title: Règlement (CE) nº 827/2000 de la Commission, du 25 avril 2000, modifiant le règlement (CE) nº 2461/1999 portant modalités d'application du règlement (CE) nº 1251/1999 du Conseil en ce qui concerne l'utilisation des terres mises en jachère pour la production de matières premières servant à la fabrication, dans la Communauté, de produits qui ne sont pas directement destinés à la consommation humaine ou animale

eurovoc_concepts:
agricultural product
crop production
fallow
land use
raw material

text: 26. 4. 2000 FR Journal officiel des Communautés européennes L 101/21 RÈGLEMENT (CE) No 827/2000 DE LA COMMISSION du 25 avril 2000 modifiant le règlement (CE) no 2461/1999 portant modalités d'application du règlement (CE) no 1251/1999 du Conseil en ce qui concerne l'utilisation des terres mises en jachère pour la produc- tion de matières premières servant à la fabrication, dans la Communauté, de produits qui ne sont pas directement destinés à la consommation humaine ou animale LA COMMISSION DES COMMUNAUTÉS EUROPÉENNES, vu le traité instituant la Communauté européenne, vu le règlement (CE) no 1251/1999 du Conseil du 17 mai 1999 instituant un régime de soutien aux producteurs de certaines cultures arables (1), modifié par le règlement (CE) no 2704/ 1999 (2), et notamment son article 9, considérant ce qui suit: (1) (2) (3) (4) L'article 6, paragraphe 3, premier alinéa, du règlement (CE) no 1251/1999 prévoit que les terres mises en jachère peuvent être utilisées pour la production de matières destinées à la fabrication, sur le territoire de la Communauté, de produits qui ne sont pas directement destinés à la consommation humaine ou animale, sous réserve de l'application de systèmes de contrôle efficaces. Afin de garantir la conformité avec le point 7 du mémo- randum d'accord entre la Communauté économique européenne et les États-Unis d'Amérique concernant les oléagineux dans le cadre du GATT, approuvé par la décision 93/355/CEE du Conseil (3), il est prévu à l'article 6, paragraphe 3, troisième alinéa, du règlement (CE) no 1251/1999 que, si la quantité de sous-produits destinée à la consommation animale ou humaine pouvant devenir disponible à la suite de la culture de graines oléagineuses sur des terres gelées en vertu du premier alinéa dépasse annuellement, sur la base des quantités prévues couvertes par les contrats conclus avec les producteurs, 1 million de tonnes métriques, exprimées en équivalent-farine de fèves de soja, la quantité prévue par chaque contrat pouvant être utilisée pour la consom- mation animale ou humaine est réduite afin de limiter cette quantité à 1 million de tonnes métriques. Il convient à présent, pour pouvoir mettre en œuvre le troisième principe établi à l'article 6, paragraphe 3, alinéa, du règlement (CE) no 1251/1999, de compléter le système de surveillance, permettant d'évaluer les quan- tités de sous-produits, mis en place par le règlement (CE) no 2461/1999 de la Commission (4). Il est nécessaire également de préciser la méthode de calcul à utiliser par la Commission dans le cadre du système de surveillance et de mettre en place une procé- dure visant à fixer le coefficient de réduction pour les quantités de sous-produits destinés au marché de l'ali- mentation animale ou humaine à appliquer sur chaque contrat en cas de dépassement du plafond de 1 million de tonnes. Dans ce contexte, la teneur en protéines pures constitue le critère déterminant pour l'élaboration de la méthode de calcul. Pour s'assurer que la quantité maximale de sous-produits pouvant être destinée à l'alimentation humaine ou animale ne sera pas dépassée, il convient d'exiger des preuves concernant l'écoulement des quantités de sous- produits destinés au marché non alimentaire, à fournir au moment de la libération de la garantie constituée par le collecteur ou le premier transformateur. Afin de permettre un contrôle efficace du respect de l'obligation de ne pas dépasser le plafond de 1 million de tonnes, il est nécessaire d'imposer une date limite pour l'écoulement des quantités de sous-produits destinés au marché non alimentaire. la nouvelle réglementation concernant le D'autre part, soutien au développement rural adoptée en 1999 n'in- terdit plus explicitement les aides agro-environnemen- tales pour les surfaces bénéficiant du régime communau- taire de retrait des terres qui sont utilisées pour une production non alimentaire. Il convient, pour des raisons de cohérence, d'adapter les dispositions interdisant le cumul avec d'autres régimes de soutien communautaire. Étant donné que le mémorandum d'accord susmen- tionné a été publié dans le Journal officiel des Commu- nautés européennes en 1993, les opérateurs sont supposés connaître ses termes depuis cette date. Vu qu'il existe un risque que le plafond de 1 million de tonnes soit dépassé il est nécessaire de pour prévoir la possibilité d'appliquer les mesures reprises dans ce règlement à tous les contrats conclus au titre de la campagne 2000/2001. la campagne 2000/2001, Les mesures prévues sont conformes à l'avis du comité de gestion des céréales, au présent règlement (5) (6) (7) (8) (9) A ARRÊTÉ LE PRÉSENT RÈGLEMENT: (1) JO L 160 du 26. 6. 1999, p. 1. (2) JO L 327 du 21. 12. 1999, p. 12. (3) JO L 147 du 18. 6. 1993, p. 25. (4) JO L 299 du 20. 11. 1999, p. 16. Article premier Le règlement (CE) no 2461/1999 est modifié comme suit: L 101/22 FR Journal officiel des Communautés européennes 26. 4. 2000 1) À l'article 4, le paragraphe 4 est remplacé par le texte preuve: suivant: «4. Lorsque le contrat porte sur des graines de navette, de colza, de tournesol ou des fèves de soja relevant des codes NC ex 1205 00 90, 1206 00 91, 1206 00 99 ou 1201 00 90, le demandeur veille à ce que le contrat spécifie, outre les informations visées au paragraphe 2, la quantité totale escomptée de sous-produits qu'il est prévu de produire et la quantité escomptée de sous-produits destinés à des fins autres que la consommation humaine ou animale, exprimée dans les deux cas par espèce. Lesdites quantités sont calculées sur la base des rapports suivants: a) 100 kilogrammes de graines de navette et/ou de colza relevant du code NC 1205 00 90 sont considérés comme équivalents à 56 kilogrammes de sous-produits; b) 100 kilogrammes de graines de tournesol relevant des codes NC 1206 00 91 ou NC 1206 00 99 sont consi- dérés comme équivalents à 56 kilogrammes de sous- produits; c) 100 kilogrammes de fèves de soja relevant du code NC 1201 00 90 sont considérés comme équivalents à 78 kilogrammes de sous-produits. » 2) L'article 14 est remplacé par le texte suivant: «1. Sans préjudice de l'article 13, l'autorité compétente visée au paragraphe 1 dudit article informe la Commission dès que possible, et au plus tard le 30 juin de l'année au cours de laquelle la récolte de la matière première est effec- tuée, de la quantité totale prévue, par espèce, de sous- produits destinés à la consommation humaine ou animale résultant des contrats mentionnés à l'article 4, si de tels contrats concernent des graines de navette, des graines de colza, des graines de tournesol ou des fèves de soja relevant des codes NC ex 1205 00 90, 1206 00 91, 1206 00 99 ou 1201 00 90. 2. La Commission calcule la quantité totale prévue de sous-produits destinés à la consommation humaine ou animale, exprimée en équivalent-farine de soja, à partir de l'information fournie conformément au paragraphe 1 en appliquant la méthode basée sur les coefficients suivants: — tourteaux de soja: 48 %, — tourteaux de colza: 32 %, — tourteaux de tournesol: 28 %. Si, sur la base du calcul effectué conformément au premier alinéa, la Commission constate un dépassement du plafond de 1 million de tonnes de sous-produits destinés à la consommation humaine ou animale, elle fixe, dès que possible et au plus tard le 31 juillet de l'année pendant laquelle la récolte de la matière première a lieu, le pourcen- tage de réduction à appliquer à chaque contrat, en vue de calculer la quantité maximale de sous-produits qui peut être destinée à la consommation humaine ou animale. » a) que les quantités de matières premières en question ont été transformées dans le respect de l'exigence prévue à l'article 4, paragraphe 2, point f), compte tenu, si néces- saire, de toute modification effectuée en vertu des dispo- sitions de l'article 8 et b) lorsque le contrat porte sur des graines de navette, de colza, de tournesol ou des fèves de soja relevant des codes NC ex 1205 00 90, 1206 00 91, 1206 00 99 ou 1201 00 90 et que la procédure prévue à l'article 14, paragraphe 2, est d'application, que les quantités de sous-produits dépassant la quantité maximale pouvant être destinée à la consommation humaine ou animale ont le marché trouvé alimentaire. » débouchés d'autres que 4) À l'article 16, le paragraphe 2 est remplacé par le texte suivant: Les obligations suivantes constituent des exigences (CEE) «2. principales au sens de l'article 20 du règlement no 2220/85: a) l'obligation de transformer à titre principal des quantités de matière première dans les produits finis mentionnés dans le contrat; b) l'obligation de trouver d'autres débouchés que le marché alimentaire pour les quantités de sous-produits dépassant la quantité maximale pouvant être destinée à la consom- mation humaine ou animale lorsque la procédure prévue à l'article 14, paragraphe 2, est d'application. La transformation en un ou plusieurs produits finis mentionnés à l'annexe III doit être faite pour le 31 juillet de la deuxième année suivant l'année de récolte de la matière première par le demandeur. Cette date limite doit également être respectée pour l'écoulement en dehors du marché alimentaire de la quantité de sous-produits dépassant la quantité maximale pouvant être destinée à la consommation humaine ou animale lorsque la procédure prévue à l'article 14, paragraphe 2, est d'application. » 5) À l'article 25, les points a) et b) sont remplacés par le texte suivant: «a) actions financées par le Fonds européen d'orientation et de garantie agricole, section “garantie” conformément aux dispositions de l'article 1er, paragraphe 2, points a) et b), du règlement (CE) no 1258/1999; b) aides communautaires prévues par le chapitre VIII du règlement (CE) no 1257/1999 à l'exception du soutien accordé au titre des coûts de plantation pour les espèces à croissance rapide prévu à l'article 31, paragraphe 3, deuxième alinéa, dudit règlement. » 3) À l'article 15, le paragraphe 4 est remplacé par le texte suivant: Article 2 La garantie est «4. libérée, au prorata, pour chaque matière première, pour autant que l'autorité compétente du collecteur ou du premier transformateur ait obtenu la Le présent règlement entre en vigueur le vingtième jour suivant celui de sa publication au Journal officiel des Communautés européennes. 26. 4. 2000 FR Journal officiel des Communautés européennes L 101/23 Le présent règlement est applicable à tous les contrats conclus au titre de la campagne 2000/2001 et des campagnes suivantes, quelle que soit la date de leur conclusion. Par dérogation au précédent alinéa, les modifications de l'article 4, paragraphe 4, et de l'article 14, paragraphe 1, du règlement (CE) no 2461/1999 prévues au présent règlement sont applicables aux contrats conclus au titre de la campagne 2001/2002 et les campagnes suivantes. Le présent règlement est obligatoire dans tous ses éléments et directement applicable dans tout État membre. Fait à Bruxelles, le 25 avril 2000. Par la Commission Franz FISCHLER Membre de la Commission


title: Commission Regulation (EC) No 828/2000 of 25 April 2000 amending the export refunds on poultrymeat

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export refund
poultrymeat

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text: L 101/24 EN Official Journal of the European Communities 26. 4. 2000 COMMISSION REGULATION (EC) No 828/2000 of 25 April 2000 amending the export refunds on poultrymeat THE COMMISSION OF THE EUROPEAN COMMUNITIES, Having regard to the Treaty establishing the European Community, Having regard to Council Regulation (EEC) No 2777/75 of 29 October 1975 on the common organisation of the market in poultrymeat (1), as last amended by Commission Regulation (EC) No 2916/95 (2), and in particular Article 8(3) thereof, Whereas: (1) (2) The export Commission Regulation (EC) No 553/2000 (3). refunds on poultrymeat were fixed by It follows from applying the criteria referred to in Article 8 of Regulation (EEC) No 2777/75 to the information known to the Commission that the export refunds at present in force should be altered to the amounts set out in the Annex hereto, HAS ADOPTED THIS REGULATION: Article 1 The export refunds on the products listed in Article 1(1) of Regulation (EEC) No 2777/75, exported in the natural state, as fixed in the Annex to Regulation (EC) No 553/2000 are hereby altered as shown in the Annex to this Regulation. This Regulation shall enter into force on 26 April 2000. Article 2 This Regulation shall be binding in its entirety and directly applicable in all Member States. Done at Brussels, 25 April 2000. For the Commission Franz FISCHLER Member of the Commission (1) OJ L 282, 1. 11. 1975, p. 77. (2) OJ L 305, 19. 12. 1995, p. 49. (3) OJ L 67, 15. 3. 2000, p. 32. 26. 4. 2000 EN Official Journal of the European Communities L 101/25 to the Commission Regulation of 25 April 2000 amending the export refunds on poultrymeat ANNEX Product code Destination of refund (1) 0207 12 10 9900 0207 12 90 9190 0207 12 90 9990 02 03 02 03 02 03 Amount of refund EUR/100 kg 28,00 25,00 28,00 25,00 28,00 25,00 (1) The destinations are as follows: 02 Angola, Saudi Arabia, Kuwait, Bahrain, Qatar, Oman, the United Arab Emirates, Jordan, Yemen, Lebanon, Iraq and Iran, 03 Armenia, Azerbaijan, Belarus, Georgia, Kazakhstan, Kyrgyzstan, Moldova, Russia, Tajikistan, Turkmenistan, Uzbekistan and Ukraine. NB: The product codes and the footnotes are defined in amended Commission Regulation (EEC) No 3846/87


title: Kommissionens förordning (EG) nr 825/2000 av den 25 april 2000 om fastställande av schablonvärden vid import för bestämning av ingångspriset för vissa frukter och grönsaker

eurovoc_concepts:
agri-monetary policy
citrus fruit
fruit vegetable
import price
pip fruit

