title: 2000 m. balandžio 25 d. Komisijos direktyva 2000/33/EB dvidešimt septintą kartą derinanti su technikos pažanga Tarybos direktyvą 67/548/EEB dėl įstatymų ir kitų teisės aktų, reglamentuojančių pavojingų medžiagų klasifikavimą, pakavimą ir ženklinimą etiketėmis, suderinimotekstas svarbus EEE.

eurovoc_concepts:
analytical chemistry
approximation of laws
chemical product
cytology
toxicology

text: 242 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/25 t. 32000L0033 2000 6 8 EUROPOS BENDRIJŲ OFICIALUSIS LEIDINYS L 136/90 KOMISIJOS DIREKTYVA 2000/33/EB 2000 m. balandžio 25 d. dvidešimt septintą kartą derinanti su technikos pažanga Tarybos direktyvą 67/548/EEB dėl įstatymų ir kitų teisės aktų, reglamentuojančių pavojingų medžiagų klasifikavimą, pakavimą ir ženklinimą etiketėmis, suderinimo (*) (tekstas svarbus EEE) EUROPOS BENDRIJŲ KOMISIJA, PRIĖMĖ ŠIĄ DIREKTYVĄ: atsižvelgdama į Europos bendrijos steigimo sutartį, 1 straipsnis atsižvelgdama į 1967 m. birželio 27 d. Tarybos direktyvą 67/548/EEB dėl įstatymų ir kitų teisės aktų, reglamentuojančių pavojingų medžiagų klasifikavimą, pakavimą ir ženklinimą etiketėmis, suderinimo (1) su paskutiniais pakeitimais, padarytais Europos Parlamento ir Tarybos direktyva 1999/33/EB (2), ypač į jos 28 straipsnį, kadangi: (1) (2) (3) (4) Direktyvos 67/458/EEB V priede nustatyti medžiagų ir pre- paratų fizikinių cheminių savybių, toksiškumo ir ekotok- siškumo nustatymo metodai. Šį priedą būtina suderinti su technikos pažanga. Pagal 1986 m. lapkričio 24 d. Tarybos direktyvos 86/609/EEB dėl valstybių narių įstatymų ir kitų teisės aktų, susijusių su eksperimentiniais ar kitais mokslo tikslais nau- dojamų gyvūnų apsauga, suderinimo (3) 7 straipsnio 2 dalį eksperimentas, kuriam naudojami gyvūnai, neatliekamas, jei siekiamo rezultato galima pagrįstai ir praktiškai pasiekti kitu moksliškai tinkamu metodu, kuriam nereikia gyvūnų. Į Direktyvos 67/548/EEB V priedą Komisija ketina įtraukti kai kuriuos alternatyvius tyrimo metodus tam, kad būtų galima ištirti chemines medžiagas nenaudojant gyvūnų, kaip numatyta Direktyvos 67/548/EEB 3 straipsnio 1 daly- je. Šioje direktyvoje numatytos priemonės atitinka Direktyvų dėl techninių kliūčių panaikinimo pavojingų medžiagų ir preparatų prekybos srityje derinimo su technikos pažanga komiteto nuomonę, Šios direktyvos I ir II priedų tekstai pridedami prie Direktyvos 67/458/EEB V priedo B dalies. 2 straipsnis 1. Valstybės narės priima įstatymus ir kitus teisės aktus, kurie, įsi- galioję ne vėliau kaip iki 2001 m. spalio 1 d. , įgyvendina šią direk- tyvą. Apie tai jos nedelsdamos praneša Komisijai. Valstybės narės, priimdamos šias nuostatas, daro jose nuorodą į šią direktyvą arba tokia nuoroda daroma jas oficialiai skelbiant. Nuorodos darymo tvarką nustato valstybės narės. 2. Valstybės narės pateikia Komisijai šios direktyvos taikymo sri- tyje priimtų nacionalinės teisės aktų pagrindinių nuostatų tekstus bei šios direktyvos ir priimtų nacionalinių nuostatų koreliacijos lentelę. 3 straipsnis Ši direktyva įsigalioja trečią dieną po jos paskelbimo Europos Bendrijų oficialiajame leidinyje. 4 straipsnis Ši direktyva skirta valstybėms narėms. Priimta Briuselyje, 2000 m. balandžio 25 d. Komisijos vardu Margot WALLSTRÖM Komisijos narė Priimta iki 26 derinimo. (*) (1) OL 196, 1967 8 16, p. 1. (2) OL L 199, 1999 7 30, p. 57. (3) OL L 358, 1986 12 18, p. 1. 13/25 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 243 I PRIEDAS „B. 40. ODOS SUARDYMAS 1. 1. 1. METODAS Įvadas Europos alternatyvių tyrimo metodų patvirtinimo centras (ECVAM, Jungtinis tyrimų centras, Europos Komisija) patvirtino, kad du in vitro tyrimo metodai odos suirimui įvertinti — žiurkės odos transepitelinės elektrinės varžos (TEV) nustatymas ir modelinė žmogaus odos sistema yra moksliškai patikimi (1) (2) (3). Europos alternatyvių tyrimo metodų centro atliktas patikrinimas parodė, kad abiem metodais galima patikimai atskirti suardančias odą medžiagas nuo odos nesuardančių medžiagų. Be to, tyrimo aprašas, paremtas modeline žmogaus odos sistema leido teisingai nustatyti odos suardymo laipsnį (R35, arba medžiagos, visiškai suardančios odą ir R34, arba kitos odą suardančios medžiagos) (2). Pateikiami abiejų metodų aprašymai bei procedūros, šių metodų pasirinkimas priklauso nuo specifinių vartotojo poreikių ar turimų privilegijų/pageidavimų. Taip pat žr. Bendrojo įvado B dalį. 1. 2. Sąvokos Odos suardymas — negrįžtamas odos audinių suardymas tiriamomis cheminėmis medžiagomis. 1. 3. Etaloninės medžiagos Išsamiai neapibūdintos, bet žr. 1. 5. 3. 4 ir 1. 7. 2. 3. 1. 4. Tyrimo metodo principas — žiurkės odos transepitelinės elektrinės varžos nustatymas Tiriamosios medžiagos apie 24 valandas yra inkubuojamos su odos diskų, paimtų iš neskausmingai užmuštų jaunų žiurkių odos, epidermio paviršiais. Odą suardančios medžiagos nustatomos pagal jų sugebėjimą sutrikdyti raginio sluoksnio (stratum corneum) vientisumą bei jo atliekamą skiriamąją (barje- rinę) funkciją, kurie matuojami kaip žemiau slenkstinio lygio odos transepitelinės elektrinės varžos sumažėjimas (5 kΩ) (4) (5). Odą sujaudrinančios ir nesujaudrinančios medžiagos paprastai nesumažina transepitelinės elektrinės varžos žemiau slenkstinio lygmens. Tiriant paviršiaus įtempimą didinančius che- minius junginius bei organines medžiagas, kurių pH yra neutralus, tyrime dar galima analizuoti šių medžiagų susijungimą su dažais (apibrėžimą žr. 6 nuorodoje), kad būtų gauta mažiau neteisingų teigiamų duomenų, kurie paprastai gaunami, tiriant šių cheminių tipų medžiagas (2) (7). 1. 5. Tyrimo metodo — žiurkės odos transepitelinės elektrinės varžos nustatymo — aprašymas 1. 5. 1. Gyvūnai Odos diskai paimami iš jaunų (20-23 dienų amžiaus) Wistar ar panašaus inbredinio kamieno žiurkių. Dorsaliniai ir šoniniai plaukai pašalinami žirklutėmis, skirtomis gyvūnams apkirpti. Po to gyvūnai plau- nami, gerai juos ištrinant, ir panardinant į antibiotikų (pvz. , streptomicino, penicilino, chloramfenikolo ar amfotericino, kurių koncentracijos pakanka bakterijų dauginimuisi sustabdyti) prisotintą tirpalą. Tre- čią ar ketvirtą dieną po pirmojo plovimo gyvūnai dar kartą plaunami antibiotikų tirpalu ir ne vėliau kaip per 3 dienas yra panaudojami (ruošiant odos preparatus, gyvūnai turi būti ne vyresni kaip 31 dienos amžiaus). 1. 5. 2. Odos diskų paruošimas Gyvūnai neskausmingai užmušami. Tada kiekvieno gyvūno oda atskiriama bei nuo jos atsargiai nusku- tami pertekliniai riebalai. Oda uždedama ant mėgintuvėlio su politetrafluoretilenu (PTFE) galo taip, kad odos epidermis liestųsi su mėgintuvėlio paviršiumi. Ant mėgintuvėlio galo tvirtai užmaunamas „O“ pavi- dalo guminis žiedas, kad prilaikytų odą, o nereikalingas likutis nukerpamas. Mėgintuvėlio ir „O“ pavidalo žiedo matmenys pateikti 1 paveiksle. Paskui „O“ pavidalo guminis žiedas žibaline alyva rūpestingai pri- tvirtinamas prie mėgintuvėlio su PTFE galo. Spyruokliniu gnybtu mėgintuvėlis įtvirtinamas receptorinėje kameroje, pripildytoje (154 mM) magnio sulfato tirpalo (2 paveikslas). 1. 5. 3. Tyrimo procedūra 1. 5. 3. 1. T i r i a m o s i o s m e d ž i a g o s p a n a u d o j i m a s Skystos tiriamosios medžiagos (150 μl) mėgintuvėlyje užpilamos ant epidermio paviršiaus (2 paveiks- las). Tiriant kietąsias medžiagas, pakankamas kietosios medžiagos kiekis užpilamas ant disko, kad visas epidermio paviršius būtų padengtas kietąja medžiaga. Paskui ant kietosios medžiagos užpilama 150 μl dejonizuoto vandens, ir mėgintuvėliai atsargiai pakratomi. Tiriamosios medžiagos ir odos sąlytis turi būti kaip galima didesnis. Naudojant kai kurias kietąsias medžiagas tai pasiekiama pašildžius mėgintuvėlį iki 30 °C, kad jame esanti medžiaga ištirptų, arba ji sugrūdama, kad virstų granulėmis ar milteliais. 244 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/25 t. Kiekvienai tiriamajai medžiagai naudojami trys odos diskai. Tiriamosios medžiagos inkubuojamos 24 valandas (taip pat žr. 1. 