title: Kommissionens direktiv 2000/33/EF af 25. april 2000 om 27. tilpasning til den tekniske udvikling af Rådets direktiv 67/548/EØF om tilnærmelse af lovgivning om klassificering, emballering og etikettering af farlige stoffer (EØS-relevant tekst.)

formats: html pdf print

text: L 136/90 DA De Europ(cid:230)iske F(cid:230)llesskabers Tidende 8. 6. 2000 KOMMISSIONENS DIREKTIV 2000/33/EF af 25. april 2000 om 27. tilpasning til den tekniske udvikling af R(cid:229)dets direktiv 67/548/E(cid:216)F om tiln(cid:230)rmelse af lovgivning om klassificering, emballering og etikettering af farlige stoffer (*) (E(cid:216)S-relevant tekst) KOMMISSIONEN FOR DE EUROP˘ISKE F˘LLESSKABER HAR (cid:151) UDSTEDT F(cid:216)LGENDE DIREKTIV: under henvisning til traktaten om oprettelse af Det Europ(cid:230)iske F(cid:230)llesskab, under henvisning til R(cid:229)dets direktiv 67/548/E(cid:216)F af 27. juni 1967 om tiln(cid:230)rmelse af lovgivning om klassificering, emballe- ring og etikettering af farlige stoffer (1), senest (cid:230)ndret ved Euro- pa-Parlamentets og R(cid:229)dets direktiv 1999/33/EF (2), s(cid:230)rlig arti- kel 28, og ud fra fłlgende betragtninger: (1) Bilag V til direktiv 67/548/E(cid:216)F indeholder metoderne til bestemmelse af stoffers og pr(cid:230)paraters fysisk-kemiske egenskaber, toksicitet og łkotoksicitet. Det er nłdvendigt at tilpasse dette bilag til den tekniske udvikling. (2) I artikel 7, stk. 2, i R(cid:229)dets direktiv 86/609/E(cid:216)F om ind- byrdes tiln(cid:230)rmelse af medlemsstaternes love og admini- strative bestemmelser om beskyttelse af dyr, der anvendes til forsłg og andre videnskabelige form(cid:229)l (3), fasts(cid:230)ttes, at »forsłg m(cid:229) ikke udfłres, hvis der p(cid:229) rimelig og praktisk tilfredsstil- m(cid:229)de kan benyttes en anden videnskabeligt lende metode, som ikke medfłrer anvendelse af dyr, for at opn(cid:229) de tilstr(cid:230)bte resultater«. (3) Kommissionen har til hensigt at indfłre alternative prłve- metoder, som ikke medfłrer anvendelse af dyr, i bilag V til direktiv 67/548/E(cid:216)F, s(cid:229)ledes at disse metoder kan anvendes til prłvning af kemiske stoffer i overensstem- melse med artikel 3, stk. 1, i direktiv 67/548/E(cid:216)F. (4) De i dette direktiv fastsatte foranstaltninger er i overens- stemmelse med udtalelse fra Udvalget for Tilpasning til den Tekniske Udvikling af Direktiverne om Fjernelse af Tekniske Hindringer for Handelen med Farlige Stoffer og Pr(cid:230)parater (cid:151) Artikel 1 Teksterne i bilag I og II til dette direktiv tilfłjes til del B i bilag V til direktiv 67/548/E(cid:216)F. Artikel 2 1. Medlemsstaterne gennemfłrer senest den 1. oktober 2001 de love og administrative bestemmelser, der er nłdven- dige for at efterkomme dette direktiv. Medlemsstaterne under- retter straks Kommissionen herom. Disse love og bestemmelser skal ved vedtagelsen indeholde en henvisning til dette direktiv eller skal ved offentliggłrelsen led- sages af en s(cid:229)dan henvisning. De n(cid:230)rmere regler for henvisnin- gen fasts(cid:230)ttes af medlemsstaterne. 2. Medlemsstaterne meddeler Kommissionen de vigtigste nationale lovbestemmelser, som de vedtager p(cid:229) det omr(cid:229)de, der er omfattet af dette direktiv, og en sammenligningstabel mellem dette direktiv og de vedtagne nationale bestemmelser. Artikel 3 Dette direktiv tr(cid:230)der i kraft p(cid:229) tredjedagen for dets offentliggł- relse i De Europ(cid:230)iske F(cid:230)llesskabers Tidende. Artikel 4 Dette direktiv er rettet til medlemsstaterne. Udf(cid:230)rdiget i Bruxelles, den 25. april 2000. P(cid:229) Kommissionens vegne Margot WALLSTR(cid:214)M Medlem af Kommissionen (*) Udstedt fłr den 26. tilpasning. (1) EFT 196 af 16. 8. 1967, s. 1. (2) EFT L 199 af 30. 7. 1999, s. 57. (3) EFT L 358 af 18. 12. 1986, s. 1. 8. 6. 2000 DA De Europ(cid:230)iske F(cid:230)llesskabers Tidende L 136/91 BILAG I »B. 40. HUD˘TSNING 1. METODE 1. 1. Indledning To in vitro-test til m(cid:229)ling af hud(cid:230)tsning er blevet anerkendt som videnskabeligt validerede af Det Europ(cid:230)iske Center for Validering af Alternative Metoder (ECVAM, Det F(cid:230)lles Forskningscenter, Europa-Kommissionen) (1) (2) (3): m(cid:229)ling af transkutan elektrisk modstand (TER) i rottehud og en test, hvor der anvendes en human hudmodel. ECVAM-valideringsundersłgelsen viste, at begge testmetoder var p(cid:229)lidelige med hensyn til at kunne skelne mellem stoffer, der er kendt for at v(cid:230)re hud(cid:230)tsende, og stoffer, der er kendt for ikke at v(cid:230)re det. Derudover kunne man med forsłgsprotokollen baseret p(cid:229) en human hudmodel skelne korrekt mellem grader af hud(cid:230)tsning (stoffer, der er kendt for at v(cid:230)re alvorligt hud(cid:230)tsende, R35, og andre hud(cid:230)tsende stof- fer, R34) (2). Beskrivelse og fremgangsm(cid:229)de for begge metoder er anfłrt nedenfor; valg af test afh(cid:230)nger af brugerens specifikke behov og pr(cid:230)ferencer. Se desuden den generelle indledning, del B. 1. 2. Definitioner Hud(cid:230)tsning: fremkomsten af irreversibel v(cid:230)vsłdel(cid:230)ggelse i huden efter applikation af teststof. 1. 3. Referencestoffer Ingen n(cid:230)rmere angivet, men se punkt 1. 5. 3. 4 og 1. 7. 2. 3. 1. 4. Princippet i testmetoden (cid:151) Rottehud-TER-testen Testmaterialet appliceres i op til 24 timer p(cid:229) den epidermale overflade (ydersiden af huden) af hudlapper fra unge rotter, der er humant aflivede. At et stof er (cid:230)tsende, viser sig ved, at det kan beskadige stratum cor- neum og sv(cid:230)kke dets barrierefunktion, hvilket kan m(cid:229)les som en reduktion i den naturlige TER under en t(cid:230)rskelv(cid:230)rdi (5 kh) (4) (5). Irriterende og ikke-irriterende stoffer medfłrer ikke TER under t(cid:230)rskelv(cid:230)rdien. Et farvebindingstrin kan fłjes til testen ved undersłgelser af overfladeaktive stoffer og neutrale organiske stoffer (se definitioner i reference 6); herved mindskes antallet af falsk positive resultater, som s(cid:230)rligt forekommer ved disse stoffer (2) (7). 1. 5. Beskrivelse af testmetode (cid:151) Rottehud-TER-testen 1. 5. 1. Forsłgsdyr Til fremstilling af hudlapper anvendes unge rotter (20-23 dage gamle, Wistar eller lignende stamme). H(cid:229)rene p(cid:229) ryggen og flanken fjernes omhyggeligt med en lille dyresaks. Dyrene vaskes dern(cid:230)st omhyggeligt, idet det p(cid:229)g(cid:230)ldende hudomr(cid:229)de holdes neddyppet i en oplłsning af antibiotika (f. eks. streptomycin, penicillin, chlo- ramphenicol og amphotericin i koncentrationer hłje nok til at h(cid:230)mme bakteriev(cid:230)kst). Forsłgsdyrene vaskes igen med antibiotika p(cid:229) tredje- og fjerdedagen efter den fłrste vask og skal derefter anvendes inden tre dage. (Dyrene m(cid:229) ikke v(cid:230)re (cid:230)ldre end 31 dage med henblik p(cid:229) fremstilling af hudlapper). 1. 5. 2. Fremstilling af hudlapper Forsłgsdyrene aflives humant. Ryghuden fjernes fra dyrene og overflłdigt fedtv(cid:230)v fjernes omhyggeligt. Huden anbringes for enden af et rłr af PTFE (polytetrafluorethylen), idet man sikrer sig, at den epidermale overflade er i kontakt med rłret. En gummi »O«-ring s(cid:230)ttes t(cid:230)tsluttende omkring rłrets ende for at holde huden p(cid:229) plads, og overflłdigt v(cid:230)v klippes af. Rłrets og »O«-ringens dimensioner ses p(cid:229) figur 1. Der t(cid:230)tnes med vaseline, s(cid:229) »O«-ringen slutter helt til enden af PTFE-rłret. Rłret fastholdes ved hj(cid:230)lp af fjederklemmer i et ydre kammer, som indeholder en magnesiumsulphatoplłsning (154 mM) (figur 2). 1. 5. 3. Fremgangsm(cid:229)de 1. 5. 3. 1. A p p l i k a t i o n a f t e s t m a t e r i a l e t Flydende teststoffer (150 (cid:181)l) appliceres p(cid:229) den epidermale overflade inde i rłret (figur 2). Drejer det sig om faste stoffer, skal tilstr(cid:230)kkeligt af stoffet p(cid:229)fłres hudlappen, s(cid:229) hele overfladen er d(cid:230)kket af stoffet. Deionise- ret vand (150 (cid:181)l) tils(cid:230)ttes oven p(cid:229) stoffet, og rłret rystes forsigtigt. Teststoffet skal have maksimal kontakt med huden. Med henblik herp(cid:229) kan det v(cid:230)re nłdvendigt at opvarme visse faste stoffer til 30 (cid:176)C, s(cid:229) de smel- ter, eller rive dem til et kornet materiale eller male dem til pulver. L 136/92 DA De Europ(cid:230)iske F(cid:230)llesskabers Tidende 8. 6. 2000 Der bruges tre hudlapper til hvert teststof. Stofferne skal v(cid:230)re i kontakt med hudlappen i 24 timer (se ligele- des 1. 5. 3. 4). Stoffet fjernes ved spuling under vandhane med vand med en temperatur p(cid:229) hłjst 30 (cid:176)C, indtil der ikke kan fjernes mere af stoffet. Stoffer, der er stivnet i rłret, kan eventuelt fjernes ved hj(cid:230)lp af en kraftig str(cid:229)le vand, der er omkring 30 (cid:176)C varmt. 1. 5. 3. 2. T E R - m (cid:229) l i n g e r TER m(cid:229)les ved hj(cid:230)lp af en lavvoltvekselstrłmsdatabro (f. eks. AIM 401 eller 6401 eller tilsvarende). Fłr den elektriske modstand m(cid:229)les, reduceres hudens overfladesp(cid:230)nding ved tils(cid:230)tning af 70 % ethanol i tilstr(cid:230)kkelig m(cid:230)ngde, s(cid:229) hele hudens overflade d(cid:230)kkes. Efter nogle f(cid:229) sekunder fjernes ethanolet, ved at man vender rłret p(cid:229) hovedet, og v(cid:230)vet hydreres nu ved tils(cid:230)tning af 3 ml magnesiumsulphatoplłsning (154 mM). Elektro- derne fra databroen anbringes nu p(cid:229) hver sin side af hudlappen for at m(cid:229)le modstanden i kh/hudlap (figur 2). Elektrodedimensioner og l(cid:230)ngden af elektroderne under krokodillen(cid:230)bbene ses i figur 1. Klemmen (kro- kodillen(cid:230)bbet) p(cid:229) den indre (tykke) elektrode hviler p(cid:229) toppen af PTFE-rłret under selve modstandsm(cid:229)lingen, hvorved man sikrer sig, at et konstant stykke af elektroden er neddykket i oplłsningen af magnesiumsulphat. Den ydre (tynde) elektrode er anbragt inde i det ydre kammer, s(cid:229) det rłrer ved kammerbunden. Afstanden mellem den nederste del af den fjedrende klemme og bunden af PTFE-rłret skal holdes konstant, da den har indflydelse p(cid:229) den m(cid:229)lte modstand. Bem(cid:230)rk, at m(cid:229)linger p(cid:229) over 20 kh kan skyldes, at teststoffet ligger som en bel(cid:230)gning p(cid:229) hudens overflade. Man kan forsłge at fjerne stoffet ved at ryste PTFE-rłret i 10 sekunder, mens man d(cid:230)kker (cid:229)bningen med en tommelfinger ifłrt en gummitut; magnesiumsulphatoplłsningen kasseres, og m(cid:229)lingen gentages med en ny magnesiumsulphatoplłsning. Gennemsnittet af TER-resultaterne accepteres, dersom v(cid:230)rdierne af samtidigt udfłrte positive og negative kontroller falder inden for de for metoden accepterede gr(cid:230)nser. For metode og apparatur, som beskrevet her, er de foresl(cid:229)ede kontrolstoffer og de dertil hłrende accepterede gr(cid:230)nser: Kontrol Stof Positiv Negativ 10 M saltsyre (36 %) Destilleret vand Modstandsgr(cid:230)nser (kh) 0,5-1,0 10-25 1. 