text: 26. 4. 2000 SV Europeiska gemenskapernas officiella tidning L 101/1 I (Rättsakter vilkas publicering är obligatorisk) KOMMISSIONENS FÖRORDNING (EG) nr 825/2000 av den 25 april 2000 om fastställande av schablonvärden vid import för bestämning av ingångspriset för vissa frukter och grönsaker EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION HAR ANTAGIT DENNA FÖRORDNING med beaktande av Fördraget om upprättandet av Europeiska gemenskapen, (2) produkter och de perioder som anges i bilagan till den förordningen. Vid tillämpningen av dessa kriterier bör schablonvärdena vid import fastställas till de nivåer som anges i bilagan till denna förordning. med beaktande av kommissionens förordning (EG) nr 3223/94 av den 21 december 1994 om tillämpningsföreskrifter för importordningen för frukt och grönsaker (1), senast ändrad genom förordning (EG) nr 1498/98 (2), särskilt artikel 4. 1 i denna, och av följande skäl: (1) I förordning (EG) nr 3223/94 anges som tillämpning av resultaten av de multilaterala förhandlingarna i Uruguay- rundan kriterierna för kommissionens fastställande av från tredje land för de schablonvärdena vid import HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE. Artikel 1 De schablonvärden vid import som avses i artikel 4 i förord- ning (EG) nr 3223/94 skall fastställas enligt tabellen i bilagan. Denna förordning träder i kraft den 26 april 2000. Artikel 2 Denna förordning är till alla delar bindande och direkt tillämplig i alla medlemsstater. Utfärdad i Bryssel den 25 april 2000. På kommissionens vägnar Franz FISCHLER Ledamot av kommissionen (1) EGT L 337, 24. 12. 1994, s. 66. (2) EGT L 198, 15. 7. 1998, s. 4. L 101/2 SV Europeiska gemenskapernas officiella tidning 26. 4. 2000 till kommissionens förordning av den 25 april 2000 om fastställande av schablonvärden vid import för bestämning av ingångspriset för vissa frukter och grönsaker BILAGA KN-nr Kod för tredje land (1) (EUR/100 kg) Schablonvärde vid import 0702 00 00 0707 00 05 0709 90 70 0805 10 10, 0805 10 30, 0805 10 50 0808 10 20, 0808 10 50, 0808 10 90 0808 20 50 052 068 204 999 052 068 999 052 999 052 204 212 624 999 388 400 404 508 512 528 720 804 999 388 512 528 720 999 126,1 107,3 80,2 104,5 104,5 66,8 85,7 77,3 77,3 82,1 38,0 44,8 48,3 53,3 94,1 97,0 94,3 88,9 90,8 84,3 105,0 99,0 94,2 72,2 77,8 78,9 59,5 72,1 (1) Landsbeteckningar som fastställs i kommissionens förordning (EG) nr 2543/1999 (EGT L 307, 2. 12. 1999, s. 46). Koden ”999” betecknar ”övriga ursprung”


title: 2000 m. balandžio 25 d. Komisijos sprendimas, iš dalies keičiantis Sprendimą 1999/813/EB, nustatantį specialius reikalavimus, reglamentuojančius Vietnamo Socialistinės Respublikos kilmės žuvininkystės produktų importą (pranešta dokumentu Nr. C(2000) 1050)tekstas svarbus EEE

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Vietnam
fishery product
health certificate
import
originating product
veterinary inspection

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text: 03/29 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 95 32000D0331 2000 5 13 EUROPOS BENDRIJŲ OFICIALUSIS LEIDINYS L 114/39 KOMISIJOS SPRENDIMAS 2000 m. balandžio 25 d. iš dalies keičiantis Sprendimą 1999/813/EB, nustatantį specialius reikalavimus, reglamentuojančius Vietnamo Socialistinės Respublikos kilmės žuvininkystės produktų importą (pranešta dokumentu Nr. C(2000) 1050) (tekstas svarbus EEE) (2000/331/EB) EUROPOS BENDRIJŲ KOMISIJA, PRIĖMĖ ŠĮ SPRENDIMĄ: atsižvelgdama į Europos bendrijos steigimo sutartį, 1 straipsnis liepos 22 d. Tarybos direktyvą atsižvelgdama į 1991 m. 91/493/EEB, nustatančią veterinarijos reikalavimus, reglamen- tuojančius žuvininkystės produktų gamybą ir jų pateikimą į rinką (1), su paskutiniais pakeitimais, padarytais Direktyva 97/79/EB (2), ypač į jos 11 straipsnio 1 dalį, kadangi: (1) (2) (3) (4) (5) 16 d. lapkričio 1999 m. sprendime regla- 1999/813/EB nustatomi specialūs reikalavimai, mentuojantys Vietnamo Socialistinės Respublikos kilmės žuvininkystės produktų importą (3). Komisijos Komisija priėmė Sprendimą 2000/333/EB, nustatantį specialius reikalavimus, taikomus Vietnamo Socialistinės Respublikos kilmės dvigeldžių moliuskų, dygiaodžių, gaubtagyvių ir jūrinių gastropodų importui (4). sušaldytus Vietnamo Socialistinė Respublika planuoja į Bendriją eksportuoti dvigeldžius arba moliuskus, dygiaodžius, gaubtagyvius ir jūrinius gastro- podus, kurie buvo sterilizuoti arba termiškai apdoroti pagal Komisijos sprendimo 93/25/EEB (5) su pakeitimais, padarytais Sprendimu 97/275/EB (6), reikalavimus. apdorotus Todėl būtina iš dalies pakeisti Sprendimo 1999/813/EB A priede nustatytą veterinarijos sertifikatą. Šiame sprendime numatytos priemonės atitinka Veteri- narijos nuolatinio komiteto nuomonę, Sprendimo 1999/813/EB A priede nustatytas veterinarijos serti- fikatas, lydintis Vietnamo Socialistinės Respublikos kilmės žuvi- ninkystės produktų siuntas, iš dalies keičiamas taip: 1. IV punktas papildomas tokiu punktu: „7. Be to, jeigu žuvininkystės produktai yra sušaldyti arba jei apdoroti dvigeldžiai moliuskai buvo surinkti patvir- tintose augimvietėse, nurodytose Komisijos sprendimo 2000/333/EB (*), nustatančio specialius Vietnamo Socia- listinės Respublikos kilmės dvigeldžių moliuskų, dygiao- džių, gaubtagyvių ir jūrinių gastropodų, kurie buvo sterilizuoti arba termiškai apdoroti pagal Komisijos sprendimą 93/25/EB, importo reikalavimus, priede. (*) OL L 114, 2000 5 13, p. 42. “ 2. Paskutinė IV punkto įtrauka pakeičiama tokiu tekstu: „— toliau pasirašęs oficialus inspektorius patvirtina, kad jis yra susipažinęs su Direktyvų 91/492/EEB, 91/493/EEB, 92/48/EEB ir Sprendimų 93/25/EB, 1999/813/EB ir 2000/333/EB nuostatomis. “ 2 straipsnis Šis sprendimas skirtas valstybėms narėms. Priimta Briuselyje, 2000 m. balandžio 25 d. Komisijos vardu David BYRNE Komisijos narys (1) OL L 268, 1991 9 24, p. 15. (2) OL L 24, 1998 1 30, p. 31. (3) OL L 315, 1999 12 9, p. 39. (4) OL L 114, 2000 5 13, p. 42. (5) OL L 16, 1993 1 25, p. 22. (6) OL L 108, 1997 4 25, p. 2


title: Reglamento (CE) n° 825/2000 de la Comisión de 25 de abril de 2000 por el que se establecen valores globales de importación para la determinación del precio de entrada de determinadas frutas y hortalizas

text: 26. 4. 2000 ES Diario Oficial de las Comunidades Europeas L 101/1 I (Actos cuya publicación es una condición para su aplicabilidad) REGLAMENTO (CE) No 825/2000 DE LA COMISIÓN de 25 de abril de 2000 por el que se establecen valores globales de importación para la determinación del precio de entrada de determinadas frutas y hortalizas LA COMISIÓN DE LAS COMUNIDADES EUROPEAS, (2) En aplicación de los criterios antes indicados, los valores globales de importación deben fijarse en los niveles que figuran en el anexo del presente Reglamento. Visto el Tratado constitutivo de la Comunidad Europea, Visto el Reglamento (CE) no 3223/94 de la Comisión, de 21 de diciembre de 1994, por el que se establecen disposiciones de aplicación del régimen de importación de frutas y hortalizas (1), cuya última modificación la constituye el Reglamento (CE) no 1498/98 (2), y, en particular, el apartado 1 de su artículo 4, Considerando lo siguiente: (1) El Reglamento (CE) no 3223/94 establece, en aplicación de los resultados de las negociaciones comerciales multi- laterales de la Ronda Uruguay, los criterios para que la Comisión fije los valores a tanto alzado de importación de terceros países correspondientes a los productos y períodos que se precisan en su anexo. HA ADOPTADO EL PRESENTE REGLAMENTO: Artículo 1 Los valores globales de importación a que se refiere el artículo 4 del Reglamento (CE) no 3223/94 quedan fijados según se indica en el cuadro del anexo. Artículo 2 El presente Reglamento entrará en vigor el 26 de abril de 2000. El presente Reglamento será obligatorio en todos sus elementos y directamente aplicable en cada Estado miembro. Hecho en Bruselas, el 25 de abril de 2000. Por la Comisión Franz FISCHLER Miembro de la Comisión (1) DO L 337 de 24. 12. 1994, p. 66. (2) DO L 198 de 15. 7. 1998, p. 4. L 101/2 ES Diario Oficial de las Comunidades Europeas 26. 4. 2000 del Reglamento de la Comisión, de 25 de abril de 2000, por el que se establecen los valores globales de importación para la determinación del precio de entrada de determinadas frutas y hortalizas ANEXO Código NC 0702 00 00 0707 00 05 0709 90 70 0805 10 10, 0805 10 30, 0805 10 50 0808 10 20, 0808 10 50, 0808 10 90 0808 20 50 Código país tercero (1) Valor global de importación (EUR/100 kg) 052 068 204 999 052 068 999 052 999 052 204 212 624 999 388 400 404 508 512 528 720 804 999 388 512 528 720 999 126,1 107,3 80,2 104,5 104,5 66,8 85,7 77,3 77,3 82,1 38,0 44,8 48,3 53,3 94,1 97,0 94,3 88,9 90,8 84,3 105,0 99,0 94,2 72,2 77,8 78,9 59,5 72,1 (1) Nomenclatura de países fijada por el Reglamento (CE) no 2543/1999 de la Comisión (DO L 307 de 2. 12. 1999, p. 46). El código «999» significa «otros orígenes»


title: Directiva 2000/33/CE da Comissão, de 25 de Abril de 2000, que adapta ao progresso técnico pela vigésima sétima vez a Directiva 67/548/CEE do Conselho, relativa à aproximação das disposições legislativas, regulamentares e administrativas respeitantes à classificação, embalagem e rotulagem das substâncias perigosas (Texto relevante para efeitos do EEE.)

eurovoc_concepts:
analytical chemistry
approximation of laws
chemical product
cytology
toxicology