5. 3. 4). Tiriamoji medžiaga pašalinama 30 °C temperatūros vandentiekio vandens srove tol, kol jokia kita medžiaga nebenusiplauna. Sukietėjusios tiriamosios medžiagos iš mėgintuvėlio pašalinamos maždaug 30 °C temperatūros vandens srove. 1. 5. 3. 2. T r a n s e p i t e l i n ė s e l e k t r i n ė s v a r ž o s m a t a v i m a i Transepitelinė elektrinė varža matuojama mažos įtampos kintamosios srovės analizatoriumi (pvz. AIM 401 arba 6401 arba juos atitinkančiais prietaisais). Prieš matuojant elektrinę varžą, sumažinamas odos paviršiaus įtempimas, pridedant pakankamai 70 % etilo alkoholio, kad visas epitelio paviršius būtų padengtas. Po kelių sekundžių etilo alkoholis pašalinamas apvertus mėgintuvėlį, o paskui audinys sudrėkinamas, pripylus (154 mM) magnio sulfato tirpalo. Norint išmatuoti odos disko varžą kΩ/odos dis- kui, iš abiejų odos disko pusių uždedami analizatoriaus elektrodai (2 paveikslas). Elektrodo matmenys ir jo ilgis žemiau „krokodilo“ tipo gnybtų yra parodytas 1 paveiksle. Matuojant varžą, vidinis (storasis) elek- trodo gnybtas uždedamas ant politetrafluoretileno pripildyto mėgintuvėlio viršaus, kad pakankama elek- trodo atkarpa būtų panardinta į magnio sulfato tirpalą. Išorinis (plonasis) elektrodas įdedamas į recep- torinę kamerą taip, kad atsidurtų kameros dugne. Atstumas tarp spyruoklinio gnybto apačios ir mėgintuvėlio, pripildyto politetrafluoretilenu (PTFE) (1 paveikslas), visą laiką turi būti vienodas, nes nuo jo priklauso matuojamos varžos dydis. Atkreipkite dėmesį į tai, kad jei matuojama varža yra didesnė nei 20 kΩ, tai gali būti, kad tiriamoji medžiaga dengia odos disko epiderminį paviršių. Šią medžiagą galima pabandyti pašalinti, pavyzdžiui, pirštine apmautos rankos nykščiu užspausti PTFE mėgintuvėlį ir apie 10 sekundžių jį pakratyti; magnio sulfato tirpalas išpilamas, ir varža vėl matuojama. Matavimas pakartojamas su šviežiai paruoštu magnio sulfato tirpalu. Atliekant transepitelinės elektrinės varžos matavimus, gautų rezultatų vidurkiai laikomi priimtinais, jei vienalaikės teigiamos ir neigiamos kontrolinės vertės neperžengia leistinų metodo dydžių. Toliau patei- kiamos siūlomos kontrolinės medžiagos ir priimtini jų varžos svyravimo intervalai, kai taikoma aprašy- toji metodika ir naudojami aprašytieji prietaisai: Kontrolė Medžiaga Teigiama Neigiama 10 M HCl (36 %) Distiliuotas vanduo Leistinas varžos inter- valas kΩ 0,5 - 1,0 10 - 25 1. 5. 3. 3. M o d i f i k u o t a p a v i r š i a u s į t e m p i m ą d i d i n a n č i ų m e d ž i a g ų i r n e u t r a l a u s p H o rg a n i n i ų j u n g i n i ų t y r i m o m e t o d i k a Jei tiriamųjų medžiagų, paviršiaus įtempimą didinančių medžiagų ar neutralaus pH organinių junginių, transepitelinė elektrinė varža yra 5 kΩ arba mažesnė, tokiu atveju galima tirti dažų skvarbą į audinius. Ši procedūra leidžia nustatyti, ar gauti rezultatai yra teigiami, bet neteisingi (2). 1. 5. 3. 3. 1. Sulforodamino B dažo panaudojimas ir pašalinimas Po pirminio apdorojimo tiriamąja medžiaga ant kiekvieno odos disko epidermio paviršiaus užpilama 150 μl 10 % sulforodamino B dažo, ištirpinto distiliuotame vandenyje ir palaikoma 2 valandas. Paskui odos diskai apie 10 sekundžių plaunami kambario temperatūros vandentiekio vandeniu, kad bet koks dažo perteklius ar neprisijungęs dažas būtų pašalintas. Kiekvienas odos diskas atsargiai išimamas iš PTFE mėgintuvėlio su politetrafluoretilenu ir įdedamas į indą (pvz. , į 20 ml scintiliacinį indą) su 8 ml dejoni- zuoto vandens. Indai 5 minutes atsargiai kratomi, kad bet koks dažo perteklius ar neprisijungęs dažas būtų pašalintas. Ši plovimo procedūra pakartojama, o paskui odos diskai perkeliami į indus su 5 ml 30 % vandeninio (w/v) natrio dodecilsulfato (SDS) tirpalo ir per naktį inkubuojami 60 °C temperatūroje. Pasi- baigus inkubacijai, kiekvienas odos diskas išimamas ir išmetamas, o likęs tirpalas 8 minutes centrifuguo- jamas 21 °C temperatūroje (santykinė centrifuginė jėga @175). 1 ml supernatanto praskiedžiamas san- tykiu 1: 5 (v/v) (t. y. 1 ml + 4 ml) 30 % vandeniniu natrio dodecilsulfato tirpalu. Tirpalo optinis tankis (OT) išmatuojamas, bangos ilgiui esant apie 565 nm. 1. 5. 3. 3. 2. Dažo kiekio apskaičiavimas Sulforodamino B dažo kiekis viename odos diske apskaičiuojamas pagal optinio tankio (OT) vertes (su- lforodamino B dažo moliarinės ekstinkcijos koeficientas, bangos ilgiui esant 565 nm = 8,7×104, o mole- kulinei masei - 580). Kiekviename odos diske nustatomas sulforodamino B dažo kiekis, paskui pakarto- tinai apskaičiuojamas dažo kiekio vidurkis. Susijungimo su dažu duomenų vidurkiai laikomi priimtinais, jei vienalaikės kontrolinės vertės neperžengia leistinų metodo ribų. Siūlomi tokie priimtini dažo kiekio kontrolinėse medžiagose svyravimo intervalai taikant aprašytą metodiką ir naudojant aprašytus prietai- sus: 13/25 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 245 Kontrolė Medžiaga Teigiama Neigiama 10 M HCl (36 %) Distiliuotas vanduo Dažo kiekio intervalas μg/diske 40 - 100 15 - 35 1. 5. 3. 4. P a p i l d o m a i n f o r m a c i j a Tiriamosios medžiagos gali būti panaudojamos odos diskams ir trumpiau (pvz. , 2 valandas), jei norima nustatyti labai odą suardančias medžiagas, tačiau, atliekant patikrinamąjį tyrimą, buvo gauti duomenys, rodantys, kad transepitelinės elektrinės varžos nustatymo metodu tiriant keletą cheminių medžiagų, panaudotų odos diskams 2 valandas (2), šių junginių sugebėjimas suardyti odą buvo pervertintas, nors šis metodas leido teisingai nustatyti odą suardančias ir nesuardančias medžiagas po 24 valandas trukusio bandymo. Panaudoto prietaiso savybės ir matmenys bei taikyta eksperimento procedūra gali turėti įtakos duome- nims, kurie gaunami, matuojant transepitelinę elektrinę varžą. Medžiagų, suardančių odos audinį, elektrinės varžos aukščiausia riba, lygi 5 kΩ buvo parinkta, panaudojus specialų prietaisą ir pritaikius šio metodo aprašyme nurodytą procedūrą. Iš esmės pakitus tyrimo sąlygoms, gali tikti skirtingos ribinės ir kontrolinė vertės. Todėl tiriant keletą etaloninių standartų, pasirinktų iš cheminių medžiagų, naudojamų, atliekant patikrinamąjį tyrimą, rekomenduojama suderinti metodologiją ir ribinę vertę. 1. 6. Tyrimo metodo — žmogaus odos modelio — principas Tiriamoji medžiaga iki 4 valandų laikoma ant trimačio žmogaus odos modelio, kurį sudaro rekonstruo- tas epidermis, turintis funkcinį raginį sluoksnį (stratum corneum). Medžiagos, suardančios odą, identifi- kuojamos pagal jų sugebėjimą per nustatytą inkubavimo laiką sumažinti ląstelių gyvybingumą (pvz. , tai- kant MTT metodą) žemiau nurodytų ribinių lygių. Šis metodas patvirtina hipotezę, kad odą suardančios cheminės medžiagos yra būtent tos, kurios sugeba prasiskverbti pro raginį sluoksnį (difuzijos ar erozijos būdu), yra pakankamai citotoksiškos ir sunaikina apatinių sluoksnių ląsteles. 1. 7. Tyrimo metodo — žmogaus odos modelio — aprašymas 1. 7. 1. Žmogaus odos modeliai Žmogaus odos modelius galima gauti iš įvairių šaltinių, tačiau jie privalo atitikti tam tikrus kriterijus. Modelis turi turėti funkcinį raginį sluoksnį, po kuriuo turi būti gyvų ląstelių sluoksnis. Turi būti reikiama barjerinė raginio sluoksnio funkcija. Tai galima parodyti, demonstruojant modelio atsparumą citotok- siškumui, panaudojus ląsteles sunaikinančias medžiagas, kurios normaliomis sąlygomis neprasiskverbia pro raginį sluoksnį. Esant nustatytoms eksperimento sąlygoms, modelis turi rodyti, kad rezultatus galima pakartoti. Modelyje esančios gyvosios ląstelės turi būti pakankamai gyvybingos, kad būtų galima atskirti teigiamas kontrolines medžiagas nuo neigiamų. Ląstelių gyvybingumas (pvz. , įvertinamas pagal MTT kiekio sumažėjimą, matuojant optinį tankį) po inkubacijos su neigiama kontroline medžiaga turi atitikti priim- tinas konkrečiam modeliui ribas. Panašiai, po inkubacijos su teigiamomis kontrolinėmis medžiagomis, palyginus jas su neigiamomis kontrolinėmis medžiagomis, ląstelių gyvybingumo laipsnis turi neperžengti nustatyto lygio. Svarbiausia įrodyti, kad panaudotas spėjimų modelis atitinka tarptautinį patvirtinimo standartą (2). 