5. 3. 3. P r o c e d u r e t i l p a s s e t o v e r f l a d e a k t i v e o g n e u t r a l e o r g a n i s k e s t o f f e r Hvis TER-v(cid:230)rdierne for overfladeaktive eller neutrale organiske stoffer er mindre end eller lig med 5 kh, kan man undersłge et farvestofs evne til at tr(cid:230)nge ned i v(cid:230)vet. Herved kan man afgłre, om resultaterne er falsk positive (2). 1. 5. 3. 3. 1. Applikation og fjernelse af farvestoffet sulforhodamin B Efter at den epidermale overflade er blevet behandlet med teststoffet, appliceres 150 (cid:181)l af en 10 % (w/v)- oplłsning af sulforhodamin B i destilleret vand p(cid:229) den epidermale overflade af hver hudlap i 2 timer. Hudlap- perne spules under en vandhane i ca. 10 sekunder med vand, der ikke er varmere end stuetemperatur, for at fjerne overskydende/ikke-bundet farvestof. Hver hudlap fjernes omhyggeligt fra PTFE-rłret og anbringes i et glas (f. eks. et 20 ml-glas til scintillationsm(cid:229)linger) indeholdende deioniseret vand (8 ml). Glassene rystes for- sigtigt i 5 minutter for at fjerne yderligere overskydende/ikke-bundet farvestof. Denne renseprocedure gen- tages, hvorefter hudlapperne fjernes og anbringes i glas, der indeholder 5 ml af en 30 % (w/v)-oplłsning af natriumdodecylsulphat (SDS) i destilleret vand. Glassene inkuberes ved 60 (cid:176)C til n(cid:230)ste dag. Efter inkubationen fjernes og kasseres hudlapperne, og den tilbagev(cid:230)rende oplłsning centrifugeres i 8 minutter ved 21 (cid:176)C (relativ centrifugalkraft p 175). 1 ml af supernatanten fortyndes 1 til 5 (v/v) (1 ml + 4 ml) med en 30 % (w/v) SDS- oplłsning i destilleret vand. Oplłsningens ekstinktion/optical density (OD) m(cid:229)les ved ca. 565 nm. 1. 5. 3. 3. 2. Beregning af farveindhold M(cid:230)ngden af sulforhodamin B pr. hudlap beregnes ud fra OD-v(cid:230)rdierne (sulforhodamin B’s mol(cid:230)re ekstink- tionskoefficient ved 565 nm = 8,7 (cid:215) 104; molekylv(cid:230)gten = 580). M(cid:230)ngden af sulforhodamin B beregnes for alle hudlapperne, og en gennemsnitlig m(cid:230)ngde beregnes ud fra tredobbeltbestemmelserne. Den gennemsnitlige v(cid:230)rdi for farvem(cid:230)ngde accepteres under foruds(cid:230)tning af, at samtidigt opn(cid:229)ede kontrolv(cid:230)rdier falder inden for de for metoden acceptable gr(cid:230)nser. Fłlgende acceptable gr(cid:230)nser for farvem(cid:230)ngde i kontrollerne er foresl(cid:229)et for metode og apparat som beskrevet her: 8. 6. 2000 DA De Europ(cid:230)iske F(cid:230)llesskabers Tidende L 136/93 Kontrol Stof Positiv Negativ 10 M saltsyre (36 %) Destilleret vand Farvem(cid:230)ngdegr(cid:230)nser ((cid:181)g/lap) 40-100 15-35 1. 5. 3. 4. Y d e r l i g e r e i n f o r m a t i o n e r Teststoffer kan ogs(cid:229) appliceres p(cid:229) hudlapper i kortere tid (f. eks. 2 timer) med henblik p(cid:229) identifikation af st(cid:230)rkt (cid:230)tsende stoffer. Man fandt imidlertid ved valideringsundersłgelserne af TER-testen, at den overvurde- rede adskillige stoffers (cid:230)tsende evne, n(cid:229)r de var applicerede p(cid:229) hudlapper i 2 timer (2), skłnt den efter 24 timers applikation korrekt kunne identificere de (cid:230)tsende og de ikke-(cid:230)tsende stoffer. Testapparaturets og forsłgsprocedurens egenskaber og dimensioner kan have indflydelse p(cid:229) de opn(cid:229)ede TER- v(cid:230)rdier. T(cid:230)rskelv(cid:230)rdien for (cid:230)tsning, 5 kh, blev bestemt med det apparatur og den fremgangsm(cid:229)de, der er beskrevet i denne metode. Hvis testbetingelserne (cid:230)ndres betydeligt, kan der blive tale om andre t(cid:230)rskel- og kontrolv(cid:230)rdier. Det anbefales derfor, at metoden og t(cid:230)rskelv(cid:230)rdien for modstand kalibreres ved at teste en r(cid:230)kke referencestandarder, der v(cid:230)lges blandt de kemikalier, der blev anvendt i valideringsundersłgelsen (3). 1. 6. Testmetodens princip (cid:151) M(cid:229)ling ved forsłgsopstilling med human hud Teststoffet appliceres i op til 4 timer p(cid:229) en tredimensional human hudmodel, omfattende en rekonstrueret epidermis med et fungerende stratum corneum. ˘tsende stoffer identificeres ved deres evne til at neds(cid:230)tte cellers levedygtighed (f. eks. p(cid:229)vist med MTT-reduktionstesten) under en fastlagt t(cid:230)rskelv(cid:230)rdi efter en bestemt eksponeringstid. Testmetodens princip er i overensstemmelse med den hypotese, der siger, at kemikalier er (cid:230)tsende, n(cid:229)r de er i stand til at tr(cid:230)nge gennem stratum corneum (ved diffusion eller erosion), og er til- str(cid:230)kkeligt cytotoksiske til at fremkalde celledłd i de underliggende cellelag. 1. 7. Beskrivelse af testmetoden (cid:151) Forsłgsopstilling med human hud 1. 7. 1. Modeller for human hud Modeller for human hud kan hidrłre fra forskellige kilder, men de m(cid:229) opfylde visse kriterier. Modellen m(cid:229) have et fungerende stratum corneum med et underliggende lag af levende celler. Stratum corneums barriere- funktion m(cid:229) v(cid:230)re tilstr(cid:230)kkelig. Dette kan vises ved, at hudmodellen ikke p(cid:229)virkes af stoffer, der er cytotoksi- ske, men som ikke almindeligvis passerer stratum corneum. Modellens resultater skal v(cid:230)re reproducerbare p(cid:229) veldefinerede betingelser. De levende celler i modellen skal v(cid:230)re tilstr(cid:230)kkelig levedygtige til, at de kan skelne klart mellem positive og negative kontroller. Efter at v(cid:230)re udsat for en negativ kontrol skal cellernes levedygtighed (f. eks. som den kan m(cid:229)les med m(cid:230)ngden af MTT-reduktion, dvs. en OD-v(cid:230)rdi) v(cid:230)re inden for acceptable gr(cid:230)nser for den p(cid:229)g(cid:230)ldende model. Vigtigst er det, at den anvendte model, der skal udsige noget om stoffers virkning, m(cid:229) have vist at kunne leve op til internationale valideringsstandarder (se reference 2). 1. 7. 2. Fremgangsm(cid:229)de 1. 7. 2. 1. A p p l i k a t i o n a f t e s t s t o f f e t For flydende stoffer skal der appliceres tilstr(cid:230)kkeligt teststof til, at hudoverfladen d(cid:230)kkes (mindst 25 (cid:181)l/cm2). Det samme g(cid:230)lder for faste stoffer, og de skal fugtes, for at sikre god hudkontakt; om nłdvendigt skal de males til et pulver, fłr de appliceres. Applikationsm(cid:229)den skal kunne anvendes til en lang r(cid:230)kke kemiske stof- fer (for eksempler se reference 2). Teststoffet skal omhyggeligt vaskes af hudoverfladen med fysiologisk salt- vand, n(cid:229)r eksponeringstiden er g(cid:229)et. 1. 7. 2. 2. M (cid:229) l i n g a f c e l l e r s l e v e d y g t i g h e d Enhver kvantitativ, godkendt metode kan bruges til m(cid:229)ling af cellers levedygtighed. Den hyppigst anvendte m(cid:229)ling er MTT-reduktionstesten, som har vist sig at give nłjagtige og reproducerbare resultater i forskellige laboratorier (2). Hudlappen anbringes i en MTT-oplłsning p(cid:229) 0,3 mg/ml ved 20-28 (cid:176)C i 3 timer. Den bund- f(cid:230)ldede bl(cid:229) formazan ekstraheres (ekstraktion med oplłsningsmidler), og formazankoncentrationen beregnes ud fra m(cid:229)ling af OD ved en błgel(cid:230)ngde mellem 545 og 595 nm. L 136/94 DA De Europ(cid:230)iske F(cid:230)llesskabers Tidende 8. 6. 2000 1. 7. 2. 3. Y d e r l i g e r e i n f o r m a t i o n Den anvendte hudmodel og nłje overholdelse af applikationstid og vaskeprocedurer etc. har den stłrste betydning for den m(cid:229)lte cellelevedygtighed. Det anbefales, at metoden og modellen, der skal udsige noget om stoffers virkning, kalibreres med en serie standardreferencer, valgt blandt de kemikalier, der er brugt i ECVAM’s valideringsundersłgelse (3). Kritisk er intra- og interlaboratoriel reproducerbarhed hvad ang(cid:229)r en lang r(cid:230)kke kemikalier, i overensstemmelse med internationale standarder. Som et minimumskrav skal meto- den leve op til kriterierne for videnskabelig gyldighed, som tidligere defineret (2), og resultaterne af en s(cid:229)dan valideringsundersłgelse skal v(cid:230)re publicerede i et videnskabeligt tidsskrift med peer-review. 2. DATA 2. 1. Behandling af resultaterne 2. 1. 1. Rottehud-TER-testen De m(cid:229)lte resultater for modstand (kh) i teststoffet, i positive og negative kontroller og alle standardreference- kemikalierne skal meddeles i tabelform, heri ogs(cid:229) data fra flergangsbestemmelser/gentagne undersłgelser, gennemsnitsv(cid:230)rdier og den deraf fłlgende klassifikation. 2. 1. 2. Test med human hudmodel OD-v(cid:230)rdier og beregnede tal for procentuel cellelevedygtighed for teststof, for positive og negative kontroller og for alle standardreferencekemikalier skal meddeles i tabelform, heri ogs(cid:229) data fra flergangsbestemmelser/ gentagne undersłgelser, gennemsnitsv(cid:230)rdier og den deraf fłlgende klassifikation. 2. 2. Evaluering og fortolkning af resultater 2. 2. 1. Rottehud-TER-testen Hvis den gennemsnitlige TER-v(cid:230)rdi for teststoffet er stłrre end 5 kh, er stoffet ikke (cid:230)tsende. Hvis TER- v(cid:230)rdien er mindre end eller lig med 5 kh, og stoffet ikke er et overfladeaktivt stof eller et neutralt organisk stof, er det (cid:230)tsende. Hvis TER-v(cid:230)rdierne for overfladeaktive eller neutrale organiske stoffer er mindre end eller lig med 5 kh, kan man undersłge et farvestofs evne til at tr(cid:230)nge ned i v(cid:230)vet. Hvis det gennemsnitlige farveindhold i hudlappen er stłrre end eller lig med det gennemsnitlige farveindhold i den sidelłbende positive kontrol udfłrt med 36 % HCl, er teststoffet en sand positiv og derfor (cid:230)tsende. Hvis det gennemsnitlige farveindhold i hudlappen er mindre end det gennemsnitlige farveindhold i den sidelłbende positive kontrol udfłrt med 36 % HCl, er teststoffet en falsk positiv og derfor ikke (cid:230)tsende. 2. 2. 2. Test med human hudmodel OD fra den negative kontrol repr(cid:230)senterer 100 % cellelevedygtighed; derfor kan de OD-v(cid:230)rdier, som m(cid:229)les ved hver undersłgelse, anvendes til beregning af den procentuelle levedygtighed i forhold til den negative kontrol. Den procentuelle cut-off v(cid:230)rdi af cellelevedygtighed, som adskiller (cid:230)tsende fra ikke-(cid:230)tsende stoffer (eller som skelner mellem forskellige grader af (cid:230)tseevne), skal klart defineres i forbindelse den anvendte model, der skal udsige noget om stoffers virkning, fłr metoden godkendes, og den p(cid:229)fłlgende validerings- undersłgelse m(cid:229) vise, at cut-off-v(cid:230)rdien er hensigtsm(cid:230)ssig (for eksempel se reference 2). 3. FREML˘GGELSE AF RESULTATER Testrapport Testrapporten skal som et minimum indeholde fłlgende oplysninger: Teststof (cid:151) Identifikation, data, dets fysiske natur og, hvis relevant, fysisk-kemiske egenskaber. Tilsvarende infor- mation skal foreligge for eventuelle referencestoffer Omst(cid:230)ndigheder ved testen (cid:151) Detaljer i den anvendte fremgangsm(cid:229)de (cid:151) Beskrivelse af og motivering for eventuelle modifikationer. 