text: L 136/90 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias 8. 6. 2000 DIRECTIVA 2000/33/CE DA COMISSˆO de 25 de Abril de 2000 que adapta ao progresso tØcnico pela vigØsima sØtima vez a Directiva 67/548/CEE do Conselho, relativa (cid:224) aproxima(cid:231)ªo das disposi(cid:231)ıes legislativas, regulamentares e administrativas respeitantes (cid:224) classifica(cid:231)ªo, embalagem e rotulagem das subst(cid:226)ncias perigosas (*) (Texto relevante para efeitos do EEE) A COMISSˆO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS, ADOPTOU A PRESENTE DECISˆO: Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Euro- peia, Artigo 1. o regulamentares e administrativas Tendo em conta a Directiva 67/548/CEE do Conselho, de 27 de Junho de 1967, relativa (cid:224) aproxima(cid:231)ªo das disposi(cid:231)ıes respeitantes (cid:224) legislativas, classifica(cid:231)ªo, embalagem e rotulagem das subst(cid:226)ncias perigo- sas (1), com a œltima redac(cid:231)ªo que lhe foi dada pela Directiva 1999/33/CE do Parlamento Europeu e do Conselho (2), e, nomeadamente o seu artigo 28. o, Considerando o seguinte: (1) O anexo V da Directiva 67/548/CEE estabelece os mØto- dos para a determina(cid:231)ªo das propriedades f(cid:237)sico-qu(cid:237)micas, da toxicidade e da ecotoxicidade de subst(cid:226)ncias e prepara- (cid:231)ıes. A adapta(cid:231)ªo ao progresso tØcnico desse anexo Ø necessÆria. (2) O n. o 2 do artigo 7. o da Directiva 86/609/CEE do Conse- lho, de 24 de Novembro de 1986, relativa (cid:224) aproxima(cid:231)ªo das disposi(cid:231)ıes legislativas, regulamentares e administrati- vas dos Estados-Membros respeitantes (cid:224) protec(cid:231)ªo dos animais utilizados para fins experimentais e outros fins cient(cid:237)ficos (3), prevŒ que nªo deve ser realizada uma expe- riŒncia se, para obter o resultado desejado, for razoÆvel e praticamente poss(cid:237)vel utilizar outro mØtodo cientifica- mente satisfat(cid:243)rio que nªo implique a utiliza(cid:231)ªo de um animal. (3) A Comissªo tenciona introduzir no anexo V da Directiva 67/548/CEE mØtodos de ensaio alternativos que nªo implicam a utiliza(cid:231)ªo de um animal, para que possam ser utilizados no ensaio de subst(cid:226)ncias qu(cid:237)micas, na acep(cid:231)ªo do n. o 1 do artigo 3. o da Directiva 67/548/CEE. (4) O disposto na presente directiva estÆ em conformidade com o parecer do ComitØ para a adapta(cid:231)ªo ao progresso tØcnico das directivas que visam a elimina(cid:231)ªo dos entraves tØcnicos ao comØrcio no sector das subst(cid:226)ncias e prepara- (cid:231)ıes perigosas, Os textos dos anexos I e II da presente directiva sªo acrescenta- dos (cid:224) parte B do anexo V da Directiva 67/548/CEE. Artigo 2. o 1. Os Estados-Membros porªo em vigor as disposi(cid:231)ıes legis- lativas, regulamentares e administrativas necessÆrias para dar cumprimento (cid:224) presente directiva o mais tardar em 1 de Outu- bro de 2001. Desse a Comissªo. facto informarªo imediatamente As disposi(cid:231)ıes adoptadas pelos Estados-Membros farªo referŒn- cia (cid:224) presente directiva ou serªo acompanhadas da referida referŒncia aquando da sua publica(cid:231)ªo oficial. As modalidades da referŒncia sªo adoptadas pelos Estados-Membros. Os Estados-Membros comunicarªo (cid:224) Comissªo as princi- 2. pais disposi(cid:231)ıes de direito interno que adoptarem no dom(cid:237)nio abrangido pela presente directiva, bem como uma tabela de correla(cid:231)ªo entre a presente directiva e as disposi(cid:231)ıes de direito interno adoptadas. Artigo 3. o A presente directiva entra em vigor no terceiro dia seguinte ao da sua publica(cid:231)ªo no Jornal Oficial das Comunidades Europeias. Artigo 4. o Os Estados-Membros sªo os destinatÆrios da presente directiva. Feito em Bruxelas, em 25 de Abril de 2000. Pela Comissªo Margot WALLSTR(cid:214)M Membro da Comissªo (*) Adoptada antes da vigØsima sexta adapta(cid:231)ªo. (1) JO 196 de 16. 8. 1967, p. 1. (2) JO L 199 de 30. 7. 1999, p. 57. (3) JO L 358 de 18. 12. 1986, p. 1. 8. 6. 2000 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 136/91 ANEXO I «B. 40. CORROSIVIDADE CUT´NEA 1. M(cid:201)TODO 1. 1. Introdu(cid:231)ªo O Centro Europeu de Valida(cid:231)ªo de MØtodos Alternativos (ECVAM, Centro Comum de Investiga(cid:231)ªo, Comissªo Europeia) reconheceu a validade cient(cid:237)fica de dois ensaios in vitro para a corrosividade cut(cid:226)nea, o ensaio de resistŒncia elØctrica transcut(cid:226)nea (transcutaneous electrical resistance (cid:151) (cid:147)TER(cid:148)) em pele de rato e um ensaio com um modelo de pele humana (ECVAM, Centro Comum de Investiga(cid:231)ªo, Comissªo Europeia) (1) (2) (3). Os estudos de valida(cid:231)ªo levados a cabo pelo ECVAM demonstraram que ambos os ensaios permitem distinguir de forma fiÆvel as subst(cid:226)ncias corrosivas das nªo corrosivas para a pele. Para alØm disso, o protocolo do ensaio baseado no modelo de pele humana permitiu distinguir correctamente entre os diferentes graus de efeito corrosivo (R35 (cid:151) altamente corrosivo, e R34 (cid:151) corrosivo) (2). Apresentam-se a seguir a descri(cid:231)ªo e os procedimentos de ambos os ensaios; a escolha do ensaio depende das exigŒncias espec(cid:237)ficas e das preferŒn- cias do utilizador. Ver tambØm a introdu(cid:231)ªo geral, parte B. 1. 2. Defini(cid:231)ıes Corrosividadede cut(cid:226)nea: produ(cid:231)ªo de danos irrevers(cid:237)veis dos tecidos cut(cid:226)neos no seguimento da aplica(cid:231)ªo de material de ensaio. 1. 3. Subst(cid:226)ncias de referŒncia Nenhuma especificada, mas ver pontos 1. 5. 3. 4 e 1. 7. 2. 3. 1. 4. Princ(cid:237)pio do mØtodo de ensaio (cid:151) ensaio TER em pele de rato O material a testar Ø aplicado durante um per(cid:237)odo de atØ 24 horas sobre a superf(cid:237)cie da epiderme de discos de pele de ratos jovens sacrificados sem crueldade. Os materiais corrosivos sªo identificados pela sua capaci- dade de causarem uma perda da integridade normal do stratum corneum e da fun(cid:231)ªo de barreira, perda essa que Ø medida pela redu(cid:231)ªo do TER intr(cid:237)nseco abaixo de um determinado limiar (5 kh) (4) (5). Os materiais simplesmente irritantes e os materiais nªo irritantes nªo reduzem o TER abaixo desse limiar. Para as subst(cid:226)n- cias tensioactivas e para os compostos org(cid:226)nicos neutros, pode ainda ser incorporado no ensaio um passo de liga(cid:231)ªo a um corante [para as defini(cid:231)ıes neste contexto, ver a referŒncia (6)], a fim de reduzir o nœmero de falsos positivos caracter(cid:237)stico dos ensaios deste tipo de subst(cid:226)ncias qu(cid:237)micas (2) (7). 1. 5. Descri(cid:231)ªo do mØtodo de ensaio (cid:151) ensaio TER em pele de rato 1. 5. 1. Animais Para a prepara(cid:231)ªo dos discos de pele, sªo utilizados ratos jovens (20-23 dias) (Wistar ou estirpe comparÆvel). Os pŒlos dorsais e dos flancos sªo removidos cuidadosamente, com a ajuda de pequenas tesouras. Os animais sªo depois cuidadosamente lavados e esfregados, devendo a zona da pele que irÆ ser utilizada ser mergulhada numa solu(cid:231)ªo antibi(cid:243)tica (contendo, por exemplo, estreptomicina, penicilina, cloranfenicol e anfoteriicina a concentra(cid:231)ıes suficientes para inibir o crescimento bacteriano). Os animais sªo novamente lavados com uma solu(cid:231)ªo antibi(cid:243)tica no terceiro ou no quarto dia ap(cid:243)s a primeira lavagem, devendo depois ser utilizados num prazo de trŒs dias (para a prepara(cid:231)ªo das peles nªo deverªo ser utilizados animais com uma idade superior a 31 dias). 1. 5. 2. Prepara(cid:231)ªo dos discos de pele Os animais sªo sacrificados sem crueldade. A pele dorsal dos animais Ø depois retirada e a gordura em excesso Ø removida atravØs de raspagem cuidadosa. A pele Ø colocada sobre a extremidade de um tubo de politetrafluoroetileno/(PTFE), com o cuidado de garantir que a superf(cid:237)cie epidØrmica esteja em contacto com o tubo. A pele Ø fixa na extremidade do tubo com uma junta t(cid:243)nica em borracha e elimina-se o tecido em excesso. As dimensıes do tubo e da junta t(cid:243)nica sªo as apresentadas na figura 1. A junta t(cid:243)rica deve ser envolvida em vaselina, de forma a garantir a estanqueicidade da sua uniªo com o tubo de PTFE. O tubo Ø depois suspenso por uma mola dentro de uma c(cid:226)mara com uma solu(cid:231)ªo de sulfato de magnØsio (154 mM) (figura 2). 1. 5. 3. Procedimento de ensaio 1. 5. 3. 1. A p l i c a (cid:231) ª o d o m a t e r i a l d e e n s a i o As subst(cid:226)ncias de ensaio l(cid:237)quidas (150 (cid:181)l) sªo aplicadas na superf(cid:237)cie epidØrmica no interior do tubo (figura 2). Quando a subst(cid:226)ncia de ensaio for s(cid:243)lida, deverÆ ser aplicada uma quantidade suficiente para garantir a cobertura de toda a superf(cid:237)cie epidØrmica. Por cima dessa subst(cid:226)ncia Ø depois acrescentada Ægua desionizada (150 (cid:181)l) e os tubos sªo ligeiramente agitados. As subst(cid:226)ncias de ensaio deverªo estar em contacto com toda a superf(cid:237)cie da pele. No caso de algumas subst(cid:226)ncias s(cid:243)lidas, poderÆ ser necessÆrio aquecer a mistura a 30 (cid:176)C para fluidificar a subst(cid:226)ncia ou ainda proceder a uma moagem para obten(cid:231)ªo de um material granular ou pulverulento. L 136/92 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias 8. 6. 2000 Para cada subst(cid:226)ncia de ensaio serªo utilizados trŒs discos de pele. As subst(cid:226)ncias de ensaio sªo aplicadas durante um per(cid:237)odo de 24 horas (ver tambØm o ponto 1. 5. 3. 4). A subst(cid:226)ncia de ensaio deverÆ depois ser removida por lavagem em Ægua corrente a uma temperatura mÆxima de 30 (cid:176)C, atØ (cid:224) remo(cid:231)ªo completa de todo o material. A remo(cid:231)ªo das subst(cid:226)ncias de ensaio que tenham eventualmente solidificado poderÆ ser faci- litada utilizando um jacto de Ægua a uma temperatura de cerca de 30 (cid:176)C. 1. 5. 3. 2. M e d i (cid:231) ı e s T E R A TER Ø medida utilizando um databridge de corrente alterna de baixa voltagem (por exemplo: AIM 401 ou 6401, ou outro modelo equivalente). Antes da medi(cid:231)ªo da resistŒncia elØctrica, a tensªo superficial da pele Ø reduzida atravØs da adi(cid:231)ªo de um volume suficiente de etanol a 70 % para cobrir toda a epiderme. Ap(cid:243)s alguns segundos, o etanol deverÆ ser removido invertendo o tubo e o tecido Ø depois hidratado atravØs da adi(cid:231)ªo de 3 ml de solu(cid:231)ªo de sulfato de magnØsio (154 mM). Os elØctrodos do databridge sªo colocados em duas extremidades do disco de pele de forma a medir a resistŒncia em kh/disco (figura 2). As dimensıes dos elØctrodos e o comprimento de elØctrodo que deverÆ ficar livre por baixo da mola sªo indicados na figura 1. A parte interior (mais grossa) do elØctrodo deverÆ estar apoiada (cid:224) borda do tubo de PTFE durante a medi(cid:231)ªo da resistŒncia, de forma a garantir que o comprimento de elØctrodo mergulhado na solu(cid:231)ªo de sulfato de magnØsio seja constante. O elØctrodo exterior (mais fino) deverÆ ser colocado dentro da c(cid:226)mara receptora de forma a tocar o fundo da mesma. A dist(cid:226)ncia entre a parte inferior da mola e o fundo do tubo de PTFE deverÆ ser mantida constante (figura 1 ), visto que afecta o valor de resistŒncia medido. De notar que nos casos em que seja medida uma resistŒncia superior a 20 kh, isso se poderÆ dever ao facto de a subst(cid:226)ncia de ensaio estar a impedir o acesso da solu(cid:231)ªo ao disco de epiderme. Para resolver esse pro- blema, uma das possibilidades serÆ tapar o tubo de PTFE com o dedo, usando luvas de borracha, e agitar durante cerca de 10 segundos. A solu(cid:231)ªo de sulfato de magnØsio deverÆ entªo ser deitada fora e substitu(cid:237)da por solu(cid:231)ªo fresca para a realiza(cid:231)ªo da medi(cid:231)ªo. A mØdia dos valores de TER medidos poderÆ ser aceite, desde que os valores medidos em amostras de con- trolo positivo e negativo simult(cid:226)neas com o ensaio se encontrem dentro dos valores normais para o mØtodo. As subst(cid:226)ncias de controlo que poderªo ser utilizadas e os respectivos valores aceitÆveis para a metodologia e instrumentos aqui descritos sªo: Controlo Subst(cid:226)ncia Positivo Negativo `cido clor(cid:237)drico 10 M (36 %) `gua destilada Gama de resistŒncia (kh) 0,5-1,0 10-25 1. 5. 3. 3. P r o c e d i m e n t o a l t e r a d o p a r a a s o r g (cid:226) n i c a s n e u t r a s s u b s t (cid:226) n c i a s t e n s i o a c t i v a s e p a r a a s s u b s t (cid:226) n c i a s Se os valores de TER das subst(cid:226)ncias de ensaio que sejam tensioactivas ou que sejam subst(cid:226)ncias org(cid:226)nicas neutras forem inferiores ou iguais a 5 kh, poderÆ proceder-se a uma avalia(cid:231)ªo da penetra(cid:231)ªo de corantes nos tecidos. Esse procedimento permitirÆ determinar se os resultados sªo ou nªo falsos positivos (2). 1. 5. 3. 3. 1. Aplica(cid:231)ªo e elimina(cid:231)ªo do corante sulforhodamina B Ap(cid:243)s o tratamento inicial com a subst(cid:226)ncia de ensaio, aplicam-se (cid:224) superf(cid:237)cie epidØrmica de cada disco de pele 150 (cid:181)l de uma solu(cid:231)ªo a 10 % (p/v) do corante sulforhodamina B em Ægua destilada, durante 2 horas. Os discos sªo depois lavados em Ægua corrente (cid:224) temperatura ambiente durante cerca de 10 segundos, a fim de remover o corante em excesso/nªo fixado. Os discos de pele deverªo entªo ser cuidadosamente retirados do tubo de PTFE e colocados num recipiente (por expemplo: um frasco de 20 ml) com Ægua desmineralizada (8 ml). Os frascos sªo cuidadosamente agitados durante 5 minutos, para remover o corante que eventual- mente ainda exista em excesso/nªo fixado. Esse procedimento de lavagem deverÆ depois ser repetido, ap(cid:243)s o que os discos de pele deverªo ser transferidos para frascos com 5 ml de uma solu(cid:231)ªo a 30 % (p/v) de dodecil sulfato de s(cid:243)dio (SDS) em Ægua destilada e incubados a 60 (cid:176)C de um dia para o outro. Ap(cid:243)s a incuba(cid:231)ªo, os discos de pele sªo retirados e deitados fora, e a solu(cid:231)ªo centrifugada durante 8 minutos a 21 (cid:176)C (for(cid:231)a relativa de centrifuga(cid:231)ªo: p 175). Uma amostra de 1 ml do sobrenadante serÆ entªo dilu(cid:237)da num factor de 1:5 (v/v) [ou seja, 1 ml + 4 ml] numa solu(cid:231)ªo a 30 % (p/v) de SDS em Ægua destilada. A densidade (cid:243)ptica (DO) da solu(cid:231)ªo deverÆ entªo ser medida a cerca de 565 nm. 1. 