1. 7. 2. Tyrimo procedūra 1. 7. 2. 1. T i r i a m o s i o s m e d ž i a g o s p a n a u d o j i m a s Jei tiriamosios medžiagos yra skystos, jos naudojamos taip, kad padengtų odos paviršių (mažiausiai - 25 μl/cm2). Jei tiriamosios medžiagos yra kietos, jos naudojamos taip, kad padengtų odą, paskui jos sudrėkinamos, kad kuo glaudžiau liestųsi su oda; jei reikia, prieš naudojimą kietosios medžiagos turėtų būti sutrinamos į miltelius. Reikia įrodyti, kad taikomas metodas tinka daugeliui įvairiausiems chemi- niams tipams priklausančių medžiagų (2). Pasibaigus medžiagos veikimo laikui, tiriamoji medžiaga turi būti druskos tirpalu kruopščiai nuplauta nuo odos. 1. 7. 2. 2. L ą s t e l i ų g y v y b i n g u m o m a t a v i m a i Ląstelių gyvybingumui įvertinti gali būti taikomas bet kuris patvirtintas kiekybinis metodas. Dažniausiai taikomas MTT redukcijos metodas, kuriuo įvairios laboratorijos gavo tikslius ir atkartojamus rezultatus (2). Odos diskas 3 valandoms pamerkiamas į 20-28oC temperatūros MTT tirpalą (0,3 mg/ml). Ekstra- huojamas (ekstrakcija tirpikliais) nusėdęs netirpus mėlynos spalvos formazanas ir nustatoma jo koncent- racija, matuojant jo optinį tankį, kai bangos ilgis siekia 545-595 nm. 246 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/25 t. 1. 7. 2. 3. P a p i l d o m a i n f o r m a c i j a Panaudotas odos modelis, tikslus medžiagos veikimo laikas, plovimo procedūrų protokolas ir kita turės didžiausią įtaką ląstelių gyvybingumo rezultatams. Rekomenduojama, kad metodologija ir spėjimo mode- lis būtų kalibruojami, ištiriant keletą etaloninių standartų, atrinktų iš cheminių medžiagų, panaudotų ECVAM tyrimui (3). Labai svarbu, kad pagal tarptautinius standartus šį metodą galima taikyti ir dauge- lyje laboratorijų, panaudojant daug įvairių cheminių medžiagų. Šis metodas bent jau turėtų atitikti aukš- čiau aprašytus mokslinio patvirtinimo kriterijus (2), o tokio patvirtinimo tyrimo duomenys privalo būti paskelbti, prieš tai juos recenzavus specialistams, moksliniame žurnale. 2. DUOMENYS 2. 1. Rezultatų apdorojimas 2. 1. 1. Žiurkės odos transepitelinės elektrinės varžos (TEV) nustatymo — metodas Tiriamosios medžiagos varžos dydžiai (kΩ), teigiamos bei neigiamos kontrolės ir bet kokios standartinės etaloninės lentelėse, kur būtų ir kartojamų mėginių/pakartotinių eksperimentų duomenys, vidurkiai bei nustatyta klasifikacija. turėtų būti pateiktos cheminės medžiagos 2. 1. 2. Žmogaus odos modelio tyrimas Optinio tankio ir tiriamąja medžiaga bei teigiamomis ir neigiamomis kontrolėmis paveiktų ląstelių pro- centais išreikšto apskaičiuoto gyvybingumo duomenys ir bet kokios etaloninės nurodytos cheminės medžiagos turėtų būti pateiktos lentelėse, kur būtų ir kartojamų mėginių/pakartotinių eksperimentų duo- menys, vidurkiai bei nustatyta klasifikacija. 2. 2. Įvertinimas ir rezultatų aiškinimas 2. 2. 1. Žiurkės odos transepitelinės elektrinės varžos nustatymo — metodas Jei tiriamosios medžiagos transepitelinės elektrinės varžos vidurkis yra didesnis nei 5kΩ, tai ji laikoma odos audinio nesuardančia medžiaga. Jei transepitelinės elektrinės varžos vidurkis yra mažesnis nei 5kΩ arba 5kΩ, o tiriamoji medžiaga priklauso paviršiaus įtempimą didinančioms ar neutraliu pH pasižymin- čioms organinėms medžiagoms, ji laikoma odos audinį suardančia medžiaga. Su paviršiaus įtempimą didinančiomis ir neutraliu pH pasižyminčiomis organinėmis medžiagomis, kurių transepitelinė elektrinė varža yra mažesnė nei 5kΩ arba 5kΩ, galima atlikti dažo įsiskverbimo tyrimą. Jeigu dažo, įsiskverbusio į odos diską, vidutinis kiekis yra didesnis nei tuo pat metu gautas vidutinis dažo, įsiskverbusio į odos diską, paveiktą 36 % HCl teigiama kontrole, kiekis arba lygus jam, tai tiriamoji medžiaga yra tikrai teigiama ir todėl priklauso odos audinį suardančioms medžiagoms. Jei dažo, įsisk- verbusio į odos diską, vidutinis kiekis yra mažesnis nei tuo pat metu gauto dažo, įsiskverbusio į odos dis- ką, paveikto 36 % HCl teigiama kontrole, kiekis, tai tiriamoji medžiaga nėra laikoma teigiama ir priklauso medžiagoms, nesuardančioms odos. 2. 2. 2. Ž m o g a u s o d o s m o d e l i o t y r i m a s Neigiamos kontrolės optinio tankio reikšmė atspindi šimtaprocentinį ląstelių gyvybingumą, taigi kiek- vieno tiriamojo mėginio optinio tankio reikšmės gali būti panaudotos apskaičiuoti gyvybingumo, paly- ginus su neigiama kontrole, procentais išreikštą reikšmę. Galutinė ląstelių gyvybingumo vertė išreikšta procentais, skirianti odą suardančias medžiagas nuo nesuardančių medžiagų (arba atskirianti vieną nuo kitos skirtingoms klasėms priklausančias odą suardančias medžiagas), turi būti aiškiai apibūdinta spėjimo modelyje prieš patvirtinant metodą, o tolesnis patvirtinimo tyrimas turi įrodyti, kad ši galutinė riba yra tinkama (2). 3. ATASKAITA Tyrimo ataskaita Tyrimo ataskaitoje turi būti pateikta tokia informacija: Tiriamoji medžiaga: — nustatymo data, fizinė prigimtis ir, jei būtina, jos fizinės ir cheminės savybės. Panaši informacija patei- kiama, jei naudojamos etaloninės medžiagos. Tyrimo sąlygos: — taikytos procedūros aprašymas, — kiekvienos modifikacijos aprašymas ir pagrindimas. 13/25 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 247 Rezultatai: — lentelėse pateikiami tiriamosios medžiagos, teigiamų bei neigiamų kontrolinių medžiagų ir visų nuro- dytų standartinių etaloninių medžiagų varžos dydžiai (transepitelinės elektrinės varžos nustatymo metodas) ar ląstelių gyvybingumo, išreikšto procentais, dydžiai (žmogaus odos modelio tyrimas), kartu pateikiant pakartotinių mėginių/kartotinių eksperimentų duomenis bei vidurkius, — bet koks kito pastebėto poveikio aprašymas. Rezultatų aptarimas. Išvados. 4. NUORODOS 1) ECVAM (1998), ECVAM News & Views. ATLA 26, p. 275-280. 2) Fentem, J. H. , Archer, G. E. B. , Balls, M. , Botham, P. A. , Curren, R. D. , Earl, L. K. , Esdaile, D. J. , Holz- hutter, H-G. & Liebsch, M. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team, Toxicology in Vitro 12, p. 483-524. 3) Barrat, M. D. , Brantom, P. G. , Fentem, J. H. , Gerner, L. , Walker, A. P. & Worth, A. P. (1998). The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 1. Selection and distribu- tion of the test chemicals, Toxicology in Vitro 121, p. 471-482. 4) Oliver, G. J. A. , Pemberton, M. A. & Rhodes, C. (1986), An in vitro skin corrosivity test – modifica- tions and validation, Food & Chemical Toxicology 24 , p. 507-512. 5) Botham, P. A. , Hall, T. J. , Dennett, R. , McCall, J. C. , Basketter, D. A. , Whittle, E. , Cheesman, M. , Esdaile, D. J. & Gardner, J. (1992), The skin corrosivity test in vitro:results of an interlaboratory trial, Toxico- logy in Vitro 6, p. 191-194. 6) Worth, A. P. , Fentem, J. H. , Balls, M. , Botham, P. A. , Curren, R. D. , Earl, L. K. , Esdaile, D. J. & Liebsch, M. (1998), An evaluation of the proposed OECD testing strategy for skin corrosion, ATLA 26, p. 709-720. 7) Botham, P. A. , Chamberlain, M. , Barratt, M. D. , Curren, R. D. , Esdaile, D. J. , Gardner, J. R. , Gordon, V. C. , Hildebrand, B. , Lewis, R. W. , Liebsch, M. , Logemann, P. , Osborne, R. , Ponec, M. , Regnier, J. F. , Stei- ling, W. , Walker, A. P. & Balls, M. (1995), A prevalidation study on in vitro skin corrosivity testing. The report and recommendations of ECVAM workshop 6, ATLA 23, p. 219-255. 248 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/25 t. 1 paveikslas 13/25 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 249 2 paveikslas 250 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/25 t. II PRIEDAS „B. 41. FOTOTOKSIŠKUMAS - 3T3 NRU FOTOTOKSIŠKUMO TYRIMAS IN VITRO 1. METODAS 1. 1. Įvadas Fototoksiškumas apibūdinamas kaip toksinė reakcija, kuri atsiranda, kai pirmą kartą oda paveikiama tam tikromis cheminėmis medžiagomis, o po to — šviesa, arba kuri sukeliama panašiai — kai sistemingai vei- kiama chemine medžiaga, oda yra apšvitinama. 