title: Direktiva Komisije 2000/33/ES z dne 25. aprila 2000 o 27. prilagoditvi direktive Sveta 67/548/EGS o približevanju zakonov in drugih predpisov v zvezi z razvrščanjem, pakiranjem in označevanjem nevarnih snovi tehničnemu napredkuBesedilo velja za EGP.

eurovoc_concepts:
analytical chemistry
approximation of laws
chemical product
cytology
toxicology

text: 242 SL Uradni list Evropske unije 13/Zv. 25 32000L0033 8. 6. 2000 URADNI LIST EVROPSKIH SKUPNOSTI L 136/90 DIREKTIVA KOMISIJE 2000/33/ES z dne 25. aprila 2000 o 27. prilagoditvi direktive Sveta 67/548/EGS o približevanju zakonov in drugih predpisov v zvezi z razvrščanjem, pakiranjem in označevanjem nevarnih snovi (*) tehničnemu napredku (Besedilo velja za EGP) KOMISIJA EVROPSKIH SKUPNOSTI JE – SPREJELA NASLEDNJO DIREKTIVO: ob upoštevanju Pogodbe o ustanovitvi Evropske skupnosti, Člen 1 ob upoštevanju Direktive Sveta 67/548/EGS z dne 27. junija 1967 o približevanju zakonov in drugih predpisov v zvezi z razvršča- njem, pakiranjem in označevanjem nevarnih snovi (1), kakor je bila nazadnje spremenjena z Direktivo Evropskega parlamenta in Sveta 1999/33/ES (2), in zlasti člena 28 Direktive, ob upoštevanju naslednjega: (1) (2) (3) (4) Priloga V k Direktivi 67/548/EGS določa metode za dolo- čanje fizikalno-kemijskih lastnosti, toksičnosti ter ekotok- sičnosti snovi in pripravkov. To prilogo je treba prilagoditi tehničnemu napredku. V skladu s členom 7(2) Direktive Sveta 86/609/EGS z dne 24. novembra 1986 o približevanju zakonov in drugih predpisov držav članic o varstvu živali, ki se uporabljajo v poskusne in druge znanstvene namene (3), se poskus, v katerem se uporabljajo živali, ne opravi, če je na voljo kaka druga znanstveno zadovoljiva, smiselna in praktična metoda za pridobitev iskanega rezultata. Komisija namerava vključiti v Prilogo V k Direktivi 67/548/EGS nekatere alternativne preskusne metode, pri katerih se živali ne uporabljajo, da bi bile na voljo za pre- skušanje kemikalij v skladu s členom 3(1) Direktive 67/548/EGS. Ukrepi, predvideni s to direktivo, so v skladu z mnenjem Odbora za prilagajanje tehničnemu napredku direktiv o odpravi tehničnih ovir pri trgovanju z nevarnimi snovmi in pripravki – Besedila iz prilog I in II k tej direktivi se dodajo delu B Priloge V k Direktivi 67/548/EGS. Člen 2 1. Države članice sprejmejo zakone in druge predpise, potrebne za uskladitev s to direktivo, najpozneje do 1. oktobra 2001. O tem takoj obvestijo Komisijo. Države članice se v sprejetih predpisih sklicujejo na to direktivo ali pa sklicevanje nanjo navedejo ob njihovi uradni objavi. Način sklicevanja določijo države članice. 2. Države članice predložijo Komisiji besedila temeljnih predpi- sov nacionalne zakonodaje, sprejetih na področju, ki ga ureja ta direktiva, ter tabelo skladnosti med to direktivo in sprejetimi nacionalnimi predpisi. Člen 3 Ta direktiva začne veljati tretji dan po objavi v Uradnem listu Evropskih skupnosti. Ta direktiva je naslovljena na države članice. Člen 4 V Bruslju, 25. aprila 2000 Za Komisijo Margot WALLSTRÖM Članica Komisije Sprejeta pred 26. prilagoditvijo. (*) (1) UL 196, 16. 8. 1967, str. 1. (2) UL L 199, 30. 7. 1999, str. 57. (3) UL L 358, 18. 12. 1986, str. 1. 13/Zv. 25 SL Uradni list Evropske unije 243 PRILOGA I „B. 40 JEDKOST ZA KOŽO 1. 1. 1 METODA Uvod Evropski center za validacijo alternativnih metod (ECVAM), Skupni raziskovalni center, Evropska Komi- sija, je kot znanstveno veljavna uvedel dva preskusa jedkosti za kožo in vitro, in sicer preskus transkutane električne upornosti (TER) na podganji koži in preskus, pri katerem je uporabljen model človeške kože (1) (2) (3). Validacijska študija ECVAM je pokazala, da je z obema preskusoma možno zanesljivo razli- kovati med znanimi jedkovinami in kemikalijami, ki niso jedke. Nadalje je preskus na podlagi modela člo- veške kože omogočil pravilno razlikovanje različnih stopenj jedkega učinkovanja (znana močno jedka sredstva, R35 in druga jedka sredstva, R34) (2). Opis in postopki za oba preskusa so navedeni; izbira pre- skusa je odvisna od posebnih zahtev in prednostne izbire uporabnika. Glej tudi del B splošnega uvoda. 1. 2 Opredelitev pojmov Jedkost za kožo: nastanek nepovratnih poškodb kožnega tkiva po nanosu preskušanega materiala. 1. 3 Referenčne snovi Niso določene, vendar glej točki 1. 5. 3. 4 in 1. 7. 2. 3. 1. 4 Načelo preskusne metode — preskus TER na podganji koži Preskušani material se nanese za največ 24 ur na epidermalne površine kožnih ploščic, odvzetih iz neustrojene kože mladih, humano usmrčenih podgan. Jedki materiali se identificirajo glede na zmožnost zmanjšati celovitost in pregradno funkcijo rožene plasti pokožnice, ki se meri kot znižanje notranjega TER pod raven praga (5 kΩ) (4) (5). Dražilni in nedražilni materiali ne znižajo TER pod raven praga. Pri preskušanju površinsko aktivnih snovi in nevtralnih organskih snovi (za opredelitev glej navedbo litera- ture pod številko (6)) je mogoče v postopek preskušanja vključiti vezavo barvila, da se zmanjša število napačno pozitivnih rezultatov, pridobljenih posebej s temi vrstami kemikalij (2) (7). 1. 5 Opis preskusne metode — preskus TER na podganji koži 1. 5. 1 Živali Za pripravo kožnih ploščic se zahtevajo mlade (20-23 dni stare) podgane (wistar ali podobne pasme). Dlaka na hrbtu in bokih se previdno odstrani z majhnimi škarjami za striženje živali. Živali se nato s pazljivim brisanjem umijejo, površina pa se potopi v antibiotično raztopino (ki denimo vsebuje streptomicin, penicilin, kloramfenikol in amfotericin v koncentracijah, ki učinkovito preprečujejo rast bakterij). Živali se z antibiotično raztopino ponovno umijejo tretji ali četrti dan po prvem umivanju, upo- rabijo pa se v 3 dneh (za pripravo kože živali ne smejo biti starejše od 31 dni). 1. 5. 2 Priprava kožnih ploščic Živali se humano usmrtijo. Hrbtna koža vsake posamezne živali se nato odstrani in z nje previdno odlušči vsa odvečna maščoba. Koža se nato namesti čez konec politetrafluoroetilenske (PTFE) cevi, pri čemer se mora površina pokožnice dotikati cevi. Čez konec cevi se tesno namesti gumijast obroč, s katerim se koža pričvrsti, nato se obreže odvečno tkivo. Mere cevi in obroča so prikazane na sliki 1. Gumijasti obroč se nato z naravnim vazelinom pazljivo pritesni na konec cevi PTFE. Cev se s pomočjo vzmetne sponke namesti v receptorsko komoro, ki vsebuje raztopino magnezijevega sulfata (154 mM) (Slika 2). 1. 5. 3 Preskusni postopek 1. 5. 3. 1 N a n o s p r e s k u š a n e g a m a t e r i a l a Tekoče preskušane snovi (150 μl) se nanesejo na površino pokožnice v cevi (Slika 2). Pri preskušanju trd- nega materiala se na kožno ploščico nanese dovolj trdne snovi, da se zagotovi, da je prekrita celotna povr- šina pokožnice. Nato se na trdno snov doda deionizirana voda (150 μl), cevi pa se rahlo pretresejo. Preskušana snov mora biti v kar največjem možnem stiku s kožo. Pri nekaterih trdnih snoveh je to mogoče doseči s segrevanjem do 30 °C, da se preskušana snov stali, ali z mletjem, da nastane granulat ali prašek. 244 SL Uradni list Evropske unije 13/Zv. 25 Za vsako preskušano snov se uporabijo tri kožne ploščice. Snovi ostanejo na koži 24 ur (glej tudi 1. 5. 3. 4). Preskušana snov se odstrani tako, da se spira s curkom tekoče vode, ki ima do 30 °C, dokler ni mogoče odstraniti nič več materiala. Pri odstranjevanju preskušane snovi, ki se je strdila v cevi, si je mogoče poma- gati s curkom tople vode pri približno 30 °C. 1. 5. 3. 2 Meritve TER TER se meri s pomočjo merilnega mostiča nizke napetosti in izmeničnega toka (npr. AIM 401 ali 6401 ali enakovreden). Pred merjenjem električnega upora se površinska napetost kože zmanjša, tako da se doda zadostna količina 70 % etanola, da prekrije pokožnico. Po nekaj sekundah se etanol odstrani, tako da se cev obrne, tkivo pa se nato navlaži s 3 ml raztopine magnezijevega sulfata (154 mM). Za merjenje upora v kΩ/kožno ploščico se elektrode merilnega mostiča namestijo na vsako stran kožne ploščice (slika 2). Mere elektrod in dolžina elektrode pod krokodilsko sponko so navedene na sliki 1. Sponka notranje (debele) elektrode med merjenjem upora leži na vrhu cevi PTFE, s čimer se zagotovi, da je v raztopino magnezijevega sulfata ves čas potopljena enaka dolžina elektrode. Zunanja (tenka) elektroda je v receptorski komori, in sicer se dotika njenega dna. Razdalja med spodnjim koncem vzmetne sponke in dnom cevi PTFE je konstantna (Slika 1), saj ta razdalja vpliva na dobljeno vrednost upora. Če je vrednost izmerjenega upora večja od 20 kΩ, je to morda posledica tega, da preskušana snov pre- kriva površino pokožnice kožne ploščice. Za odstranitev te plasti se lahko na primer začepi cev PTFE z orokavičenim palcem in jo stresa približno 10 sekund; raztopina magnezijevega sulfata se zavrže, mer- jenje upora pa se ponovi s svežim magnezijevim sulfatom. Povprečni rezultati TER se sprejmejo pod pogojem, da so vrednosti istočasne pozitivne in negativne kon- trole v mejah sprejemljivosti za to metodo. Predlagane kontrolne snovi in njihove pripadajoče sprejem- ljive meje upora za opisano metodologijo in napravo so naslednje: Kontrola Snov Pozitivno Negativno 10 M klorovodikova kislina (36 %) Destilirana voda Meje upora (kΩ) 0,5-1,0 10-25 1. 5. 3. 3 S pr em enj eni p osto pek z a površinsko akt ivne snovi i n nevt ralne organs ke s novi Če so vrednosti TER pri preskušanih snoveh, ki so bodisi površinsko aktivne snovi bodisi nevtralne organske snovi, manjše ali enake 5 kΩ, je mogoče na tkivih opraviti oceno penetracije barvila. Ta postopek bo pokazal, ali so rezultati napačno pozitivni (2). 1. 5. 3. 3. 1 Nanos in odstranitev barvila sulforhodamin B Po začetni obdelavi s preskušano snovjo se na površino pokožnice vsake kožne ploščice za 2 uri nanese 150 μl 10 % (ut. /vol. ) raztopine barvila sulforhodamin B v destilirani vodi. Kožne ploščice se nato pri- bližno 10 sekund spirajo s tekočo vodo pri največ sobni temperaturi, da se odstrani morebitno odvečno/nevezano barvilo. Vsaka kožna ploščica se pazljivo odstrani iz cevi PTFE in se prenese v vialo (npr. 20 ml stekleničko za scintilacijsko tekočino), ki vsebuje deionizirano vodo (8 ml). Viale se 5 minut rahlo stresajo, da se odstrani še preostalo odvečno/nevezano barvilo. Postopek izpiranja se ponovi, nato pa se kožne ploščice odstranijo in prenesejo v viale, ki vsebujejo 5 ml 30 % (ut. /vol. ) natrijevega dodecil sulfata (SDS) v destilirani vodi in se v inkubatorju čez noč shranijo pri 60 °C. Po inkubaciji se vse kožne ploščice odstranijo in zavržejo, preostala raztopina pa se 8 minut centrifugira pri 21 °C (relativna centrifugalna sila ˜ 175). Vzorec supernatanta v količini 1 ml se nato razredči 1 proti 5 (vol. /vol. ) (tj. 1 ml + 4 ml) s 30 % (ut. /vol. ) SDS v destilirani vodi. Optična gostota (OD) raztopine se meri pri pri- bližno 565 nm. 1. 5. 3. 3. 2 Izračun vsebnosti barvila Vsebnost barvila sulforhodamin B v ploščici se izračuna iz vrednosti OD (koeficient molarne ekstinkcije barvila sulforhodamin B pri 565 nm = 8,7 × 104; molska masa = 580). Vsebnost barvila sulforhodamin B se določi za vsako kožno ploščico, nato pa se izračuna srednja vrednost vsebnosti barvila za ponovitve. Povprečni rezultati vezanja barvila se sprejmejo pod pogojem, da so vrednosti istočasne kontrole v mejah sprejemljivosti za metodo. Predlagane sprejemljive meje vsebnosti barvila za kontrolne snovi za opisano metodologijo in napravo so naslednje: 13/Zv. 25 SL Uradni list Evropske unije 245 Kontrola Snov Pozitivno Negativno 10 M klorovodikova kislina (36 %) Destilirana voda Meje vsebnosti barvila (μg/košček) 40-100 15-35 1. 