8. 6. 2000 DA De Europ(cid:230)iske F(cid:230)llesskabers Tidende L 136/95 Resultater (cid:151) Angivelse i tabelform af m(cid:229)lte v(cid:230)rdier for modstand (TER-testen) eller v(cid:230)rdier for den procentuelle leve- dygtighed (test med human hudmodel) for teststoffet, positive og negative kontroller og eventuelle stan- dardreferencestoffer, og for data fra flergangsbestemmelser/gentagne undersłgelser og gennem- snitsv(cid:230)rdier (cid:151) Beskrivelse af eventuelle andre observationer. Diskussion af resultater Konklusioner 4. REFERENCER (1) ECVAM (1998), ECVAM News & Views, ATLA 26, s. 275-280. (2) Fentem, J. H. , Archer, G. E. B. , Balls, M. , Botham, P. A. , Curren, R. D. , Earl, L. K. , Esdaile, D. J. , Holzhutter, H-G. & Liebsch, M. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivi- ty. 2. Results and evaluation by the Management Team, Toxicology in Vitro 12, s. 483-524. (3) Barratt, M. D. , Brantom, P. G. , Fentem, J. H. , Gerner, I. , Walker, A. P. & Worth, A. P. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 1. Selection and distribution of the test chemicals, Toxicology in Vitro 12, s. 471-482. (4) Oliver, G. J. A. , Pemberton, M. A. & Rhodes, C. (1986), An in vitro skin corrosivity test (cid:151) modifications and validation, Food & Chemical Toxicology 24, s. 507-512. (5) Botham, P. A. , Hall, T. J. , Dennett, R. , McCall, J. C. , Basketter, D. A. , Whittle, E. , Cheeseman, M. , Esdaile, D. J. & Gardner, J. (1992), The skin corrosivity test in vitro: results of an interlaboratory trial, Toxicology in Vitro 6, s. 191-194. (6) Worth, A. P. , Fentem, J. H. , Balls, M. , Botham, P. A. , Curren, R. D. , Earl, L. K. , Esdaile, D. J. & Liebsch, M. (1998), An evaluation of the proposed OECD testing strategy for skin corrosion, ATLA 26, s. 709-720. (7) Botham, P. A. , Chamberlain, M. , Barratt, M. D. , Curren, R. D. , Esdaile, D. J. , Gardner, J. R. , Gordon, V. C. , Hil- debrand, B. , Lewis, R. W. , Liebsch, M. , Logemann, P. , Osborne, R. , Ponec, M. , Regnier, J. F. , Steiling, W. , Walker, A. P. & Balls, M. (1995), A prevalidation study on in vitro skin corrosivity testing. The report and recommendations of ECVAM workshop 6, ATLA 23, s. 219-255. L 136/96 DA De Europ(cid:230)iske F(cid:230)llesskabers Tidende 8. 6. 2000 Figur 1 8. 6. 2000 DA De Europ(cid:230)iske F(cid:230)llesskabers Tidende L 136/97 Figur 2 L 136/98 DA De Europ(cid:230)iske F(cid:230)llesskabers Tidende 8. 6. 2000 BILAG II »B. 41. FOTOTOKSICITET (cid:151) IN VITRO 3T3 NRU-FOTOTOKSICITETSTEST 1. METODE 1. 1. Indledning Fototoksicitet defineres som det toksiske respons, der fremkaldes p(cid:229) huden, efter at den har v(cid:230)ret udsat for bestemte kemiske stoffer og en p(cid:229)fłlgende eksponering for lys, eller som det respons, der fremkaldes ved bestr(cid:229)ling af huden efter systemisk indgift af et kemisk stof. Resultater fra in vitro 3T3 NRU-fototoksicitetstesten bruges til identifikation af et stofs fototoksiske potentia- le, dvs. p(cid:229)visning af eventuel risiko ved teststoffet i forbindelse med bestr(cid:229)ling med UV-lys og synligt lys. Eftersom p(cid:229)visning af fotocytotoksicitet induceret af den kombinerede virkning af et kemisk stof og lys er det toksikologiske slutprodukt af in vitro-testen, kan den identificere stoffer, der er fototoksiske in vivo efter systemisk indgift og fordeling i huden, og stoffer, som for(cid:229)rsager fotoirritation efter lokal applikation p(cid:229) huden. In vitro 3T3 NRU-fototoksicitetstesten blev udviklet og valideret fra 1992-1997 (1) (2) (3) med det form(cid:229)l at finde frem til et p(cid:229)lideligt in vitro-alternativ til de forskellige in vivo- test, der blev anvendt. I 1996 anbefalede en OECD-workshop at anvende in vitro-metoder til vurdering af fototoksicitet (4). f(cid:230)lles EU/COLIPA-projekt i et Resultater fra in vitro NRU-fototoksicitetstesten blev sammenlignet med akutte fototoksicitets-/fotoirritations- virkninger p(cid:229) dyr og mennesker, og testen har vist sig fortr(cid:230)ffelig til at forudsige disse virkninger. Testen er ikke beregnet til p(cid:229)visning af andre negative virkninger af den kombinerede effekt af kemiske stoffer og lys, f. eks. fotogenotoksicitet, fotoallergi og fotocarcinogenicitet, selv om mange kemikalier med de n(cid:230)vnte egen- skaber vil give et positivt resultat med in vitro 3T3 NRU-fototoksicitetstesten. Dertil kommer, at testen ikke er beregnet til vurdering af styrken af fototoksicitet. En fremgangsm(cid:229)de til vurdering af kemikaliers toksicitet vises trinvist i till(cid:230)gget. 1. 2. Definitioner Str(cid:229)lingsintensitet: (irradiance) intensiteten af ultraviolet (UV) eller synligt lys som falder p(cid:229) en overflade, m(cid:229)lt i W/m2 eller mW/cm2. Lysdosis: m(cid:230)ngden (= intensitet (cid:215) tid) af ultraviolet (UV) eller synlig str(cid:229)ling, som falder p(cid:229) en overflade, udtrykt i joule (= W (cid:215) s) pr. overfladeenhed, f. eks. J/m2 eller J/cm2. Błlgel(cid:230)ngder for UV-lys: betegnelser anbefalet af CIE (»Den Internationale Belysningskommission«): UVA (315-400 nm), UVB (280-315 nm) og UVC (100-280 nm). Ogs(cid:229) andre betegnelser bruges: gr(cid:230)nsen mellem UVB og UVA placeres ofte ved 320 nm, og UVA bliver sommetider opdelt i UV-A1 og UV-A2, med en gr(cid:230)nse ved ca. 340 nm. Cellernes levedygtighed: parameter, der m(cid:229)ler en cellepopulations totale aktivitet (f. eks. farvestoffet Neutral Red’s optagelse i levende cellers lysosomer), som, afh(cid:230)ngigt af m(cid:229)lemetode og testens udformning, korrelerer med det totale antal celler og/eller deres levedygtighed. Cellernes relative levedygtighed: cellernes levedygtighed udtrykt i forhold til negative kontroller (oplłsningsmid- del), som har v(cid:230)ret gennem hele testproceduren (enten + UV eller ﬂ UV), men som ikke er behandlet med et kemisk stof. Forsłgsmodel, der skal udsige noget om stoffers virkning: en algoritme til beregning af toksisk potentiale ud fra resultaterne af toksicitetstesten. I n(cid:230)rv(cid:230)rende retningslinier kan PIF og MPE anvendes til beregning af det fototoksiske potentiale ud fra resultaterne fra in vitro 3T3 NRU-fototoksicitetstesten. PIF (fotoirritationsfaktor): en faktor, beregnet ud fra sammenlignende m(cid:229)linger af to lige effektive (EC50) cyto- toksiske koncentrationer af teststoffet, ved frav(cid:230)r (ﬂ UV) eller tilstedev(cid:230)relse (+ UV) af en ikke-cytotoksisk bestr(cid:229)ling med UVA/synligt lys. MPE (gennemsnitlig lyseffekt): en ny parameter afledt af matematisk analyse af to responskurvers totale uds- tr(cid:230)kning fremkommet ved frav(cid:230)r (ﬂ UV) eller tilstedev(cid:230)relse (+ UV) af en ikke-cytotoksisk bestr(cid:229)ling med UVA/synligt lys. 8. 6. 2000 DA De Europ(cid:230)iske F(cid:230)llesskabers Tidende L 136/99 Fototoksicitet: et akut, toksisk respons, der opn(cid:229)s efter fłrstegangsuds(cid:230)ttelse af huden for bestemte stoffer og p(cid:229)fłlgende lysp(cid:229)virkning, eller som induceres ved bestr(cid:229)ling af huden efter systemisk indgift af et kemisk stof. Fotoirritation: en underafdeling af udtrykket »fototoksicitet«, som kun beskriver hudens fototoksiske reaktioner p(cid:229) kemikalier, administreret lokalt eller oralt. Disse fototoksiske reaktioner medfłrer altid uspecifikke celle- skader (svarende til solskoldethed). Fotoallergi: en erhvervet immunologisk reaktionsevne, som ikke fremkommer efter den fłrste behandling med kemikaliet og lys, men hvor hudens reaktionsevne fłrst kan p(cid:229)vises efter en induktionsperiode p(cid:229) 1-2 uger. Fotogenotoksicitet: et genotoksisk respons fra gener efter uds(cid:230)ttelse af celler for en ikke-genotoksisk dosis af UV/synligt lys og et ikke-genotoksisk kemikalie. Fotocarcinogenicitet: carcinogenicitet induceret ved gentagne applikationer af kemikalie og lys. Udtrykket »foto co-carcinogenese« anvendes, hvis UV-induceret tumordannelse forłges af et kemikalie. 1. 3. Referencestoffer Ud over som positiv kontrol at teste Chlorpromazin sidelłbende hver gang, anbefales det med henblik p(cid:229) nyetablering af 3T3 NRU-fototoksicitetstesten som referencestoffer at anvende et udvalg af de kemikalier, der er anvendt i de ringprłverne af denne test (1) (3) (13). 1. 4. Indledende betragtninger Mange kemikalietyper er blevet rapporteret som fototoksiske (5) (6) (7) (8). Det eneste f(cid:230)lles tr(cid:230)k er deres evne til at absorbere lysenergi fra sollys. Ifłlge fotokemiens fłrste lov (Grotthaus-Draper’s lov) kr(cid:230)ver en fotoreaktion tilstr(cid:230)kkelig absorption af lyskvanter. Fłr en biologisk testning udfłres efter n(cid:230)rv(cid:230)rende ret- ningslinier, błr kemikaliets absorptionsspektrum for UV/synligt lys fastl(cid:230)gges (f. eks. efter OECD Test Guide- line 101). Hvis den mol(cid:230)re ekstinktions/absorptionskoefficient er mindre end 10 liter (cid:215) molﬂ1 (cid:215) cmﬂ1 har kemikaliet ikke noget fotoreaktivt potentiale, og det er overflłdigt at undersłge det med in vitro 3T3 NRU- fototoksicitetstesten eller nogen anden biologisk test med henblik p(cid:229) p(cid:229)visning af fotokemisk effekt (till(cid:230)g). 1. 5. Testmetodens princip Man har identificeret fire forskellige mekanismer, hvorved et (kemisk) farvelegeme ved lysabsorption kan fremkalde et fototoksisk respons (7). Alle fire medfłrer cellebeskadigelse. In vitro 3T3 NRU-fototoksicitets- testen er derfor baseret p(cid:229) sammenligning af et kemisk stofs cytotoksicitet, n(cid:229)r det ved undersłgelsen uds(cid:230)t- tes eller ikke uds(cid:230)ttes for UVA/synligt lys i en dosis, der ikke i sig selv er cytotoksisk. Cytotoksicitet forst(cid:229)s i denne test som koncentrationsafh(cid:230)ngig reduktion af optagelse af farvestoffet Neutral Red (NR (9)) 24 timer efter behandling med teststoffet og bestr(cid:229)ling. Balb/c 3T3-celler dyrkes i 24 timer, s(cid:229) der dannes et encellet lag. To mikrotiterplader med 96 brłnde hver anvendes pr. teststof. Pladerne pr(cid:230)inkuberes med 8 forskellige koncentrationer af det teststoffet i en time. En af pladerne bliver derefter udsat for ikke-cytotoksisk UVA/synligt lys i en dosis p(cid:229) 5 J/cm2 UVA (+ UV-eks- periment), mens den anden plade l(cid:230)gges młrkt (ﬂ UV-eksperiment). Derefter erstattes behandlingsmediet med dyrkningsmediet p(cid:229) begge plader, og efter 24 timers inkubation bestemmes cellelevedygtigheden ved den m(cid:230)ngde af Neutral Red, der optages (NRU) i lłbet af 3 timer. Den relative cellelevedygtighed, udtrykt som procent af de ubehandlede negative kontroller, beregnes for hver af de 8 testkoncentrationer. Med henblik p(cid:229) vurdering af den fototoksiske styrke sammenlignes det koncentrationsafh(cid:230)ngige respons med (+ UV) eller uden (ﬂ UV) bestr(cid:229)ling, almindeligvis p(cid:229) EC50-niveauet, dvs. ved den koncentration, som neds(cid:230)tter celleleve- dygtigheden med 50 % i forhold til de ubehandlede kontroller. 