3T3 NRU fototoksiškumo tyrimo in vitro rezultatai leidžia nustatyti tiriamos medžiagos fototoksinį akty- vumą, t. y. ar kokios nors tiriamos medžiagos ultravioletiniais ir matomos šviesos spinduliais gali kelti pavojų. Kadangi toksikologinio tyrimo in vitro tikslas — ištirti fototoksiškumą, odą paveikus cheminėmis medžia- gomis ir šviesa, todėl šio tyrimo metu galima identifikuoti fototoksiškus junginius in vivo po to, kai jais sis- temingai buvo veikiama oda ir kai jie joje pasiskirsto, taip pat fotodirginančias medžiagas, kurių veikimas pasireiškia joms paveikus konkrečią odos vietą. 1992-1997 m. vykdant bendrą Europos Sąjungos ir COLIPA projektą, buvo sukurtas ir patvirtintas 3T3 NRU fototoksiškumo tyrimas (1) (2) (3), kad būtų rasta patikima alternatyva metodams, taikomiems in vivo. 1996 m vykusiame OECD seminare buvo pasiūlytas nuoseklus fototoksiškumo tyrimas in vitro (4). in tyrimo fototoksiškumo 3T3 NRU ūmiojo vitro fototoksiškumo/fotodirginimo poveikiu žmonėms bei gyvūnams ir buvo pastebėta, kad šis tyrimas leidžia puikiai numatyti tokį poveikį. Šiuo tyrimu nesiekiama numatyti kitokio pobūdžio žalingo poveikio, kuris gali atsirasti, kai odą vienu metu veikia cheminės medžiagos bei šviesa, pvz. , fotogenotoksiškumo, foto- alergijos, fotodirginimo ar fotokarcinogenotoksiškumo, nors atliekant 3T3 NRU fototoksiškumo tyrimą daugelis šiomis savybėmis pasižyminčių cheminių medžiagų reagavo teigiamai. Be to, šis tyrimas nėra skir- tas šviesos fototoksiniam aktyvumui įvertinti. duomenys lyginami buvo su Šiame priede pateikiamas nuoseklusis cheminių medžiagų fototoksiškumo tyrimas. 1. 2. Sąvokos Spinduliuotė: ultravioletinės (UV) ar matomos šviesos, krentančios ant paviršiaus, intensyvumas, išreiškia- mas W/m2 arba mW/cm2. Šviesos dozė: ultravioletinės (UV) ar matomos šviesos, krentančios ant paviršiaus, kiekis išreiškiamas džau- liais (= W × s) paviršiaus plotui, pvz. , J/m2, J/cm2. Ultravioletinės šviesos bangų juostos: CIE (Tarptautinės radiacijos komisijos) rekomenduojami žymėjimai: UVA (315-400 nm), UVB (280-315 nm), UVC (100-280 nm). Vartojami ir kiti žymėjimai: skiriamoji riba tarp UVA ir UVB paprastai yra ties 320 nm padala, ir todėl UVA galima padalyti į UV-A1 ir UV-A2, skiriamąją ribą nustačius ties 340 nm padala. Ląstelių gyvybingumas: parametras, rodantis absoliutų ląstelių populiacijos aktyvumą (pvz. , vitalinio neutra- laus raudonojo dažo susigėrimą į ląstelių lizosomas), kuris priklausomai nuo galutinio išmatuoto dydžio bei tyrimo programos, yra susijęs su bendru ląstelių skaičiumi ir (ar) jų gyvybingumu. Santykinis ląstelių gyvybingumas:ląstelių gyvybingumas, išreikštas palyginus su neigiamais kontroliniais mėginiais (tirpikliais), su kuriais atliekama visa tyrimo procedūra (arba + UV, arba — UV) ir kurie nebuvo paveikti tiriamąja chemine medžiaga. Spėjimų modelis: algoritmas, naudojamas numatant toksiškumo galią, remiantis toksiškumo tyrimo rezul- tatais. Pasirinkus šį kelią, kai bandoma nustatyti fototoksinį aktyvumą, kai atliekant 3T3 NRU fototoksiš- kumo tyrimą in vitro, gauti rezultatai būtų panaudoti, numatant fotoksiškumo galią, galima naudotis FSV (fotodirginimo veiksniu) ir VFE (vidutiniu fotoefektu). Fotodirginimo veiksnys (FDV): veiksnys, gaunamas lyginant tarpusavyje dvi vienodai veiksmingas tiriamas cheminės medžiagos necitotoksine ultravioletinės/matomos šviesos spinduliuote. koncentracijas citotoksines apšvitinus (EB50), gautas Vidutinis fotoefektas (VFE): naujas parametras, gautas matematiškai išanalizavus visą dviejų skirtingų kon- centracijų kreivių pavidalą, gautą apšvitinus necitotoksine ultravioletine/matoma šviesa. 13/25 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 251 Fototoksiškumas: ūmiai pasireiškiantis toksinis atsakas, kai oda iš pradžių veikiama tam tikromis cheminėmis medžiagomis, o vėliau — šviesa, arba kuris pasireiškia panašiai, kai į odą sistemiškai injekuojama cheminė medžiaga. Fotodirginimas: fototoksiškumo atmaina, naudojama apibūdinant tik tokias fototoksines reakcijas, kurios vyksta odoje, kai cheminės medžiagos ją veikia vietiniu ar oraliniu būdu. Vykstant šioms fototoksinėms reakcijoms, ląstelės suardomos nespecifiniu būdu (ši reakcija panaši į tą, kurią sukelia nudegimas nuo saulės). Fotoalergija: įgytas imunologinis reaktyvumas, kurio nebūna odą veikiant chemine medžiaga pirmą kartą; jį sukelia tik 1-2 savaites trunkanti indukcija. Fotogenotoksiškumas: genotoksinis atsakas, pažeidžiantis ląstelės genomą ir atsiranda tada, kai ląstelės apšvi- tinamos ultravioletinės/matomos šviesos bangų negenotoksine doze ir negenotoksiniu chemine medžiaga. Fotokarcinogeniškumas: karcinogeniškumas, sukeliamas pakartotinai paveikus chemine medžiaga ir šviesa. Terminas „fotokarcinogenezė“ paprastai vartojamas tada, kai cheminė medžiaga suaktyvina vėžio, sukelto ultravioletine spinduliuote, vystymąsi. 1. 3. Etaloninės medžiagos Atliekant tyrimą, kai norima iš naujo nustatyti 3T3 NRU fototoksiškumą, be teigiamos kontrolinės medžia- gos — chlorpromazino, kuri turėtų būti kartu tiriama per kiekvieną naują bandymą, rekomenduojama kaip etalonus naudoti ir keletą cheminių medžiagų, kurios buvo naudojamos atliekant šį tyrimą keliose skirtin- gose laboratorijose (3) (1) (13). 1. 4. Pirminis aptarimas Nustatyta, kad daugelio tipų cheminės medžiagos sukelia fototoksinį poveikį (5) (6) (7) (8). Vienintelė bendra šių medžiagų ypatybė — gebėjimas absorbuoti saulės šviesos bangų spektre esančią šviesos ener- giją. Pagal pirmąjį fotochemijos dėsnį (Grotthauso-Draperio dėsnis) tam, kad vyktų fotocheminė reakcija, yra reikalingas pakankamas absorbuotų šviesos kvantų kiekis. Taigi, vadovaujantis šia tyrimo metodika (pa- gal OECD fototoksiškumo tyrimo rekomendaciją Nr. 101), prieš atliekant biologinį tyrimą siūloma nustatyti tiriamosios medžiagos absorbuojamos ultravioletinės/matomos šviesos spinduliuotės bangų spektrą. Jeigu moliarinės ekstinkcijos/absorbcijos koeficientas yra mažesnis nei 10 litrų × mol— 1× cm— 1, tai tiriamoji medžiaga nepasižymi fototoksiniu aktyvumu ir jos nereikia naudoti atliekant in vitro 3T3 NRU fototosiškumo tyrimą ar kurį nors kitą biologinį tyrimą norint nustatyti žalingą fotocheminį poveikį (priedėlis). 1. 5. Tyrimo metodo principas Buvo nustatyti keturi mechanizmai, kaip chromoforas (cheminė medžiaga), absorbuodamas šviesą, sukelia fototoksinį atsaką (7). Jie visi sukelia ląstelių pažeidimus. Taigi 3T3 NRU fototoksiškumo tyrimas in vitro yra grindžiamas cheminės medžiagos citotoksiškumo, kai medžiaga apšvitinama arba neapšvitinama neci- totoksine ultravioletinės/matomos šviesos spinduliuotės doze, palyginimu. Šio tyrimo metu citotoksišku- mas išreiškiamas nuo koncentracijos priklausomu vitalinio neutralaus raudonojo dažo (NR) susigėrimo į ląstelę susilpnėjimu (9) praėjus 24 valandoms, po to kai ląstelės buvo paveiktos tiriamąja chemine medžiaga bei apšvitintos. Balb/c inbredinio pelių kamieno transformuoto fibroblastų ląstelių linija 3T3 24 valandas kultivuojama in vitro, kad susiformuotų monosluoksniai. Po to į dvi 96 duobučių mikrotitravimo plokšteles, skirtas kiek- vienai tiriamajai medžiagai, įpilamos 8 skirtingos tiriamosios medžiagos koncentracijos, ir plokštelės 1 valandą inkubuojamos. Paskui viena mikrotitravimo plokštelė apšvitinama necitotoksine 5J/cm2 ultravioletinės/matomos šviesos spinduliuotės doze, o kita plokštelė tuo metu laikoma tamsoje. Vėliau abie- jose plokštelėse esanti terpė pakeičiama kultivavimui skirta terpe, ir po pakartotinio 24 valandų inkuba- vimo pagal 3 valandas trunkantį neutralaus raudonojo dažo susigėrimą (NRU) į ląsteles nustatomas ląste- lių gyvybingumas. Santykinis ląstelių gyvybingumas, išreiškiamas neigiamų kontrolinių mėginių (nepaveiktų nei chemine medžiaga, nei šviesa) procentais, apskaičiuojamas kiekvienai iš 8 tiriamosios medžiagos koncentracijų. Numatant medžiagos fototoksinį aktyvumą, lyginami atsakai į skirtingas medžia- gos, apšvitintos ultravioletinės šviesos spinduliuote arba laikytos tamsoje, koncentracijas, kai lygis papras- tai būna EB50, t. y. tokios koncentracijos, kuri slopina ląstelių gyvybingumą 50 % tiriamąja medžiaga nepa- veiktuose kontroliniuose mėginiuose. 