5. 3. 4 D o d a t n e i n f o r m a c i j e Preskušane snovi je mogoče nanesti na kožne ploščice tudi za krajši čas (npr. 2 uri), da se identificirajo močno jedki materiali. Vendar se je v validacijski študiji izkazalo, da preskus TER po dvournem nanosu na kožne ploščice (2) precenjuje jedki potencial več preskušanih kemikalij, medtem ko je po 24-urnem nanosu omogočil pravilno identifikacijo jedkih sredstev in sredstev, ki niso jedka. Lastnosti in mere preskusne naprave in uporabljenega poskusnega postopka lahko vplivajo na pridob- ljene vrednosti TER. Prag za jedkost 5 kΩ je bil ugotovljen na podlagi podatkov, pridobljenih s poseb- nimi napravami in postopki, opisanimi v tej metodi. Če se preskusni pogoji bistveno spremenijo, se lahko uporabijo različni pragovi in kontrolne vrednosti. Zaradi tega je priporočljivo, da se metodologija in prag upora umerjata s preskušanjem vrste referenčnih standardov, ki se izberejo izmed kemikalij, uporablje- nih v validacijski študiji (3). 1. 6 Načelo preskusne metode — preskus z modelom človeške kože Preskušani material se največ za 4 ure površinsko nanese na tridimenzionalni model človeške kože, ki obsega rekonstruirano pokožnico s funkcionalno roženo plastjo. Jedki materiali se identificirajo glede na sposobnost, da v specifičnem času izpostavljenosti zmanjšajo sposobnost celic za življenje — viabilnost (ki se določi npr. z uporabo preskusa zmanjševanja MTT) pod opredeljene pragove. Načelo preskusa je skladno s hipotezo, da so jedke kemikalije tiste, ki lahko prodrejo v roženo plast (z difuzijo ali erozijo) in so dovolj citotoksične, da povzročijo odmiranje celic v spodaj ležečih slojih celic. 1. 7 Opis preskusne metode — preskus z modelom človeške kože 1. 7. 1 Modeli človeške kože Modeli človeške kože sicer lahko izvirajo iz različnih virov, vendar morajo izpolnjevati nekatera merila. Model mora imeti funkcionalno roženo plast s spodaj ležečim slojem živih celic. Pregradna funkcija rožene plasti mora biti zadostna. To se lahko pokaže, tako da se prikaže odpornost modela na citotoksičnost po nanosu snovi, za katere je znano, da so citotoksične za celice, vendar pa običajno ne prodrejo skozi roženo plast. Model mora dati pri opredeljenih pogojih preskusa ponovljive rezultate. Viabilnost živih celic v modelu mora biti dovolj visoka, da je mogoče dobro razlikovati med pozitivnimi in negativnimi kontrolnimi snovmi. Viabilnost celic (npr. izmerjena s količino zmanjšanja MTT, tj. vred- nostjo OD) po izpostavljenosti negativni kontrolni snovi mora biti v mejah sprejemljivosti za posamezni model. Podobno morajo biti vrednosti viabilnosti celic s pozitivno kontrolno snovjo (v primerjavi z vred- nostmi za negativno kontrolo) v opredeljenih mejah sprejemljivosti. Najpomembneje pa je, da mora upo- rabljeni model za napovedovanje ustrezati mednarodnemu validacijskemu standardu (2). 1. 7. 2 Preskusni postopek 1. 7. 2. 1 N a n o s p r e s k u š a n e g a m a t e r i a l a Pri tekočih materialih je treba nanesti dovolj preskušane snovi, da se prekrije površina kože (najmanj 25 μl/cm2. Pri trdnih materialih je treba nanesti dovolj preskušane snovi, da se prekrije koža, nato pa je treba snov navlažiti, da se zagotovi dober stik s kožo; kadar je primerno, je treba trdne snovi pred nano- som zmleti v prašek. Metoda nanašanja mora biti primerna za širok razpon vrst kemikalij (2). Ob koncu časa izpostavljenosti je treba preskušani material skrbno izmiti s površine kože z raztopino soli. 1. 7. 2. 2 M e r i t v e vi a b i l n o s t i c e l i c Za merjenje viabilnosti celic je možno uporabiti katero koli kvantitativno, validirano metodo. Najpogo- steje uporabljeni preskus je zmanjšanje MTT, za katerega se je v več laboratorijih izkazalo, da daje natančne in ponovljive rezultate (2). Kožna ploščica se za 3 ure položi v raztopino 0,3 mg MTT/ml pri 20-28 °C. Oborina modrega formazana se nato ekstrahira (ekstrakcija topila), koncentracija formazana pa se izmeri tako, da se določi vrednost OD pri valovni dolžini med 545 in 595 nm. 246 SL Uradni list Evropske unije 13/Zv. 25 1. 7. 2. 3 D o d a t n e i n f o r m a c i j e Uporabljeni model kože in natančni protokol glede časa izpostavljenosti, postopkov umivanja, itd. bodo imeli velik učinek na rezultate preskusa viabilnosti celic. Priporočljivo je, da se metodologija in model za napovedovanje umerjata s preskušanjem vrste referenčnih standardov, izbranih izmed kemikalij, uporab- ljenih v validacijski študiji ECVAM (3). Odločilnega pomena je, da je uporabljena metoda ponovljiva v istem laboratoriju in v drugih laboratorijih za širok spekter kemikalij, in sicer v skladu z mednarodnimi standardi. Metoda mora izpolnjevati najmanj merila za predhodno opredeljeno znanstveno veljavnost (2), rezultati takšne validacijske študije pa morajo biti objavljeni v recenzirani znanstveni publikaciji. 2. 2. 1 PODATKI Obdelava rezultatov 2. 1. 1 Preskus TER na podganji koži Vrednosti upora (kΩ) za preskušani material, pozitivne in negativne kontrole ter vse standardne refe- renčne kemikalije, vključno s podatki o ponovljenih poskusih, srednjih vrednostih in iz njih izpeljanih razvrstitvah, je treba prikazati v obliki razpredelnice. 2. 1. 2 Preskus z modelom človeške kože Podatki o vrednosti OD in izračunanih odstotnih vrednostih viabilnosti celic za preskušano snov, pozitivne in negativne kontrole ter vse standardne referenčne kemikalije, vključno s podatki o ponovlje- nih poskusih, srednjih vrednostih in iz njih izpeljanih razvrstitvah, je treba prikazati v obliki razpredel- nice. 2. 2 Vrednotenje in razlaga rezultatov 2. 2. 1 Preskus TER na podganji koži Če je srednja vrednost TER, dobljena za preskušano snov, večja od 5 kΩ, snov ni jedka. Če je vrednost TER manjša ali enaka 5 kΩ, preskušana snov pa ni površinsko aktivna snov ali nevtralna organska snov, potem je snov jedka. Za površinsko aktivne snovi ali nevtralne organske snovi, katerih vrednosti TER so manjše ali enake 5 kΩ, se lahko izvede preskus penetracije barvila. Če je srednja vrednost vsebnosti barvila v kožni ploščici enaka ali večja od istočasno določene srednje vrednosti vsebnosti barvila v kožni ploščici iz pozitivne kon- trole s 36 % HCl, potem je preskušana snov pravilno pozitivna in je torej jedka. Če je srednja vrednost vsebnosti barvila v kožni ploščici manjša od istočasno določene srednje vrednosti vsebnosti barvila v kožni ploščici iz pozitivne kontrole s 36 % HCl, potem je preskušana snov napačno pozitivna in torej ni jedka. 2. 2. 2 Preskus z modelom človeške kože Vrednost OD negativne kontrole predstavlja 100 % viabilnost celic; torej se lahko vrednosti OD, pridob- ljene za vsak preskušani vzorec, uporabijo za izračun odstotne viabilnosti celic v primerjavi z negativno kontrolo. Mejna vrednost odstotne viabilnosti celic, ki se uporablja za razlikovanje med jedkimi in nejedkimi preskušanimi materiali (ali za razlikovanje med različnimi razredi jedkega učinkovanja), mora biti v modelu za napovedovanje natančno opredeljena, še preden se metoda validira, naknadna validacijska študija pa mora potrditi ustreznost te mejne vrednosti (2). 3. POROČANJE Poročilo o preskusu Poročilo o preskusu mora vključevati vsaj naslednje informacije: Preskušana snov: — identifikacijski podatki, fizikalne lastnosti in, kadar je pomembno, fizikalno-kemijske lastnosti. Podobne informacije je treba zagotoviti tudi za referenčne snovi, če se uporabijo. Preskusni pogoji: — podrobni podatki o uporabljenem preskusnem postopku, — opis in utemeljitev morebitnih sprememb. 13/Zv. 25 SL Uradni list Evropske unije 247 Rezultati: — tabelarni prikaz vrednosti upora (preskus TER) ali vrednosti odstotne viabilnosti celic (preskus z modelom človeške kože) za preskušani material, pozitivne in negativne kontrole ter vse standardne referenčne kemikalije, vključno s podatki o ponovljenih poskusih in srednjih vrednostih, — opis kakršnih koli drugih opaženih učinkov. Razprava o rezultatih. Zaključki. 4. LITERATURA (1) ECVAM (1998), ECVAM News & Views, ATLA 26, str. 275-280. (2) Fentem, J. H. , Archer, G. E. B. , Balls, M. , Botham, P. A. , Curren, R. D. , Earl, L. K. , Esdaile, D. J. , Holzhutter, H-G. & Liebsch, M. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team, Toxicology in Vitro 12, str. 483-524. (3) Barratt, M. D. , Brantom, P. G. , Fentem, J. H. , Gerner, I. , Walker, A. P. & Worth, A. P. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 1. Selection and distribu- tion of the test chemicals, Toxicology in Vitro 12, str. 471-482. (4) Oliver, G. J. A. , Pemberton, M. A. & Rhodes, C. (1986), An in vitro skin corrosivity test — modifica- tions and validation, Food & Chemical Toxicology 24, str. 507-512. (5) Botham, P. A. , Hall, T. J. , Dennett, R. , McCall, J. C. , Basketter, D. A. , Whittle, E. , Cheeseman, M. , Esdaile, D. J. & Gardner, J. (1992), The skin corrosivity test in vitro: results of an interlaboratory trial, Toxicology in Vitro 6, str. 191-194. (6) Worth, A. P. , Fentem, J. H. , Balls, M. , Botham, P. A. , Curren, R. D. , Earl, L. K. , Esdaile, D. J. & Liebsch, M. (1998), An evaluation of the proposed OECD testing strategy for skin corrosion, ATLA 26, str. 709-720. (7) Botham, P. A. , Chamberlain, M. , Barratt, M. D. , Curren, R. D. , Esdaile, D. J. , Gardner, J. R. , Gordon, V. C. , Hildebrand, B. , Lewis, R. W. , Liebsch, M. , Logemann, P. , Osborne, R. , Ponec, M. , Regnier, J. F. , Steiling, W. , Walker, A. P. & Balls, M. (1995), A prevalidation study on in vitro skin corrosivity tes- ting. The report and recommendations of ECVAM workshop 6, ATLA 23, str. 219-255. 248 SL Uradni list Evropske unije 13/Zv. 25 Slika 1 13/Zv. 25 SL Uradni list Evropske unije 249 Slika 2 250 SL Uradni list Evropske unije 13/Zv. 25 PRILOGA II „B. 41 FOTOTOKSIČNOST –PRESKUS FOTOTOKSIČNOSTI 3T3 NRU IN VITRO 1. METODA 1. 1 Uvod Fototoksičnost je opredeljena kot toksična reakcija, ki nastane po prvotni izpostavljenosti kože nekaterim kemikalijam ter naknadni izpostavljenosti svetlobi, ali se podobno sproži z obsevanjem kože po sistemskem dajanju kemikalije. Informacije, pridobljene pri preskusu fototoksičnosti 3T3 NRU in vitro, se uporabljajo za ugotavljanje fototoksičnega potenciala preskušane snovi, tj. prisotnosti ali odsotnosti možnih nevarnosti, ki se lahko pojavijo zaradi preskušane snovi v povezavi z izpostavljenostjo UV in vidni svetlobi. Ker je končni toksikološki cilj preskusa in vitro določiti fotocitotoksičnost, ki jo sproži kombinirano delo- vanje kemikalije in svetlobe, je mogoče s preskusom ugotoviti tako spojine, ki so fototoksične in vivo po sistemskem dajanju in porazdelitvi po koži, kot spojine, ki delujejo kot fotoiritanti po površinskem nanosu na kožo. Preskus fototoksičnosti 3T3 NRU in vitro se je razvil in validiral v skupnem projektu EU/COLIPA v obdobju 1992-1997 (1) (2) (3) za pridobitev veljavne alternative in vitro raznim preskusom in vivo, ki so bili v uporabi. Leta 1996 je delavnica v okviru OECD priporočila stopenjski preskus in vitro za ocenjevanje fototoksičnosti (4). fototoksičnosti 3T3 NRU in vitro Rezultati preskusa akutnimi učinki fototoksičnosti/fotoiritacije in vivo pri živalih in ljudeh, in izkazalo se je, da preskus omogoča odlično napo- vedovanje teh učinkov. Preskus ni namenjen napovedovanju drugih škodljivih učinkov, ki lahko nastanejo zaradi kombiniranega delovanja kemikalije in svetlobe, npr. fotogenotoksičnosti, fotoalergenosti in fotorakotvornosti, čeprav bodo številne kemikalije, ki imajo takšne lastnosti, v preskusu fototoksičnosti 3T3 NRU in vitro reagirale pozitivno. Poleg tega preskus tudi ni namenjen ocenjevanju fototoksičnega poten- ciala. so se primerjali z Zaporedni pristop k preskušanju fototoksičnosti kemikalij je podrobno razložen v dodatku. 