5. 3. 3. 2. CÆlculo do teor em corante O teor do corante sulforhodamina B por disco Ø calculado a partir dos valores de DO (coeficiente de extin(cid:231)ªo molar do corante sulforhodamina B a 565 nm = 8,7 (cid:215) 104; peso molecular = 580). O teor deverÆ ser determi- nado para cada disco de pele e tambØm em termos de valor mØdio dos replicados. Poderªo ser aceitÆveis valores mØdios para a liga(cid:231)ªo do corante, desde que os valores medidos nos controlos se encontrem dentro das gamas normais para o mØtodo. As gamas de concentra(cid:231)ªo do corante que poderªo ser utilizadas nas subst(cid:226)ncias de controlo para a metodologia e instrumentos aqui descritos sªo: 8. 6. 2000 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 136/93 Controlo Subst(cid:226)ncia Positivo Negativo `cido clor(cid:237)drico 10 M (36 %) `gua destilada Gama de teores em corante ((cid:181)g/disco) 40-100 15-35 1. 5. 3. 4. I n f o r m a (cid:231) ª o a d i c i o n a l As subst(cid:226)ncias de ensaio tambØm poderªo ser aplicadas por per(cid:237)odos de tempo menores (por expemplo: 2 horas), para identifica(cid:231)ªo dos materiais mais severamente corrosivos. Contudo, no estudo de valida(cid:231)ªo, verifi- cou-se que o ensaio TER resulta na sobrestima(cid:231)ªo do potencial corrosivo de diversos materiais de ensaio quando se utiliza uma aplica(cid:231)ªo de apenas 2 horas (2), embora permita uma identifica(cid:231)ªo correcta das subs- t(cid:226)ncias corrosivas e nªo corrosivas ap(cid:243)s uma aplica(cid:231)ªo ao longo de 24 horas. As propriedades e dimensıes do aparelho a utilizar nos ensaios e o procedimento experimental aplicado podem influenciar os valores de TER obtidos. O limiar de corrosªo de 5 kh foi desenvolvido a partir dos dados obtidos com o aparelho e com os procedimentos descritos no presente mØtodo. Poderªo ser aplicÆveis outros limiares e valores de controlo se as condi(cid:231)ıes do ensaio forem significativamente diferentes. Logo, recomenda-se que a metodologia e os valores para o limiar de resistŒncia sejam calibrados atravØs do ensaio de uma sØrie de materiais de referŒncia a seleccionar de entre os materiais utilizados no estudo de valida- (cid:231)ªo (3). 1. 6. Princ(cid:237)pio do mØtodo de ensaio (cid:151) ensaio em modelo de pele humana O material de ensaio Ø aplicado localmente por um per(cid:237)odo que poderÆ ir atØ 4 horas num modelo tridimen- sional de pele humana, que inclu(cid:237) uma epiderme reconstru(cid:237)da com um stratum corneum funcional. Os mate- riais corrosivos sªo identificados pela sua capacidade de diminui(cid:231)ªo da viabilidade celular (que poderÆ ser determinada, por exemplo, utilizando o ensaio de redu(cid:231)ªo MTT) abaixo de determinados limiares, em fun(cid:231)ªo dos per(cid:237)odos de exposi(cid:231)ªo utilizados. O princ(cid:237)pio do ensaio baseia-se na hip(cid:243)tese de que as subst(cid:226)ncias qu(cid:237)- micas corrosivas sªo as que conseguem penetrar o stratum corneum (por difusªo ou por erosªo) e que sªo sufi- cientemente citot(cid:243)xicas para causar morte celular nas camadas celulares subjacentes. 1. 7. Descri(cid:231)ªo do mØtodo de ensaio (cid:151) ensaio em modelo de pele humana 1. 7. 1. Modelo de pele humana Os modelos de pele humana podem ter diversas origens, mas devem sempre cumprir determinados critØrios. Assim, o modelo deverÆ ter um stratum corneum funcional e uma camada subjacente de cØlulas vivas. O stra- tum corneum deverÆ ter uma fun(cid:231)ªo de barreira adequada. Essa caracter(cid:237)stica poderÆ ser comprovada atravØs da demonstra(cid:231)ªo da resistŒncia do modelo (cid:224) citotoxicidade ap(cid:243)s aplica(cid:231)ªo de subst(cid:226)ncias comprovadamente citot(cid:243)xicas mas que normalmente nªo conseguem atravessar o stratum corneum. Para alØm disso, deverÆ demonstrar-se que o modelo permite obter resultados reprodut(cid:237)veis em determinadas condi(cid:231)ıes experimen- tais. A viabilidade celular das cØlulas vivas do modelo deverÆ ser suficiente para permitir distinguir bem os resulta- dos das subst(cid:226)ncias de controlo positivo e negativo. A viabilidade celular (medida, por exemplo, pela redu(cid:231)ªo do MTT, ou seja, por um valor de DO) ap(cid:243)s a exposi(cid:231)ªo (cid:224) subst(cid:226)ncia de controlo negativo deverÆ manter-se em n(cid:237)veis aceitÆveis para o modelo de pele espec(cid:237)fico que esteja a ser utilizado. Da mesma forma, os valores da viabilidade celular ap(cid:243)s exposi(cid:231)ªo (cid:224) subst(cid:226)ncia de controlo positivo (por compara(cid:231)ªo com a viabilidade do controlo negativo) deverÆ tambØm situar-se dentro de determinados limites. Mais importante ainda, o modelo preditivo utilizado deverÆ ter sido certificado de acordo com normas de valida(cid:231)ªo internacionais (2). 1. 7. 2. Procedimento de ensaio 1. 7. 2. 1. A p l i c a (cid:231) ª o d o m a t e r i a l d e e n s a i o Para os materiais l(cid:237)quidos deverÆ ser aplicada uma quantidade suficiente para cobrir toda a superf(cid:237)cie de pele (no m(cid:237)nimo 25 (cid:181)l/cm2). Para os materiais s(cid:243)lidos, deverÆ ser tambØm aplicada uma quantidade suficiente para cobrir toda a pele, e humidificada por forma a garantir um bom contacto com a pele; quando necessÆrio, os s(cid:243)lidos poderªo ser mo(cid:237)dos antes da aplica(cid:231)ªo. DeverÆ ser demonstrado que o mØtodo de aplica(cid:231)ªo utilizado Ø adequado para diversos tipos qu(cid:237)micos (2). Ap(cid:243)s o per(cid:237)odo de exposi(cid:231)ªo, o material de ensaio deverÆ ser cuidadosamente lavado da superf(cid:237)cie da pele com uma solu(cid:231)ªo salina. 1. 7. 2. 2. M e d i (cid:231) ª o d a v i a b i l i d a d e c e l u l a r A viabilidade celular poderÆ ser medida atravØs de qualquer mØtodo quantitativo devidamente validado. O ensaio utilizado mais frequentemente Ø a redu(cid:231)ªo do MTT, que permite comprovadamente obter resultados fiÆveis e reprodut(cid:237)veis entre laborat(cid:243)rios (2). O disco de pele Ø colocado numa solu(cid:231)ªo MTT a 0,3 mg/ml, a 20-28 (cid:176)C, durante 3 horas. O precipitado azul de formazan Ø depois extra(cid:237)do (extrac(cid:231)ªo com solvente) e a sua concentra(cid:231)ªo Ø medida atravØs da determina(cid:231)ªo da DO a um comprimento de onda entre 545 e 595 nm. L 136/94 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias 8. 6. 2000 1. 7. 2. 3. O u t r a s i n f o r m a (cid:231) ı e s O modelo de pele utilizado, tal como o protocolo exacto para o tempo de exposi(cid:231)ªo, os procedimentos de lavagem, etc. , terªo um impacto significativo sobre os resultados em termos de viabilidade celular. Reco- menda-se que a metodologia e o modelo preditivo sejam calibrados atravØs do ensaio de uma sØrie de padrıes a escolher de entre os produtos qu(cid:237)micos utilizados no estudo de valida(cid:231)ªo do ECVAM (3). Um dos factores cr(cid:237)ticos serÆ a demonstra(cid:231)ªo da reprodutibilidade do mØtodo utilizado infra e inter-laborat(cid:243)rios para diversos produtos qu(cid:237)micos, de acordo com as normas internacionais. O mØtodo deverÆ cumprir, no m(cid:237)nimo, os critØrios de validade cient(cid:237)fica jÆ definidos (2), e os resultados dos estudos de valida(cid:231)ªo devem ser publica- dos em revista cient(cid:237)fica dedicada a estudos comparativos. 2. DADOS 2. 1. Tratamento dos resultados 2. 1. 1. Ensaio TER em pele de rato Os valores de resistŒncia (kh) do material de ensaio, dos controlos positivo e negativo e de qualquer produto qu(cid:237)mico padrªo utilizado deverªo ser apresentados sob a forma de uma tabela, incluindo todos os dados rela- tivos aos replicados/repeti(cid:231)ªo de experiŒncias, os valores mØdios e as classifica(cid:231)ıes da(cid:237) deduzidas em termos de corrosividade. 2. 1. 2. Ensaio em modelo de pele humana Os valores da DO e os dados relativos aos cÆlculos da percentagem de viabilidade celular do material de ensaio, dos controlos positivo e negativo e de qualquer produto qu(cid:237)mico padrªo utilizado deverªo ser apre- sentados sob a forma de uma tabela, incluindo todos os dados relativos aos replicados/repeti(cid:231)ªo de experiŒn- cias, os valores mØdios e as classifica(cid:231)ıes da(cid:237) deduzidas em termos de corrosividade. 2. 2. Avalia(cid:231)ªo e interpreta(cid:231)ao dos resultados 2. 2. 1. Ensaio TER em pele de rato Caso o valor mØdio de TER obtido para a subst(cid:226)ncia de ensaio seja superior a 5 kh, a subst(cid:226)ncia Ø conside- rada nªo corrosiva. Se o valor do TER for inferior a ou igual a 5 kh e se a subst(cid:226)ncia em causa nªo for ten- sioactiva nem um composto org(cid:226)nico neutro, serÆ considerada corrosiva. Se a subst(cid:226)ncia for tensioactiva ou um composto org(cid:226)nico neutro e se o valor de TER for inferior ou igual a 5 kh, poderÆ proceder-se a um tratamento com corante. Se o teor mØdio de corante dos discos for superior ou igual ao teor mØdio de corante dos discos de controlo positivo com HCl a 36 % testados em simult(cid:226)neo, o resultado da subst(cid:226)ncia de ensaio Ø um positivo verdadeiro e portanto a subst(cid:226)ncia deve ser considerada corrosiva. Se o teor mØdio de corante dos discos for inferior ao teor mØdio de corante dos discos de controlo positivo com HCl a 36 % testados em simult(cid:226)neo, o resultado da subst(cid:226)ncia de ensaio Ø um falso positivo e portanto a subst(cid:226)ncia deve ser considerada como nªo corrosiva. 2. 2. 2. Ensaio em modelo de pele humana O valor de DO do controlo negativo representa 100 % de viabilidade celular, pelo que os valores obtidos para cada amostra de ensaio poderªo ser utilizados para calcular uma percentagem de viabilidade relativa em rela(cid:231)ªo ao controlo negativo. A percentagem que deverÆ ser considerada para separar os materiais de ensaio corrosivos dos nªo corrosivos (ou para distinguir entre as diferentes classes de corrosividade) deverªo ser cla- ramente definidos no modelo preditivo durante a valida(cid:231)ªo do mØtodo, e deve ser demonstrado, no quadro do estudo de valida(cid:231)ªo, que esse valor Æ apropriado (2). 3. APRESENTA˙ˆO DOS RESULTADOS Relat(cid:243)rio de ensaio O relat(cid:243)rio do ensaio deverÆ incluir, pelo menos, as seguintes informa(cid:231)ıes: Subst(cid:226)ncia de ensaio: (cid:151) identifica(cid:231)ªo, caracter(cid:237)sticas f(cid:237)sicas e, se necessÆrio, f(cid:237)sico-qu(cid:237)micas. Se forem utilizadas subst(cid:226)ncias de referŒncia, deverÆ ser tambØm apresentada a mesma informa(cid:231)ªo em rela(cid:231)ªo a essas subst(cid:226)ncias. Condi(cid:231)ıes do ensaio: (cid:151) procedimento de ensaio utilizado, (cid:151) descri(cid:231)ªo e justifica(cid:231)ªo de eventuais modifica(cid:231)ıes. 8. 6. 2000 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 136/95 Resultados: (cid:151) tabelas com os valores de resistŒncia (ensaio TER) ou com as percentagens de viabilidade celular (ensaio em modelo de pele humana) dos materiais de ensaio, dos controlos positivo e negativo e de qualquer produto qu(cid:237)mico padrªo que tenha sido utilizado, incluindo todos os dados relativos aos replicados/repe- ti(cid:231)ªo de experiŒncias e valores mØdios, (cid:151) descri(cid:231)ªo de outros efeitos eventualmente observados. Discussªo dos resultados. Conclusıes. 4. BIBLIOGRAFIA (1) ECVAM (1998), ECVAM News & Views, ATLA 26, p. 275-280. (2) Fentem, J. H. , Archer, G. E. B. , Balls, M. , Botham, P. A. , Curren, R. D. , Earl, L. K. , Esdaile, D. J. , Holzhutter, H-G. & Liebsch, M. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosi- vity. 2. Results and evaluation by the Management Team, Toxicology in Vitro 12, pp. 483-524. (3) Barratt, M. D. , Brantom, P. G. , Fentem, J. H. , Gerner, I. , Walker, A. P. & Worth, A. P. (1998), (cid:147)The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 1. Selection and distribution of the test chemicals(cid:148), Toxicology in Vitro 12, pp. 471-482. (4) Oliver, G. J. A. , Pemberton, M. A. & Rhodes, C. (1986), (cid:147)An in vitro skin corrosivity test (cid:151) modifications and validation(cid:148), Food & Chemical Toxicology 24, pp. 507-512. (5) Botham, P. A. , Hall, T. J. , Dennett, R. , McCall, J. C. , Basketter, D. A. , Whittle, E. , Cheeseman, M. , Esdaile, D. J. & Gardner, J. (1992), (cid:147)The skin corrosivity test in vitro: results of an interlaboratory trial(cid:148), Toxicology in Vitro 6, pp. 191-194. (6) Worth, A. P. , Fentem, J. H. , Balls, M. , Botham, P. A. , Curren, R. D. , Earl, L. K. , Esdaile, D. J. & Liebsch, M. (1998), (cid:147)An evaluation of the proposed OECD testing strategy for skin corrosion(cid:148), ATLA 26, pp. 709-720. (7) Botham, P. A. , Chamberlain, M. , Barratt, M. D. , Curren, R. D. , Esdaile, D. J. , Gardner, J. R. , Gordon, V. C. , Hil- debrand, B. , Lewis, R. W. , Liebsch, M. , Logemann, P. , Osborne, R. , Ponec, M. , Regnier, J. F. , Steiling, W. , Walker, A. P. & Balls, M. (1995), (cid:147)A prevalidation study on in vitro skin corrosivity testing. The report and recommendations of ECVAM workshop 6(cid:148), ATLA 23, pp. 219-255. L 136/96 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias 8. 6. 2000 Figura 1 8. 6. 2000 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 136/97 Figura 2 L 136/98 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias 8. 6. 2000 ANEXO II «B. 41. FOTOTOXICIDADE (cid:151) ENSAIO DE FOTOTOXICIDADE (cid:151) IN-VITRO 3T3 NRU 1 M(cid:201)TODO 1. 