die Richtlinie 91/492/EWG vom 15. Juli 1991 zur Festlegung von Hygienevorschriften für die Erzeugung und Vermarktung lebender Muscheln (1), zuletzt geändert durch die Richtlinie 97/79/EG (2), insbesondere auf Artikel 9 Nummer 3 Buchstabe b), in Erwägung nachstehender Gründe: (1) (2) Die Entscheidung 97/20/EG der Kommission (3), zuletzt geändert durch die Entscheidung 98/571/EG (4), enthält die Liste der Drittländer, aus denen zum Verzehr bestimmte lebende Muscheln, Stachelhäuter, Manteltiere und Meeresschnecken in jeder Form eingeführt werden können. Mit der Entscheidung 2000/333/EG der Kommission (5) wurden Sonderbedingungen für von Muscheln, Stachelhäutern, Manteltieren und Meeres- schnecken mit Ursprung in der Sozialistischen Republik Vietnam festgelegt. Die Entscheidung 97/20/EG sollte daher entsprechend geändert und die Sozialistische Einfuhr die (1) ABl. L 268 vom 24. 9. 1991, S. 1. (2) ABl. L 24 vom 30. 1. 1998, S. 31. (3) ABl. L 6 vom 10. 1. 1997, S. 46. (4) ABl. L 277 vom 14. 10. 1998, S. 42. (5) Siehe Seite 42 dieses Amtsblatts. 13. 5. 2000 DE Amtsblatt der Europäischen Gemeinschaften L 114/41 ANHANG LISTE DER DRITTLÄNDER, AUS WELCHEN DIE EINFUHR VON ZUM VERZEHR BESTIMMTEN MUSCHELN, STACHELHÄUTERN, MANTELTIEREN UND MEERESSCHNECKEN IN JEDER FORM ZUGELASSEN IST I. Drittländer, die Gegenstand einer spezifischen Entscheidung im Sinne der Richtlinie 91/492/EWG des Rates sind: AU CL Australien Chile MA Marokko PE VN KR TN TR Peru Sozialistische Republik Vietnam Südkorea Tunesien Türkei II. Drittländer, die möglicherweise Gegenstand einer vorläufigen Entscheidung im Sinne der Entscheidung 95/408/EWG des Rates sein werden: CA FO GL NZ TH Kanada Färöer Grönland Neuseeland Thailand (nur für Erzeugnisse, die nach den Bestimmungen der Entscheidung 93/25/EWG der Kommission sterilisiert oder hitzebehandelt wurden) US Vereinigte Staaten von Amerika