1. 2 Opredelitve Obsevanje: intenziteta ultravijolične (UV) ali vidne svetlobe, ki doseže površino, merjena v W/m2 Odmerek svetlobe: količina (= intenziteta × čas) ultravijoličnega (UV) ali vidnega sevanja, ki doseže površino, izražena v joulih (= W × s) na enoto površine, npr. J/m2 ali J/cm2 Valovni pasovi UV-svetlobe: oznake, ki jih priporoča CIE (Commission Internationale de L’Eclairage), so: UVA (315-400 nm), UVB (280-315 nm) in UVC (100-280 nm). Uporabljajo se tudi druge oznake: ločnica med UVB in UVA je pogosto pri 320 nm, UVA pa se lahko razdeli v UV-A1 in UV-A2, pri čemer je ločnica pri približno 340 nm. Viabilnost celic: parameter za merjenje celotne dejavnosti populacije celic (npr. sprejemanje vitalnega barvila nevtralno rdeče v celične lizosome), ki se glede na merjeni ciljni učinek in uporabljeni načrt preskusa ujema s skupnim številom in/ali vitalnostjo celic. Relativna viabilnost celic: viabilnost celic, izražena glede na negativne kontrole (topilo), ki potekajo ves čas preskusnega postopka (bodisi + UV bodisi – UV), vendar se ne obdelajo s preskušano kemikalijo. Model za napovedovanje: algoritem, ki se uporablja za pretvorbo rezultatov preskusa toksičnosti v napoved toksičnega potenciala. V pričujočem navodilu za preskus se lahko za pretvorbo rezultatov preskusa fototoksičnosti 3T3 NRU in vitro v napoved fototoksičnega potenciala uporabita PIF in MPE. PIF (faktor fotoiritacije): faktor, pridobljen s primerjanjem dveh enako učinkovitih citotoksičnih koncentracij (EC50) preskušane kemikalije, dobljenih v odsotnosti (– UV) in v prisotnosti (+ UV) necitotoksičnega obse- vanja z UVA/vidno svetlobo. MPE (srednji fotoučinek): novejša mera, izpeljana iz matematične analize celotne oblike krivulj reakcije na dve koncentraciji, pridobljenih v odsotnosti (– UV) in v prisotnosti (+ UV) necitotoksičnega obsevanja z UVA/vidno svetlobo. 13/Zv. 25 SL Uradni list Evropske unije 251 Fototoksičnost: akutna toksična reakcija, ki nastane po prvotni izpostavljenosti kože nekaterim kemikalijam in naknadni izpostavljenosti svetlobi, ali se podobno sproži z obsevanjem kože po sistemskem dajanju kemikalije. Fotoiritacija: podvrsta izraza ‚fototoksičnost‘, ki se uporablja le za opis tistih fototoksičnih reakcij, ki nasta- nejo na koži po izpostavljenosti kemikalijam (površinsko ali oralno). Te fototoksične reakcije vselej vodijo do nespecifičnih poškodb celic (reakcije, podobne sončnim opeklinam). Fotoalergenost: pridobljena imunološka reakcija, ki se ne pojavi pri prvi obdelavi s kemikalijo in svetlobo in pri kateri je potrebno indukcijsko obdobje enega tedna ali dveh, preden se pojavi reakcija kože. Fotogenotoksičnost: genotoksična reakcija, opažena pri genetskem končnem cilju, ki nastopi po izpostavlje- nosti celic negenotoksičnemu odmerku UV/vidne svetlobe in negenotoksični kemikaliji. Fotorakotvornost: rakotvornost, ki ko-karcinogeneza‘ se uporablja, če se tumorigeneza, inducirana z UV, poveča zaradi kemikalije. jo sproži ponovljena uporaba svetlobe in kemikalije. Izraz ‚foto 1. 3 Referenčne snovi Poleg kemikalije pozitivne kontrole klorpromazin, ki jo je treba hkrati preskušati v vsakem preskusu, se za novo vzpostavljeni preskus fototoksičnosti 3T3 NRU priporoča, da se kot referenčne kemikalije uporabljajo nekateri predstavniki kemikalij, uporabljenih v medlaboratorijskih preskušanjih pričujočega preskusa (1) (3) (13). 1. 4 Začetni preudarki Za več vrst kemikalij je bilo ugotovljeno, da sprožajo fototoksične učinke (5) (6) (7) (8). Njihova edina skupna lastnost je sposobnost, da v območju sončne svetlobe absorbirajo svetlobno energijo. Po prvem zakonu fotokemije (Grotthaus-Draperjev zakon) zahteva fotoreakcija zadostno absorpcijo svetlobnih kvantov. Zato je treba, še preden se začne razmišljati o biološkem preskušanju po pričujočih navodilih za preskus, določiti absorpcijski spekter UV/vidne svetlobe pri preskušani kemikaliji (npr. v skladu z Navodi- lom za preskušanje 101 OECD). Če je koeficient molarne ekstinkcije/absorpcije manjši od 10 litrov × mol- × cm-, kemikalija nima fotoreaktivnega potenciala in je ni treba preskušati niti v preskusu fototoksičnosti 3T3 NRU in vitro niti v katerem koli drugem biološkem preskusu škodljivih fotokemičnih učinkov (doda- tek). 1. 5 Načelo preskusne metode Ugotovljeni so bili štirje mehanizmi, pri katerih absorpcija svetlobe v (kemični) kromatofori lahko povzroči fototoksično reakcijo (7). Pri vseh pride do poškodbe celic. Zaradi tega temelji preskus fototoksičnosti 3T3 NRU in vitro na primerjavi citotoksičnosti kemikalije, kadar se preskuša v prisotnosti in v odsotnosti izpos- tavljenosti necitotoksičnemu odmerku UVA/vidne svetlobe. Citotoksičnost se v tem preskusu izraža kot od koncentracije odvisno zmanjšanje sprejemanja vitalnega barvila nevtralno rdeče (NR) (9) 24 ur po obdelovanju s preskusno kemikalijo in obsevanju. Celice stalne celične linije mišjih fibroblastov Balb/c 3T3 se kultivirajo 24 ur, da se oblikujejo enoslojne celične plasti. Dve 96-kanalni plošči na eno preskušano kemikalijo se nato eno uro predinkubirata z osmimi različnimi koncentracijami kemikalije. Nato se ena od obeh plošč izpostavi necitotoksičnemu odmerku UVA/vidne svetlobe v odmerku 5 J/cm2 UVA (poskus + UV), medtem ko druga plošča ostane v temi (poskus – UV). Na obeh ploščah se nato gojišče za obdelovanje nadomesti z gojiščem kulture, po nadaljnjih 24 urah inkubacije pa se 3 ure določa viabilnost celic s sprejemanjem nevtralne rdeče (NRU). Relativna viabilnost celic, izražena kot odstotek neobdelanih negativnih kontrol, se izračuna za vsako od osmih preskusnih kon- centracij. Za napoved fototoksičnega potenciala se reakcije na koncentracije, pridobljene v prisotnosti (+ UV) in v odsotnosti (– UV) obsevanja, med seboj primerjajo, običajno na ravni EC50, tj. pri koncentraciji, ki viabilnost celic v primerjavi z neobdelanimi kontrolami zmanjša za 50 %. 1. 6 Merila kakovosti Občutljivost celic na UVA, historični podatki: pri celicah je treba redno preverjati občutljivost na UVA. Celice se sprva zasejejo pri gostoti, uporabljeni v preskusu fototoksičnosti 3T3 NRU in vitro, naslednji dan se obsevajo z odmerki UVA od 1-9 J/cm2, nato pa se dan pozneje s pomočjo preskusa NRU določi viabilnost celic. Celice izpolnjujejo merila kakovosti, če njihova viabilnost po obsevanju s 5 J/cm2 UVA ni manjša od 80 % viabilnosti temnih kontrol. Pri najvišjem odmerku UVA v višini 9 J/cm2 viabilnost ne sme biti manjša od 50 % viabilnosti temnih kontrol. To preverjanje je treba ponoviti približno pri vsaki 10. pasaži celic. Občutljivost celic negativne kontrole na UVA, trenutni preskus: preskus izpolnjuje merila kakovosti, če negativne kontrole (celice v Earlovi uravnoteženi raztopini soli (EBSS) z 1 % dimetilsulfoksidom (DMSO) ali brez njega ali 1 % etanola (EtOH)) v poskusu + UVA pokažejo viabilnost, ki ni manjša od 80 % viabilnosti neobsevanih celic v istem topilu hkratnega temnega poskusa (– UVA). 252 SL Uradni list Evropske unije 13/Zv. 25 Viabilnost negativnih kontrol: absolutna optična gostota (OD540 NRU), merjena v ekstraktu NR negativnih kontrol, pokaže, ali so celice 1 × 104, zasejane na vsak posamezni kanal, v dveh dneh preskusa zrasle v obi- čajnem času podvajanja. Preskus izpolnjuje merila sprejemljivosti, če je srednja vrednost OD540 NRU neob- delanih kontrol ≥ 0,2. Pozitivna kontrola: skupaj z vsakim preskusom fototoksičnosti 3T3 NRU in vitro se obenem preskuša tudi znana fototoksična kemikalija. Klorpromazin (CPZ) se je kot pozitivna kontrola uporabil v validacijski štu- diji EU/COLIPA in se zato priporoča. Za CPZ, ki se je preskušal s standardnim protokolom v preskusu fototoksičnosti 3T3 NRU in vitro, so bila opredeljena naslednja merila sprejemljivosti: obsevani CPZ (+ UVA): EC50 = 0,1 do 2,0 μg/ml, neobsevani CPZ (– UVA): EC50 = 7,0 do 90,0 μg/ml. Faktor fotoiritacije (PIF), tj. premik EC50, mora biti najmanj 6. Namesto CPZ se lahko kot hkratna pozitivna kontrola uporabijo tudi druge znane fototoksične kemikalije, ki ustrezajo vrsti preskušane kemikalije, ki se vrednoti, ali njenim značilnostim glede topnosti. V tem pri- meru je treba na podlagi zgodovinskih podatkov območja vrednosti EC50 in PIF ali MPE (srednji fotoučinek) ustrezno opredeliti kot merila sprejemljivosti preskusa. 1. 7 Opis preskusne metode 1. 7. 1 Priprave 1. 7. 1. 1 C e l i c e Stalna celična linija mišjih fibroblastov — Balb/c 3T3, klon 31 — bodisi iz ATCC bodisi iz ECACC je bila uporabljena v validacijski študiji in je zato priporočljiva. Z istim preskusnim protokolom je mogoče uspešno uporabiti tudi druge celice ali celične linije, če so pogoji kulture prilagojeni specifičnim potrebam celic, vendar pa je treba dokazati enakovrednost. Celice je treba redno preverjati glede odsotnosti kontaminacije z mikoplazmo, uporabiti pa se smejo le, če so rezultati takšnih preverjanj zadovoljivi. Ker se občutljivost celic na UVA lahko poveča s številom pasaž, je treba uporabiti celice Balb/c 3T3 z naj- manjšim možnim številom pasaž, po možnosti nižjim od 100. Pomembno je, da se občutljivost celic Balb/c 3T3 na UVA redno preverja v skladu s postopkom kontrole kakovosti, opisanim v teh navodilih. 1. 7. 1. 2 G o j i š č e i n p o g o j i k u l t i v i r a n j a Tako za rutinske pasaže celic kot med samim preskusnim postopkom je treba uporabiti ustrezna gojišča kulture in ustrezne inkubacijske pogoje. Pri celicah Balb/c 3T3 je to DMEM z dodatkom 10 % seruma novorojenih telet, 4 mM glutamina, penicilina in streptomicina; ter vlažna inkubacija pri 37 °C/7,5 % CO2. Pri tem je še zlasti pomembno, da pogoji celične kulture zagotavljajo čas celičnega cikla v okviru običajnih historičnih meja uporabljenih celic ali celične linije. 1. 7. 1. 3 P r i p r a v a k u l t u r Celice iz zamrznjene zaloge kultur se v gojišče kulture zasejejo v ustrezni gostoti in se ponovno kultivirajo vsaj enkrat, preden se uporabijo v preskusu fototoksičnosti 3T3 NRU in vitro. Za preskus fototoksičnosti se celice v gojišče kulture zasejejo v takšni gostoti, da se kulture do konca pre- skusa ne bodo spojile, tj. ko se 48 ur po zasejanju celic določa viabilnost celic. Za celice Balb/c 3T3, ki se kultivirajo v 96-kanalnih ploščah, se priporoča gostota celic 1 × 104 celic na kanal. Za vsako preskušano kemikalijo se celice enako zasejejo v dve ločeni 96-kanalni plošči, ki gresta nato hkrati čez celotni preskusni postopek pod enakimi pogoji kultiviranja, razen časovnega obdobja, v katerem se ena plošča obseva (+ UVA/vidna svetloba), druga pa ostane v temi (– UVA/vidna svetloba). 