1. 6. Kvalitetskriterier Cellernes UVA-fłlsomhed, historiske data: cellernes fłlsomhed for UVA błr kontrolleres regelm(cid:230)ssigt. Cellerne uds(cid:229)s med samme t(cid:230)thed som bliver anvendt i in vitro 3T3 NRU-fototoksicitetstesten, bestr(cid:229)les den fłlgende dag med UVA-doser p(cid:229) 1-9 J/cm2, og cellelevedygtigheden m(cid:229)les n(cid:230)ste dag med NRU-testen. Kvalitetskravet er, at levedygtigheden efter bestr(cid:229)ling med 5 J/cm2 ikke er mindre end 80 % af kontrollen, som var opbevaret młrkt. Ved den hłjeste UVA dosis p(cid:229) 9 J/cm2 skal levedygtigheden ikke v(cid:230)re mindre end 50 % af den młrke kontrol. Denne kontrolundersłgelse błr gentages for ca. hver 10. cellegeneration. UVA-fłlsomhed i den negative kontrol, den foreliggende test: kvalitetskravet er, at den negative kontrol (celler i Earl’s Balanced Salt Solution (EBSS) med eller uden 1 % dimethylsulphoxid (DMSO) eller 1 % ethanol (EtOH)) i + UVA-eksperimentet udviser en cellelevedygtighed, som ikke er mindre end 80 % af de ikke-bestr(cid:229)lede celler i samme oplłsning i det parallelt lłbende forsłg i młrke (ﬂ UVA). L 136/100 DA De Europ(cid:230)iske F(cid:230)llesskabers Tidende 8. 6. 2000 Levedygtighed i de negative kontroller: den absolutte optical density/extinction (OD540 NRU) m(cid:229)lt i ekstraktet af NR fra den negative kontrol angiver om de 1 (cid:215) 104 celler uds(cid:229)ede pr. brłnd er vokset med normal fordob- lingstid i undersłgelsens to dłgn. En undersłgelse accepteres, hvis den gennemsnitlige OD540 NRU i de ube- handlede kontroller er ¯ 0,2 Positiv kontrol: et kendt fototoksisk kemikalie skal testes sidelłbende med hver in vitro 3T3 NRU-fototoksici- tetstest. Chlorpromazin (CPZ) blev anvendt som positiv kontrol i EU/COLIPA-valideringsundersłgelsen og anbefales derfor. Nedenst(cid:229)ende kriterier blev defineret for accept af testen udfłrt med CPZ i standardprocedu- ren i in vitro 3T3 NRU-fototoksicitetstesten: CPZ bestr(cid:229)let (+ UVA): EC50 = 0,1 til 2 (cid:181)g/ml, CPZ ikke-bestr(cid:229)let (ﬂ UVA): EC50 = 7,0 til 90,0 (cid:181)g/ml. Fotoirritationsfaktoren (PIF), dvs. (cid:230)ndring af EC50, błr v(cid:230)re mindst 6. Andre kendte fototoksiske kemikalier, der passer til teststoffets kemiske gruppe eller oplłselighedskarakteri- stik, kan anvendes som sidelłbende positiv kontrol i stedet for CPZ. I s(cid:229) fald skal hłjeste og laveste v(cid:230)rdier for EC50 og PIF eller MPE (gennemsnitlig lyseffekt) v(cid:230)re tilstr(cid:230)kkeligt definerede som kriterier for accept af testen. 1. 7. Beskrivelse af testmetoden 1. 7. 1. Forberedelser 1. 7. 1. 1. C e l l e r En stabil musefibroblastcellelinje (cid:151) Balb/c 3T3, klon 31 (cid:151) enten fra ATCC eller fra ECACC blev brugt i vali- deringsundersłgelsen og anbefales derfor. Andre celler kan med held anvendes med samme testfremgangs- m(cid:229)de, hvis dyrkningsbetingelserne er tilpasset disse cellers s(cid:230)rlige behov, men det er nłdvendigt at bevise deres (cid:230)kvivalens. Cellerne m(cid:229) regelm(cid:230)ssigt undersłges for kontamination med mycoplasma og m(cid:229) kun anvendes, hvis en s(cid:229)dan undersłgelse falder tilfredsstillende ud. Eftersom fłlsomheden for UVA har tendens til at forłges med antallet af cellegenerationer, błr Balb/c 3T3-celler med det lavest mulige antal foretr(cid:230)kkes, fortrinsvis mindre end 100. Det er vigtigt, at Balb/c 3T3-cellernes UVA-fłlsomhed kontrolleres regelm(cid:230)ssigt, som beskrevet under kvalitetskontrol i disse ret- ningslinier. 1. 7. 1. 2. M e d i e r o g d y r k n i n g s b e t i n g e l s e r Passende dyrkningsmedier og inkubationsbetingelser błr anvendes til rutinedyrkning af celler og under testen. For Balb/c 3T3-cellers vedkommende er det DMEM, suppleret med 10 % serum fra nyfłdte kalve, 4 mM glu- tamin, penicillin og streptomycin og en inkubation i fugtig atmosf(cid:230)re ved 37 (cid:176)C /7,5 % CO2. Det er specielt vigtigt, at betingelserne for dyrkning sikrer at tiden for cellecyklus er indenfor det normale for cellerne. 1. 7. 1. 3. F r e m s t i l l i n g a f c e l l e k u l t u r e r Nedfrosne celler s(cid:229)s i et dyrkningsmedium med en passende t(cid:230)thed og subkultur anlagt mindst Øn gang, fłr de bliver anvendt i en in vitro 3T3 NRU-fototoksicitetstest. Til brug i fototoksicitetstesten s(cid:229)s cellerne ud i et dyrkningsmedium med en s(cid:229)dan t(cid:230)thed, at cellekulturen ikke konfluerer ved testens afslutning, dvs. n(cid:229)r cellelevedygtigheden m(cid:229)les 48 timer efter uds(cid:229)ning af cellerne. For Balb/c 3T3-celler p(cid:229) en mikrotiterplade med 96 brłnde er den anbefalede cellet(cid:230)thed 1 (cid:215) 104 pr. brłnd. For hvert teststof uds(cid:229)s celler p(cid:229) samme m(cid:229)de i to forskellige mikrotiterplader med 96 brłnde, og de fłres sidelłbende igennem hele testproceduren under identiske dyrkningsbetingelser, bortset fra den tid, hvor den ene plade bestr(cid:229)les (+ UVA/synligt lys) og den anden anbringes i młrke (ﬂ UVA/synligt lys). 1. 7. 1. 4. M e t a b o l i s k a k t i v e r i n g Medens det for alle in vitro-test til p(cid:229)visning af genotoksisk og carcinogenotoksisk potentiale er nłdvendigt at anvende et stofskifteaktiverende system, kendes der, for s(cid:229) vidt ang(cid:229)r fototoksicitet, endnu ikke noget kemikalie, der kr(cid:230)ver et s(cid:229)dant stofskifteaktiverende system for at kunne fungere som et fototoksin in vivo eller in vitro. Det er s(cid:229)ledes ikke i n(cid:230)rv(cid:230)rende test hverken nłdvendigt eller videnskabeligt berettiget at anvende et stofskifteaktiverende system. 8. 6. 2000 DA De Europ(cid:230)iske F(cid:230)llesskabers Tidende L 136/101 1. 7. 1. 5. T e s t s t o f / f r e m s t i l l i n g Teststoffer skal v(cid:230)re frisk fremstillede lige fłr brugen, medmindre data for deres stabilitet p(cid:229)viser, at opbeva- ring kan accepteres. Fremstilling under rłdt lys kan v(cid:230)re nłdvendigt, dersom hurtig fotodegradation kan finde sted. Teststofferne błr oplłses i saltvand med stłdpudevirkning, f. eks. Earl’s Balanced Salt Solution (EBSS) eller fysiologisk saltvand med phosphatstłdpude (PBS), som, for at undg(cid:229) interferens under bestr(cid:229)lingen, ikke m(cid:229) indeholde proteinkomponenter eller lysabsorberende pH-indikatorer. Testkemikalier med begr(cid:230)nset oplłselighed i vand błr oplłses i passende oplłsningsmiddel i 100 gange den łnskede slutkoncentration og derefter fortyndes 1:100 med stłdpude-saltoplłsning. Hvis der anvendes oplłs- ningsmiddel, skal det forefindes i et konstant volumen p(cid:229) 1 % (v/v) i alle kulturer, dvs. i de negative kontroller s(cid:229)vel som i alle fortyndinger af teststoffet. Dimethylsulphoxid (DMSO) og ethanol (EtOH) anbefales som oplłsningsmidler. Andre oplłsningsmidler med lav cytotoksicitet (f. eks. acetone) kan v(cid:230)re passende, men de skal omhyggeligt undersłges for s(cid:230)rlige egen- skaber, f. eks. reaktion med teststoffet, quenching af den fototoksiske effekt, evnen til at opfange radikaler. Vortexblanding og/eller ultralydbehandling og/eller opvarmning til 37 (cid:176)C kan anvendes for at łge oplłsnings- processen. 1. 7. 1. 6. U V - b e s t r (cid:229) l i n g / f r e m s t i l l i n g Lyskilde: valget af en passende lyskilde med passende filter er den mest afgłrende faktor i testning for fototok- sicitet. UVA og synligt lys ledsages almindeligvis af fotosensibilisering (7) (10), mens UVB er mindre relevant og direkte st(cid:230)rkt cytotoksisk i stigende grad op til 1000 gange fra 313 til 280 nm (11). Som kriterium for valg af den rigtige lyskilde er det vigtigt, at lyskilden udsender błlgel(cid:230)ngder, som absorberes af teststoffet, og at lysdosis (opn(cid:229)et indenfor en rimelig tid) er tilstr(cid:230)kkelig til p(cid:229)visning af stoffer, der er kendt for fotosensi- bilisering. Yderligere błr de anvendte błlgel(cid:230)ngder og doser, inklusive varmep(cid:229)virkning (infrarłdt lys), ikke v(cid:230)re unłdigt skadelige for testsystemet. Lamper med kunstigt sollys regnes for den optimale lyskilde. Lys fra b(cid:229)de xenon- og (doteret) kviksłlvmetal- halidlysbuer bruges. Sidstn(cid:230)vnte har den fordel, at den udsender mindre varme og er billigere, men den mat- cher ikke sollyset perfekt. Eftersom alle kunstige sollyskilder udsender betydelige m(cid:230)ngder UVB, błr de for- synes med passende filtre for at sv(cid:230)kke de meget toksiske UVB-błlgel(cid:230)ngder. in vitro 3T3 NRU-fototoksicitetstesten błr et bestr(cid:229)lingsspektrum praktisk taget uden UVB anvendes Til (UVA:UVB p 1:20). Et eksempel p(cid:229) den spektrale str(cid:229)lingsfordeling fra det i valideringsundersłgelsen af in vitro 3T3 NRU-fototoksicitetstesten anvendte kunstige sollys er offentliggjort (3). Dosimetri: str(cid:229)lingsintensiteten (irradiance) skal regelm(cid:230)ssigt checkes fłr hver test for fototoksicitet, ved hj(cid:230)lp af et passende bredb(cid:229)ndet UV-meter. UV-meteret skal v(cid:230)re kalibreret til lyskilden. Dets funktionsevne skal checkes, til hvilket form(cid:229)l brugen af et reference UV-meter af samme type og identisk kalibrering anbefales. Ideelt er det med stłrre intervaller at bruge et spektroradiometer for at m(cid:229)le den spektrale str(cid:229)lingsintensitet fra den med filter forsynede lyskilde og for at checke kalibreringen af det bredb(cid:229)ndede UV-meter, men til anvendelse af s(cid:229)dant apparatur kr(cid:230)ves passende uddannet personale. En dosis p(cid:229) 5 J/cm2 UVA blev i valideringsundersłgelsen fastlagt som v(cid:230)rende uden cytotoksisk effekt p(cid:229) Balb/c 3T3-celler og tilstr(cid:230)kkeligt kraftig til at aktivere selv svagt fototoksiske kemikalier. For at opn(cid:229) 5 J/cm2 inden for en periode p(cid:229) 50 minutter skal str(cid:229)lingsintensiteten s(cid:230)ttes til 1,666 mW/cm2. Hvis man anvender andre celler eller en anden lyskilde, skal UVA-dosis rettes til, s(cid:229) den ikke er skadelig for cellerne, men til- str(cid:230)kkelig til at p(cid:229)vise standardfototoksiner. Lyseksponerinstiden beregnes p(cid:229) fłlgende m(cid:229)de: 1. 7. 2. Testbetingelser Hłjeste koncentration af et teststof błr ikke overskride 100 (cid:181)l/ml, idet alle fototoksiske kemikalier er fundet ved brug af lavere koncentrationer, medens hłjere koncentrationer har tendens til at give falsk positive resul- tater (13). PH i oplłsningen med den hłjeste koncentration af teststoffet błr for at v(cid:230)re rimelig ligge mellem 6,5 og 7,8. L 136/102 DA De Europ(cid:230)iske F(cid:230)llesskabers Tidende 8. 6. 