1 Introdu(cid:231)ªo A fototoxicidade Ø definida como uma reac(cid:231)ªo t(cid:243)xica decorrente da primeira exposi(cid:231)ªo da pele a determina- das subst(cid:226)ncias qu(cid:237)micas, com posterior exposi(cid:231)ªo (cid:224) luz, ou por irradia(cid:231)ªo da pele na sequŒncia da adminis- tra(cid:231)ªo sistØmica de uma subst(cid:226)ncia qu(cid:237)mica. A informa(cid:231)ªo decorrente do ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU Ø utilizada para definir o potencial fotot(cid:243)xico de uma subst(cid:226)ncia em estudo, ou seja, a existŒncia ou ausŒncia de poss(cid:237)veis riscos associados a uma subst(cid:226)ncia em estudo, por exposi(cid:231)ªo (cid:224) radia(cid:231)ªo UV e vis(cid:237)vel. Dado que o objectivo toxicol(cid:243)gico do ensaio in vitro consiste na determina(cid:231)ªo da fotocitotoxicidade decor- rente da ac(cid:231)ªo combinada de uma subst(cid:226)ncia e da uma radia(cid:231)ªo, o ensaio permite identificar compostos que exibem fototoxicidade in vivo na sequŒncia da sua administra(cid:231)ªo sistØmica e difusªo na pele, bem como com- postos fotoirritantes na sequŒncia da sua aplica(cid:231)ªo t(cid:243)pica na pele. O ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU foi elaborado e validado entre 1992 e 1997 no (cid:226)mbito de um projecto conjunto UE/COLIPA (1) (2) (3), com o objectivo de estabelecer um mØtodo in vitro vÆlido destinado a substituir os diversos ensaios in vivo utilizados. Num seminÆrio da OCDE realizado em 1996 foi recomen- dada a adop(cid:231)ªo de uma abordagem sequencial in vitro para avaliar a fototoxicidade (4). Os resultados do ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU foram comparados com os efeitos de fototoxici- dade/fotoirrita(cid:231)ªo aguda in vivo em animais e no homem, tendo o ensaio revelado uma excelente previsibili- dade dos referidos efeitos. O ensaio nªo Ø concebido para detectar outros efeitos nocivos decorrentes da ac(cid:231)ªo combinada das subst(cid:226)ncias qu(cid:237)micas e a das radia(cid:231)ıes, nomeadamente a fotogenotoxicidade, a fotoalergia e a fotocarcinogenicidade, embora muitas subst(cid:226)ncias qu(cid:237)micas que apresentam essas propriedades exibam uma reac(cid:231)ªo positiva no ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU. O ensaio nªo Ø tambØm concebido para avaliar o potencial fotot(cid:243)xico. O apŒndice I apresenta abordagem sequencial para a determina(cid:231)ªo da fototoxicidade de subst(cid:226)ncias qu(cid:237)micas. 1. 2 Defini(cid:231)ıes Irradi(cid:226)ncia: intensidade da radia(cid:231)ªo ultravioleta (UV) ou vis(cid:237)vel que incide numa superf(cid:237)cie, expressa em W/m2 ou mW/cm2. Dose de radia(cid:231)ªo: quantidade (= intensidade (cid:215) tempo) de radia(cid:231)ªo ultravioleta (UV) ou vis(cid:237)vel que incide numa superf(cid:237)cie, expressa em joules (= W (cid:215) s) por unidade de superf(cid:237)cie (por exemplo, J/m2 ou J/cm2). Bandas de comprimentos de onda da radia(cid:231)ªo UV: as designa(cid:231)ıes recomendadas pela CIE (Commission Internatio- nale de l’(cid:201)clairage) sªo: UVA (315-400 nm), UVB (280-315 nm) e UVC (100-280 nm). Utilizam-se tambØm outras designa(cid:231)ıes: o limite entre UVB e UVA Ø frequentemente situado a 320 nm, podendo as radia(cid:231)ıes UVA subdividir-se em UV-A1 e UV-A2, com uma separa(cid:231)ªo a cerca de 340 nm. Viabilidade celular: par(cid:226)metro que mede a actividade total de uma popula(cid:231)ªo celular (por exemplo, absor(cid:231)ªo do pigmento vital vermelho neutro pelos lisosomas celulares); em fun(cid:231)ªo da variÆvel determinada e do tipo de ensaio realizado, Ø poss(cid:237)vel correlacionar a viabilidade celular com o nœmero total e/ou a vitalidade das cØlulas. Viabilidade celular relativa: viabilidade celular expressa em rela(cid:231)ªo aos ensaios de controlo negativos (apenas com o solvente) efectuados ao longo do procedimento de ensaio (+ UV ou ﬂ UV), na ausŒncia da subst(cid:226)ncia em estudo. Modelo de previsªo: algoritmo utilizado para transformar os resultados de um ensaio de toxicidade numa pre- visªo do potencial de toxicidade. No (cid:226)mbito das presentes directrizes de ensaio, podem utilizar-se os par(cid:226)me- tros PIF e MPE para transformar os resultados do ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU numa previsªo do potencial fotot(cid:243)xico. PIF (photo irritation factor (cid:151) Factor de fotoirrita(cid:231)ªo): factor obtido por compara(cid:231)ªo entre duas concentra(cid:231)ıes citot(cid:243)xicas igualmente eficazes (EC50) da subst(cid:226)ncia em estudo, respectivamente sem (ﬂ UV) e com exposi(cid:231)ªo (+ UV) a uma dose nªo citot(cid:243)xica de radia(cid:231)ªo UVA/vis(cid:237)vel. MPE (mean photo effect (cid:151) Fotoefeito mØdio): par(cid:226)metro obtido por tratamento matemÆtico do tra(cid:231)ado de duas curvas concentra(cid:231)ªo-efeito obtidas, respectivamente, sem (ﬂ UV) e com (+ UV) exposi(cid:231)ªo a uma dose nªo cito- t(cid:243)xica de radia(cid:231)ªo UVA/vis(cid:237)vel. 8. 6. 2000 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 136/99 Fototoxidade: reac(cid:231)ªo t(cid:243)xica aguda decorrente da exposi(cid:231)ªo da pele a determinadas subst(cid:226)ncias qu(cid:237)micas e sua posterior exposi(cid:231)ªo (cid:224) luz, ou por irradia(cid:231)ªo da pele ap(cid:243)s a administra(cid:231)ªo sistØmica de uma subst(cid:226)ncia qu(cid:237)- mica. Fotoirrita(cid:231)ªo: subcategoria do termo (cid:147)fototoxicidade(cid:148) utilizada apenas para descrever as reac(cid:231)ıes fotot(cid:243)xicas da pele decorrentes da exposi(cid:231)ªo, por aplica(cid:231)ªo t(cid:243)pica ou administra(cid:231)ªo oral, a subst(cid:226)ncias qu(cid:237)micas. As referi- das reac(cid:231)ıes fotot(cid:243)xicas provocam sempre danos celulares nªo espec(cid:237)ficos (do tipo eritema solar). Fotoalergia: reac(cid:231)ªo imunol(cid:243)gica adquirida, que nªo ocorre na sequŒncia da primeira exposi(cid:231)ªo (cid:224) subst(cid:226)ncia qu(cid:237)mica e (cid:224) radia(cid:231)ªo, sendo necessÆrio um per(cid:237)odo de indu(cid:231)ªo de uma ou duas semanas para que se observe reac(cid:231)ªo cut(cid:226)nea. Fotogenotoxicidade: reac(cid:231)ªo genot(cid:243)xica observada para um par(cid:226)metro genØtico, produzido na sequŒncia da exposi(cid:231)ªo das cØlulas a uma dose nªo genot(cid:243)xica de radia(cid:231)ªo UV/vis(cid:237)vel e a uma subst(cid:226)ncia qu(cid:237)mica nªo genot(cid:243)xica. Fotocarcinogenicidade: carcinogenicidade induzida pela exposi(cid:231)ªo repetida (cid:224)s radia(cid:231)ıes e a uma subst(cid:226)ncia qu(cid:237)- mica. Utiliza-se o termo (cid:147)fotococarcinogØnese(cid:148) quando o efeito cancer(cid:237)geno das radia(cid:231)ıes UV Ø refor(cid:231)ado pela exposi(cid:231)ªo a uma subst(cid:226)ncia qu(cid:237)mica. 1. 3 Subst(cid:226)ncias de referŒncia AlØm da clorpromacina utilizada para o controlo positivo, que deve ser analisada paralelamente em cada ensaio, recomenda-se a utiliza(cid:231)ªo como subst(cid:226)ncias de referŒncia no ensaio de fototoxicidade 3T3 NRU de um subconjunto das subst(cid:226)ncias qu(cid:237)micas utilizadas para o mesmo fim nos ensaios interlaboratoriais (1) (3) (13). 1. 4 Considera(cid:231)ıes preliminares Existem inœmeras referŒncias aos efeitos fotot(cid:243)xicos de muitas subst(cid:226)ncias (5) (6) (7) (8). A œnica caracter(cid:237)stica comum das referidas subst(cid:226)ncias consiste na capacidade de absorver a energia luminosa da radia(cid:231)ªo solar. De acordo com a primeira lei da fotoqu(cid:237)mica (lei de Grotthaus-Draper), Ø necessÆria a absor(cid:231)ªo de uma quanti- dade suficiente de quanta de luz para que se observe fotorreac(cid:231)ªo. Deste modo, antes de realizar um ensaio biol(cid:243)gico em conformidade com as presentes directrizes, deve determinar-se o espectro de absor(cid:231)ªo no UV/vi- s(cid:237)vel da subst(cid:226)ncia em estudo (por exemplo de acordo com a directriz 101 da OCDE). Caso o coeficiente de extin(cid:231)ªo/absor(cid:231)ªo molar seja inferior a 10 litro (cid:215) mol(cid:150)1 (cid:215) cm(cid:150)1, a subst(cid:226)ncia carece de potencial fotorreactivo, nªo sendo necessÆrio submetŒ-la ao ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU nem a qualquer outro ensaio biol(cid:243)gico para a determina(cid:231)ªo de efeitos fotoqu(cid:237)micos nocivos (apŒndice I). 1. 5 Princ(cid:237)pio de mØtodo Foram identificados quatro mecanismos mediante os quais a absor(cid:231)ªo de luz por um crom(cid:243)foro pode ocasio- nar uma reac(cid:231)ªo fotot(cid:243)xica (7); todos os referidos mecanismos se traduzem em danos celulares. Deste modo, o ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU baseia-se na compara(cid:231)ªo da citotoxicidade de uma subst(cid:226)ncia submetida a ensaio com ou sem exposi(cid:231)ªo a uma dose nªo citot(cid:243)xica de radia(cid:231)ªo UVA/vis(cid:237)vel. No (cid:226)mbito do ensaio, a citotoxicidade Ø expressa numa redu(cid:231)ªo, em termos de concentra(cid:231)ªo, da absor(cid:231)ªo do pigmento ver- melho neutro vital [neutral red (cid:151) NR (9)] 24 horas ap(cid:243)s a administra(cid:231)ªo da subst(cid:226)ncia em estudo e a irra- dia(cid:231)ªo. Efectua-se uma cultura de cØlulas Balb/c 3T3 durante 24 h, atØ (cid:224) forma(cid:231)ªo de monocamadas. Para cada subs- t(cid:226)ncia em estudo, procede-se (cid:224) prØ-incuba(cid:231)ªo, durante 1 h, de duas placas de 96 alvØolos com oito concentra- (cid:231)ıes diferentes da subst(cid:226)ncia. Expıe-se uma das placas a uma dose nªo citot(cid:243)xica de 5 J/cm2 UVA (experiŒncia + UV), mantendo-se a outra na obscuridade (experiŒncia ﬂ UV). Seguidamente, o meio de trata- mento Ø substitu(cid:237)do, em ambas as placas, por um meio de cultura; ap(cid:243)s uma nova incuba(cid:231)ªo de 24 h, deter- mina-se a viabilidade celular por anÆlise da absor(cid:231)ªo do vermelho neutro (neutral red uptake (cid:151) NRU) durante 3 h. Calcula-se a viabilidade celular relativa, expressa em percentagem das amostras de controlo isentas da subst(cid:226)ncia em estudo, para cada uma das oito concentra(cid:231)ıes de ensaio. Para a previsªo do potencial fotot(cid:243)- xico, comparam-se as reac(cid:231)ıes, em termos de concentra(cid:231)ıes, obtidas com (+ UV) e sem (ﬂ UV) irradia(cid:231)ªo, em geral ao n(cid:237)vel EC50, ou seja, a concentra(cid:231)ªo que inibe a viabilidade celular em 50 % relativamente (cid:224)s amostras de controlo isentas da subst(cid:226)ncia. 1. 6 CritØrios de qualidade Sensibilidade das cØlulas (cid:224)s radia(cid:231)ıes UVA (cid:151) dados de referŒncia: deve comprovar-se periodicamente a sensibili- dade das cØlulas (cid:224)s radia(cid:231)ıes UVA. Para tal, as cØlulas sªo inoculadas (cid:224) densidade utilizada no ensaio de foto- toxicidade in vitro 3T3 NRU e irradiam-se as mesmas, no dia seguinte, com uma dose de 1 a 9 J/cm2 de radia(cid:231)ªo UVA. Um dia depois, determina-se a viabilidade celular atravØs do ensaio NRU. As cØlulas satisfazem os critØrios de qualidade se, na sequŒncia da irradia(cid:231)ªo com 5 J/cm2 UVA, a sua viabilidade for superior ou igual a 80 % da viabilidade das amostras mantidas na obscuridade. A viabilidade obtida utilizando a dose mÆxima de radia(cid:231)ªo UVA de 9 J/cm2 nªo deve ser inferior a 50 % da obtida com as amostras mantidas na obscuridade. O processo deve repetir-se aproximadamente em cada 10 passagens celulares. Sensibilidade das cØlulas das amostras de controlo negativas (cid:224) radia(cid:231)ªo UVA (cid:151) ensaio em curso: o ensaio satisfaz os critØrios de qualidade se as amostras de controlo negativas [cØlulas numa solu(cid:231)ªo salina equilibrada de Earl (earl’s balanced salt solution (cid:151) EBSS) contendo ou nªo 1 % de dimetilssulf(cid:243)xido (DMSO) ou 1 % de etanol (EtOH)] no ensaio + UVA apresentarem uma viabilidade igual ou superior a 80 % da das cØlulas nªo irradiadas, no mesmo solvente, no ensaio paralelo realizado na obscuridade (ﬂ UVA). L 136/100 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias 8. 6. 2000 Viabilidade das amostras de controlo negativas: a densidade (cid:243)ptica absoluta (OD540 NRU) determinada no extracto NR das amostras de controlo negativas indica se as 1 (cid:215) 104 cØlulas inoculadas por alvØolo apresentam um tempo de replica(cid:231)ªo normal no decurso dos dois dias do ensaio. O ensaio satisfaz os critØrios se a densidade (cid:243)ptica mØdia (OD540 NRU) das amostras de controlo nªo tratadas for igual ou superior a 0,2. Controlo positivo: paralelamente a cada ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU deve efectuar-se um ensaio com uma subst(cid:226)ncia fotot(cid:243)xica conhecida. Recomenda-se a utiliza(cid:231)ªo de clorpromacina (CPZ), subst(cid:226)ncia de controlo positivo utilizada no estudo de valida(cid:231)ªo EU/COLIPA. Foram definidos os seguintes critØrios de acei- ta(cid:231)ªo para o uso de CPZ em conformidade com o protocolo normalizado do ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU: CPZ irradiada (+ UVA), EC50 = 0,1 a 2,0 (cid:181)g/ml; CPZ nªo irradiada (ﬂ UVA), EC50 = 7,0 a 90,0 (cid:181)g/ml. O factor de fotoirrita(cid:231)ªo (PIF), ou seja, a varia(cid:231)ªo da EC50, deve ser de, pelo menos, 6. Em vez da CPZ, podem utilizar-se nos referidos controlos positivos paralelos outras subst(cid:226)ncias fotot(cid:243)xicas conhecidas, adequadas (cid:224) categoria qu(cid:237)mica ou (cid:224)s caracter(cid:237)sticas de solubilidade da subst(cid:226)ncia em estudo. Neste caso, devem definir-se como critØrios de aceita(cid:231)ªo para o ensaio, com base nos dados acumulados, os interva- los dos valores da EC50 e o PIF ou o MPE. 1. 7 Descri(cid:231)ªo do mØtodo 1. 7. 1 Prepara(cid:231)ªo 1. 7. 1. 