1. 7. 1. 4 A k t i v a c i j a p r e s n o v e Medtem ko je uporaba presnovnih sistemov splošna zahteva za vse preskuse in vitro za napovedovanje genotoksičnega in karcinogenega potenciala, doslej v primeru fototoksikologije ni znana nobena kemikalija, za katero bi bila potrebna presnovna transformacija, da bi kemikalija učinkovala kot fototoksin in vivo ali in vitro. Zaradi tega ni niti potrebno niti znanstveno upravičeno, da se pričujoči preskus opravi s sistemom za aktivacijo presnove. 13/Zv. 25 SL Uradni list Evropske unije 253 1. 7. 1. 5 P r e s k u š a n a k e m i k a l i j a / p r i p r a v a Preskušane kemikalije je treba sveže pripraviti tik pred uporabo, razen če podatki o stabilnosti potrjujejo sprejemljivost hranjenja. Lahko se zahteva priprava pod rdečo lučjo, kadar je velika verjetnost hitre fotodegradacije. Preskušane kemikalije je treba raztopiti v puferskih raztopinah soli, npr. EBSS (Earlovi uravnoteženi razto- pini soli) ali fosfatpuferni raztopini soli (PBS), v katerih zato, da med obsevanjem ne pride do interference, ne sme biti proteinskih sestavin in pH indikatorskih barv, ki absorbirajo svetlobo. Preskušane kemikalije z omejeno topnostjo v vodi je treba v ustreznih topilih raztopiti v koncentraciji, enaki 100-kratni želeni končni koncentraciji, in jih nato razredčiti v razmerju 1: 100 s pufersko raztopino soli. Če se uporabi topilo, mora imeti stalni volumen 1 % (vol. /vol. ) v vseh kulturah, tj. v negativnih kontrolah in v vseh koncentracijah preskušane kemikalije. Priporočeni topili sta dimetilsulfoksid (DMSO) in etanol (EtOH). Druga topila z nizko citotoksičnostjo (npr. aceton) so sicer lahko ustrezna, vendar je treba pri njih skrbno preveriti specifične lastnosti, npr. reagiranje s preskušano kemikalijo, izničenje fototoksičnega učinka, lovljenje radikalov. Za boljšo topnost se lahko po potrebi uporabi vrtinčno mešanje in/ali uporaba ultrazvoka in/ali segrevanje na 37 °C. 1. 7. 1. 6 UV obsevanje/priprava Vir svetlobe: izbira primernega vira svetlobe in ustreznega filtra je ključni dejavnik pri preskušanju fototoksičnosti. UVA in vidna območja so navadno povezana z nastankom preobčutljivosti na svetlobo (fotosenzitizacijo) (7) (10), medtem ko je UVB manj pomemben in je sam neposredno močno citotoksičen, saj svojo citotoksičnost med 313 in 280 nm poviša tisočkrat (11). Merila za izbiro ustreznega vira svetlobe morajo vključevati bistveno zahtevo, da vir svetlobe oddaja valovne dolžine, ki jih preskušana kemikalija absorbira, ter da mora odmerek svetlobe (ki ga je mogoče doseči v razumnem času) zadostovati za odkri- vanje znanih fotosenzitizatorjev. Nadalje uporabljene valovne dolžine in odmerki ne smejo po nepotreb- nem škodovati preskusnemu sistemu, pri čemer je vključeno oddajanje toplote (infrardeče območje). Simulacija sončne svetlobe s solarnimi simulatorji velja za optimalni vir svetlobe. V solarnih simulatorjih se uporabljajo tako ksenonove obločne svetilke kakor (dopirane) živosrebrove kovinske halogenidne obločne svetilke. Slednje imajo to prednost, da oddajajo manj toplote in da so cenejše, vendar ujemanje s sončno svetlobo ni popolno. Ker vsi solarni simulatorji oddajajo precejšnje količine UVB, jih je treba ustrezno filtrirati, da se oslabijo močno citotoksične valovne dolžine UVB. Za preskus fototoksičnosti 3T3 NRU in vitro je treba uporabiti sevalni spekter, v katerem praktično ni UVB (UVA:UVB ˜ 1:20). Primer spektralne razdelitve filtriranega solarnega simulatorja, uporabljenega v validacijski študiji preskusa fototoksičnosti 3T3 NRU in vitro, je bil objavljen (3). Dozimetrija: pred vsakim preskusom fototoksičnosti je treba redno preverjati intenzivnost svetlobe (obse- vanja), in sicer z uporabo primernega širokospektralnega UV-metra. UV-meter je treba predhodno kalibrirati za vir svetlobe. Preveriti je treba delovanje UV-metra in v ta namen se priporoča uporaba drugega, refe- renčnega UV-metra iste vrste in iste umeritve. Idealno je treba pri večjih intervalih uporabiti spektroradiometer, da se meri spektralno sevanje filtriranega vira svetlobe in preveri kalibracija širokospektralnega UV-metra, vendar pa mora takšne instrumente vešče upravljati ustrezno usposobljeno osebje. V validacijski študiji je bilo ugotovljeno, da odmerek v višini 5 J/cm2 (UVA) ni citotoksičen za celice Balb/c 3T3 in da je dovolj močan, da sam zazna celo šibko fototoksične kemikalije. Da se doseže 5 J/cm2 v 50 minutah, mora biti sevanje nastavljeno na 1,666 mW/cm2. Če se uporabi druga celična linija ali dru- gačen vir svetlobe, je morda potrebna rahla prilagoditev odmerka UVA, in sicer je merilo neškodljivost za celice in zadostna moč za zaznavanje standardnih fototoksinov. Čas izpostavljenosti svetlobi se izračuna takole: 1. 7. 2 Preskusni pogoji Maksimalna koncentracija preskušane kemikalije ne sme preseči 100 μg/ml, saj so bile vse fototoksične kemikalije ugotovljene pri nižjih koncentracijah, pri višjih koncentracijah pa se pojavnost napačno pozi- tivnih vrednosti poveča (13). Vrednost pH najvišje koncentracije preskušane kemikalije mora biti zadovo- ljiva (območje pH: 6,5-7,8). 254 SL Uradni list Evropske unije 13/Zv. 25 Razpon koncentracij kemikalije, ki se preskuša v prisotnosti (+ UVA) in v odsotnosti (– UVA) svetlobe, je treba ustrezno določiti v predhodnih poskusih za ugotavljanje razpona. Razpon in razmak serije koncen- tracij se prilagodita tako, da podatki iz poskusov v zadostni meri podpirajo krivulje koncentracija-reakcija. Uporabiti je treba geometrične serije koncentracij (s konstantnim faktorjem razredčevanja). 1. 7. 3 Preskusni postopek (1) 1. 7. 3. 1 P r v i da n Pripraviti celično suspenzijo v vrednosti 1 × 1055 celic/ml v gojišču kulture, samo 100 μl gojišča kulture pa razdeliti v stranske kanale ene 96-kanalne mikrotiterske plošče za tkivne kulture (= slepi vzorci). V pre- ostale kanale razdeliti 100 μl celične suspenzije z 1 × 105 celicami/ml (= 1 × 104 celic/kanal). Za vsako pre- skušano kemikalijo pripraviti dve plošči: eno za ugotavljanje citotoksičnosti (– UVA), drugo pa za določa- nje fotocitotoksičnosti (+ UVA). Celice inkubirati 24 ur (7,5 % CO2, 37 °C), dokler ne oblikujejo na pol strnjene enojne plasti. S takšnim inkubacijskim časom se zagotovijo okrevanje celic, pritrjevanje in eksponentna rast. 1. 7. 3. 2 Drugi dan Po inkubaciji odcediti gojišče kulture s celic in jih dvakrat sprati s 150 μl EBSS/PBS na kanal. Dodati 100 μl EBSS/PBS, ki vsebuje ustrezno koncentracijo preskušane kemikalije ali zgolj topila (negativna kontrola). Uporabiti 8 različnih koncentracij preskušane kemikalije. Celice s preskušano kemikalijo v temi inkubirati 60 minut (7,5 % CO2, 37 °C). Za izvedbo (+ UVA) dela preskusa celice pri sobni temperaturi obsevati 50 minut prek pokrova 96-kanalne plošče z 1,7 mW/cm2 UVA (= 5 J/cm2. Zračiti z ventilatorjem, da se prepreči kondenzacija H2O pod pokro- vom. Dvojnike plošč (– UVA) zadržati pri sobni temperaturi 50 minut v temni škatli (= čas izpostavljenosti UVA). Odcediti preskusno tekočino in dvakrat sprati s 150 μl EBSS/PBS. Zamenjati EBSS/PBS z gojiščem kulture in inkubirati (7,5 % CO2, 37 °C) čez noč (18-22 ur). 1. 7. 3. 3 T r e t j i d a n Mikroskopsko vrednotenje Celice preučiti pod fazno-kontrastnim mikroskopom. Zabeležiti morfološke spremembe celic zaradi citotoksičnega učinkovanja preskušane kemikalije. To preverjanje je priporočljivo zaradi izključevanja napak pri preskusu, vendar se te zabeležke ne uporabijo za vrednotenje citotoksičnosti ali fototoksičnosti. Preskus sprejemanja nevtralne rdeče Celice sprati s 150 μl predhodno segretega EBSS/PBS. Raztopino za spiranje odstraniti z rahlim stresanjem. Dodati 100 μl gojišča NR in 3 ure inkubirati pri 37 °C v vlažnem ozračju s 7,5 % CO2. Po inkubaciji odstraniti gojišče NR in celice sprati s 150 μl EBSS/PBS. Odcediti in v celoti popivnati EBSS/PBS. (Izbirno: centrifugirati obrnjeno ploščo. ) Dodati natančno 150 μl raztopine za desorpcijo NR (sveže pripravljen etanol/ocetna kislina) Deset minut hitro stresati mikrotitersko ploščo na stresalniku za mikrotiterske plošče, dokler se NR ne eks- trahira iz celic in tvori homogeno raztopino. Optično gostoto ekstrakta NR izmeriti pri 540 nm v spektrofotometru, slepe vzorce uporabiti kot refe- rence. Podatke shraniti v ustreznem datotečnem formatu (npr. ASCII) za naknadno analizo. (1) Dodatne podrobnosti so v literaturi pod navedbo 12. “ 13/Zv. 25 SL Uradni list Evropske unije 255 2. 2. 1 PODATKI Kakovost in količina podatkov Podatki naj omogočajo smiselno analizo povezave koncentracija-reakcija, pridobljene v prisotnosti in v odsotnosti obsevanja z UVA/vidno svetlobo. Če se ugotovi citotoksičnost, je treba tako razpon koncentra- cij kakor razmak med posameznimi koncentracijami izbrati tako, da je poskusne podatke mogoče pred- staviti v obliki krivulje. Glede na dejstvo, da preskušana kemikalija morebiti ni citotoksična do določene mejne koncentracije v višini 100 μg/ml v temnem poskusu (– UVA), vendar je zelo citotoksična pri obsevanju (+ UVA), se bodo razponi koncentracij, namenjeni preskušanju v obeh delih poskusa, po veli- kosti morda morali razlikovati, da bo izpolnjena zahteva glede ustrezne kakovosti podatkov. Če se v nobe- nem od obeh delov preskusa (– UVA in + UVA) ne ugotovi citotoksičnost, zadostuje preskušanje z velikim razmakom med posameznimi odmerki do najvišje koncentracije. Jasno pozitivnega rezultata ni treba potrditi s ponovitvijo poskusa. Poleg tega tudi ni treba potrditi jasno negativnih rezultatov, pod pogojem da je bila preskušana kemikalija preskušena pri dovolj visokih kon- centracijah. V takšnih primerih zadostuje en glavni poskus, podprt z enim predhodnim poskusom ali več za ugotavljanje razpona. Preskuse z mejnimi rezultati blizu mejne črte modela za napovedovanje je treba za potrditev ponoviti. Če je ponovitev preskusa potrebna, je za doseganje jasnega rezultata morda treba spremeniti preskusne pogoje. Ključna spremenljivka tega preskusa je priprava raztopin preskušane kemikalije. Zaradi tega je spreminjanje pogojev (sotopilo, zmletje, uporaba ultrazvoka) morda najbolj primerno pri ponovitvi pre- skusa. Kot o alternativi se lahko razmisli tudi o spreminjanju inkubacijskega časa pred obsevanjem. Za kemikalije, ki so v vodi nestabilne, je lahko ustrezen krajši čas. 2. 2 Obdelava rezultatov Kadar je mogoče, se določi koncentracija preskušane kemikalije, ki izraža 50 % inhibicijo celičnega NRU (EC50). To je mogoče izvesti z uporabo katerega koli ustreznega nelinearnega regresivnega postopka (naj- bolje funkcije Hill ali logistične regresije) na podatkih koncentracija-reakcija ali z uporabo drugih postop- kov prilagajanja krivulje (14). Preden se vrednost EC50 uporabi za nadaljnje izračune, je treba ustrezno pre- veriti kakovost prilagoditve krivulje. Kot alternativa se lahko za izračun vrednosti EC50 uporabijo grafične metode prilagajanja krivulje. V takšnem primeru je priporočljiva uporaba verjetnostne mreže (os x: log, os y: probit), saj bo funkcija koncentracija-reakcija po tej transformaciji v številnih primerih postala skoraj linearna. 