2000 De forskellige koncentrationer af et teststof med (+ UVA) eller uden (ﬂ UVA) lys błr fastl(cid:230)gges i et forudg(cid:229)- ende forsłg. Koncentrationerne, deres intervaller og deres hłjeste og laveste gr(cid:230)nse skal justeres s(cid:229)dan, at koncentration/respons-kurverne er tilstr(cid:230)kkeligt underbygget af de eksperimentelle data. Geometrisk fortyn- dingsr(cid:230)kke (med en konstant fortyndingsfaktor) błr anvendes. 1. 7. 3. Fremgangsm(cid:229)de (1) 1. 7. 3. 1. 1. d a g Der fremstilles en suspension af 1 (cid:215) 105 celler/ml i et kulturmedium. 100 (cid:181)l af det rene kulturmedium afpipet- teres i de perifere brłnde i en mikrotiterplade med 96 brłnde til v(cid:230)vskultur, disse udgłr de negative kontrol- ler. I de resterende brłnde afpipetteres 100 (cid:181)l af cellesuspensionen med 1 (cid:215) 105 celler/ml (= 1 (cid:215) 104 celler/ brłnd). Der fremstilles 2 plader pr. teststof, den ene til bestemmelse af cytotoksicitet (ﬂ UVA) og den anden til bestemmelse af fototoksicitet (+ UVA). Cellerne inkuberes i 24 timer (37 (cid:176)C /7,5 % CO2), indtil der har dannet sig et halvt sammenflydende enkeltlag. Denne inkubationsperiode giver cellerne mulighed for at regenerere og vedh(cid:230)fte sig samt for eksponentiel v(cid:230)kst. 1. 7. 3. 2. 2. d a g Efter inkubationen dekanteres kulturmediet fra cellerne, og der vaskes to gange med 150 (cid:181)l EBSS/PBS pr. brłnd. Der tils(cid:230)ttes 100 (cid:181)l EBSS/PBS indeholdende den passende koncentration af teststoffet eller kun 100 (cid:181)l oplłsningsmiddel (negativ kontrol). Der anvendes 8 forskellige koncentrationer af teststoffet. Cellerne inkube- res med teststoffet i młrke i 60 minutter (37 (cid:176)C /7,5 % CO2). Under + UVA-forsłget bestr(cid:229)les cellerne ved stuetemperatur i 50 minutter gennem l(cid:229)get p(cid:229) mikrotiterpladen med 1,7 mW/cm2 UVA (= 5 J/cm2). Med en elektrisk vifte hindres dannelse af kondensvand under l(cid:229)get. Den tilsvarende ﬂ UVA-plade opbevares i młrke ved stuetemperatur ligeledes i 50 minutter. Testoplłsningen dekanteres, vaskes to gange med 150 (cid:181)l EBSS/PBS. Kulturmediet erstattes med EBSS/PBS og inkuberes (37 (cid:176)C /7,5 % CO2) til n(cid:230)ste dag (18-22 timer). 1. 7. 3. 3. 3. d a g Mikroskopisk evaluering Cellerne undersłges i mikroskop med fasekontrast. Forandringer i cellernes morfologi, som skyldes cytotoksi- ske virkninger fra teststoffet, noteres. Dette check anbefales for at udelukke fejl i forsłget, men noterne bru- ges ikke til evaluering af cytotoksicitet eller fototoksicitet. Neutral Red’s optagelse i cellerne Cellerne vaskes med 150 (cid:181)l forvarmet EBSS/PBS. Vaskeoplłsning fjernes ved at banke let p(cid:229) pladen. 100 (cid:181)l Neutral Red-oplłsning tils(cid:230)ttes, inkuberes i fugtig atmosf(cid:230)re ved 37 (cid:176)C og 7,5 % CO2 i 3 timer. Efter inkubationen fjernes Neutral Red-oplłsningen, og cellerne vaskes med 150 (cid:181)l EBSS/PBS. Der dekanteres og trykkes efter med sugende papir, s(cid:229) alt EBSS/PBS fjernes. (Eventuelt: pladen centrifugeres, s(cid:229) v(cid:230)sken slyn- ges bort). Der tils(cid:230)ttes nłjagtig 150 (cid:181)l oplłsning af frisk fremstillet ethanol/eddikesyre, som ekstraherer Neutral Red. Mikrotiterpladen rystes hurtigt p(cid:229) en dertil beregnet shaker i 10 minutter, indtil al Neutral Red er fjernet fra cellerne og har dannet en homogen oplłsning. OD af Neutral Red-ekstraktet m(cid:229)les ved 540 nm i et spektrofotometer, med de negative kontroller som refe- rence. Resultaterne opbevares i et passende filformat (f. eks. ASCII) med henblik p(cid:229) senere analyse. (1) Yderligere detaljer findes i reference (12). 8. 6. 2000 DA De Europ(cid:230)iske F(cid:230)llesskabers Tidende L 136/103 2. DATA 2. 1. Kvalitative og kvantitative data Resultaterne af undersłgelsen skal give mulighed for en analyse af koncentration/respons fremkommet med og uden bestr(cid:229)ling af UVA/synligt lys. Hvis der p(cid:229)vises cytotoksicitet, skal man anfłre hłjeste og laveste undersłgte koncentration, og de forskellige koncentrationer, der er anvendt, skal tilsammen indtegnes p(cid:229) en kurve over tallene. Da et teststof i młrke (ﬂ UVA) kan v(cid:230)re uden cytotoksisk effekt i koncentrationer op til de 100 (cid:181)g/ml, som er sat som gr(cid:230)nse, men st(cid:230)rkt cytotoksisk, n(cid:229)r det bliver bestr(cid:229)let (+ UVA), kan det v(cid:230)re nłdvendigt at undersłge det p(cid:229)g(cid:230)ldende stof i forskellige fortyndingsr(cid:230)kker i de to systemer. Hvis der ikke p(cid:229)vises cytotoksicitet, hverken med UVA/synligt lys eller uden UVA/synligt lys, behłver man ikke anvende s(cid:229) mange forskellige koncentrationer i undersłgelsen. Et klart positivt resultat kr(cid:230)ver ikke bekr(cid:230)ftelse i en ny undersłgelse, og det samme g(cid:230)lder klart negative resultater, hvis stoffet er undersłgt i tilstr(cid:230)kkeligt hłje koncentrationer. I disse tilf(cid:230)lde er det tilstr(cid:230)kkeligt med Øt forsłg, hvis der forud herfor er gennemfłrt et eller flere forberedende forsłg, med henblik p(cid:229) at finde de rette koncentrationer. Usikre resultater, der ligger n(cid:230)r gr(cid:230)nsev(cid:230)rdien, skal kontrolleres ved at gentage undersłgelsen. Hvis det er nłdvendigt at gentage en undersłgelse, kan det v(cid:230)re p(cid:229)kr(cid:230)vet at variere forsłgsbetingelserne for at opn(cid:229) et klart resultat. Af central betydning i denne sammenh(cid:230)ng er fremstilling af flere oplłsninger med teststoffet. En (cid:230)ndring heri (co-solvens, blanding, ultralydbehandling) kan v(cid:230)re s(cid:230)rdeles relevant ved gen- tagelsen af en undersłgelse. Alternativt kan en (cid:230)ndring i inkubationstiden fłr bestr(cid:229)ling overvejes. En kortere tid kan v(cid:230)re relevant for stoffer, der er ustabile i vandig oplłsning. 2. 2. Behandling af resultaterne Hvor det er muligt, fastl(cid:230)gges den koncentration af teststoffet, der giver en 50 % h(cid:230)mning af celle-NRU (EC50). Dette kan głres ved anvendelse af passende ikke-line(cid:230)r regression (fortrinsvis en Hill-funktion eller logistisk regression) p(cid:229) koncentration/respons-data eller andre passende procedurer (14). Fłr EC50 anvendes til videre beregninger, skal beregningerne checkes. Alternativt kan beregningen af EC50 foretages grafisk. Det anbefales at anvende sandsynlighedspapir (x-akse: log, y-akse: probit), da koncentration/respons-funktionen ofte vil v(cid:230)re n(cid:230)sten line(cid:230)r efter denne transformation. 2. 3. Evaluering af resultaterne (forsłgsmodeller, der skal forudsige noget om stoffers virkning) 2. 3. 1. Forsłgsmodel 1, der skal forudsige noget om fotoirritationsfaktoren (PIF) Hvis der opn(cid:229)s komplette koncentration/respons-kurver b(cid:229)de med lys (+ UVA) og uden (ﬂ UVA) lys, kan fotoirritationsfaktoren (PIF) beregnes efter fłlgende formel: PIF < 5 peger ikke p(cid:229) noget fototoksisk potentiale, mens PIF ¯ 5 pege p(cid:229) fototoksisk potentiale. Hvis et kemikalie kun er cytotoksisk + UVA, men ikke ved undersłgelsen ﬂ UVA, kan PIF ikke beregnes, selv om resultatet peger p(cid:229) et fototoksisk potentiale. I s(cid:229)danne tilf(cid:230)lde kan »> PIF« beregnes, hvis (ﬂ UV)-cytotoksi- citetstesten udfłres til og med den hłjeste testkoncentration (Cmax), og denne v(cid:230)rdi anvendes til beregningen af »> PIF«: Hvis m(cid:229)lingerne kun viser »> PIF«, peger enhver v(cid:230)rdi > 1 p(cid:229) et fototoksisk potentiale. Hvis hverken EC50 (ﬂ UV) og EC50 (+ UV) kan beregnes, fordi kemikaliet selv ikke i den hłjeste testkoncentra- tion udviser cytotoksicitet, er der ikke tale om et fototoksisk potentiale. I s(cid:229)danne tilf(cid:230)lde anvendes et formelt »PIF = *1« til at karakterisere resultatet. L 136/104 DA De Europ(cid:230)iske F(cid:230)llesskabers Tidende 8. 6. 2000 Hvis m(cid:229)lingerne kun viser »PIF = *1«, peges der ikke p(cid:229) noget fototoksisk potentiale. I tilf(cid:230)ldene (b) og (c) skal koncentrationerne fundet i in vitro 3T3 NRU-fototoksicitetstesten nłje tages i betragtning, n(cid:229)r der peges p(cid:229) et fototoksisk potentiale. 2. 3. 2. Forsłgsmodel 2, der skal udsige noget om den gennemsnitlige lyseffekt (MPE) Alternativt kan anvendes en ny model til p(cid:229)visning af fototoksisk potentiale. Den er blevet udviklet ud fra data opn(cid:229)et under EU/COLIPA-valideringsundersłgelsen (15) og blindtestet i en p(cid:229)fłlgende in vitro-undersł- gelse af UV-filterkemikaliers fototoksicitet (13). Denne model kommer uden om PIF-modellens begr(cid:230)nsninger i de tilf(cid:230)lde, hvor EC50 ikke kan findes. Modellen anvender den gennemsnitlige lyseffekt (MPE), et m(cid:229)l, som er baseret p(cid:229) en sammenligning af komplette koncentration/respons-kurver. Humboldt Universitetet i Berlin) har udviklet et computerprogram til MPE-modellen, som kan f(cid:229)s gratis. 2. 4. Tolkning af resultaterne Et positivt resultat i in vitro 3T3 NRU-fototoksicitetstesten (PIF ¯ 5 eller MPE ¯ 0,1 ) viser, at teststoffet er fototoksisk. Hvis et s(cid:229)dant resultat er opn(cid:229)et ved koncentrationer under 10 (cid:181)g/ml, er det sandsynligt, at test- stoffet ogs(cid:229) in vivo er fototoksisk ved lysp(cid:229)virkning. Hvis et positivt resultat kun er opn(cid:229)et ved den hłjeste testkoncentration p(cid:229) 100 (cid:181)g/ml, kan det v(cid:230)re nłdvendigt med yderligere overvejelser over stoffets risikoe- genskaber eller fototoksicitet. Disse overvejelser kan g(cid:229) p(cid:229) data vedrłrende penetration, absorption og mulig akkumulation af stoffet i huden eller p(cid:229) brugen af en alternativ test, f. eks. en in vitro-hudtest med human hud, med henblik p(cid:229) af- eller bekr(cid:230)ftelse af stoffets risikoegenskaber. Et negativt resultat i in vitro 3T3 NRU-fototoksicitetstesten (PIF > 5 eller MPE < 0,1 ) viser at teststoffet ikke er fototoksisk over for pattedyrceller dyrket p(cid:229) den beskrevne m(cid:229)de. I de tilf(cid:230)lde, hvor stoffet viser negative resultater helt op til den hłjeste koncentration p(cid:229) 100 (cid:181)g/ml, betyder et negativt resultat, at stoffet ikke er fototoksisk, og at fototoksicitet in vivo er usandsynlig. Konklusionen vil v(cid:230)re den samme, hvis der fremkom- mer identiske koncentrationstoksicitetssvar (EC50+ UV og EC50ﬂ UV) ved lavere koncentrationer. Hvis der deri- mod ikke p(cid:229)vises toksicitet (+ UV og ﬂ UV), og hvis oplłseligheden i vand har begr(cid:230)nset den mulige koncen- tration til v(cid:230)rdier under 100 (cid:181)g/ml, kan man betvivle testens egnethed til det p(cid:229)g(cid:230)ldende stof, og bekr(cid:230)ftende undersłgelser m(cid:229) tages i betragtning (f. eks. en in vitro-hudmodel eller en ex vivo-hudmodel eller en in vivo-test). 