1 C Ø l u l a s Recomenda-se a utiliza(cid:231)ªo de uma linhagem celular permanente de fibroblastos de rato (cid:151) Balb/c 3T3, clon 31 (cid:151) proveniente do ATCC ou ECACC, idŒntica (cid:224) utilizada no ensaio de valida(cid:231)ªo. Podem tambØm obter-se resultados satisfat(cid:243)rios por recurso a outras cØlulas ou linhagens celulares, aplicando o mesmo protocolo de ensaio, se as condi(cid:231)ıes de cultura forem adequadas (cid:224)s necessidades espec(cid:237)ficas das cØlulas; todavia, nesse caso, Ø necessÆrio demonstrar a equivalŒncia. Deve comprovar-se regularmente que as cØlulas nªo estªo contaminadas por micoplasmas, devendo as mes- mas apenas ser utilizadas se os resultados das referidas comprova(cid:231)ıes forem satisfat(cid:243)rios. Uma vez que a sensibilidade das cØlulas (cid:224)s radia(cid:231)ıes UVA pode aumentar com o nœmero de passagens, devem utilizar-se cØlulas Balb/c 3T3 que tenham sido objecto do menor nœmero poss(cid:237)vel de passagens, preferivel- mente menos de 100. Deve comprovar-se periodicamente a sensibilidade das cØlulas Balb/c 3T3 (cid:224)s radia(cid:231)ıes UVA por recurso ao procedimento de controlo de qualidade descrito nas presentes directrizes. 1. 7. 1. 2 M e i o s e c o n d i (cid:231) ı e s d e c u l t u r a Devem utilizar-se meios de cultura e condi(cid:231)ıes de incuba(cid:231)ªo adequados (cid:224)s passagens celulares comuns e ao procedimento de ensaio. No caso das cØlulas Balb/c 3T3, recomenda-se o uso de DMEM enriquecido com 10 % de soro de bovino recØm-nascido, 4 mM de glutamina, penicilina e estreptomicina, incubado a 37 (cid:176)C numa atmosfera hœmida com 7,5 % de CO2. (cid:201) particularmente importante que as condi(cid:231)ıes de cultura celular permitam manter o ciclo celular nos valores normais das cØlulas ou da linhagem celular utilizadas. 1. 7. 1. 3 P r e p a r a (cid:231) ª o d a s c u l t u r a s Inoculam-se num meio de cultura de densidade adequada cØlulas provenientes de culturas-mªe congeladas, efectuando-se pelo menos uma subcultura antes de utilizÆ-las no ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU. Para o ensaio de fototoxicidade, inoculam-se as cØlulas num meio de cultura de densidade tal que impe(cid:231)a a confluŒncia das culturas antes do termo do ensaio, ou seja, aquando da determina(cid:231)ªo da viabilidade celular 48 h ap(cid:243)s a inocula(cid:231)ªo das cØlulas. No caso das cØlulas Balb/c 3T3 cultivadas em placas de 96 alvØolos, reco- menda-se uma densidade de 1 (cid:215) 104 cØlulas por alvØolo. Para cada subst(cid:226)ncia em estudo, inoculam-se as cØlulas de modo idŒntico em duas placas diferentes de 96 alvØolos, mantendo-se as condi(cid:231)ıes de cultura ao longo de todo o ensaio, excepto durante o per(cid:237)odo de irra- dia(cid:231)ªo de uma das subst(cid:226)ncias (+ radia(cid:231)ªo UVA/vis(cid:237)vel), enquanto que a outra se mantØm na obscuridade (ﬂ radia(cid:231)ªo UVA/vis(cid:237)vel). 1. 7. 1. 4 A c t i v a (cid:231) ª o m e t a b (cid:243) l i c a Embora, de modo geral, seja necessÆrio recorrer a sistemas de activa(cid:231)ªo metab(cid:243)lica para todos os ensaios in vitro de previsªo do potencial genot(cid:243)xico ou carcinogØnico, no dom(cid:237)nio da fototoxicologia nªo se conhece ainda qualquer subst(cid:226)ncia qu(cid:237)mica que necessite de uma transforma(cid:231)ªo metab(cid:243)lica para actuar como fototo- xina in vivo ou in vitro. Por conseguinte, nªo se considera necessÆrio nem cientificamente justificado utilizar um sistema de activa(cid:231)ªo metab(cid:243)lica no presente ensaio. 8. 6. 2000 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 136/101 1. 7. 1. 5 S u b s t (cid:226) n c i a e m e s t u d o (cid:151) P r e p a r a (cid:231) ª o As subst(cid:226)ncias devem preparar-se imediatamente antes da utiliza(cid:231)ªo, excepto se os dados de estabilidade mos- trarem que Ø poss(cid:237)vel armazenÆ-las. Caso seja provÆvel a ocorrŒncia de fotodegrada(cid:231)ªo rÆpida, pode ser neces- sÆrio preparar as referidas subst(cid:226)ncias (cid:224) luz vermelha. As subst(cid:226)ncias em estudo sªo dissolvidas em solu(cid:231)ıes-tampªo salinas, tais como uma solu(cid:231)ªo salina equili- brada de Earl (EBSS) ou uma solu(cid:231)ªo-tampªo salina de fosfatos (phosphate buffered saline (cid:151) PBS), que nªo devem conter componentes proteicos nem corantes indicadores de pH que absorvam a luz, de modo a evitar interferŒncias durante a irradia(cid:231)ªo. As subst(cid:226)ncias de ensaio fracamente solœveis em Ægua devem dissolver-se em solventes adequados numa con- centra(cid:231)ªo 100 vezes superior (cid:224) concentra(cid:231)ªo final desejada, diluindo-se de seguida na propor(cid:231)ªo 1:100 com a solu(cid:231)ªo-tampªo salina. Caso se utilize um solvente, a sua concentra(cid:231)ªo volœmica deve permanecer constante (1 %) em todas as culturas, isto Ø, tanto nas amostras de controlo negativo como nas amostras da subst(cid:226)ncia em estudo em todas as concentra(cid:231)ıes. Recomenda-se o uso do dimetilssulf(cid:243)xido (DMSO) e do etanol (EtOH) como solventes. Podem utilizar-se outros solventes de citotoxicidade reduzida (por exemplo, acetona), devendo contudo avaliar-se devidamente as suas propriedades espec(cid:237)ficas, nomeadamente a possibilidade de reagir com a subst(cid:226)ncia em estudo, de reduzir o efeito fotot(cid:243)xico ou de captar radicais. Se necessÆrio, pode recorrer-se a um agitador mec(cid:226)nico, a um banho de ultra-sons e/ou ao aquecimento a 37 (cid:176)C para facilitar a dissolu(cid:231)ªo. 1. 7. 1. 6 I r r a d i a (cid:231) ª o c o m U V (cid:151) P r e p a r a (cid:231) ª o Fonte de radia(cid:231)ªo: a escolha de uma fonte de radia(cid:231)ªo e de uma filtra(cid:231)ªo adequadas constitui o factor determi- nante dos ensaios de fototoxicidade. As regiıes do vis(cid:237)vel e do UVA encontram-se, em geral, associadas (cid:224) fotossensibiliza(cid:231)ªo (7) (10), enquanto que a gama do UVB possui menor import(cid:226)ncia neste dom(cid:237)nio, apresen- tando em contrapartida uma elevada citotoxicidade directa que Ø multiplicada por 1 000 entre 313 e 280 nm (11). Os critØrios de selec(cid:231)ªo da fonte de radia(cid:231)ªo adequada devem incluir o requisito essencial da emissªo de comprimentos de onda que a subst(cid:226)ncia em estudo absorve; por outro lado, a dose de luz (pass(cid:237)vel de ser obtida num per(cid:237)odo razoÆvel) deve ser suficiente para detectar os fotossensibilizadores conhecidos. AlØm disso, os comprimentos de onda e as doses utilizadas nªo devem causar danos desnecessÆrios ao sistema em estudo, nomeadamente devidos (cid:224) emissªo de calor (regiªo do infravermelho). Considera-se que a melhor fonte de luz Ø produzida por simuladores de radia(cid:231)ªo solar, que utilizam arcos de xØnon ou arcos de mercœrio dopado-halogeneto de metal. Estes œltimos apresentam a vantagem de emitir menos calor e de ser mais econ(cid:243)micos, mas nªo reproduzem exactamente a luz solar. Dado que todos os simuladores de radia(cid:231)ªo solar emitem quantidades considerÆveis de radia(cid:231)ªo UVB, devem utilizar-se filtros adequados para atenuar os respectivos comprimentos de onda altamente citot(cid:243)xicos. No ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU deve utilizar-se um espectro de irradi(cid:226)ncia praticamente isento de UVB (UVA:UVB p 1:20). A referŒncia 3 inclui um exemplo da distribui(cid:231)ªo da irradi(cid:226)ncia espectral do simulador de radia(cid:231)ªo solar filtrada utilizado na valida(cid:231)ªo do ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU (3). Dosimetria: antes de cada ensaio de fototoxicidade deve comprovar-se a intensidade da radia(cid:231)ªo (irradi(cid:226)ncia) por recurso a um medidor de UV de banda larga adequado, previamente calibrado em fun(cid:231)ªo da fonte de radia(cid:231)ªo. Deve comprovar-se o desempenho do aparelho, recomendando-se para tal a utiliza(cid:231)ªo de um segundo medidor de UV de referŒncia do mesmo tipo, calibrado do mesmo modo. A utiliza(cid:231)ªo, a intervalos superiores, de um espectrorradi(cid:243)metro para medir a irradi(cid:226)ncia espectral da fonte de luz filtrada e comprovar a calibra(cid:231)ªo do medidor de UV de banda larga constitui a solu(cid:231)ªo ideal, embora a manipula(cid:231)ªo dos instru- mentos em causa necessite de pessoal devidamente qualificado. O ensaio de valida(cid:231)ªo mostrou que a dose de 5 J/cm2 (UVA) nªo apresenta citotoxicidade para as cØlulas Balb/c 3T3, sendo suficientemente potente para activar as subst(cid:226)ncias qu(cid:237)micas fracamente fotot(cid:243)xicas. Para obter 5 J/cm2 no per(cid:237)odo de 50 min, deve ajustar-se a irradi(cid:226)ncia a 1,666 mW/cm2. Caso se utilize outra linhagem celular ou outra fonte de radia(cid:231)ªo, pode ser necessÆrio adaptar ligeiramente a dose de raios UVA de um modo que nªo danifique as cØlulas e seja suficiente para detectar as fototoxinas de referŒncia. A dura(cid:231)ªo da exposi(cid:231)ªo Ø calculada de acordo com a expressªo: 1. 7. 2 Condi(cid:231)ıes de ensaio A concentra(cid:231)ªo mÆxima da subst(cid:226)ncia em estudo nªo deve exceder 100 mg/ml, uma vez que todas as subs- t(cid:226)ncias fotot(cid:243)xicas foram detectadas a concentra(cid:231)ıes inferiores; alØm disso, a concentra(cid:231)ıes superiores, aumenta a incidŒncia de falsos resultados positivos (13). O pH da concentra(cid:231)ªo mais elevada da subst(cid:226)ncia em estudo deve ser adequado (compreendido entre 6,5 e 7,8). L 136/102 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias 8. 6. 2000 Devem determinar-se de forma adequada, em ensaios prØvios, as gamas de concentra(cid:231)ªo da subst(cid:226)ncia em estudo com (+ UVA) e sem (ﬂ UVA) irradia(cid:231)ªo. A gama e o intervalo de uma sØrie de concentra(cid:231)ıes devem ajustar-se de modo a que as curvas concentra(cid:231)ªo-resposta sejam fundamentadas experimentalmente. Devem utilizar-se concentra(cid:231)ıes em progressªo geomØtrica, com um factor de dilui(cid:231)ªo constante. 1. 7. 3 Procedimento (1) 1. 7. 3. 1 P r i m e i r o d i a Prepara-se uma suspensªo de 1 (cid:215) 105 cØlulas/ml no meio de cultura e colocam-se 100 ml de meio de cultura apenas nos alvØolos perifØricos de uma placa de microtitula(cid:231)ªo de 96 alvØolos (= ensaios em branco). Nos res- tantes alvØolos colocam-se 100 ml de suspensªo de 1 (cid:215) 105 cØlulas/ml (= 1 (cid:215) 104 cØlulas/alvØolo). Preparam-se duas placas com cada subst(cid:226)ncia em estudo, destinando-se uma a determinar a citotoxicidade (ﬂ UVA) e a outra a fotocitotoxicidade (+ UVA). Incubam-se as cØlulas durante 24 h (7,5 % CO2, 37 (cid:176)C) atØ (cid:224) forma(cid:231)ªo de uma monocamada semiconfluente. O referido per(cid:237)odo de incuba(cid:231)ªo permite a recupera(cid:231)ªo, a aderŒncia e o crescimento exponencial das cØlulas. 1. 7. 3. 2 S e g u n d o d i a Ap(cid:243)s a incuba(cid:231)ªo, decanta-se o meio de cultura celular e efectuam-se, por alvØolo, duas lavagens com 150 (cid:181)l de EBSS/PBS. Adicionam-se 100 (cid:181)l de EBSS/PBS com a concentra(cid:231)ªo adequada da subst(cid:226)ncia em estudo ou, no caso das amostras de controlo negativo, apenas solvente. Adicionam-se oito concentra(cid:231)ıes diferentes da subst(cid:226)ncia em estudo. Incubam-se as cØlulas com a subst(cid:226)ncia em estudo durante 60 minutos, na obscuridade (7,5 % CO2, 37 (cid:176)C). Na componente (+ UVA) do ensaio, irradiam-se as cØlulas durante 50 minutos, (cid:224) temperatura ambiente, atra- vØs da cobertura da placa de 96 alvØolos, com uma dose de 1,7 mW/cm2 UVA (= 5 J/cm2). Utilizar um venti- lador para evitar a condensa(cid:231)ªo de Ægua sob a cobertura. Para o ensaio (ﬂ UVA), colocar na obscuridade a segunda sØrie de placas, (cid:224) temperatura ambiente, durante 50 minutos (= tempo de exposi(cid:231)ªo aos raios UVA). Decanta-se a solu(cid:231)ªo de ensaio, efectuando duas lavagens com 150 ml de EBSS/PBS. Substitui-se a EBSS/PBS pelo meio de cultura e incuba-se (7,5 % CO2, 37 (cid:176)C) atØ ao dia seguinte (18-22 h). 1. 7. 3. 3 T e r c e i r o d i a AnÆlise microsc(cid:243)pica Examinam-se as cØlulas num microsc(cid:243)pio com dispositivo de contraste de fase. Registam-se as altera(cid:231)ıes mor- fol(cid:243)gicas das cØlulas devidas aos efeitos citot(cid:243)xicos da subst(cid:226)ncia em estudo. A comprova(cid:231)ªo em causa Ø reco- mendada com o objectivo de excluir erros experimentais, embora as observa(cid:231)ıes efectuadas no seu (cid:226)mbito nªo sejam utilizadas para avaliar a citotoxicidade nem a fototoxicidade. Ensaio de absor(cid:231)ªo do vermelho neutro Lavam-se as cØlulas com 150 (cid:181)l de EBSS/PBS prØ-aquecida. Remove-se a solu(cid:231)ªo de lavagem sacudindo ligei- ramente. Adicionam-se 100 (cid:181)l de meio com NR e incuba-se durante 3 h a 37 (cid:176)C, em atmosfera hœmida com 7,5 % CO2. Ap(cid:243)s a incuba(cid:231)ªo, elimina-se o meio com NR e lavam-se as cØlulas com 150 ml de EBSS/PBS. Decanta-se e enxuga-se totalmente a EBSS/PBS. (Alternativa: centrifugar a placa invertida. ) Adicionam-se exactamente 150 (cid:181)l de solu(cid:231)ªo de desor(cid:231)ªo do NR (solu(cid:231)ªo de etanol/Æcido acØtico recente- mente preparada). Agita-se rapidamente a placa num agitador de microplacas durante 10 min, atØ que o NR seja extra(cid:237)do das cØlulas e forme uma solu(cid:231)ªo homogØnea. Mede-se a densidade (cid:243)ptica do extracto de NR a 540 nm num espectrofot(cid:243)metro, utilizando como referŒncia os ensaios em branco. Armazenam-se os dados num ficheiro de formato adequado (por exemplo, ASCII), com vista ao seu tratamento posterior. (1) A referŒncia bibliogrÆfica 12 contØm informa(cid:231)ıes complementares. 8. 6. 2000 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 136/103 2 RESULTADOS 2. 