2. 3 Vrednotenje rezultatov (modeli za napovedovanje) 2. 3. 1 Model za napovedovanje — 1. različica: faktor fotoiritacije (PIF) Če se pridobita obe popolni krivulji koncentracija-reakcija (v prisotnosti (+ UVA) in v odsotnosti (– UVA) svetlobe), se faktor fotoiritacije (PIF) izračuna z uporabo naslednje formule: (a) PIF < 5 ne napove nobenega fototoksičnega potenciala, medtem ko PIF ≥ 5 napove fototoksični potencial. Če je kemikalija citotoksična le pri + UVA in ni citotoksična pri preskušanju – UVA, se PIF ne da izračunati, čeprav je to rezultat, ki kaže na fototoksični potencial. V takšnih primerih se ‚> PIF‘ lahko izračuna, če je (– UV) preskus citotoksičnosti izveden do najvišje preskusne koncentracije (Cmax) in se ta vrednost uporabi za izračun ‚> PIF‘; (b) Če je mogoče pridobiti le ‚> PIF‘, potem katera koli vrednost > 1 napove fototoksični potencial. Če se ne moreta izračunati niti EC50 (– UV) niti EC50 (+ UV) zaradi tega, ker kemikalija ne kaže citotoksičnosti do najvišje preskusne koncentracije, to ne nakazuje fototoksičnega potenciala. V takšnih pri- merih se za karakterizacijo rezultata uporabi formalni ‚PIF = *1‘; 256 SL Uradni list Evropske unije 13/Zv. 25 (c) Če je mogoče pridobiti le ‚PIF = *1‘, to ne napove fototoksičnega potenciala. V primerih (b) in (c) je treba pri napovedovanju fototoksičnega potenciala skrbno upoštevati koncentracije, dosežene pri preskusu fototoksičnosti 3T3 NRU in vitro. 2. 3. 2 Model za napovedovanje — 2. različica: srednji fotoučinek (MPE) Kot alternativo je mogoče uporabiti novejšo različico modela za napovedovanje fototoksičnega potenciala, ki se je razvil z uporabo podatkov validacijske študije EU/COLIPA (15) in preskusil pod slepimi pogoji v nadaljnji študiji fototoksičnosti kemikalij in vitro, ki se uporabljajo kot UV-filter (13). Ta model zaobide ome- jitve modela PIF, kadar vrednosti EC50 ni mogoče pridobiti. Model uporablja ‚srednji fotoučinek‘ (MPE), mero, ki temelji na primerjavi celotnih krivulj koncentracija-reakcija. Za uporabo modela MPE so na Uni- verzi Humboldt (Berlin) razvili posebno računalniško programsko opremo, ki je na voljo brezplačno. 2. 4 Razlaga rezultatov Pozitivni rezultat v preskusu fototoksičnosti 3T3 NRU (PIF ≥ 5 ali MPE ≥ 0,1) in vitro kaže, da ima preskušana snov fototoksični potencial. Če se takšen rezultat pridobi pri koncentracijah pod 10 μg/ml, je verjetno, da preskušana kemikalija učinkuje fototoksično tudi pod različnimi pogoji izpostavljenosti in vivo. Če je pozitivni rezultat pridobljen le pri najvišji preskusni koncentraciji 100 μg/ml, je morda potreben nadaljnji razmislek o oceni nevarnosti ali fototoksičnega potenciala. Ta lahko zajema podatke o penetraciji, absorp- ciji in možni akumulaciji kemikalije v koži ali preskušanju kemikalije v potrdilnem alternativnem preskusu, denimo pri preskusu in vitro z modelom človeške kože. Negativni rezultat iz preskusa fototoksičnosti 3T3 NRU (PIF < 5 ali MPE < 0,1) in vitro kaže, da pod upo- rabljenimi pogoji preskušana snov ni bila fototoksična za kultivirane celice sesalcev. V primerih, v katerih je kemikalijo mogoče preskušati do najvišje koncentracije 100 μg/ml, negativni rezultat kaže, da kemikalija nima fototoksičnega potenciala, fototoksičnost in vivo pa je malo verjetna. V primerih, v katerih so bile iden- tične vrednosti koncentracija-toksična reakcija (EC50 + UV in EC50 – UV) pridobljene pri nižjih koncentra- cijah, bi bila interpretacija podatkov enaka. Kadar pa nasprotno toksičnost ni bila ugotovljena (+ UV in – UV) in če je topnost v vodi omejila koncentracije na vrednosti pod 100 μg/ml, je združljivost preskušane snovi s preskusom vprašljiva, in je treba razmisliti o potrjevalnem preskusu (npr. z uporabo modela kože in vitro ali modela kože ex vivo ali preskusa in vivo). 3. POROČANJE Poročilo o preskusu Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije: Preskušana kemikalija: — identifikacijski podatki in št. CAS, če je znano, — fizikalne lastnosti in čistota, — fizikalno-kemijske lastnosti, pomembne za izvedbo študije, — stabilnost in fotostabilnost, če sta znani. Topilo: — utemeljitev izbire topila, — topnost preskušane kemikalije v tem topilu, — odstotek topila v obdelovalnem mediju (EBSS ali PBS). Celice: — vrsta in izvor celic, — odsotnost mikoplazme, — število celičnih pasaž, če je znano, — občutljivost celic na UVA, določena z obsevalno opremo, ki se uporablja pri preskusu fototoksičnosti 3T3 NRU in vitro. Preskusni pogoji (a) — inkubacija pred obdelavo in po njej: — vrsta in sestava gojišča kulture, — pogoji inkubacije (koncentracija CO2, temperatura, vlažnost), — trajanje inkubacije (predhodna obdelava, naknadna obdelava). 13/Zv. 25 SL Uradni list Evropske unije 257 Preskusni pogoji (b) — obdelava s kemikalijo: — utemeljitev izbire koncentracij preskušane kemikalije, uporabljenih tako v prisotnosti kot v odsotnosti obsevanja z UV/vidno svetlobo, — pri omejeni topnosti preskušane kemikalije in odsotnosti citotoksičnosti utemeljitev najvišje presku- šane koncentracije, — vrsta in sestava obdelovalnega gojišča (puferska raztopina soli), — trajanje kemičnega obdelovanja. Preskusni pogoji (c) — obsevanje: — utemeljitev izbora uporabljenega vira svetlobe, — spektralne značilnosti sevanja vira svetlobe, — značilnosti prepuščanja/absorpcije uporabljenega filtra(-ov), — značilnosti radiometra in podatki o njegovi kalibraciji, — oddaljenost vira svetlobe od preskusnega sistema, — UVA-obsevanje s te razdalje, izraženo v mW/cm2, — trajanje izpostavljenosti UV/vidni svetlobi, — odmerek UVA (obsevanje × čas), izražen v J/cm2, — temperatura celičnih kultur med obsevanjem in celičnih kultur, ki so bile istočasno v temi. Preskusni pogoji (d) — preskus NRU: — sestava gojišča NR, — trajanje inkubacije NR, — pogoji inkubacije (koncentracija CO2, temperatura, vlažnost), — pogoji ekstrakcije NR (ekstrakcijsko sredstvo, trajanje), — valovna dolžina, uporabljena za spektrofotometrično merjenje optične gostote NR, — druga valovna dolžina (referenca), če je bila uporabljena, — vsebina spektrofotometričnega slepega vzorca, če je bil uporabljen. Rezultati: — viabilnost celic, pridobljena pri vsaki posamezni koncentraciji preskušane kemikalije, izražena kot odstotek srednje viabilnosti kontrol, — krivulje koncentracija-reakcija (koncentracija preskušane kemikalije proti relativni viabilnosti celic), pri- dobljene v hkratnih poskusih + UVA in — UVA, — analiza podatkov o krivuljah koncentracija-reakcija: če je mogoče, navedba/izračun EC50 (+ UVA) in EC50 (– UVA), — primerjava dveh krivulj koncentracija-reakcija, pridobljenih v prisotnosti in odsotnosti obsevanja UVA/vidne svetlobe, in sicer bodisi z izračunom faktorja fotoiritacije (PIF) ali z izračunom srednjega fotoučinka (MPE), — razvrstitev fototoksičnega potenciala, — merila za sprejemljivost preskusa (a) — hkratna negativna kontrola: — absolutna viabilnost (optična gostota ekstrakta NR) obsevanih in neobsevanih celic, — historični podatki o negativnih kontrolah, srednja in standardna deviacija. — merila za sprejemljivost preskusa (b) — hkratna pozitivna kontrola: — EC50 (+ UVA) in EC50 (– UVA) in PIF kemikalije pozitivne kontrole, — historični podatki o kemikaliji pozitivne kontrole: EC50 (+ UVA) in EC50 (– UVA) in PIF, srednja in standardna deviacija. Razprava o rezultatih. Zaključki. 258 SL Uradni list Evropske unije 13/Zv. 25 4. LITERATURA (1) Spielmann, H. , Balls, M. , Döring, B. , Holzhütter, H. G. , Kalweit, S. , Klecak, G. , L’Eplattenier, H. , Liebsch, M. , Lovell, W. W. , Maurer, T. , Moldenhauer, F. , Moore, L. , Pape, W. , Pfannbecker, U. , Potthast, J. , De Silva, O. , Steiling, W. and Willshaw, A. (1994), EEC/COLIPA project on in vitro phototoxicity testing: First results obtained with a Balb/c 3T3 cell phototoxicity assay, Toxicology in Vitro 8, str. 793-796. (2) Anon (1998), Statement on the scientific validity of the 3T3 NRU PT test (an in vitro test for phototoxicity), European Commission, Joint Research Centre: ECVAM and DGXI/E/2, 3 November 1997, ATLA 26, str. 7-8. (3) Spielmann, H. , Balls, M. , Dupuis, J. , Pape, W. J. W. , Pechovitch, G. , De Silva, O. , Holzhütter, H. G. , Clothier, R. , Desolle, P. , Gerberick, F. , Liebsch, M. , Lovell, W. W. , Maurer, T. , Pfannenbecker, U. , Potthast, J. M. , Csato, M. , Sladowski, D. , Steiling, W. and Brantom, P. (1998), EU/COLIPA In vitro phototoxicity ‚validation study, results of phase II (blind trial), part 1: the 3T3 NRU phototoxicity test, Toxicology in Vitro 12, str. 305-327. ‘ (4) OECD Test Guidelines Programme, ENV/MC/CHEM/TG(96)9: Final Report of the OECD Workshop on Harmonisation of Validation and Acceptance Criteria of Alternative Toxicological Test Methods, OECD Publications Office, Pariz, 1996. (5) (6) (7) Lovell, W. W. (1993), A scheme for in vitro screening of substances for photoallergenic potential, Toxicology in Vitro 7, str. 95-102. Santamaria, L. and Prino, G. (1972), List of the photodynamic substances, Research progress in organic, biological and medicinal chemistry Vol. 3 Part 1, North Holland Publishing Co, Amsterdam, str. XI-XXXV. Spielmann, H. , Lovell, W. W. , Hölzle, E. , Johnson, B. E. , Maurer, T. , Miranda, M. A. , Pape, W. J. W. , Sapora, O. and Sladowski, D. (1994), In vitro phototoxicity testing: The report and recommendations of ECVAM workshop 2, ATLA 22, str. 314-348. (8) Spikes, J. D. (1989), Photosensitization, The science of photobiology, edited by KC Smith, Plenum Press, New York, 2nd edition, str. 79-110. (9) Borenfreund, E. and Puerner, J. A. (1985), Toxicity determination in vitro by morphological alterations and neutral red absorption, Toxicology Letters 24, str. 119-124. (10) Lambert L. A, Warner W. G. and Kornhauser A. (1996), Animal models for phototoxicity testing, Dermatotoxicology, edited by FN Marzulli and HI Maibach, published by Taylor & Francis, Washington DC, 5th Edition, str. 515-530. (11) Tyrrell R. M. and Pidoux M (1987), Action spectra for human skin cells: estimates of the relative cytotoxicity of the middle ultraviolet, near ultraviolet and violet regions of sunlight on epidermal keratinocytes, Cancer Research 47, str. 1825-1829. (12) ZEBET/ECVAM/COLIPA, Standard Operating Procedure: Balb/c 3T3 NRU Phototoxicity Test, drafted 23 December 1997 by M. Liebsch and approved 6 March 1998 by the Management Team of the EU/COLIPA project ‚In Vitro Photoirritation‘. (13) Spielmann, H. , Balls, M. , Dupuis, J. , Pape, W. J. W. , De Silva, O. , Holzhütter, H. G. , Gerberick, F. , Liebsch, M. , Lovell, W. W. and Pfannenbecker (1998), A Study on the Phototoxic Potential of UV Filter Chemicals from Annex VII of the EU Directive 76/768/EEC in the 3T3 NRU In Vitro Phototoxicity Test, ATLA 26, str. 679-708. (14) Holzhütter, H. G. and Quedenau, J. (1995), Mathematical modelling of cellular responses to external signals, Journal of Biological Systems 3, str. 127-138. (15) Holzhütter, H. G. (1997), A general measure of in vitro phototoxicity derived from pairs of dose- response curves and its use for predicting the in vivo phototoxicity of chemicals, ATLA 25, str. 445- 462. 13/Zv. 25 SL Uradni list Evropske unije 259 Dodatek