3. RAPPORTERING Testrapport Testrapporten skal indeholde fłlgende information: Teststoffet: (cid:151) Identifikationsdata og CAS-nummer, hvis kendt (cid:151) Fysiske egenskaber og renhedsgrad (cid:151) Fysisk-kemiske egenskaber, som er relevante for undersłgelsen (cid:151) Stabilitet og fotostabilitet, hvis kendt Oplłsningsmiddel: (cid:151) Begrundelse for valg af oplłsningsmiddel (cid:151) Teststoffets oplłselighed i oplłsningsmidlet (cid:151) M(cid:230)ngden (i procent) af oplłsningsmiddel i kulturmediet (EBSS eller PBS) Celler: (cid:151) Celletype og oprindelse (cid:151) Frav(cid:230)r af mycoplasma (cid:151) Antal generationer, hvis kendt (cid:151) Cellernes fłlsomhed for UVA, m(cid:229)lt med det str(cid:229)lingsudstyr, som anvendes i in vitro 3T3 NRU-fototoksi- citetstesten Testbetingelser (a); inkubation fłr og efter uds(cid:230)ttelsen for kemikaliet: (cid:151) Type og sammens(cid:230)tning af dyrkningsmediet (cid:151) Omst(cid:230)ndigheder ved inkubationen (CO2-koncentration, temperatur, fugtighed) (cid:151) Varighed af inkubationen (fłr og efter uds(cid:230)ttelsen for kemikaliet) 8. 6. 2000 DA De Europ(cid:230)iske F(cid:230)llesskabers Tidende L 136/105 Testbetingelser (b); uds(cid:230)ttelsen for kemikaliet (cid:151) Begrundelse for valg af koncentrationer af teststoffet b(cid:229)de med og uden bestr(cid:229)ling med UV/synligt lys (cid:151) Begrundelse for den stłrste koncentration anvendt ved undersłgelsen, dersom stoffet er tungtoplłseligt, og cytotoksicitet ikke er p(cid:229)vist (cid:151) Type og sammens(cid:230)tning af behandlingsmediet (stłdpude-salt-oplłsningen) (cid:151) Varigheden af uds(cid:230)ttelsen for det kemiske stof Testbetingelser (c); bestr(cid:229)ling (cid:151) Begrundelse for valget af lyskilde (cid:151) Lyskildens spektrale str(cid:229)lingskarakteristik (cid:151) Det (de) anvendte filterfiltres transmission/absorptions-karakteristik (cid:151) Det anvendte spektroradiometers karakteristik og detaljeret beskrivelse af dets kalibrering (cid:151) Afstanden mellem lyskilden og testsystemet (cid:151) UVA-str(cid:229)lingsintensiteten (irradiance) for den p(cid:229)g(cid:230)ldende afstand udtrykt i mW/cm2 (cid:151) Varigheden af uds(cid:230)ttelsen for UV/synligt lys (cid:151) UVA-dosis (str(cid:229)lingsintensitet (cid:215) tid) udtrykt i J/cm2 (cid:151) Temperaturen i cellekulturen under bestr(cid:229)lingen og den tilsvarende cellekultur samtidigt opbevaret i młrke Testbetingelser (d); NRU-testen (cid:151) Sammens(cid:230)tning af Neutral Red-mediet (cid:151) Varigheden af inkubationen med NR (cid:151) Omst(cid:230)ndigheder ved inkubationen (CO2-koncentration, temperatur, fugtighed) (cid:151) Omst(cid:230)ndighederne ved ekstraktion af NR (ekstraktionsmiddel, varighed) (cid:151) Błlgel(cid:230)ngde anvendt ved den spektrofotometriske afl(cid:230)sning af OD (ekstinktionen) for NR (cid:151) Angivelse af eventuel referencebłlgel(cid:230)ngde (cid:151) Indholdet i brłnden anvendt til eventuel m(cid:229)ling af negative kontroller Resultater (cid:151) Cellelevedygtighed for hver koncentration af teststoffet udtrykt som procent af levedygtigheden i kontrol- lerne (cid:151) Koncentration/respons-kurver (koncentration af teststoffet over for den relative cellelevedygtighed), frem- kommet i samhłrende eksperimenter, + UVA og ﬂ UVA (cid:151) Analyse af data af kurverne over koncentration/respons; hvis muligt beregning/kalkulation af EC50 (+ UVA) og EC50 (ﬂ UVA) (cid:151) Sammenligning af de to koncentration/respons-kurver, som er fremkommet ved bestr(cid:229)ling med og uden UVA/synligt lys, enten ved beregning af fotoirritationsfaktor (PIF), eller beregning af den gennemsnitlige lyseffekt (MPE) (cid:151) Klassifikation af fototoksiciteten (cid:151) Kriterier for accept af test (a), samtidig negativ kontrol: (cid:151) Absolut levedygtighed (ekstinktion (OD) for NR-ekstraktet) for bestr(cid:229)lede og ikke-bestr(cid:229)lede celler (cid:151) Forklarende data for den negative kontrol, gennemsnit og standarddeviation (cid:151) Kriterier for accept af test (b), samtidig positiv kontrol: (cid:151) EC50 (+ UVA) og EC50 (ﬂ UVA) og PIF for den positive kontrols kemikalie (cid:151) forklarende data for den positive kontrols kemikalie: EC50 (+ UVA) og EC50 (ﬂ UVA) og PIF, gennem- snit og standarddeviation Diskussion af resultater Konklusioner L 136/106 DA De Europ(cid:230)iske F(cid:230)llesskabers Tidende 8. 6. 2000 4. REFERENCER (1) Spielmann, H. , Balls, M. , D(cid:246)ring, B. , Holzh(cid:252)tter, H. G. , Kalweit, S. , Klecak, G. , L’Eplattenier, H. , Liebsch, M. , Lovell, W. W. , Maurer, T. , Moldenhauer, F. , Moore, L. , Pape, W. , Pfannbecker, U. , Potthast, J. , De Sil- va, O. , Steiling, W. and Willshaw, A. ( 1994), EEC/COLIPA project on in vitro phototoxicity testing: First results obtained with a Balb/c 3T3 cell phototoxicity assay, Toxicology in Vitro 8, s. 793-796. (2) Anon (1998), Statement on the scientific validity of the 3T3 NRU PT test (an in vitro test for phototoxi- city), European Commission, Joint Research Centre: ECVAM and DGXI/E/2, 3 November 1997, ATLA 26, s. 7-8. (3) Spielmann, H. , Balls, M. , Dupuis, J. , Pape, W. J. W. , Pechovitch, G. , De Silva, O. , Holzh(cid:252)tter, H. G. , Clot- hier, R. , Desolle, P. , Gerberick, F. , Liebsch, M. , Lovell, W. W. , Maurer, T. , Pfannenbecker, U. , Potthast, J. M. , Csato, M. , Sladowski, D. , Steiling, W. and Brantom, P. (1998), EU/COLIPA »In vitro phototoxicity« validation study, results of phase II (blind trial), part 1: the 3T3 NRU phototoxicity test, Toxicology in Vitro 12, s. 305-327. (4) OECD Test Guidelines Programme, ENV/MC/CHEM/TG(96)9: Final Report of the OECD Workshop on Harmonisation of Validation and Acceptance Criteria of Alternative Toxicological Test Methods, OECD Publications Office, Paris, 1996. (5) Lovell, W. W. (1993), A scheme for in vitro screening of substances for photoallergenic potential, Toxico- logy in Vitro 7, s. 95-102. (6) Santamaria, L. and Prino, G. (1972), List of the photodynamic substances, Research progress in organic, biological and medicinal chemistry Vol. 3 Part 1, North Holland Publishing Co, Amsterdam, s. XI-XXXV. (7) Spielmann, H. , Lovell, W. W. , H(cid:246)lzle, E. , Johnson, B. E. , Maurer, T. , Miranda, M. A. , Pape, W. J. W. , Sapora, O. and Sladowski, D. (1994), In vitro phototoxicity testing: The report and recommendations of ECVAM workshop 2, ATLA 22, s. 314-348. (8) Spikes, J. D. (1989), Photosensitization, The science of photobiology, edited by KC Smith, Plenum Press, New York, 2nd edition, s. 79-110. (9) Borenfreund, E. and Puerner, J. A. (1985), Toxicity determination in vitro by morphological alterations and neutral red absorption, Toxicology Letters 24, s. 119-124. (10) Lambert L. A, Warner W. G. and Kornhauser A. (1996), Animal models for phototoxicity testing, Der- matotoxicology, edited by FN Marzulli and HI Maibach, published by Taylor & Francis, Washington DC, 5th Edition, s. 515-530. (11) Tyrrell R. M. and Pidoux M (1987), Action spectra for human skin cells: estimates of the relative cytoto- xicity of the middle ultraviolet, near ultraviolet and violet regions of sunlight on epidermal keratinocy- tes, Cancer Research 47, s. 1825-1829. (12) ZEBET/ECVAM/COLIPA, Standard Operating Procedure: Balb/c 3T3 NRU Phototoxicity Test, drafted 23 December 1997 by M. Liebsch and approved 6 March 1998 by the Management Team of the EU/ COLIPA project »In Vitro Photoirritation«. (13) Spielmann, H. , Balls, M. , Dupuis, J. , Pape, W. J. W. , De Silva, O. , Holzh(cid:252)tter, H. G. , Gerberick, F. , Liebsch, M. , Lovell, W. W. and Pfannenbecker (1998), A Study on the Phototoxic Potential of UV Filter Chemicals from Annex VII of the EU Directive 76/768/EEC in the 3T3 NRU In Vitro Phototoxicity Test, ATLA 26, s. 679-708. (14) Holzh(cid:252)tter, H. G. and Quedenau, J. (1995), Mathematical modelling of cellular responses to external sig- nals, Journal of Biological Systems 3, s. 127-138. (15) Holzh(cid:252)tter, H. G. (1997), A general measure of in vitro phototoxicity derived from pairs of dose-res- ponse curves and its use for predicting the in vivo phototoxicity of chemicals, ATLA 25, s. 445-462. 8. 6. 2000 DA De Europ(cid:230)iske F(cid:230)llesskabers Tidende L 136/107 Till(cid:230)g


title: Règlement (CE) nº 836/2000 de la Commission, du 25 avril 2000, établissant des valeurs unitaires pour la détermination de la valeur en douane de certaines marchandises périssables

eurovoc_concepts:
customs valuation
fruit
perishable goods
vegetable

text: 27. 4. 2000 FR Journal officiel des Communautés européennes L 102/9 RÈGLEMENT (CE) No 836/2000 DE LA COMMISSION du 25 avril 2000 établissant des valeurs unitaires pour la détermination de la valeur en douane de certaines marchan- dises périssables LA COMMISSION DES COMMUNAUTÉS EUROPÉENNES, vu le traité instituant la Communauté européenne, vu le règlement (CEE) no 2913/92 du Conseil du 12 octobre 1992 établissant le code des douanes communautaire (1), modifié en dernier lieu par le règlement (CE) no 955/1999 du Parlement européen et du Conseil (2), (CEE) no 2913/92 établissant vu le règlement (CEE) no 2454/93 de la Commission du 2 juillet 1993 fixant certaines dispositions d'application du règle- ment le code des douanes communautaire (3), modifié en dernier lieu par le règlement (CE) no 1662/1999 (4), et notamment son article 173, para- graphe 1, considérant ce qui suit: (1) Les articles 173 à 177 du règlement (CEE) no 2454/93 prévoient la Commission de valeurs unitaires périodiques pour les l'établissement par critères pour les produits désignés selon la classification reprise à l'annexe no 26 de ce règlement. (2) L'application des règles et critères fixés dans les articles visés ci-dessus aux éléments qui ont été communiqués à la Commission conformément aux dispositions de l'ar- ticle 173, paragraphe 2, du règlement précité conduit à établir pour les produits considérés les valeurs unitaires comme il est indiqué à l'annexe du présent règlement, A ARRÊTÉ LE PRÉSENT RÈGLEMENT: Article premier Les valeurs unitaires visées à l'article 173, paragraphe 1, du règlement (CEE) no 2454/93 sont établies comme indiqué dans le tableau figurant en annexe. Le présent règlement entre en vigueur le 28 avril 2000. Article 2 Le présent règlement est obligatoire dans tous ses éléments et directement applicable dans tout État membre. Fait à Bruxelles, le 25 avril 2000. Par la Commission Erkki LIIKANEN Membre de la Commission (1) JO L 302 du 19. 10. 1992, p. 1. (2) JO L 119 du 7. 5. 1999, p. 1. (3) JO L 253 du 11. 10. 1993, p. 1. (4) JO L 197 du 29. 7. 1999, p. 25. L 102/10 FR Journal officiel des Communautés européennes 27. 4. 2000 ANNEXE Désignation des marchandises Montants des valeurs unitaires/100 kg net Rubrique Espèces, variétés, code NC 1. 10 Pommes de terre de primeurs 0701 90 50 1. 30 Oignons autres que de semence 0703 10 19 1. 40 Aulx 0703 20 00 1. 50 Poireaux ex 0703 90 00 1. 60 Choux-fleurs 0704 10 00 1. 70 Choux de Bruxelles 0704 20 00 1. 80 Choux blancs et choux rouges 0704 90 10 1. 90 Brocolis asperges ou à jets [Brassica oleracea L. convar. botrytis (L. ) Alef var. italica Plenck] ex 0704 90 90 1. 100 Choux de Chine ex 0704 90 90 1. 110 Laitues pommées 0705 11 10 1. 