1 Qualidade e quantidade dos resultados Os dados devem permitir uma anÆlise significativa das respostas obtidas para cada concentra(cid:231)ªo, com e sem irradia(cid:231)ªo UVA/vis(cid:237)vel. Caso se observe fototoxicidade, tanto a gama de concentra(cid:231)ıes como o intervalo entre cada concentra(cid:231)ªo devem ser estabelecidos de modo que permitam adaptar o tra(cid:231)ado de uma curva aos dados experimentais. Uma vez que a subst(cid:226)ncia em estudo pode nªo produzir efeitos citot(cid:243)xicos (cid:224) concentra(cid:231)ªo-li- mite de 100 mg/ml definida para o ensaio realizado na obscuridade (ﬂ UVA), exibindo todavia uma elevada citotoxicidade no ensaio com irradia(cid:231)ªo (+ UVA), pode ser necessÆrio utilizar em cada componente do ensaio gamas de concentra(cid:231)ªo de magnitude diversa, de modo a obter resultados de qualidade adequada. Caso nªo se observe citotoxicidade em nenhuma das componentes do ensaio (ﬂ UVA e + UVA), bastarÆ utilizar concen- tra(cid:231)ıes separadas por um intervalo apreciÆvel, atØ (cid:224) concentra(cid:231)ªo mÆxima. Nªo Ø necessÆrio comprovar um resultado claramente positivo, repetindo o ensaio. Os resultados claramente negativos nªo necessitam tambØm de comprova(cid:231)ªo caso o ensaio tenha sido realizado com concentra(cid:231)ıes suficientemente altas. Nessas circunst(cid:226)ncias, bastarÆ realizar um ensaio principal e um ou vÆrios ensaios prØ- vios com o objectivo de definir as gamas de concentra(cid:231)ªo. Os ensaios cujos resultados se situem no limite do modelo de predi(cid:231)ªo devem ser repetidos para fins compro- vativos. Caso se considere necessÆrio repetir o ensaio, pode ser importante alterar as condi(cid:231)ıes experimentais de modo a obter um resultado inequ(cid:237)voco. Neste contexto, a prepara(cid:231)ªo das solu(cid:231)ıes da subst(cid:226)ncia constitui um aspecto fundamental. A altera(cid:231)ªo das referidas condi(cid:231)ıes, expressa, por exemplo, na utiliza(cid:231)ªo de co-solven- tes, na tritura(cid:231)ªo da amostra ou na utiliza(cid:231)ªo de um banho de ultra-sons, pode, pois, revelar-se fundamental. Como alternativa, pode tambØm alterar-se o per(cid:237)odo da incuba(cid:231)ªo antes da irradia(cid:231)ªo: no caso de subst(cid:226)ncias instÆveis em Ægua, pode ser conveniente reduzir o referido per(cid:237)odo. 2. 2 Tratamento dos resultados Se poss(cid:237)vel, deve determinar-se a concentra(cid:231)ªo de subst(cid:226)ncia em estudo que induz uma inibi(cid:231)ªo de 50 % da absor(cid:231)ªo celular de vermelho neutro (EC50). Para tal, pode aplicar-se aos resultados de concentra(cid:231)ªo-resposta qualquer mØtodo de regressªo nªo linear adequado (de preferŒncia, uma fun(cid:231)ªo de Hill ou uma regressªo log(cid:237)stica) ou outros mØtodos de ajustamento (14). Antes de utilizar um determinado valor de EC50 nos cÆlcu- los posteriores, deve comprovar-se devidamente a qualidade do ajustamento. Podem tambØm utilizar-se no cÆlculo do valor de EC50 mØtodos de ajustamento grÆfico. Nesse caso, recomenda-se a utiliza(cid:231)ªo de papel pro- babil(cid:237)stico (eixo x: log, eixo y: probit), uma vez que, frequentemente, a fun(cid:231)ªo concentra(cid:231)ªo-resposta se torna praticamente linear na sequŒncia da transforma(cid:231)ªo. 2. 3 Avalia(cid:231)ªo dos resultados (modelos de previsªo) 2. 3. 1 Modelo de previsªo (cid:151) versªo 1: factor de fotoirrita(cid:231)ªo (PIF) Se, tanto em presen(cid:231)a (+ UVA) como na ausŒncia (ﬂ UVA) de radia(cid:231)ªo, se obtiverem curvas concentra(cid:231)ªo-res- posta completas, pode calcular-se o factor de fotoirrita(cid:231)ªo (PIF) por recurso (cid:224) f(cid:243)rmula seguinte: A obten(cid:231)ªo de um valor PIF < 5 traduz a ausŒncia de potencial fotot(cid:243)xico, enquanto que um PIF ¯ 5 traduz a existŒncia de potencial fotot(cid:243)xico. Se uma subst(cid:226)ncia se revelar citot(cid:243)xica quando irradiada (+ UVA) mas nªo na ausŒncia de irradia(cid:231)ªo (ﬂ UVA), nªo Ø poss(cid:237)vel calcular o PIF, embora o referido resultado indique a existŒncia de potencial fotot(cid:243)xico. Em tais casos, pode calcular-se um valor (cid:147)> PIF(cid:148) se o ensaio de citotoxicidade (ﬂ UV) tiver decorrido atØ (cid:224) concentra(cid:231)ªo de ensaio mÆxima (CmÆx), valor que se utiliza no cÆlculo de (cid:147)> PIF(cid:148): Caso se obtenha apenas um valor (cid:147)> PIF(cid:148), qualquer valor superior a 1 traduz um potencial fotot(cid:243)xico. Se nªo for poss(cid:237)vel calcular a EC50 (ﬂ UV) nem a EC50 (+ UV) porque a subst(cid:226)ncia nªo produz efeitos citot(cid:243)xi- cos mesmo (cid:224) concentra(cid:231)ªo de ensaio mÆxima, tal significa que a subst(cid:226)ncia nªo possui potencial fotot(cid:243)xico. Nessas condi(cid:231)ıes, utiliza-se um (cid:147)PIF = *1(cid:148) te(cid:243)rico para caracterizar o resultado. L 136/104 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias 8. 6. 2000 Caso se obtenha apenas um valor (cid:147)PIF = *1(cid:148), o ensaio traduz a ausŒncia de potencial fotot(cid:243)xico. Nos casos b) e c), devem tomar-se na devida conta as concentra(cid:231)ıes obtidas no ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU aquando da previsªo do potencial fotot(cid:243)xico. 2. 3. 2 Modelo de previsªo (cid:151) versªo 2: fotoefeito mØdio (MPE) Como alternativa, pode utilizar-se uma nova versªo do modelo de previsªo do potencial fotot(cid:243)xico elaborada com base nos dados obtidos no estudo de valida(cid:231)ªo EU/COLIPA (15) e comprovada num ensaio (cid:147)cego(cid:148) reali- zado no (cid:226)mbito de um estudo posterior relativo (cid:224) fototoxicidade in vitro de subst(cid:226)ncias utilizadas como filtros de UV (13). Este modelo permite superar a limita(cid:231)ªo do modelo baseado no PIF nos casos em que nªo Ø pos- s(cid:237)vel obter um valor de EC50. O modelo utiliza o fotoefeito mØdio (MPE), que constitui um par(cid:226)metro baseado na compara(cid:231)ªo das curvas concentra(cid:231)ªo-resposta, na sua totalidade. A Universidade Humboldt de Berlim ela- borou um programa informÆtico especial para a aplica(cid:231)ªo do modelo MPE, que pode obter-se gratuitamente. 2. 4 Interpreta(cid:231)ªo dos resultados A obten(cid:231)ªo de um resultado positivo no ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU (PIF ¯ 5 ou MPE ¯ 0,1) indica que a subst(cid:226)ncia em estudo apresenta potencial fotot(cid:243)xico. Se o referido resultado foi obtido com con- centra(cid:231)ıes inferiores a 10 mg/ml, Ø provÆvel que a subst(cid:226)ncia em estudo apresente tambØm efeitos fotot(cid:243)xi- cos em diversas condi(cid:231)ıes de exposi(cid:231)ªo in vivo. Caso se obtenha um resultado positivo apenas com a concen- tra(cid:231)ªo de ensaio mÆxima de 100 mg/ml, pode ser necessÆrio, para avaliar o perigo ou o poder fotot(cid:243)xico, ter em conta outros aspectos, tais como a penetra(cid:231)ªo e a absor(cid:231)ªo cut(cid:226)neas e a poss(cid:237)vel acumula(cid:231)ªo da subst(cid:226)n- cia na pele, ou submeter a subst(cid:226)ncia a outro tipo de ensaios, com o objectivo de confirmar os resultados, uti- lizando, por exemplo, um modelo de pele humana in vitro. A obten(cid:231)ªo de um resultado negativo no ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU (PIF < 5 ou MPE < 0,1) indica que a subst(cid:226)ncia em estudo nªo apresenta efeitos fotot(cid:243)xicos nas cØlulas de mam(cid:237)fero cultivadas nas condi(cid:231)ıes em causa. Se for poss(cid:237)vel submeter a subst(cid:226)ncia a ensaio atØ (cid:224) concentra(cid:231)ªo mÆxima de 100 mg/ml, a obten(cid:231)ªo de um resultado negativo indica que a mesma nªo possui de potencial fotot(cid:243)xico, sendo improvÆ- vel que produza efeitos fotot(cid:243)xicos in vivo. Nos casos em que se obtenham reac(cid:231)ıes t(cid:243)xicas idŒnticas (EC50 + UV e EC50 ﬂ UV) com concentra(cid:231)ıes inferiores, devem interpretar-se os dados do mesmo modo. Todavia, caso nªo se observe toxicidade (+ UV e ﬂ UV) e a solubilidade em Ægua da subst(cid:226)ncia em estudo tenha limitado as concentra(cid:231)ıes utilizadas a menos de 100 mg/ml, pode questionar-se a compatibilidade da subst(cid:226)ncia com o mØtodo de ensaio, devendo encarar-se a possibilidade de realizar um ensaio de confirma(cid:231)ªo (por exemplo, com um modelo de pele in vitro ou ex vivo, ou um ensaio in vivo). 3 RELAT(cid:211)RIO Relat(cid:243)rio do ensaio O relat(cid:243)rio do ensaio deve incluir as seguintes informa(cid:231)ıes: Subst(cid:226)ncia em estudo: (cid:151) dados de identifica(cid:231)ªo e n. o CAS, se conhecido, (cid:151) natureza f(cid:237)sica e pureza, (cid:151) propriedades f(cid:237)sico-qu(cid:237)micas relevantes para a realiza(cid:231)ªo do estudo, (cid:151) estabilidade e fotoestabilidade, se conhecidas. Solvente: (cid:151) justifica(cid:231)ªo da escolha do solvente, (cid:151) solubilidade da subst(cid:226)ncia em estudo no solvente, (cid:151) percentagem de solvente presente no meio de tratamento (EBSS ou PBS). CØlulas (cid:151) tipo e proveniŒncia das cØlulas, (cid:151) ausŒncia de micoplasma, (cid:151) nœmero de passagens celulares, se conhecido, (cid:151) sensibilidade das cØlulas (cid:224) radia(cid:231)ªo UVA, determinada com o equipamento de irradia(cid:231)ªo utilizado no ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU. Condi(cid:231)ıes de ensaio a) (cid:151) incuba(cid:231)ªo antes do tratamento e ap(cid:243)s o mesmo: (cid:151) tipo e composi(cid:231)ªo do meio de cultura, (cid:151) condi(cid:231)ıes de incuba(cid:231)ªo (concentra(cid:231)ªo de CO2, temperatura e humidade), (cid:151) dura(cid:231)ªo da incuba(cid:231)ªo (tratamento prØvio e posterior). 8. 6. 2000 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 136/105 Condi(cid:231)ıes de ensaio b) (cid:151) tratamento com a subst(cid:226)ncia: (cid:151) fundamenta(cid:231)ªo da escolha das concentra(cid:231)ıes da subst(cid:226)ncia em estudo utilizadas nos ensaios com e sem irradia(cid:231)ªo UV/vis(cid:237)vel, (cid:151) caso a subst(cid:226)ncia em estudo seja fracamente solœvel e nªo-citot(cid:243)xica, fundamenta(cid:231)ªo da escolha da maior concentra(cid:231)ªo utilizada, (cid:151) tipo e composi(cid:231)ªo do meio de tratamento (solu(cid:231)ªo-tampªo salina), (cid:151) dura(cid:231)ªo do tratamento qu(cid:237)mico. Condi(cid:231)ıes de ensaio c) (cid:151) irradia(cid:231)ªo: (cid:151) fundamenta(cid:231)ªo da escolha da fonte de radia(cid:231)ªo utilizada, (cid:151) caracter(cid:237)sticas da irradi(cid:226)ncia espectral da fonte de radia(cid:231)ªo, (cid:151) caracter(cid:237)sticas de transmissªo/absor(cid:231)ªo do filtro ou filtros utilizados, (cid:151) caracter(cid:237)sticas do radi(cid:243)metro e condi(cid:231)ıes de calibra(cid:231)ªo, (cid:151) dist(cid:226)ncia entre a fonte de radia(cid:231)ªo e o sistema de ensaio, (cid:151) irradi(cid:226)ncia UVA (cid:224) referida dist(cid:226)ncia, expressa em mW/cm2, (cid:151) dura(cid:231)ªo da exposi(cid:231)ªo (cid:224) radia(cid:231)ªo UV/vis(cid:237)vel, (cid:151) dose de radia(cid:231)ªo UVA (irradi(cid:226)ncia x tempo), expressa em J/cm2, (cid:151) temperatura utilizada para as culturas celulares irradiadas e as culturas mantidas na obscuridade. Condi(cid:231)ıes de ensaio d) (cid:151) ensaio NRU: (cid:151) composi(cid:231)ªo do meio NR, (cid:151) dura(cid:231)ªo da incuba(cid:231)ªo em NR, (cid:151) condi(cid:231)ıes de incuba(cid:231)ªo (concentra(cid:231)ªo de CO2, temperatura e humidade), (cid:151) condi(cid:231)ıes de extrac(cid:231)ªo do NR (agente de extrac(cid:231)ªo, dura(cid:231)ªo), (cid:151) comprimento de onda utilizado para a leitura espectrofotomØtrica da densidade (cid:243)ptica do NR, (cid:151) segundo comprimento de onda (referŒncia), se aplicÆvel, (cid:151) subst(cid:226)ncia utilizada para o ensaio em branco do espectrofot(cid:243)metro, se aplicÆvel. Resultados: (cid:151) viabilidade celular obtida para cada concentra(cid:231)ªo da subst(cid:226)ncia em estudo, expressa em percentagem da viabilidade mØdia dos controlos, (cid:151) curvas concentra(cid:231)ªo-resposta (concentra(cid:231)ªo da subst(cid:226)ncia em estudo (cid:151) viabilidade celular relativa), obti- das nos ensaios + UVA e ﬂ UVA paralelos, (cid:151) anÆlise dos dados provenientes das curvas concentra(cid:231)ªo-resposta: se poss(cid:237)vel, cÆlculo automÆtico/cÆlculo do valor de EC50 (+ UVA) e EC50 (ﬂ UVA), (cid:151) compara(cid:231)ªo das duas curvas concentra(cid:231)ªo-resposta obtidas com e sem irradia(cid:231)ªo UVA/vis(cid:237)vel, calculando o factor de fotoirrita(cid:231)ªo (PIF) ou o fotoefeito mØdio (MPE), (cid:151) classifica(cid:231)ªo do potencial fotot(cid:243)xico, (cid:151) critØrios de aceita(cid:231)ªo do ensaio a) (cid:151) controlo negativo paralelo: (cid:151) viabilidade absoluta (densidade (cid:243)ptica do extracto de NR) das cØlulas irradiadas e as nªo irradiadas, (cid:151) dados de referŒncia do controlo negativo, mØdia e desvio-padrªo, critØrios de aceita(cid:231)ªo do ensaio b) (cid:151) controlo positivo paralelo: (cid:151) EC50 (+ UVA), EC50 (ﬂ UVA) e PIF da subst(cid:226)ncia de controlo positivo (cid:151) dados de referŒncia da subst(cid:226)ncia de controlo positivo: EC50 (+ UVA), EC50 (ﬂ UVA) e PIF, mØdia e desvio-padrªo. Discussªo dos resultados. Conclusıes. L 136/106 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias 8. 6. 2000 4 BIBLIOGRAFIA (1) Spielmann, H. , Balls, M. , D(cid:246)ring, B. , Holzh(cid:252)tter, H. G. , Kalweit, S. , Klecak, G. , L’Eplattenier, H. , Liebsch, M. , Lovell, W. W. , Maurer, T. , Moldenhauer, F. , Moore, L. , Pape, W. , Pfannbecker, U. , Potthast, J. , De Silva, O. , Steiling, W. and Willshaw, A. ( 1994), EEC/COLIPA project on in vitro phototoxicity testing: First results obtained with a Balb/c 3T3 cell phototoxicity assay, Toxicology in Vitro 8, pp. 793-796. (2) Anon (1998), Statement on the scientific validity of the 3T3 NRU PT test (an in vitro test for phototoxi- city), European Commission, Joint Research Centre: ECVAM and DGXI/E/2, 3 November 1997, ATLA 26, pp. 7-8. (3) Spielmann, H. , Balls, M. , Dupuis, J. , Pape, W. J. W. , Pechovitch, G. , De Silva, O. , Holzh(cid:252)tter, H. G. , Clot- hier, R. , Desolle, P. , Gerberick, F. , Liebsch, M. , Lovell, W. 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title: Verordnung (EG) Nr. 825/2000 der Kommission vom 25. April 2000 zur Festlegung pauschaler Einfuhrwerte für die Bestimmung der im Sektor Obst und Gemüse geltenden Einfuhrpreise