title: Κανονισμός (ΕΚ) αριθ. 828/2000 της Επιτροπής, της 25ης Απριλίου 2000, για τροποποίηση των επιστροφών κατά την εξαγωγή στον τομέα του κρέατος πουλερικών

eurovoc_concepts:
export refund
poultrymeat

formats: pdf print

text: L 101/24 EL Επίσηµη Εφηµερίδα των Ευρωπαϊκών Κοινοτήτων 26. 4. 2000 ΚΑΝΟΝΙΣΜΟΣ (ΕΚ) αριθ. 828/2000 ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ της 25ης Απριλίου 2000 για τροποποίηση των επιστροφών κατά την εξαγωγή στον τοµέα του κρέατος πουλερικών Η ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΤΩΝ ΕΥΡΩΠΑΪΚΩΝ ΚΟΙΝΟΤΗΤΩΝ, Έχοντας υπόψη: τη συνθήκη για την ίδρυση της Ευρωπαϊκής Κοινότητας, τον κανονισµό (ΕΟΚ) αριθ. 2777/75 του Συµβουλίου, της 29ης Οκτωβρίου 1975, περί κοινής οργανώσεως της αγοράς στον τοµέα του κρέατος πουλερικών (1), όπως τροποποιήθηκε τελευταία από τον κανονισµό (ΕΚ) αριθ. 2916/95 της Επιτροπής (2), και ιδίως το άρθρο 8 παράγραφος 3, Εκτιµώντας τα ακόλουθα: (1) (2) Οι επιστροφές που εφαρµόζονται στον τοµέα του κρέατος των πουλερικών έχουν καθοριστεί από τον κανονισµό (ΕΚ) αριθ. 553/2000 της Επιτροπής (3). Η εφαρµογή των κριτηρίων των αναφεροµένων στο άρθρο 8 του κανονισµού (ΕΟΚ) αριθ. 2777/75 στα στοιχεία των οποίων έλαβε γνώση η Επιτροπή, οδηγεί στην τροποποίηση των επιστροφών κατά την εξαγωγή, που ισχύουν επί του παρόντος, σύµφωνα µε το παράρτηµα του παρόντος κανονι- σµού, ΕΞΕ∆ΩΣΕ ΤΟΝ ΠΑΡΟΝΤΑ ΚΑΝΟΝΙΣΜΟ: Άρθρο 1 Οι επιστροφές κατά την εξαγωγή των αναφερόµενων στο άρθρο 1 παράγραφος 1 του κανονισµού (ΕΟΚ) αριθ. 2777/75 προϊόντων, οι οποίες καθορίζονται στο παράρτηµα του τροποποιηµένου κανο- νισµού (ΕΚ) αριθ. 553/2000 τροποποιούνται σύµφωνα µε τα ποσά που ορίζονται στο παράρτηµα του παρόντος κανονισµού. Ο παρών κανονισµός αρχίζει να ισχύει στις 26 Απριλίου 2000. Άρθρο 2 Ο παρών κανονισµός είναι δεσµευτικός ως προς όλα τα µέρη του και ισχύει άµεσα σε κάθε κράτος µέλος. Βρυξέλλες, 25 Απριλίου 2000. Για την Επιτροπή Franz FISCHLER Μέλος της Επιτροπής (1) ΕΕ L 282 της 1. 11. 1975, σ. 77. (2) ΕΕ L 305 της 19. 12. 1995, σ. 49. (3) ΕΕ L 67 της 15. 3. 2000, σ. 32. 26. 4. 2000 EL Επίσηµη Εφηµερίδα των Ευρωπαϊκών Κοινοτήτων L 101/25 του κανονισµού της Επιτροπής, της 25ης Απριλίου 2000, για τροποποίηση των επιστροφών κατά την εξαγωγή στον τοµέα του κρέατος πουλερικών ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Κωδικός προϊόντος Προορισµός των επιστροφών (1) 0207 12 10 9900 0207 12 90 9190 0207 12 90 9990 (1) Προορισµοί: 02 03 02 03 02 03 Ποσό των επιστροφών EUR/100 kg 28,00 25,00 28,00 25,00 28,00 25,00 Ιράν, 02 Αγκόλα, Σαουδική Αραβία, Κουβέιτ, Μπαχρέιν, Κατάρ, Οµάν, Ενωµένα Αραβικά Εµιράτα, 03 Αρµενία, Αζερµπαϊτζάν, Λευκορωσία, Γεωργία, Καζακστάν, Κιργιζία, Μολδαβία, Ρωσία, Τατζικιστάν, Τουρκµενιστάν, Ουζµπεκιστάν και Ιορδανία, Υεµένη, Λίβανος, Ιράκ και Ουκρανία. NB: Οι κωδικοί των προϊόντων, συµπεριλαµβανοµένων των υποσηµειώσεων, καθορίζονται στον τροποποιηµένο κανονισµό (ΕΟΚ) αριθ. 3846/87 της Επιτροπής


title: Κανονισμός (EK) αριθ. 825/2000 της Επιτροπής της 25ης Απριλίου 2000 για καθορισμό των κατ' αποκοπή τιμών κατά την εισαγωγή για τον καθορισμό της τιμής εισόδου ορισμένων οπωροκηπευτικών

eurovoc_concepts:
agri-monetary policy
citrus fruit
fruit vegetable
import price
pip fruit

text: 26. 4. 2000 EL Επίσηµη Εφηµερίδα των Ευρωπαϊκών Κοινοτήτων L 101/1 I (Πράξεις για την ισχύ των οποίων απαιτείται δηµοσίευση) ΚΑΝΟΝΙΣΜΟΣ (EK) αριθ. 825/2000 ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ της 25ης Απριλίου 2000 για καθορισµό των κατ’ αποκοπή τιµών κατά την εισαγωγή για τον καθορισµό της τιµής εισόδου ορισµένων οπωροκηπευτικών Η ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΤΩΝ ΕΥΡΩΠΑΪΚΩΝ ΚΟΙΝΟΤΗΤΩΝ, Έχοντας υπόψη: τη συνθήκη για την ίδρυση της Ευρωπαϊκής Κοινότητας, τον κανονισµό (ΕΚ) αριθ. 3223/94 της Επιτροπής, της 21ης ∆εκεµ- βρίου 1994, σχετικά µε τις λεπτοµέρειες εφαρµογής του καθεστώ- τος κατά την εισαγωγή οπωροκηπευτικών (1), όπως τροποποιήθηκε τελευταία από τον κανονισµό (EK) αριθ. 1498/98 (2), και ιδίως το άρθρο 4 παράγραφος 1, Εκτιµώντας τα ακόλουθα: (1) Ο κανονισµός (EK) αριθ. 3223/94, σε εφαρµογή των αποτε- λεσµάτων των πολυµερών εµπορικών διαπραγµατεύσεων του Γύρου της Ουρουγουάης, προβλέπει τα κριτήρια για τον καθορισµό από την Επιτροπή των κατ’ αποκοπή τιµών κατά την εισαγωγή από τρίτες χώρες, για τα προϊόντα και τις περιόδους που ορίζονται στο παράρτηµά του. (2) Σε εφαρµογή των προαναφερθέντων κριτηρίων, οι κατ’ απο- κοπή τιµές κατά την εισαγωγή πρέπει να καθοριστούν, όπως αναγράφονται στο παράρτηµα του παρόντος κανονισµού, ΕΞΕ∆ΩΣΕ ΤΟΝ ΠΑΡΟΝΤΑ ΚΑΝΟΝΙΣΜΟ: Άρθρο 1 Οι κατ’ αποκοπή τιµές κατά την εισαγωγή που αναφέρονται στο άρθρο 4 του κανονισµού (EK) αριθ. 3223/94 καθορίζονται όπως αναγράφονται στον πίνακα που εµφαίνεται στο παράρτηµα. Ο παρών κανονισµός αρχίζει να ισχύει στις 26 Απριλίου 2000. Άρθρο 2 Ο παρών κανονισµός είναι δεσµευτικός ως προς όλα τα µέρη του και ισχύει άµεσα σε κάθε κράτος µέλος. Βρυξέλλες, 25 Απριλίου 2000. Για την Επιτροπή Franz FISCHLER Μέλος της Επιτροπής (1) EE L 337 της 24. 12. 1994, σ. 66. (2) EE L 198 της 15. 7. 1998, σ. 4. L 101/2 EL Επίσηµη Εφηµερίδα των Ευρωπαϊκών Κοινοτήτων 26. 4. 2000 του κανονισµού της Επιτροπής, της 25ης Απριλίου 2000, για τον καθορισµό των κατ’ αποκοπή τιµών κατά την εισαγωγή για τον καθορισµό τιµών εισόδου ορισµένων οπωροκηπευτικών ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Κωδικός ΣΟ Κωδικός τρίτης χώρας (1) (σε EUR/100 χιλιόγραµµα) Κατ’ αποκοπή τιµή κατά την εισαγωγή 0702 00 00 0707 00 05 0709 90 70 0805 10 10, 0805 10 30, 0805 10 50 0808 10 20, 0808 10 50, 0808 10 90 0808 20 50 052 068 204 999 052 068 999 052 999 052 204 212 624 999 388 400 404 508 512 528 720 804 999 388 512 528 720 999 126,1 107,3 80,2 104,5 104,5 66,8 85,7 77,3 77,3 82,1 38,0 44,8 48,3 53,3 94,1 97,0 94,3 88,9 90,8 84,3 105,0 99,0 94,2 72,2 77,8 78,9 59,5 72,1 (1) Ονοµατολογία των χωρών που καθορίζεται από τον κανονισµό (ΕΚ) αριθ. 2543/1999 της Επιτροπής (ΕΕ L 307 της 2. 12. 1999, σ. 46). Ο κωδικός «999» αντιπροσωπεύει «άλλες καταγωγές»