1. 6. Kokybės kriterijai Ląstelių jautrumas UVA; ankstesnių tyrimų duomenys: ląstelių jautrumas ultravioletinės šviesos spinduliuotei turėtų būti tikrinamas reguliariai. Ląstelės pasėjamos tokiu pat tankiu, kaip ir atliekant 3T3 NRU fototok- siškumą in vitro, kitą dieną lastelės apšvitinamos UVA (1-9 J/cm2) dozėmis, o dar kitą dieną ląstelių gyvy- bingumas nustatomas, atliekant neutralaus raudonojo dažo susigėrimo į ląsteles (NRU) tyrimą. Ląstelės lai- komos atitinkančiomis kokybės kriterijus, jei jų gyvybingumas po apšvitos 5 J/cm2 UVA spinduliuotės doze sudaro ne mažiau kaip 80 % tamsoje laikytų kontrolinių ląstelių gyvybingumo. Esant didžiausios apšvitos UVA dozei (9 J/cm2), ląstelių gyvybingumas turėtų sudaryti ne mažiau kaip 50 % tamsoje laikytų kontro- linių ląstelių gyvybingumo. Šis tikrinimas turėtų būti daromas atliekant kas dešimtą ląstelių persėjimą. Neigiamų kontrolinių mėginių ląstelių jautrumas UVA: šis tyrimas laikomas atitinkančiu kokybės kriterijus, jei neigiamų kontrolinių ląstelių (laikomų Earlo subalansuotame druskų tirpale (EBSS), kuriame yra arba nėra 1 % dimetilsulfoksido (DMSO) ar 1 % etiletanolio (EtOH), atliekant + UVA tyrimą gyvybingumas sudaro ne mažiau kaip 80 % neapšvitintų ląstelių, laikytų tame pačiame tirpale tamsoje (- UVA), gyvybingumo. 252 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/25 t. Neigiamų kontrolinių mėginių ląstelių gyvybingumas: absoliutus optinis tankis (OT540 NRU), išmatuotas NR neigiamų kontrolinių mėginių ląstelių ekstrakte, parodo, ar 1 × 104 ląstelių, pasėtų į vienos mikrotitra- vimo plokštelės duobutę, skaičius padaugėjo, dukart pailginus tyrimo trukmę. Tyrimas laikomas priimti- nu, jei kontrolinių mėginių, nepaveiktų chemine medžiaga, optinio tankio (OT540 NRU) vidurkis yra 3 0,2. Teigiami kontroliniai mėginiai: atliekant kiekvieną 3T3 NRU fototoksiškumo tyrimą in vitro, tiriamas ir žino- mos cheminės medžiagos fototoksinis aktyvumas. Kadangi pagal Europos Sąjungos ir COLIPA bendrą pro- jektą atliekant tyrimo patvirtinimą chlorpromazinas buvo naudojamas kaip teigiama kontrolinė medžiaga, todėl rekomenduojama jį naudoti. Atliekant 3T3 NRU fototoksiškumo tyrimą in vitro, naudojamas chlor- promazinas arba kai pagal standartinį protokolą buvo nustatyti tokie tyrimo priimtinumo kriterijai, kai (+ UVA) bandymo metu chlorpromazino EB50 siekė 0,1-2,0 μg/ml, o (– UVA) bandymo metu — chlor- promazino koncentracija siekė nuo 7,0 iki 90,0 μg/ml. Fotodirginimo veiksnys, t. y. EB50 pokytis, turėtų būti ne mažesnis negu 6. Vietoj chlorpromazino kaip gretutinės teigiamos kontrolinės medžiagos gali būti naudojamos kitos žino- mos cheminės medžiagos, pasižyminčios fototoksiniu aktyvumu, bei atitinkančios tiriamos medžiagos klasę ir pasižyminčios tokiomis pat tirpumo savybėmis. Tuo atveju, kaip rodo ankstesnių tyrimų duome- nys, kaip tyrimo priimtinumo kriterijus reikėtų tinkamai nustatyti EB50 dydžių intervalus/skalę, fotosudir- ginimo veiksnį ir vidutinį fotoefektą. 1. 7. Tyrimo metodo aprašymas 1. 7. 1. Preparatai 1. 7. 1. 1. L ą s t e l ė s Atliekant tyrimo patvirtinimą, buvo panaudota pelių fibroblastų ląstelių permanentinė linija Balb/c 3T3 (klonas 31), gauta arba iš ATCC, arba iš ECACC, todėl siūloma ją naudoti. Atliekant tyrimą pagal tą pačią metodiką, galima sėkmingai panaudoti kitas ląsteles ar ląstelių linijas, jei jų kultivavimo sąlygos yra pritai- kytos specifiniams ląstelių poreikiams, tačiau reikia, kad jos būtų lygiavertės. Reikia nuolat tikrinti, ar ląstelės neužkrėstos mikoplazmomis, ir tik tada, kai tokio patikrinimo rezultatai yra tinkami, ląsteles galima tirti. Juo daugiau ląstelės bus persėjamos, tuo ląstelių jautrumas UVA spinduliuotei gali padidėti, todėl turi būti tiriamos paties mažiausio persėjimo (mažesnio nei 100) Balb/c 3T3 linijos ląstelės. Svarbu patikrinti Balb/c 3T3 linijos ląstelių jautrumą UVA spinduliuotei pagal šioje rekomendacijoje pateiktą kokybės kontrolės procedūrą. 1. 7. 1. 2. T e r p ė i r k u l t i v a v i m o s ą l y g o s Atliekant įprastinį ląstelių persėjimą bei tyrimo procedūras, reikia naudoti atitinkamą terpę bei paisyti kul- tivavimo sąlygų. Balb/c 3T3 linijos ląstelės kultivuojamos DMEM terpėje, papildytoje 10 % naujagimių ver- šelių serumu, 4 mM glutaminu, penicilinu bei streptomicinu drėgnoje atmosferoje, kai aplinkos tempera- tūra siekia 37 °C, o CO2 kiekis - 7,5 %. Ypač svarbu, kad ląstelių kultivavimo sąlygos užtikrintų tyrimui naudojamų ląstelių ar jų linijų gyvavimo laikotarpiu ląstelinį ciklą. 1. 7. 1. 3. K u l t ū r ų p a r u o š i m a s Ląstelės, paimtos iš užšaldytų kamieninių kultūrų, reikiamu tankumu pasėjamos į kultivavimo terpę ir prieš jas panaudojant 3T3 NRU fototoksiškumo tyrime bent kartą yra persėjamos in vitro. Ląstelės, kurios bus naudojamos fototoksiškumo tyrimui, pasėjamos į kultivavimo terpę tokiu tankiu, kad atskiros ląstelių kolonijos nesusilietų kultivavimo pabaigoje, t. y. tada, kai praėjus 48 valandoms nuo ląs- telių pasėjimo yra įvertinamas jų gyvybingumas. Balb/c 3T3 linijos ląstelėms, auginamoms 96 duobučių mikrotitravimo plokštelėje, rekomenduojamas ląstelių tankis vienoje duobutėje yra 1 × 104. Tiriant kiekvieną cheminę medžiagą, ląstelės vienodai pasėjamos į dvi atskiras 96 duobučių mikrotitra- vimo plokšteles, kurios viso tyrimo metu yra kultivuojamos vienodomis sąlygomis, išskyrus tą laikotarpį, kai ląstelės, kultivuojamos vienoje plokštelėje, apšvitinamos UVA/matomos šviesos spinduliuote, o kitoje plokštelėje — laikomos tamsoje. 1. 7. 1. 4. M e t a b o l i n ė a k t y v a c i j a Nors iki šiol vis dar reikalaujama, atliekant tyrimus, kad būtų įvertintas tiriamų medžiagų genotoksinis bei karcinogeninis aktyvumai, naudoti metabolines sistemas, tačiau kai atliekami fototoksikologiniai tyrimai, nėra žinoma jokia cheminė medžiaga, kurią reikėtų transformuoti metaboliniu būdu, kad ji veiktų kaip fototoksinas tiek in vivo, tiek in vitro. Dėl šios priežasties laikomasi nuostatos, kad šiam tyrimui metabolinės aktyvacijos sistema nėra nei būtina, nei moksliškai pateisinama. 13/25 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 253 1. 7. 1. 5. T i r i a m o j i c h e m i n ė m e d ž i a g a / p r e p a r a t a s Prieš pat pradedant tyrimą tiriamosios cheminės medžiagos turi būti iš naujo paruošiamos, nebent jų sta- bilumo tyrimai rodo, kad laikomos jos nepakito. Jei medžiagos gali pradėti greitai irti, apšvietus jas šviesa, gali prireikti jas ruošti raudonoje šviesoje. Tiriamosios cheminės medžiagos turi būti ištirpinamos buferiniuose druskų tirpaluose — Earlo subalan- suotame druskų tirpale (EBSS) arba buferiniame fosfatinių druskų tirpale (PBS), kuriuose turi nebūti nei bal- tymų, nei absorbuojančių šviesą pH indikatorinių spalvų, nes priešingu atveju apšvitos metu nebus išvengta tyrimo klaidų. Tiriamosios cheminės medžiagos, ribotai tirpstančios vandenyje, turi būti maksimaliai (iki 100 %) ištirpi- namos atitinkamuose tirpikliuose, kad būtų gauta pageidaujama jų koncentracija ir tada jas būtų galima praskiesti buferiniais druskų tirpalais santykiu 1: 100. Jei naudojamas tirpiklis, visose kultūrose, t. y. neigia- muose kontroliniuose mėginiuose ir visose tiriamosios medžiagos koncentracijose, jo tūris turi būti pasto- vus - 1 % (v/v). Rekomenduojami tirpikliai yra dimetilsulfoksidas (DMSO) ir etanolis (EtOH). Galima naudoti ir kitus nela- bai didelio citotoksiškumo tirpiklius (pvz. , acetoną), tačiau prieš naudojimą reikia detaliai ištirti jų specifi- nes savybes, pvz. , jų sąveiką su chemine medžiaga, fototoksinio efekto slopinimą bei laisvųjų radikalų suri- šimą. Jei reikia, tirpumą galima padidinti suplakant ir (ar) suardant ultragarsu ir (ar) kaitinant iki 37 °C tempe- ratūros. 