text: 26. 4. 2000 DE Amtsblatt der Europäischen Gemeinschaften L 101/1 I (Veröffentlichungsbedürftige Rechtsakte) VERORDNUNG (EG) Nr. 825/2000 DER KOMMISSION vom 25. April 2000 zur Festlegung pauschaler Einfuhrwerte für die Bestimmung der im Sektor Obst und Gemüse geltenden Einfuhrpreise DIE KOMMISSION DER EUROPÄISCHEN GEMEINSCHAFTEN — gestützt auf den Vertrag zur Gründung der Europäischen Gemeinschaft, (2) ihrem Anhang angeführten Erzeugnisse und Zeiträume festgelegt. In Anwendung der genannten Kriterien sind die im Anhang zur vorliegenden Verordnung ausgewiesenen pauschalen Einfuhrwerte zu berücksichtigen — gestützt auf die Verordnung (EG) Nr. 3223/94 der Kommission vom 21. Dezember 1994 mit Durchführungsbestimmungen zur Einfuhrregelung für Obst und Gemüse (1), zuletzt geändert durch die Verordnung (EG) Nr. 1498/98 (2), insbesondere auf Artikel 4 Absatz 1, in Erwägung nachstehender Gründe: (1) Die in Anwendung der Ergebnisse der multilateralen Handelsverhandlungen der Uruguay-Runde von der der Kommission festzulegenden, pauschalen Einfuhrwerte zu berücksichtigenden Kriterien sind in der Verordnung (EG) Nr. 3223/94 für die in zur Bestimmung HAT FOLGENDE VERORDNUNG ERLASSEN: Artikel 1 Die in Artikel 4 der Verordnung (EG) Nr. 3223/94 genannten pauschalen Einfuhrwerte sind in der Tabelle im Anhang zur vorliegenden Verordnung festgesetzt. Diese Verordnung tritt am 26. April 2000 in Kraft. Artikel 2 Diese Verordnung ist in allen ihren Teilen verbindlich und gilt unmittelbar in jedem Mitglied- staat. Brüssel, den 25. April 2000 Für die Kommission Franz FISCHLER Mitglied der Kommission (1) ABl. L 337 vom 24. 12. 1994, S. 66. (2) ABl. L 198 vom 15. 7. 1998, S. 4. L 101/2 DE Amtsblatt der Europäischen Gemeinschaften 26. 4. 2000 zu der Verordnung der Kommission vom 25. April 2000 zur Festlegung pauschaler Einfuhrwerte für die Bestimmung der im Sektor Obst und Gemüse geltenden Einfuhrpreise ANHANG KN-Code Drittland-Code (1) (EUR/100 kg) Pauschaler Einfuhrpreis 0702 00 00 0707 00 05 0709 90 70 0805 10 10, 0805 10 30, 0805 10 50 0808 10 20, 0808 10 50, 0808 10 90 0808 20 50 052 068 204 999 052 068 999 052 999 052 204 212 624 999 388 400 404 508 512 528 720 804 999 388 512 528 720 999 126,1 107,3 80,2 104,5 104,5 66,8 85,7 77,3 77,3 82,1 38,0 44,8 48,3 53,3 94,1 97,0 94,3 88,9 90,8 84,3 105,0 99,0 94,2 72,2 77,8 78,9 59,5 72,1 (1) Nomenklatur der Länder gemäß der Verordnung (EG) Nr. 2543/1999 der Kommission (ABl. L 307 vom 2. 12. 1999, S. 46). Der Code „999“ steht für „Verschiedenes“