title: Directiva 2000/21/CE da Comissão, de 25 de Abril de 2000, relativa à lista dos actos legislativos comunitários mencionada no n.o 1, quinto travessão, do artigo 13.o da Directiva 67/548/CEE do Conselho (Texto relevante para efeitos do EEE)

eurovoc_concepts:
application of EU law
dangerous substance
exchange of information
labelling
marketing
national implementing measure

formats: html pdf print

text: L 103/70 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias 28. 4. 2000 DIRECTIVA 2000/21/CE DA COMISSÃO de 25 de Abril de 2000 relativa à lista dos actos legislativos comunitários mencionada no n. o 1, quinto travessão, do artigo 13. o da Directiva 67/548/CEE do Conselho (Texto relevante para efeitos do EEE) A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS, (3) Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Europeia, Tendo em conta a Directiva 67/548/CEE do Conselho, de 27 de Junho de 1967, relativa à aproximação das disposições legislativas, regulamentares e administrativas respeitantes à clas- sificação, embalagem e rotulagem das substâncias perigosas (1), com a última redacção que lhe foi dada pela Directiva 1999/ /33/CE do Parlamento Europeu e do Conselho (2), e, nomeada- mente, o n. o 1 do seu artigo 13. o, Considerando o seguinte: (1) (2) O n. o 1 do artigo 13. o da Directiva 67/548/CEE isenta determinadas substâncias da aplicação das disposições previstas nos seus artigos 7. o, 8. o, 14. o e 15. o referentes à notificação. Mais especificamente, o n. o 1, quinto travessão, do artigo 13. o isenta substâncias utilizadas exclusivamente noutras categorias de produtos relativa- mente aos quais existem procedimentos comunitários de notificação ou homologação e para os quais as exigên- cias relativas às informações a prestar são iguais às previstas na Directiva 67/548/CEE. Por conseguinte, a Comissão deve elaborar uma lista dos actos legislativos comunitários que prevêem tais procedimentos de notifi- cação ou homologação, lista que será periodicamente reanalisada e, se necessário, revista. A Directiva 91/414/CEE do Conselho, de 15 de Julho de 1991, relativa à colocação dos produtos fitofarmacêu- ticos no mercado (3), com a última redacção que lhe foi dada pela Directiva 1999/80/CE da Comissão (4), prevê a inclusão de substâncias activas no seu anexo I como requisito prévio da autorização dos referidos produtos antes da sua colocação no mercado. A Directiva 93/ /90/CEE da Comissão, de 29 de Outubro de 1993, rela- tiva à lista de substâncias referida no n. o 1, quinto travessão, do artigo 13. o da Directiva 67/548/CEE do Conselho (5), abrange apenas as substâncias activas desti- nadas à inclusão no anexo I da Directiva 91/414/CEE relativa à colocação no mercado. As substâncias activas incluindo sujeitas a autorização para outros efeitos, investigação e desenvolvimento, nos termos do disposto no artigo 22. o da Directiva 91/414/CEE, deviam igual- mente ser abrangidas por forma a limitar os procedi- mentos de autorização exclusivamente ao âmbito da Directiva 91/414/CEE. (1) JO 196 de 16. 8. 1967, p. 1. (2) JO L 199 de 30. 7. 1999, p. 57. (3) JO L 230 de 19. 8. 1991, p. 1. (4) JO L 210 de 10. 8. 1999, p. 13. (5) JO L 277 de 10. 11. 1993, p. 33. As substâncias utilizadas exclusivamente como substân- cias activas de produtos biocidas nos termos da Directiva 98/8/CE do Parlamento Europeu e do Conselho, de 16 de Fevereiro de 1998, relativa à colocação de produtos biocidas no mercado (6), são abrangidas pelo n. o 1, quinto travessão, do artigo 13. o da Directiva 67/548/CEE devendo, por conseguinte, ser isentas, incluindo para efeitos de investigação e desenvolvimento, por forma a limitar os procedimentos de autorização aplicáveis a tais substâncias exclusivamente ao âmbito da Directiva 98/8/CE. (4) (5) A Directiva 93/90/CEE deve ser revogada. As disposições da presente directiva estão em conformi- dade com o parecer do Comité de Adaptação ao Progresso Técnico das directivas que têm por objectivo eliminação dos entraves técnicos ao comércio no sector das substâncias e preparações perigosas, ADOPTOU A PRESENTE DECISÃO: Artigo 1. o A lista dos actos legislativos comunitários referente a categorias de produtos relativamente aos quais existem procedimentos comunitários de notificação ou homologação e para os quais as exigências de apresentação de informações relativas às catego- rias de substâncias identificadas na lista são iguais às previstas na Directiva 67/548/CEE, consta do anexo da presente directiva. Artigo 2. o A Directiva 93/90/CEE é revogada. Artigo 3. o 1. Os Estados-Membros porão em vigor e publicarão as disposições necessárias para dar cumprimento à presente direc- tiva até 1 de Abril de 2001. Desse facto informarão imediata- mente a Comissão. 2. Quando os Estados-Membros adoptarem essas disposi- ções, estas devem incluir uma referência à presente directiva ou ser acompanhadas dessa referência aquando da sua publicação oficial. As modalidades dessa referência serão adoptadas pelos Estados-Membros. (6) JO L 123 de 24. 4. 1998, p. 1. 28. 4. 2000 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 103/71 Os Estados-Membros são os destinatários da presente directiva. Artigo 4. o Feito em Bruxelas, em 25 de Abril de 2000. Pela Comissão Margot WALLSTRÖM Membro da Comissão ANEXO Actos legislativos comunitários relativos a categorias de produtos relativamente aos quais existem procedi- mentos comunitários de notificação ou homologação e para os quais as exigências relativas às informações a prestar referentes às categorias de substâncias identificadas são iguais às previstas nos artigos 7. o, 8. o, 14. o e 15. o da Directiva 67/548/CEE 1. Directiva 91/414/CEE do Conselho, de 15 de Julho de 1991, relativa à colocação dos produtos fitofarmacêuticos no mercado. 2. Directiva 98/8/CE do Parlamento Europeu e do Conselho, de 16 de Fevereiro de 1998, relativa à colocação de produtos biocidas no mercado. Para substâncias destinadas a uma utilização exclusiva como substâncias activas de produtos fitossanitários e/ou produtos biocidas


title: Rozporządzenie Komisji (WE) nr 827/2000 z dnia 25 kwietnia 2000 r. zmieniające rozporządzenie (WE) nr 2461/1999 ustanawiające szczegółowe zasady stosowania rozporządzenia Rady (WE) nr 1251/1999 w zakresie uprawiania odłogowanych gruntów w celu produkcji surowców wykorzystywanych do wytwarzania we Wspólnocie produktów nie przeznaczonych pierwotnie do spożycia przez ludzi lub zwierzęta

eurovoc_concepts:
agricultural product
crop production
fallow
land use
raw material