1. 7. 1. 6. A p š v i t a u l t r a v i o l e t i n i a i s s p i n d u l i a i s / p a r e n g i m a s Šviesos šaltinis: tinkamas šviesos šaltinis bei šviesos filtras yra svarbiausi veiksniai, apsprendžiantys foto- toksiškumo tyrimą. UVA bei matomos šviesos spinduliuotės bangos ilgio spektrai dažniausiai yra susiję su fotodirginimu tuo tarpu UVB spinduliuotė nėra tokia svarbi ir pasižymi dideliu tiesioginiu citotoksiškumu — bangos ilgio spektrui esant tarp 313 ir 280 nm, UVB citotoksiškumas padidėja net 1 000 kartų (11). Parenkant tinkamą šviesos šaltinį, vadovaujamasi tokiais kriterijais, pagal kuriuos kurie reikalaujama, kad pasirinktu laiko tarpu, panaudojus žinomus fotodirgintojus, būtų galima užregistruoti šviesos šaltinio spinduliuotės, kurią absorbuoja tiriamoji cheminė medžiaga, bangos ilgius ir dozę. Be to, bangos ilgiai ir dozė, įskaitant ir šilumos (infraraudonojo bangos ilgio spektre) emisiją, neturi turėti pernelyg neigiamos įtakos tiriamajai sistemai. Manoma, kad saulės šviesą imituojantys prietaisai yra optimaliausias šviesos šaltinis. Juose naudojami tiek ksenoniniai, tiek gyvsidabriu padengti kaitinamieji lankai. Pastarieji pranašesni tuo, kad yra pigesni ir mažiau išspinduliuoja šilumos, tačiau jų išspinduliuojamoji šviesa, artima saulės šviesai, nėra patenkinama. Visi prietaisai, mėgdžiojantys saulės šviesą, išspinduliuoja pakankamai didelius UVB spinduliuotės kiekius, todėl reikia tinkamai filtruoti jų išspinduliuojamą šviesą, kad didelis UVB spinduliuotės citotoksiškumas būtų susilpnintas. Atliekant 3T3 NRU fototoksiškumo tyrimą in vitro, reikia naudoti apšvitos spektrą, neturintį UVB ilgio bangų (UVA/UVB santykis turi būti lygus 1:20). Atliekant 3T3 NRU fototoksiškumo tyrimą in vitro, buvo paskelbti duomenys apie saulės šviesą mėgdžiojančio prietaiso išspinduliuojamos šviesos bangų spektro pasiskirstymą (3). Dozimetrija: prieš kiekvieną fototoksiškumo tyrimą naudojant tinkamą plačiabangį ultravioletinės spinduliuotės registravimo prietaisą, visuomet turi būti pastoviai tikrinamas spinduliuotės intensyvumas. Šis matavimo prietaisas turi būti kalibruojamas šviesos šaltinio atžvilgiu. Ultravioletinės spinduliuotės registravimo prietaisą reikia tikrinti, naudojant kitą standartinį prietaisą, skirtą ultravioletinei spinduliuotei registruoti bei priklausantį tam pačiam tipui ir šviesos šaltinio atžvilgiu kalibruotą tokiu pat būdu. Idea- liausia būtų tai, kad šviesos šaltinio išspinduliuotų ir praėjusių pro filtrą bangų spektras bei plačiabangis prietaisas, kalibruotas šviesos šaltinio atžvilgiu ir skirtas ultravioletinei spinduliuotei registruoti būtų ati- tinkamai išmatuotas bei patikrintas spektriniu radiometru, tačiau su šiuo prietaisu turi dirbti parengti kva- lifikuoti asmenys. Atliekant tyrimo patvirtinimą, buvo nustatyta, kad UVA spinduliuotės intensyvumo dozė (5 J/cm2) nėra citotoksiška Balb/c 3T3 linijos ląstelių atžvilgiu bei pakankama, kad cheminės medžiagos, pasižyminčios mažu citotoksiniu aktyvumu, būtų sužadinamos. Kad 5 J/cm2 dozė būtų pasiekta per 50 minučių, spinduliuotės intensyvumas turi siekti 1,666 mW/cm2. Jei naudojama kita ląstelių linija ar kitas šviesos šal- tinis, UVA spindulių dozė, kurią išspinduliuoja kitu būdu kalibruotas prietaisas, taikomi kriterijai, kurie neturi neigiamos įtakos ląstelėms ir yra pakankami, kad būtų galima užregistruoti standartinius fototoksi- nius efektus. Šviesos spinduliuotės trukmė apskaičiuojama pagal tokią formulę: 1. 7. 2. Tyrimo sąlygos Tiriamosios cheminės medžiagos maksimali koncentracija neturi viršyti 100 μg/ml, kadangi visos cheminės fototoksinės medžiagos nustatomos, kai jų koncentracija yra nedidelė, tuo tarpu koncentracijai didėjant, daugėja teigiamų klaidingų rezultatų (13). Kai tiriamosios cheminės medžiagos koncentracija yra maksi- mali, jos pH turi atitikti pageidaujamą intervalą (6,5-7,8). 254 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/25 t. Tiriamosios cheminės medžiagos, apšvitintos UVA spinduliuote arba laikomos tamsoje, koncentracijos ribos turi būti tinkamai nustatomos per ankstesnius vykdytus ribų paieškos tyrimus. Koncentracijų serijų riba ir jų skiriamoji riba turi būti taip nustatomos, kad eksperimentiniai duomenys atitiktų atsakus į skir- tingas tiriamosios medžiagos koncentracijas. Tam tikslui naudojamos geometrinės koncentracijų serijos (kartu su pastovaus praskiedimo veiksniu). 1. 7. 3. Tyrimo procedūra (1) 1. 7. 3. 1. P i r m o j i d i e n a Ląstelių suspensija paruošiama terpėje, skirtoje ląstelėms kultivuoti (1 × 105 ląstelių/ml), ir po 100 μl terpės išpilstoma į 96 duobučių mikrotitravimo plokštelės periferines duobutes (vadinamąsias „tuščiąsias“ duo- butes). Į likusias duobutes išpilstoma po 100 μl paruoštos ląstelių suspensijos (105 ląstelių/ml arba 1 × 104 ląstelių/duobutėje). Kiekvienai tiriamajai cheminei medžiagai paruošiamos 2 mikrotitravimo plokštelės, kurių viena bus apšvitinama UVA spinduliuote ir skirta fotocitotoksiškumo įvertinimui, tuo tarpu kai kita bus laikoma tamsoje ir skirta citotoksiškumui nustatyti. Ląstelės inkubuojamos 24 valandas (atmosferoje, turinčioje 7,5 % CO2, esant 37 °C temperatūrai), kol susi- daro pusiau susiliejantis ląstelių monosluoksnis. Šios inkubacijos metu ląstelių gyvybinis ciklas atsigauna, jos prilimpa prie substrato, ir prasideda eksponentinis ląstelių populiacijos didėjimas. 1. 7. 3. 2. A n t r o j i d i e n a Po inkubacijos terpė nupilama nuo ląstelių ir jos du kartus plaunamos įpilant į kiekvieną duobutę po 150 μl EBSS/PBS tirpalo. Po plovimo į kiekvieną duobutę įpilama po 100 μl EBSS/PBS tirpalo, turinčio atitin- kamos koncentracijos tiriamosios cheminės medžiagos ar tirpiklio (neigiamosios kontrolės). Tyrimui nau- dojamos 8 skirtingos tiriamosios cheminės medžiagos koncentracijos. Ląstelės su tiriamąja chemine medžiaga inkubuojamos tamsoje 1 valandą (atmosferoje, turinčioje 7,5 % CO2, 37 °C). Atliekant fototoksiškumo tyrimą, ląstelės 50 minučių kambario temperatūroje 1,7 mW/cm2 intensyvumo UVA spinduliuote (5 J/cm2) švitinamos per 96 duobučių mikrotitravimo plokštelės dangtelį. Paskui plokš- telė džiovinama džiovintuvu, kad po jos dangteliu nesikondensuotų vandens lašeliai. Plokštelės, kurios bus panaudotos citototoksiškumui tirti, 50 minučių laikomos tamsioje dėžėje kambario temperatūroje (lai- kymo sąlygos, adekvačios plokštelės, naudojamos fototoksiškumo tyrimams, sąlygoms). Tiriamasis tirpalas nupilamas, o ląstelės du kartus plaunamos, įpilant į kiekvieną duobutę po 150 μl EBSS/PBS tirpalo. Vėliau šis tirpalas pakeičiamas terpe, skirta ląstelėms kultivuoti ir plokštelė per naktį inku- buojama atmosferoje, turinčioje 7,5 % CO2, esant 37 °C temperatūrai. 1. 7. 3. 3. T r e č i o j i d i e n a Mikroskopinis tyrimas Ląstelės analizuojamos faziniu-kontrastiniu mikroskopu. Registruojami morfologiniai ląstelių pokyčiai, atsiradę dėl tiriamosios cheminės medžiagos sukeltų citotoksnių efektų. Šis patikrinimas rekomenduoja- mas tam, kad būtų išvengta klaidų eksperimento metu, tačiau, tiriant citotoksiškumą ar fototoksiškumą, šie užrašai nėra naudojami. Neutralaus raudonojo (NR) dažo susigėrimo tyrimas Ląstelės praplaunamos su 150 μl pašildytu EBSS/PBS tirpalu, vėliau jis atsargiai nusiurbiamas automatine mikropipete. Į kiekvieną duobutę pilama 100 μl NR terpės ir inkubuojama 3 valandas atmosferoje, turin- čioje 7,5 % CO2, esant 37 °C temperatūrai. Po inkubacijos NR terpė nupilama, o ląstelės praplaunamos į kiekvieną duobutę įpilant po 150 μl EBSS/PBS tirpalo. Praplovimui skirtas tirpalas nupilamas ir plokštelė visiškai išdžiovinama, centrifuguojant ją apgrę- žiamuoju būdu. Vėliau į kiekvieną duobutę įpilama po 150 μl NR absorbcinio tirpalo (šviežiai paruošto etilo alkoholio ir acto rūgšties tirpalo). Plokštelė 10 minučių greitai kratoma ant kratytuvo tol, kol NR visiškai difunduoja iš ląstelių ir susidaro homogeniškas tirpalas. NR tirpalo optinis tankis matuojamas spektrofotometru (bangos ilgiui siekiant 540 nm), o duobutės, pri- pildytos tik terpės, naudojamos kontrolei. Gauti duomenys yra saugomi atitinkamo formato laikmenoje (pvz. , ASCII) tam, kad vėliau būtų galima juos analizuoti. 