120 Endives ex 0705 29 00 1. 130 Carottes ex 0706 10 00 1. 140 Radis ex 0706 90 90 1. 160 Pois (Pisum sativum) 0708 10 00 a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) EUR FIM SEK ATS FRF BEF/LUF DEM IEP GBP DKK ITL GRD NLG ESP PTE 45,79 272,24 377,49 630,06 300,35 1 847,10 30,90 183,71 254,73 425,16 202,68 1 246,42 126,64 752,96 1 044,04 1 742,59 830,70 5 108,62 45,99 273,47 379,18 632,89 301,70 1 855,39 55,28 328,68 455,74 760,67 362,61 2 229,99 59,69 354,90 492,10 821,35 391,54 2 407,89 37,17 221,01 306,45 511,49 243,83 1 499,49 105,95 629,95 873,47 1 457,90 694,99 4 274,01 63,11 375,22 520,27 868,38 413,96 2 545,75 152,67 907,73 1 258,64 2 100,79 1 001,45 6 158,69 21,82 129,74 179,89 300,25 143,13 880,22 43,48 258,49 358,42 598,23 285,18 1 753,78 129,01 767,08 1 063,62 1 775,28 846,28 5 204,42 406,91 2 419,37 3 354,64 5 599,19 2 669,15 16 414,68 89,55 36,06 27,17 60,43 24,33 18,33 247,68 99,74 75,15 89,96 36,22 27,29 108,12 43,54 32,80 116,74 47,01 35,42 72,70 29,27 22,06 207,22 83,44 62,87 123,43 49,70 37,45 298,60 120,24 90,59 42,68 17,18 12,95 85,03 34,24 25,80 252,33 101,61 76,56 795,85 320,47 241,46 341,31 88 658,51 15 357,40 100,90 7 618,53 9 179,73 230,32 59 826,68 10 363,16 68,09 5 140,98 6 194,47 943,98 245 207,88 42 474,82 279,08 21 071,01 25 388,90 342,84 89 056,61 15 426,35 101,36 7 652,74 9 220,95 412,06 107 037,01 18 540,91 121,82 9 197,82 11 082,64 444,94 115 575,96 20 020,03 131,54 9 931,58 11 966,77 277,08 71 973,67 12 467,25 81,91 6 184,78 7 452,18 789,76 205 147,81 35 535,63 233,48 17 628,60 21 241,07 470,41 122 193,16 21 166,26 139,07 10 500,20 12 651,92 1 138,02 295 610,34 51 205,52 336,44 25 402,15 30 607,59 162,65 42 249,41 7 318,43 48,08 3 630,54 4 374,52 324,07 84 179,53 14 581,55 95,81 7 233,65 8 715,97 961,69 249 806,52 43 271,40 284,31 21 466,17 25 865,04 3 033,14 136 477,38 896,71 787 886,27 67 704,01 81 577,99 27. 4. 2000 FR Journal officiel des Communautés européennes L 102/11 Désignation des marchandises Montants des valeurs unitaires/100 kg net Rubrique Espèces, variétés, code NC 1. 170 Haricots: 1. 170. 1 Haricots (Vigna spp. , Phaseolus ssp. ) ex 0708 20 00 1. 170. 2 Haricots (Phaseolus ssp. , vulgaris var. Compressus Savi) ex 0708 20 00 1. 180 Fèves ex 0708 90 00 1. 190 Artichauts 0709 10 00 1. 200 Asperges: 1. 200. 1 — vertes ex 0709 20 00 1. 200. 2 — autres ex 0709 20 00 1. 210 Aubergines 0709 30 00 1. 220 Céleris à côtes, aussi dénommés céleris en bran- ches [Apium graveolens L. , var. dulce (Mill. ) Pers. ] ex 0709 40 00 1. 230 Chanterelles 0709 51 30 1. 240 Piments doux ou poivrons 0709 60 10 1. 250 Fenouil 0709 90 50 1. 270 Patates douces, entières, fraîches (destinées à la consommation humaine) 0714 20 10 2. 10 Châtaignes et marrons (Castanea spp. ), frais ex 0802 40 00 2. 30 Ananas, frais ex 0804 30 00 a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) EUR FIM SEK ATS FRF BEF/LUF DEM IEP GBP DKK ITL GRD NLG ESP PTE 142,45 847,00 1 174,42 1 960,22 934,44 5 746,60 139,06 826,81 1 146,44 1 913,51 912,17 5 609,67 157,74 937,88 1 300,44 2 170,55 1 034,71 6 363,22 — — — — — — 424,03 2 521,18 3 495,81 469,06 2 788,90 3 867,02 5 834,81 2 781,47 17 105,43 6 454,40 3 076,83 18 921,80 159,41 947,79 1 314,18 2 193,49 1 045,64 6 430,47 278,62 112,19 84,53 271,98 109,52 82,52 308,51 124,23 93,60 — — — 829,34 333,95 251,62 917,40 369,41 278,34 311,77 125,54 94,59 1 061,87 275 830,37 47 779,24 313,93 23 702,43 28 559,56 1 036,57 269 257,71 46 640,72 306,45 23 137,64 27 879,03 1 175,81 305 427,23 52 906,00 347,61 26 245,73 31 624,03 — — — — — — 3 160,78 142 220,50 934,44 821 041,41 70 553,07 85 010,88 3 496,41 157 322,46 1 033,67 908 225,26 78 044,88 94 037,93 1 188,24 308 655,19 53 465,14 351,29 26 523,11 31 958,25 50,02 297,40 412,37 688,28 328,10 2 017,76 97,83 39,39 29,68 372,85 96 850,10 16 776,34 110,23 8 322,44 10 027,89 1 699,80 10 106,55 14 013,49 23 389,76 11 149,96 68 569,76 3 324,52 1 338,70 1 008,66 12 670,48 570 112,92 282 822,92 3 745,87 340 779,30 3 291 271,75 225,26 1 339,35 1 857,11 3 099,68 1 477,63 9 087,07 73,55 437,31 606,36 1 012,07 482,46 2 967,00 53,79 319,81 443,44 740,15 352,83 2 169,83 176,48 1 049,30 1 454,94 2 428,42 1 157,63 7 119,19 66,58 395,84 548,86 916,10 436,71 2 685,64 440,58 177,41 133,67 143,85 57,93 43,64 105,20 42,36 31,92 345,16 138,99 104,72 130,21 52,43 39,51 1 679,13 436 169,41 75 553,11 496,41 37 480,56 45 161,12 548,25 142 412,66 24 668,67 162,08 12 237,69 14 745,45 400,95 104 149,25 18 040,70 118,53 8 949,67 10 783,65 1 315,50 341 712,93 59 191,39 388,91 29 363,80 35 381,06 496,26 128 907,95 22 329,39 146,71 11 077,21 13 347,17 L 102/12 FR Journal officiel des Communautés européennes 27. 4. 2000 Désignation des marchandises Montants des valeurs unitaires/100 kg net Rubrique Espèces, variétés, code NC 2. 40 Avocats, frais ex 0804 40 00 2. 50 Goyaves et mangues, fraîches ex 0804 50 00 2. 60 Oranges douces, fraîches: 2. 60. 1 — sanguines et demi-sanguines 0805 10 10 2. 60. 2 — Navels, Navelines, Navelates, Salustianas, Vernas, Valencia Lates, Maltaises, Sha- moutis, Ovalis, Trovita, Hamlins 0805 10 30 2. 60. 3 — autres 0805 10 50 2. 70 Mandarines (y compris les Tangerines et Sat- sumas), et hybrides similaires d'agrumes, frais: fraîches; Clémentines, Wilkings 2. 70. 1 — Clémentines 0805 20 10 2. 70. 2 — Monréales et Satsumas 0805 20 30 2. 70. 3 — Mandarines et Wilkings 0805 20 50 2. 70. 4 — Tangerines et autres ex 0805 20 70 ex 0805 20 90 2. 85 Limes (Citrus aurantifolia), fraîches ex 0805 30 90 2. 90 Pamplemousses et pomélos, frais: 2. 90. 1 — blancs ex 0805 40 00 2. 90. 2 — roses ex 0805 40 00 2. 100 Raisins de table ex 0806 10 10 a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) EUR FIM SEK ATS FRF BEF/LUF DEM IEP GBP DKK ITL GRD NLG ESP PTE 127,03 755,31 1 047,29 1 748,02 833,29 5 124,53 132,26 786,36 1 090,35 1 819,89 867,55 5 335,23 248,46 100,05 75,38 258,67 104,16 78,48 946,92 245 971,54 42 607,10 279,95 21 136,63 25 467,97 985,86 256 084,87 44 358,93 291,46 22 005,68 26 515,11 — — — — — — — — — — — — — — — — — — 42,76 254,21 352,48 67,30 400,15 554,84 43,57 259,04 359,18 67,84 403,34 559,27 588,32 280,46 1 724,74 926,08 441,46 2 714,91 599,49 285,78 1 757,49 933,47 444,99 2 736,56 144,61 859,79 1 192,16 1 989,83 948,56 5 833,41 53,03 315,32 437,22 55,89 332,30 460,76 729,76 347,88 2 139,37 769,05 366,61 2 254,56 135,33 804,65 1 115,71 1 862,22 887,72 5 459,30 — — — — — — — — — 83,62 33,67 25,37 131,63 53,00 39,94 85,21 34,31 25,85 132,68 53,43 40,25 282,83 113,89 85,81 103,72 41,77 31,47 109,31 44,02 33,16 264,69 106,58 80,31 — — — — — — — — — — — — — — — — — — 318,70 82 785,61 14 340,09 94,22 7 113,87 8 571,65 501,67 130 312,71 22 572,72 148,31 11 197,93 13 492,62 324,75 84 357,48 14 612,37 96,01 7 248,94 8 734,40 505,67 131 351,91 22 752,73 149,49 11 287,23 13 600,22 1 077,91 279 997,03 48 500,99 318,67 24 060,48 28 990,98 395,32 102 687,18 17 787,44 116,87 8 824,03 10 632,26 416,60 108 216,58 18 745,24 123,16 9 299,18 11 204,78 1 008,78 262 040,45 45 390,55 298,23 22 517,45 27 131,75 27. 4. 2000 FR Journal officiel des Communautés européennes L 102/13 Désignation des marchandises Montants des valeurs unitaires/100 kg net Rubrique Espèces, variétés, code NC 2. 110 Pastèques 0807 11 00 2. 120 Melons: 2. 120. 1 — Amarillo, Cuper, Honey Dew (y compris Cantalene), Onteniente, Piel de Sapo (y compris Verde Liso), Rochet, Tendral, Futuro ex 0807 19 00 2. 120. 2 — autres ex 0807 19 00 2. 140 Poires: 2. 140. 1 Poires-Nashi (Pyrus pyrifolia) ex 0808 20 50 2. 140. 2 autres ex 0808 20 50 2. 150 Abricots ex 0809 10 00 2. 160 Cerises 0809 20 95 0809 20 05 2. 170 Pêches 0809 30 90 2. 180 Nectarines ex 0809 30 10 2. 190 Prunes 0809 40 05 2. 200 Fraises 0810 10 00 2. 205 Framboises 0810 20 10 2. 210 Myrtilles (fruits du Vaccinium myrtillus) 0810 40 30 2. 220 Kiwis (Actinidia chinensis Planch. ) 0810 50 00 a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) EUR FIM SEK ATS FRF BEF/LUF DEM IEP GBP DKK ITL GRD NLG ESP PTE 93,14 553,78 767,85 1 281,61 610,95 3 757,20 182,16 73,35 55,27 694,26 180 341,28 31 238,65 205,25 15 496,94 18 672,59 70,10 416,80 577,92 151,51 900,83 1 249,07 964,60 459,83 2 827,84 2 084,80 993,83 6 111,83 235,00 1 397,25 1 937,39 77,79 462,51 641,31 3 233,67 1 541,50 9 479,88 1 070,40 510,26 3 138,01 495,26 2 944,68 4 083,02 6 814,93 3 248,69 19 978,74 377,09 2 242,08 3 108,81 5 188,87 2 473,55 15 211,77 172,80 1 027,42 1 424,59 2 377,77 1 133,49 6 970,71 180,52 1 073,31 1 488,22 2 483,97 1 184,11 7 282,04 191,38 1 137,89 1 577,77 2 633,44 1 255,37 7 720,24 335,93 1 997,34 2 769,46 4 622,48 2 203,55 13 551,32 137,10 55,21 41,60 296,32 119,32 89,91 459,62 185,08 139,45 152,14 61,26 46,16 968,64 390,05 293,89 737,52 296,98 223,77 337,97 136,09 102,54 353,06 142,17 107,12 374,31 150,72 113,56 657,02 264,57 199,34 522,54 135 733,30 23 511,67 154,48 11 663,73 14 053,87 1 129,36 293 361,17 50 815,92 333,88 25 208,88 30 374,71 1 751,71 455 023,45 78 819,00 517,87 39 100,71 47 113,27 579,85 150 620,89 26 090,50 171,42 12 943,03 15 595,33 3 691,72 166 110,20 1 091,41 958 957,08 82 404,33 99 290,72 2 810,87 126 475,99 831,00 730 148,05 62 742,50 75 599,76 1 288,06 334 586,29 57 956,92 380,80 28 751,40 34 643,17 1 345,59 349 529,85 60 545,44 397,81 30 035,52 36 190,43 1 426,56 370 562,97 64 188,78 421,75 31 842,92 38 368,21 2 504,04 112 670,42 740,29 650 448,28 55 893,80 67 347,62 750,86 4 464,41 6 190,24 10 332,06 4 925,32 30 289,62 1 468,55 591,35 445,56 5 596,99 251 838,44 124 932,59 1 654,68 150 533,91 1 453 867,69 1 822,37 10 835,32 15 023,98 25 076,36 11 953,96 73 514,22 3 564,25 1 435,23 1 081,39 13 584,13 611 222,90 303 216,85 4 015,97 365 352,38 3 528 600,36 108,32 644,03 892,99 1 490,48 710,51 4 369,51 211,85 85,31 64,28 807,41 209 731,54 36 329,62 238,70 18 022,48 21 715,67 L 102/14 FR Journal officiel des Communautés européennes 27. 4. 2000 Désignation des marchandises Montants des valeurs unitaires/100 kg net Rubrique Espèces, variétés, code NC 2. 230 Grenades ex 0810 90 85 2. 240 Kakis (y compris le fruit Sharon) ex 0810 90 85 2. 250 Litchis ex 0810 90 30 a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) EUR FIM SEK ATS FRF BEF/LUF DEM IEP GBP DKK ITL GRD NLG ESP PTE 347,17 2 064,18 2 862,14 4 777,16 2 277,29 14 004,80 310,96 1 848,87 2 563,59 4 278,87 2 039,75 12 543,99 453,05 2 693,70 3 735,02 6 234,08 2 971,80 18 275,92 679,01 273,42 206,01 608,18 244,90 184,52 886,09 356,80 268,84 2 587,84 116 440,82 765,06 672 214,86 57 764,23 69 601,34 2 317,91 104 295,11 685,26 602 097,48 51 738,96 62 341,36 3 377,07 151 952,37 998,39 877 223,64 75 380,88 90 828,01


title: 2000/332/EC: Commission Decision of 25 April 2000 amending Decision 97/20/EC establishing the list of third countries fulfilling the equivalence conditions for the production and placing on the market of bivalve molluscs, echinoderms, tunicates and marine gastropods (notified under document number C(2000) 1052) (Text with EEA relevance)