text: 03/t. 29 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 47 32000R0827 26. 4. 2000 DZIENNIK URZĘDOWY WSPÓLNOT EUROPEJSKICH L 101/21 ROZPORZĄDZENIE KOMISJI (WE) NR 827/2000 z dnia 25 kwietnia 2000 r. zmieniające rozporządzenie (WE) nr 2461/1999 ustanawiające szczegółowe zasady stosowania rozporządzenia Rady (WE) nr 1251/1999 w zakresie uprawiania odłogowanych gruntów w celu produkcji surowców wykorzystywanych do wytwarzania we Wspólnocie produktów nie przezna- czonych pierwotnie do spożycia przez ludzi lub zwierzęta KOMISJA WSPÓLNOT EUROPEJSKICH, uwzględniając Traktat ustanawiający Wspólnotę Europejską, uwzględniając rozporządzenie Rady (WE) nr 1251/1999 z dnia 17 maja 1999 r. ustanawiające system wsparcia dla produ- centów niektórych roślin uprawnych (1), zmienione rozporzą- dzeniem (WE) nr 2704/1999 (2), w szczególności jego art. 9, a także mając na uwadze, co następuje: (1) (2) (3) (4) art. 6 ust. 3 pierwszy akapit rozporządzenia (WE) nr 1251/1999 przewiduje, że odłogowane grunty mogą być uprawiane w celu produkcji surowców wykorzysty- wanych do wytwarzania we Wspólnocie produktów nie przeznaczonych pierwotnie do spożycia przez ludzi lub zwierzęta, pod warunkiem stosowania systemów efek- tywnej kontroli; w celu zapewnienia zgodności z pkt 7 Protokołu Ustaleń dotyczącego roślin oleistych, zawartego między Euro- pejską Wspólnotą Gospodarczą a Stanami Zjednoczo- nymi Ameryki w ramach GATT i zatwierdzonego decyzją Rady 93/355/EWG (3), art. 6 ust. 3 akapit trzeci rozporządzenia (WE) nr 1251/1999 przewiduje, że jeśli ilość produktów ubocznych używanych w celach paszo- wych bądź spożywczych, wyprodukowanych przy uprawie roślin oleistych na gruntach odłogowanych zgodnie z akapitem pierwszym przewyższa 1 milion ton rocznie wyrażonych w ekwiwalencie sojowym, na podstawie przewidywań ilościowych określonych w umowie z producentem, w celu ograniczenia ilości do 1 ilość przewidziana w każdej umowie, a miliona ton, mogąca być wykorzystana w celach paszowych bądź spożywczych powinna być zmniejszona; w celu umożliwienia wprowadzenia w życie zasad usta- nowionych w art. 6 ust. 3 akapit trzeci rozporządzenia (WE) nr 1251/1999, system monitorowania w celu osza- cowania ilości produktów ubocznych, wprowadzony (WE) nr 2461/1999 (4), przez rozporządzenie Komisji powinien być rozszerzony; jest również niezbędnym zdefiniowanie metody kalku- lacji, która ma być używana przez Komisję jako część systemu monitorowania oraz wprowadzenie procedury ilości ustalania współczynnika produktów ubocznych, które mają być wykorzystane do celów paszowych albo spożywczych, który stosowany byłby do każdej umowy, w którym pułap 1 miliona ton zmniejszenia dla (1) Dz. U. L 160 z 26. 6. 1999, str. 1. (2) Dz. U. L 327 z 21. 12. 1999, str. 12. (3) Dz. U. L 147 z 18. 6. 1993, str. 25. (4) Dz. U. L 299 z 20. 11. 1999, str. 16. (5) (6) (7) (8) jest przekroczony; w takich sytuacjach, zawartość czys- tego białka powinna być decydującym kryterium przy sporządzaniu metody kalkulacji; aby zapewnić, że maksymalna ilość produktów ubocz- nych przeznaczona do spożycia przez ludzi lub zwie- rzęta nie jest przekroczona, powinny być przedstawione dowody dotyczące rozdysponowania ilości produktów ubocznych na cele niepaszowe i niespożywcze, przez wniesienie zabezpieczenia przez zbierającego lub pierw- szego przetwórcę; w celu zapewnienia efektywnej kontroli przeprowa- dzanej zgodnie z wymogiem nie przekroczenia pułapu 1 miliona ton, niezbędnym jest ustanowienie końcowego terminu, do którego będzie można dysponować produk- tami ubocznymi wykorzystywanymi w celach rynko- wych niepaszowych i niespożywczych; nowe zasady dotyczące wsparcie rozwoju obszarów wiejskich w 1999 r. nie przekreślają już wyraźnie pomocy agroekologicznej zakwalifikowanej jako wspól- notowe uzgodnienia o odłogowaniu dotyczące upra- wiania niepaszowych i niespożywczych roślin upraw- nych; w interesie spójności, powinny być przyjęte prze- pisy zabraniające kumulacji z innymi wspólnotowymi systemami wsparcia; od momentu opublikowania Protokołu Ustaleń w Dzien- niku Urzędowym Wspólnot Europejskich w 1993 r. , podmioty gospodarcze są zobowiązane do znajomości jego warunków od tej daty; w obawie przekroczenia ton w roku pułapu gospodarczym 2000/2001, powinny zostać ustanowione przepisy umożliwiające stosowanie środków przewidzianych w niniejszym rozporządzeniu we wszystkich umowach zawartych w roku gospodarczym 2000/2001; 1 miliona (9) środki przewidziane w niniejszym rozporządzeniu są zgodne z opinią Komitetu Zarządzającego ds. Zbóż, PRZYJMUJE NINIEJSZE ROZPORZĄDZENIE: Artykuł 1 W rozporządzeniu (WE) 2461/1999 wprowadza się niniejszym następujące zmiany: 48 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 03/t. 29 1) W art. 4 ust. 4 otrzymuje brzmienie: 3) W art. 15 ust. 4 otrzymuje brzmienie: „4. W przypadku, gdy umowy dotyczące nasion rzepaku, rzepiku, ziaren słonecznika lub nasion soji objętych kodami CN 1205 00 90, 1206 00 91, 1206 00 99 lub 1201 00 90, wnioskodawcy zapewniają, w uzupełnieniu informacji wymaganych na podstawie ust. 2, że sprecyzują całkowitą przewidywaną ilość produktów ubocznych i przewidywaną ilość produktów ubocznych przeznaczonych do wykorzys- tania innego niż spożycie przez ludzi lub zwierzęta, wska- zując gatunek w obydwu przypadkach. Ilości powinny być określane na podstawie następujących wskaźników: a) 100 kilogramów nasion rzepaku i/lub rzepiku oznaczo- nych kodem 1205 00 90 uważa się za ekwiwalent 56 kilogramów produktów ubocznych. b) 100 kilogramów ziaren słonecznika oznaczonego kodem CN 1206 00 91 albo 1206 00 99 uważa się za ekwiwa- lent 56 kilogramów produktów ubocznych c) 100 kilogramów nasion soi oznaczonych kodem CN 1201 00 90 uważa się za ekwiwalent 78 kilogramów produktów ubocznych. ” 2) Artykuł 14 otrzymuje brzmienie: „1. Bez uszczerbku dla art. 13, właściwe władze okreś- lone w ust. 1 tego artykułu, możliwie jak najszybciej, ale nie później niż do dnia 30 czerwca roku, w którym surowce mają być zebrane, powiadomią Komisję o całkowitej ilości produktów ubocznych przeznaczonych do spożycia przez ludzi i zwierzęta i wynikających z umów, przewidzianych w art. 4 dotyczących rzepaku, rzepiku, ziaren słonecznika oraz nasion soi objętych kodami CN ex 1205 00 90, 1206 00 91, 1206 00 99 oraz 1201 00 90. 2. Na podstawie informacji dostarczonych przewidzia- nych w zastosowaniu ust. 1, Komisja oblicza przewidywaną całkowitą ilość produktów ubocznych przeznaczonych do spożycia przez ludzi i zwierzęta, wyrażoną w ekwiwalencie mąki sojowej, stosując następujące mnożniki: — makuchy sojowe: 48 % — makuchy rzepikowe: 32 % — makuchy słonecznikowe: 28 %. „4. Zabezpieczenie jest zwolnione na zasadzie proporcjo- nalności pod warunkiem, że właściwe władze danej osoby zbierającej bądź pierwszego przetwórcy są w posiadaniu dowodu na to, że: a) dana ilość surowca została przetworzona zgodnie z wymaganiami ustanowionymi w art. 4 ust. 2 lit. f), z uwzględnieniem, odpowiednio do okoliczności, zmian wprowadzonych zgodnie z art. 8. ; i objętych słonecznika, b) w przypadku umów dotyczących nasion rzepaku, kodami CN soji rzepiku, 1205 00 90, albo 1206 00 91, 12 01 00 90 i stosowania procedury przewidzianej w art. 14 ust. 2, ilość produktów ubocznych, która prze- kroczyła maksymalną ilość przeznaczoną do spożycia przez ludzi i zwierzęta, znalazła zbyt do innych celów niż paszowe i spożywcze. ” 1206 00 99 4) W art. 16 ust. 2 otrzymuje brzmienie: „2. Podstawowe wymagania w rozumieniu rozporządzenia (EWG) nr 2220/85 są następujące: art. 20 a) obowiązek przetwarzania surowca, przede wszystkim na produkty końcowe określone w umowie; b) w przypadku stosowania procedury przewidzianej w art. 14 ust. 2, obowiązek szukania zbytu, dla ilości produktów ubocznych przekraczających maksymalne ilości przeznaczone do spożycia przez ludzi i zwierzęta, na cele inne niż spożywcze i paszowe. Przetwarzanie na jeden lub więcej produktów końcowych określonych w załączniku III, przeprowadzone do dnia 31 lipca drugiego roku od tego, w którym osoba zgłaszająca zebrała surowiec. W przypadku stosowania procedury prze- widzianej w art. 14 ust. 2, ten nieprzekraczalny termin jest również przestrzegany w stosunku do zbytu na rynku ilości produktów ubocznych wykraczających poza maksymalne ilości przeznaczone do spożycia przez ludzi i zwierzęta, na cele inne niż spożywcze i paszowe. ” 5) W art. 25 lit. a) i b) otrzymują brzmienie: „a) finansowania przez Sekcję Gwarancji Europejskiego Funduszu Orientacji i Gwarancji Rolnej zgodnie z art. 1 ust. 2 lit. a) i b) rozporządzenia (WE) nr 1258/1999; b) pomocy wspólnotowej przewidzianej w rozdziale VIII rozporządzenia (WE) nr 1257/1999 z wyjątkiem wsparcia przyznawanego w odniesieniu do kosztów siewu gatunków szybko rosnących przewidzianych w jego drugi wymienionego rozporządzenia. ” art. 31 ust. 3 akapit Jeśli w wyniku kalkulacji przeprowadzonych zgodnie z akapitem pierwszym, Komisjaodkryje przekroczenie pułapu 1 miliona ton produktów ubocznych, które mają być wyko- rzystane na cele spożywcze i paszowe, ustala ona, tak szybko jak to możliwe i przed dniem 31 lipca ostatniego roku, w którym surowce mają być zebrane, procentową redukcję stosowaną do każdej umowy, do celów określenia maksymalnej ilości produktów ubocznych przeznaczonych do spożycia przez ludzi i zwierzęta. ” Artykuł 2 Niniejsze rozporządzenie wchodzi w życie dwudziestego dnia po jego opublikowaniu w Dzienniku Urzędowym Wspólnot Euro- pejskich. 03/t. 29 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 49 Niniejsze rozporządzenie stosuje się w odniesieniu do wszystkich umów zawartych na lata gospodarcze 2000/01 i następne lata, niezależnie od daty ich zawarcia. Nie naruszając poprzedniego ustępu, przepisy zmieniające art. 4 ust. 4 i art. 14 ust. 1 rozporządzenia (WE) nr 2461/1999 przewidziane w niniejszym rozporządzeniu, stosuje się w odniesieniu do umów zawartych na lata gospodarcze 2000/01 i następne lata. Niniejsze rozporządzenie wiąże w całości Państwach Członkowskich. i jest bezpośrednio stosowane we wszystkich Sporządzono w Brukseli, dnia 25 kwietnia 2000 r. W imieniu Komisji Franz FISCHLER Członek Komisji


title: 2000/333/CE: Decisão da Comissão, de 25 de Abril de 2000, que estabelece condições especiais de importação de moluscos bivalves, equinodermos, tunicados e gastrópodes marinhos originários da República Socialista do Vietname [notificada com o número C(2000) 1054] (Texto relevante para efeitos do EEE)

eurovoc_concepts:
Vietnam
health control
import
mollusc
originating product

text: L 114/42 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias 13. 5. 2000 DECISÃO DA COMISSÃO de 25 de Abril de 2000 que estabelece condições especiais de importação de moluscos bivalves, equinodermos, tunicados e gastrópodes marinhos originários da República Socialista do Vietname [notificada com o número C(2000) 1054] (Texto relevante para efeitos do EEE) (2000/333/CE) A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS, Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Europeia, Tendo em conta a Directiva 91/492/CEE do Conselho, de 15 de Julho de 1991, que estabelece as normas sanitárias que regem a produção e a colocação no mercado de moluscos bivalves vivos (1), com a última redacção que lhe foi dada pela Directiva 97/79/CE (2), e, nomeadamente, o ponto 3, alínea b), do seu artigo 9. o, Considerando o seguinte: (1) (2) (3) (4) (5) Um perito da Comissão efectuou uma visita de inspecção à República Socialista do Vietname a fim de verificar as condições de produção, armazenagem e expedição para a Comunidade de produtos da pesca. A legislação da República Socialista do Vietname atribui ao «National Fisheries Inspection and Quality Assurance Center (NAFIQACEN)» a responsabilidde da inspecção sanitária dos moluscos bivalves, equinodermos, tuni- cados e gastrópodes marinhos, bem como da vigilância das condições de higiene e salubridade da sua produção. A mesma legislação confere ao NAFIQACEN o poder de autorizar ou proibir a colheita de moluscos bivalves, equinodermos, tunicados e gastrópodes marinhos de determinadas zonas. O NAFIQACEN e os seus laboratórios têm capacidade para verificar eficazmente a aplicação da legislação em vigor na República Socialista do Vietname. As autoridades competentes da República Socialista do Vietname comprometeram-se a comunicar regular e rapidamente à Comissão informações sobre a presença de plâncton com toxinas nas zonas de colheita. As autoridades competentes da República Socialista do Vietname deram garantias oficiais do respeito das normas enunciadas no capítulo V do anexo da Directiva 91/492/CEE e do respeito de requisitos equivalentes aos prescritos pela referida directiva no respeitante à classifi- cação das zonas de produção e de transposição, à apro- (1) JO L 268 de 24. 9. 1991, p. 1. (2) JO L 24 de 30. 1. 1998, p. 31. (6) (7) (8) vação dos centros de expedição e de depuração e ao controlo da saúde pública e à vigilância da produção. A República Socialista do Vietname pode constar da lista dos países terceiros que preenchem as condições de equivalência referidas no ponto 3, alínea a), do artigo 9. o da Directiva 91/492/CEE. A República Socialista do Vietname pretende exportar para a Comunidade moluscos bivalves, equinodermos, tunicados e gastrópodes marinhos congelados ou trans- formados e submetidos a processos de esterilização ou tratamento térmico em conformidade com as exigências da Decisão 93/25/CEE da Comissão (3), alterada pela 97/275/CE (4). Para o efeito, é necessário designar as zonas de produção onde pode proceder-se à colheita e exportar em seguida para a Comunidade moluscos bivalves, equinodermos, tunicados e gastrópodes mari- nhos. As condições especiais de importação são aplicáveis sem prejuízo das decisões tomadas em aplicação da Directiva 91/67/CEE do Conselho, de 28 de Janeiro de 1991, relativa às condições de polícia sanitária que regem a introdução no mercado de animais e produtos da aqui- cultura (5), com a última redacção que lhe foi dada pela Directiva 95/22/CE (6). (9) As medidas previstas na presente decisão estão em conformidade com o parecer do Comité Veterinário Permanente, ADOPTOU A PRESENTE DECISÃO: Artigo 1. o O «National Fisheries Inspection and Quality Assurance Center (NAFIQACEN) of the Ministry of Fisheries» é a autoridade competente na República Socialista do Vietname para verificar e certificar a conformidade dos moluscos bivalves, equino- dermos, tunicados e gastrópodes marinhos com os requisitos da Directiva 91/492/CEE. (3) JO L 16 de 25. 1. 1993, p. 22. (4) JO L 108 de 25. 4. 1997, p. 52. (5) JO L 46 de 19. 2. 1991, p. 1. (6) JO L 243 de 11. 10. 1995, p. 1. 13. 5. 2000 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 114/43 Os moluscos bivalves, equinodermos, tunicados e gastrópodes marinhos originários da República Socialista do Vietname e destinados ao consumo humano devem ser provenientes das zonas de produção autorizadas constantes do anexo. Artigo 2. o Os Estados-Membros são os destinatários da presente decisão. Artigo 3. o Feito em Bruxelas, em 25 de Abril de 2000. Pela Comissão David BYRNE Membro da Comissão ANEXO Número Nome 01 02 03 04 05 TAN THANH BINH DAI BA MUM AN THUY CON TRAU