13/25 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 255 2. 2. 1. DUOMENYS Duomenų kokybė ir kiekybė Remiantis duomenimis turi būti įmanoma atlikti svarbią atsako, gauto UVA (+) ir UVA (–) eksperimentų metu bei priklausomo nuo koncentracijos, analizę. Jei nustatomas citotoksiškumas, tai tiriamosios cheminės medžiagos koncentracijos intervalas ir atskirų jos koncentracijų susikirtimo taškai pateikiami taip, kad eksperimentiniai duomenys atitiktų kreivę. Dėl to, kad tamsoje laikoma tiriamoji cheminė medžiaga gali būti necitotoksiška iki apibrėžtos koncentracijos (100 μg/ml), bet ypač citotoksiška tada, kai apšvitinama UVA spinduliuote, per abu eksperimento etapus turi būti tiriamas koncentracijos intervalas, šiuo tikslu gali prireikti nubrėžti aiškią skiriamąją ribą tarp atskirų koncentracijos dydžių, kad būtų paisoma adekvačių duomenų kokybei taikomo reikalavimo. Jei abiejų eksperimento etapų (medžiagą švitinant spin- duliais arba laikant ją tamsoje) citotoksiškumas nenustatomas, tai užtenka nustatyti skiriamąją ribą tarp ats- kirų dozių iki pačios didžiausios medžiagos koncentracijos. Nėra reikalaujama pakartoti eksperimentą tam, kad būtų patvirtintas akivaizdus teigiamas rezultatas. Be to nereikia patvirtinti akivaizdžiai neigiamų rezultatų, gaunamų tiriant cheminę medžiagą, kurios koncentra- cija yra pakankamai didelė. Tokiais atvejais užtenka atlikti vieną pagrindinį eksperimentą ir vieną ar keletą papildomų eksperimentų, kurių metu preliminariai nustatomi koncentracijų intervalai. Tyrimai kartojami, jei taikant spėjimų modelį gaunami labai arti galutinės ribos esantys tarpiniai rezultatai. Jei prireikia atlikti pakartotinį tyrimą, keičiamos eksperimento sąlygos, kurios gali turėti didelės reikšmės, kai norima gauti pageidaujamą rezultatą. Pagrindinė šio tyrimo procedūra — tiriamosios cheminės medžia- gos tirpalų paruošimas. Todėl eksperimento sąlygų pakeitimai (papildomas tirpiklis, medžiagos suardy- mas, sutrinant ją arba veikiant ultragarsu) gali turėti reikšmės kartojant eksperimentą. Priešingu atveju rei- kia pakeisti inkubacijos prieš apšvitinimą trukmę. Trumpesnė inkubacija svarbi greitai vandenyje suyrančioms cheminėms medžiagoms. 2. 2. Rezultatų apdorojimas Jei yra įmanoma, tai nustatoma tiriamosios medžiagos koncentracija, kuriai esant, ląstelinis NRU inhibuo- jamas 50 % (EB50). Tai padaroma, tyrimo metu gautus atsako į skirtingas koncentracijas duomenis apdo- rojant nelinijinės regresijos (pirmiausia — Hill funkcijos arba atitinkamos logistinės regresijos) arba kito- mis atitikties procedūromis (14). Prieš panaudojant EB50 tolesniems apskaičiavimams, būtina atitinkamai patikrinti atitikimo kokybę. EB50 gali būti apskaičiuojamas ir grafiniais duomenų atitikties metodais. Šiuo atveju rekomenduojama nubraižyti tikimybės grafiką (x ašis — log; y ašis — tikimybės vienetas arba pro- bitas), kadangi atlikus šią transformaciją, atsako į įvairias koncentracijas funkcija taps linijinė. 2. 3. Rezultatų įvertinimas (spėjimų modeliai) 2. 3. 1. Spėjimo modelio 1 variantas: fotodirglumo veiksnys (FDV) Atliekant apšvitos UVA (+) ir UVA (–) eksperimentus gaunamos atsako į skirtingas tiriamosios cheminės medžiagos koncentracijas kreivės, o FDV apskaičiuojamas pagal tokią formulę: Jei FDV < 5, tai medžiaga nėra fototoksiška, tuo tarpu jei FDV ≥ 5, medžiaga yra fototoksiška. Jei cheminė medžiaga, tik apšvitinta ultravioletine spinduliuote pasirodo esanti citotoksiška, o laikyta tam- soje — necitotoksiška, tai tokiu atveju neįmanoma apskaičiuoti fotodirglumo veiksnio. Tokiais atvejais, kai atliekamas citotoksiškumo tyrimas, tiriamąją cheminę medžiagą laikant tamsoje, ir nustatomas fotodir- glumo veiksnys „> FDV“, tai šio veiksnio vertė apskaičiuojama pagal didžiausią tiriamosios medžiagos kon- centraciją (Cmax): Jei įmanoma apskaičiuoti „> FDV“ vertę, tai, paėmus bet kokią šio veiksnio reikšmę, didesnę nei 1, bus galima spėti apie fototoksiškumą būdingą medžiagai. Jei cheminė medžiaga, būdama pačios didžiausios koncentracijos, nepasižymi citotoksiškumu, ir dėl to, kai ji laikoma tamsoje arba apšvitinama ultravioletine spinduliuote, abiem atvejais negalima apskaičiuoti EB50, tai šitai rodo, kad medžiaga nėra fototoksiška. Tokiais atvejais pažymima, kad išmatuotas fotodirglumo veiksnys lygus 1. 256 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/25 t. Jei galima gauti tik FDV, lygų 1, tai rodo, jog medžiaga nėra fototoksiška. Kai b ir c atvejais bandoma nustatyti medžiagos fototoksiškumą, reikia ypač atkreipti dėmesį į tiriamosios cheminės medžiagos koncentracijas, gautas tiriant 3T3 NRU fototoksiškumą in vitro. 2. 3. 2. Spėjimų modelio 2 variantas: vidutinis fotoefektas (VFE) Bandant nustatyti medžiagos fototoksiškumą, galima taikyti ir kitą spėjimų modelio variantą, kuris buvo sukurtas, kai Europos Sąjunga ir COLIPA atliko tyrimo patvirtinimą15 ir vėliau ištyrė cheminių medžiagų, apšvitintų filtruota ultravioletine spinduliuote, fototoksiškumą in vitro, esant „nulinėms sąlygoms“ (13). Tai- kant šį modelį išvengiama fotodirglumo veiksnio modelio apribojimų tais atvejais, kai EB50 neįmanoma apskaičiuoti. Šis modelis remiasi vidutiniu fotoefektu (VFE) — parametru, kuris remiasi absoliučių atsakų į skirtingas tiriamosios medžiagos koncentracijas kreivių lyginimu. Tam, kad VFE modelis būtų pritaikytas, Berlyno Humboldtų universitete buvo sukurta nemokamai įsigyjama speciali kompiuterių programa. 2. 4. Rezultatų aiškinimas Teigiamas rezultatas, gautas tiriant 3T3 NRU fotoksiškumą in vitro (FDV ≥ 5; VFE ≥ 0,1), rodo, kad tiria- moji cheminė medžiaga yra fototoksiška. Jei šis rezultatas buvo gautas, kai tiriamosios cheminės medžia- gos koncentracijos buvo mažesnės nei 10 μg/ml, tai rodo, kad ši medžiaga gali įgyti fototoksinį aktyvumą, esant įvairioms apšvitinimo sąlygoms in vivo. Jei teigiamas rezultatas gaunamas tada, kai didžiausia tiria- mosios cheminės medžiagos koncentracija siekia 100 μg/ml, tai vėliau būtina įvertinti tos medžiagos keliamą žalą arba fototoksinį aktyvumą. Šitai galima atlikti, tiriant cheminės medžiagos įsiskverbimą bei kaupimąsi odos audinyje arba cheminę medžiagą tiriant kitu metodu, patvirtinančiu medžiagos fototok- siškumą (pvz. , panaudojant modelinę žmogaus odos sistemą). Neigiamas rezultatas, gautas tiriant 3T3 NRU fototoksiškumą in vitro (FDV < 5 arba VFE < 0,1), rodo, kad tiriamoji cheminė medžiaga nėra fototoksiška žinduolių ląstelėms, kurios buvo kultivuojamos, esant nusta- tytomis sąlygomis. Tais atvejais, kai tiriamosios cheminės medžiagos didžiausia koncentracija siekė 100 μg/ml, neigiamas rezultatas rodo, kad tiriamoji cheminė medžiaga nėra fototoksiška in vitro, ir neatrodo, kad ji tokia taps in vivo. Tais atvejais, kai naudojant mažesnes tiriamosios medžiagos koncentracijas, buvo gauti identiški atsakai į fototoksinės medžiagos, apšvitintos ultravioletine spinduliuote bei laikytos tamso- je, skirtingas koncentracijas, tai gauti rezultatai bus vienodai aiškinami. Tačiau tuo atveju, jei nebus nustatytas medžiagos fototoksiškumas apšvitinus ją ultravioletine spinduliuote arba laikant tamsoje ir jei tiriamosios medžiagos koncentracijos, kurias apriboja jos tirpumas vandenyje, bus mažesnės nei 100 μg/ml, bus galima suabejoti metodu, kuriuo tiriama ši cheminė medžiaga, ir reikės atlikti tyrimo patvirti- nimą (odos audinio modelinė sistema in vitro ar ex vivo arba tyrimas in vitro). 3. ATASKAITA Tyrimo ataskaita Tyrimo ataskaitoje pateikiama tokia informacija: Tiriamoji cheminė medžiaga: — identifikacijos duomenys bei CAS numeris, jeigu jis žinomas, — fizinė prigimtis ir grynumas, — tyrimui svarbios fizikinės ir cheminės savybės, — stabilumas ir fotostabilumas, jei jis žinomas. Tirpiklis: — tirpiklio pasirinkimo pagrindimas, — tiriamosios cheminės medžiagos tirpumas šiame tirpiklyje, — tirpiklio kiekis terpėje (EBSS arba PBS), kuria paveikiama cheminė medžiaga. Ląstelės: — ląstelių tipas ir šaltinis, — ar ląstelėse neaptikta mikoplazmų, — ląstelių persėjimų skaičius, jei jis žinomas, — ląstelių jautrumas ultravioletinei spinduliuotei, nustatytas 3T3 NRU fototoksiškumo tyrimo metu, panaudojant apšvitinančius prietaisus, in vitro. Tyrimo sąlygos a) — inkubacija prieš poveikį ir po jo: — terpės, skirtos kultivavimui, tipas ir sudėtis, — inkubacijos sąlygos (CO2 koncentracija, temperatūra, drėgmė), — inkubacijos trukmė (prieš poveikį ir po jo). 13/25 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 257 Tyrimo sąlygos b) — paveikimas tiriamąja chemine medžiaga: — pagrindimas, kodėl pasirinkta tokia apšvitinamos ultravioletine spinduliuote ir laikomos tamsoje tiria- mosios cheminės medžiagos koncentracija, — pagrindimas, kodėl tyrimui pasirinkta didžiausia koncentracija, kai tiriamosios cheminės medžiagos tir- pumas terpėje yra ribotas ir medžiaga nėra citotoksiška, — terpės, kurioje buvo paveikiamas tyrimo objektas, buferinių druskų tirpalo tipas ir sudėtis, — poveikio tiriamąja chemine medžiaga trukmė. Tyrimo sąlygos c) — spinduliuotė: — pagrindimas, kodėl pasirinktas tyrimo metu naudotas šviesos šaltinis, — šviesos šaltinio išspinduliuojamų bangų spektrinės charakteristikos, — panaudoto šviesos filtro pralaidumo/absorbcijos charakteristikos, — radiometro charakteristikos bei jo kalibravimo duomenys, — atstumas tarp šviesos šaltinio ir tiriamosios sistemos, — apšvitos UVA spinduliais intensyvumas, esant nustatytam atstumui, išreikštas mW/cm2, — apšvitos ultravioletine ir matoma šviesos spinduliuote trukmė, — UVA spinduliuotės dozė, išreikšta J/cm2, — temperatūra, kuriai esant ląstelių kultūros buvo apšvitinamos ir tuo pačiu metu laikytos tamsoje. Tyrimo sąlygos d) — NRU tyrimas: — NR terpės sudėtis, — NR inkubacijos trukmė, — inkubacijos sąlygos (CO2 koncentracija, temperatūra, drėgmė), — NR išskyrimo sąlygos (išskyrimui panaudota medžiaga, trukmė), — šviesos bangos ilgis, panaudotas spektrofotometriniam NR optinio tankio nustatymui, — antrasis standartinis bangos ilgis (etalonas), jei toks buvo panaudotas, — nulinė spektrofotometro padėtis, jeigu buvo panaudotas. Rezultatai: — ląstelių gyvybingumas, nustatytas kiekvienai tiriamosios cheminės medžiagos koncentracijai ir išreikš- tas kontroliniuose mėginiuose esančių ląstelių vidutinio gyvybingumo procentais, — atsakų į skirtingas tiriamosios cheminės medžiagos koncentracijas kreivės (tiriamosios cheminės medžiagos koncentracijos ir santykinio ląstelių gyvybingumo santykis), nustatytos vienu metu atlikus medžiagos UVA (+) ir UVA (-) fototoksiškumo tyrimus, — atsakų į skirtingas tiriamosios cheminės medžiagos koncentracijas kreivėje pateiktų duomenų analizė; jei įmanoma, tai apskaičiuojamas medžiagos EB50, UVA (+) ir EB50 UVA (-), — dviejų atsakų į medžiagos koncentracijas kreivių, gautų, nesant apšvitos UVA ir matomos šviesos spin- duliuote, palyginimas arba apskaičiuojant fotodirglumo faktorių (FDF) arba vidutinį fotoefektą (VFE), — fototoksinio aktyvumo klasifikacija, — tyrimo priimtinumo kriterijai a) — gretutiniai neigiami kontroliniai mėginiai: — absoliutus ląstelių, apšvitintų ir neapšvitintų UVA spinduliais, gyvybingumas (NR ekstrakto optinis tankis), — anksčiau atliktų tyrimų metu gauti duomenys apie naudotus neigiamus kontrolinius mėginius, jų vidurkis ir standartinis nukrypimas. — tyrimo priimtinumo kriterijai b) — gretutiniai teigiami kontroliniai mėginiai: — teigiamame kontroliniame mėginyje esančios cheminės medžiagos, apšvitintos UVA spinduliuote (UVA (+)) bei laikytos tamsoje (UVA (-)), EB50 bei FDV, — anksčiau atliktų tyrimų duomenys apie teigiamuose kontroliniuose mėginiuose esančias chemines medžiagas; EB50 UVA (+) ir EB50 UVA (-), vidutinį FDV bei jo standartinį nukrypimą. Rezultatų aptarimas. Išvados. 258 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 13/25 t. 4. NUORODOS 1) Spielman, H. , Balls, M, Döring, B. , Holzhütter, H. G. , Kalweit, S. , Klecak, G. , L’Eplattenier, H. , Liebsch, M. , Lovell, W. W. , Maurer, T. , Moldenauer, F. , Moore, L. , Pape, W. , Phannbecker, U. , Potthast, J. , De Silva, O. , Steiling, W. and Willshaw, A. (1994), EEB/COLIPA project on in vitro phototoxicity testing: First results obtained with a Balb/c 3T3 cell phototoxicity assay, Toxicology in Vitro 8, p. 793-796. 2) Anon (1998), Statement on the scientific validity of the 3T3 NRU PT test (an in vitro test for photo- toxicity), European Commission, Joint Research Centre: ECVAM and DGXI/E/2, 3 November 1997, ATLA 26, p. 7-8. 3) Spielmann, H. , Balls, M. , Dupuis, J. , Pape, W. J. , Pechovitch, G. , De Silva, O. , Holzhütter, H. G. , Clot- hier, R. , Desolle, P. , Gerberick, F. , Liebsch, M. , Lovell, W. W. , Maurer, T. , Pfannenbecker, U. , Potthast, J. M. , Csato, M. , Sladowski, D. , Steiling, W. and Brantom, P. (1998), ES/COLIPA „In vitro phototoxici- ty“ validation study, results of phase II (blind trial), part 1: the 3T3 NRU phototoxicity test, Toxicology in Vitro 12, p. 305-327. 4) OECD Test Guidelines Programme, ENV/MC/CHEM/TG(96)9: Final Report of the OECD Workshop on Harmonisation of Validation and Acceptance Criteria of Alternative Toxicological Test Methods. OECD Publications Office, Paris, 1996. 5) 6) 7) 8) Lovell, W. W. (1993), A scheme for in vitro screening of substances for photoallergenic potential, Toxi- cology In Vitro 7, p. 95-102. Santamaria, L. and Prino, G. (1972), List of photodynamic substances, Research progress in organic, bio- logical and medicinal chemistry Vol. 3, Part 1, North Holland Publishing Co, Amsterdam, p. XI–XXXV. Spielmann, H. , Lovell, W. W. , Hölzle, E. , Johnson, B. E. , Maurer, T. , Miranda, M. A. , Pape, W. J. W. , Sapora, O. and Sladowski, D. (1994). In vitro phototoxicity testing: The report and recommendations of ECVAM workshop 2, ATLA 22, p. 314-348. Spikes, J. D. (1989), Photosensitization. The science of photobiology, edited by K. C. Smith, Plenum Press, New York, 2nd edition, p. 79-110. 9) Borenfreund, E. and Puerner, J. A. (1985), Toxicity determination in vitro by morphological alterations and neutral red absorption, Toxicology Letters 24, p. 119-124. 10) Lambert, L. A. , Warner W. G. and Kornhauser, A. (1996), Animal models for phototoxicity testing, Dermatotoxicology, edited by FN Marzulli and HI Maibach, published by Taylor & Francis, Washington DC, 5th Edition, p. 515-530. 11) Tyrrell R. M. and Pidoux M. (1987), Action spectra for human skin cells: estimates of the relative cyto- toxicity of the middle ultraviolet, near ultraviolet and violet regions of sunlight on epidermal kerati- nocytes, Cancer Research 47, p. 1825-1829. 12) ZEBET/ECVAM/COLIPA, Standard Operating Procedure Balb/c 3T3 NRU Photoxicity Test, drafted 23 December 1997 by M. Liebsch and approved 6 March 1998 by the Management Team of the ES/COLIPA project „In Vitro Photoirritation“. 13) Spielmann, H. , Balls, M. , Dupuis, J. , Pape, W. J. W. , De Silva, O. , Holzhütter, H. G. , Gerberick, F. , Liebsch, M. , Lovell, W. W. and Pfannenbecker (1998), A Study on the Phototoxic Potential of UV Fil- ter Chemicals from annex VII of the EU Directive 76/768/EEC in the 3T3 NRU In Vitro Phototoxicity Test, ATLA 26, p. 679-708. 14) Holzhütter, H. G. and Quedenau, J. (1995), Mathematical Modelling of cellular responses to external signals, Journal of Biological Systems 3, p. 127-138. 15) Holzhütter, H. G. (1997), A general measure of in vitro phototoxicity derived from pairs of dose- response curves and its use for predicting the in vivo phototoxicity of chemicals, ATLA 25, p. 445- 462. 13/25 t. LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 259 Priedėlis (1) Papildomi duomenys pateikti 12 nuorodoje. “