eurovoc_concepts:
Vietnam
health control
import
marketing
mollusc
third country

text: L 114/40 EN Official Journal of the European Communities 13. 5. 2000 COMMISSION DECISION of 25 April 2000 amending Decision 97/20/EC establishing the list of third countries fulfilling the equivalence conditions for the production and placing on the market of bivalve molluscs, echinoderms, tunicates and marine gastropods (notified under document number C(2000) 1052) (Text with EEA relevance) (2000/332/EC) THE COMMISSION OF THE EUROPEAN COMMUNITIES, (3) The measures provided for in this Decision are in accordance with the opinion of the Standing Veterinary Committee, HAS ADOPTED THIS DECISION: Article 1 The Annex to Decision 97/20/EC is replaced by the Annex to this Decision. Article 2 This Decision is addressed to the Member States. Done at Brussels, 25 April 2000. For the Commission David BYRNE Member of the Commission Having regard to the Treaty establishing the European Community, Having regard to Council Directive 91/492/EEC of 15 July 1991 laying down the health conditions for the production and the placing on the market of live bivalve molluscs (1), as last amended by Directive 97/79/EC (2) and in particular Article 9(3)(b) thereof, Whereas: (1) (2) Commission Decision 97/20/EC of 17 December 1996 (3), as last amended by Decision 98/571/EC (4), establishes the list of third countries from which imports of bivalve molluscs, echinoderms, tunicates and marine gastropods in whatever form are authorised for human consumption. Commission Decision 2000/333/EC (5) down special conditions for the import of bivalve molluscs, echinoderms, tunicates and marine gastropods origin- ating in the Socialist Republic of Vietnam, therefore Decision 97/20/EC should be amended to include the Socialist Republic of Vietnam in part I of the list. lays (1) OJ L 268, 24. 9. 1991, p. 1. (2) OJ L 24, 30. 1. 1998, p. 31. (3) OJ L 6, 10. 1. 1997, p. 46. (4) OJ L 277, 14. 10. 1998, p. 42. (5) See page 42 of this Official Journal. 13. 5. 2000 EN Official Journal of the European Communities L 114/41 ANNEX List of third countries from which imports of bivalve molluscs, echinoderms, tunicates and marine gastropods in whatever form for human consumption are authorised I. Third countries which have been the subject of a specific decision based on Council Directive 91/492/EEC AU CL Australia Chile MA Morocco PE VN KR TN TR Peru Socialist Republic of Vietnam South Korea Tunisia Turkey II. Third countries, which may be the subject of a provisional decision, based on Council Decision 95/408/EC CA FO GL NZ TH Canada Faeroe Islands Greenland New Zealand Thailand (only for products sterilised or heat-treated under the conditions laid down in Commission Decision 93/25/EEC) US United States of America


title: QUESTION ÉCRITE E-1287/00 posée par María Sornosa Martínez (PSE) à la Commission. Graves problèmes de désertification à Valence (Espagne).

eurovoc_concepts:
EU programme
Spain
Structural Funds
desertification
environmental protection
groundwater
use of aid
water management

text: 18. 4. 2001 FR Journal officiel des CommunautØs europØennes C 113 E/7 d(cid:146)Ønergies renouvelables, en rØfØrence notamment au livre blanc sur une stratØgie communautaire et un plan d(cid:146)action pour les sources d(cid:146)Ønergie renouvelable (1); promotion de nouveaux services dans le domaine des nouvelles technologies de communication; gestion Øconome des ressources en eau; et soutien (cid:224) un tourisme durable et de qualitØ, tenant compte des capacitØs d(cid:146)accueil du site. D(cid:146)autre part, les orientations relatives (cid:224) l(cid:146)initiative communautaire Interreg, approuvØes par la Commission le 28 avril 2000 (2), soulignent de maniŁre explicite que l(cid:146)intØgration des rØgions insulaires est un domaine prioritaire dans le cadre de la coopØration transnationale. Cette prioritØ devra se traduire en assignant (cid:224) ces rØgions une allocation financiŁre appropriØe. De plus, dans le contexte de la coopØration interrØgionale, il est prØvu qu(cid:146)une attention particuliŁre soit portØe (cid:224) la participation des rØgions insulaires. Enfin, pour mieux respecter les handicaps naturels spØcifiques des petites (cid:238)les de la Mer EgØe, le rŁglement (CEE) no 2019/93 du Conseil, du 19 juillet 1993, portant mesures spØcifiques pour certains produits agricoles en faveur des (cid:238)les mineures de la mer EgØe (3) prØvoit des instruments spØcifiques en faveur de ces (cid:238)les. Il faut Øgalement rappeler que certaines (cid:238)les font partie d(cid:146)un groupe particulier, celui des rØgions ultrapØriphØriques, qui partagent un ensemble de handicaps communs dØfinis (cid:224) l(cid:146)article 299, paragraphe 2 (ex-article 227) du traitØ CE. Pour ces rØgions, la Commission a adoptØ, le 14 mars 2000 (4), un rapport sur la mise en (cid:156)uvre de ce nouvel article. (1) COM(97) 599 final. (2) COM(2000) 1101 final. (3) JO L 184 du 27. 7. 1993. (4) COM(2000) 147 final. (2001/C 113 E/007) QUESTION (cid:201)CRITE E-1287/00 posØe par Mar(cid:237)a Sornosa Mart(cid:237)nez (PSE) (cid:224) la Commission Objet: Graves problŁmes de dØsertification (cid:224) Valence (Espagne) (19 avril 2000) Un congrŁs sur la dØsertification, organisØ par la sociØtØ europØenne de conservation des sols (SECS) s(cid:146)est rØcemment tenu (cid:224) Valence (Espagne). Parmi les scientifiques et experts participant (cid:224) cette manifestation, au nombre de plus de 400, se dØtache l(cid:146)affirmation selon laquelle l(cid:146)Espagne est le pays qui, de toute l(cid:146)Europe, risque le plus de perdre une partie de son sol (60 % du territoire espagnol sont gravement affectØs par la dØsertification). Dans la communautØ valencienne notamment, ce problŁme concerne 40 % du territoire, 5 (cid:224) 7 % des sols Øtant irrØcupØrables. les conclusions auxquelles ont abouti Dans la rØponse apportØe par la Commission (cid:224) la question E-1563/95 (1), le commissaire Fischler dØclarait que «la clØ pour une lutte efficace contre la dØsertification se trouve dans une utilisation judicieuse des terres, compatible avec les exigences de l(cid:146)environnement, et une gestion rationnelle et prudente des ressources en eau». Il faut par ailleurs souligner que l(cid:146)on s(cid:146)emploie dans ce mŒme esprit (cid:224) mettre en chantier la future directive-cadre relative (cid:224) l(cid:146)eau. Actuellement, nØanmoins, dans la communautØ autonome de Valence: (cid:129) l(cid:146)on constate des pratiques agricoles et en matiŁre d(cid:146)urbanisme qui affectent sØrieusement les diffØrents niveaux des nappes phrØatiques dans des zones telles que Les Mar(cid:237)nes, la Marjal de Almenara, la Marjal de Peæ(cid:237)scola et la Marjal de Pego-Oliva, (cid:129) des dØviations de cours d(cid:146)eau sont prØvues, telles que celle du Xucar-Vinalop(cid:243) qui affectera le lac de la Albufera (zone protØgØe dans le cadre de LIFE), (cid:129) la pollution des eaux par les nitrates du fait d(cid:146)une conservation des sols dØficiente est en augmentation, (cid:129) un parc thØmatique (Terra M(cid:237)tica) est en construction, dont on estime qu(cid:146)il doublera en 2002 le dØficit hydrique d(cid:146)une zone gravement affectØe par la sØcheresse, (cid:129) des terrains de golf (Peæ(cid:237)scola, Benidorm et Finestrat, Manises) ont ØtØ installØs ou sont en cours d(cid:146)installation, sans aucune planification ni prØvision en ce qui concerne notamment les ressources hydriques. C 113 E/8 Journal officiel des CommunautØs europØennes FR 18. 4. 2001 La Commission n(cid:146)estime-t-elle pas que toutes ces pratiques sont en contradiction non seulement avec la convention concernant la lutte contre la dØsertification, (cid:224) laquelle a souscrit l(cid:146)Espagne, mais Øgalement avec les principes d(cid:146)«utilisation durable du sol» auxquels ont souscrit le gouvernement valencien pour recevoir et gØrer les Fonds du FEDER, du FEOGA et des Fonds de cohØsion? l(cid:146)(cid:201)tat espagnol et Quelles mesures la Commission entend-elle prendre pour demander au gouvernement espagnol et au gouvernement autonome de lutter efficacement contre le grave problŁme de la dØsertification qui affecte tout particuliŁrement la communautØ valencienne et au titre duquel est re(cid:231)u le financement communau- taire prØcitØ? (1) JO C 311 du 22. 11. 1995, p. 4. RØponse donnØe par Mme Wallstr(cid:246)m au nom de la Commission (3 juillet 2000) La Commission confirme que la lØgislation communautaire actuelle relative (cid:224) l(cid:146)eau ne permet pas de garantir la gestion durable de toutes les ressources hydriques. C(cid:146)est pourquoi la Commission a proposØ au Parlement et au Conseil, notamment (cid:224) la suite des initiatives de la commission de l(cid:146)environnement du Parlement, une directive-cadre (1) sur l(cid:146)eau. Le Conseil a adoptØ une position commune en octobre 1999 (2). Le Parlement a Ømis son avis (en deuxiŁme lecture) en fØvrier 2000 (3). La procØdure de concertation semble indiquer que l(cid:146)adoption finale aura lieu (cid:224) la fin du premier semestre 2000. La directive-cadre sur l(cid:146)eau dØfinira des objectifs environnementaux ambitieux, qui consistent notamment (cid:224) «prØvenir une dØtØrioration de l(cid:146)Øtat des eaux souterraines, restaurer les masses d(cid:146)eaux souterraines et assurer un Øquilibre entre les captages et le renouvellement des eaux souterraines» [article 4, paragraphe 1, point b]. Cette directive dispose Øgalement que la gestion des eaux se fera dans le cadre des bassins hydrographiques («plan de gestion de district hydrographique»), afin d(cid:146)assurer la protection des eaux de surface et des eaux souterraines [article 3]. Enfin, elle prØvoit certaines obligations, en vertu desquelles les (cid:201)tats membres devront veiller (cid:224) ce que des mesures lØgalement contraignantes soient ØlaborØes (cid:224) cette fin, telles que des «mesures de contr(cid:244)le des captages d(cid:146)eau douce dans les eaux de surface et les eaux souterraines, et des endiguements d(cid:146)eau douce de surface, notamment l(cid:146)Øtablissement d(cid:146)un ou de plusieurs registres des captages d(cid:146)eau et l(cid:146)institution d(cid:146)une autorisation prØalable pour le captage et l(cid:146)endiguement». Seuls les captages d(cid:146)eau n(cid:146)ayant pas d(cid:146)incidence significative peuvent Œtre exemptØs de ces obligations [article 11, paragraphe 3, point d]. Une fois la directive adoptØe, la Commission assurera sa transposition et sa mise en (cid:156)uvre de maniŁre appropriØe, en utilisant les deux instruments prØvus (cid:224) cet effet par le traitØ CE, notamment en son article 226 (ex-article 169), ainsi qu(cid:146)en informant et en consultant toutes les parties concernØes. En outre, la directive sera garante d(cid:146)ouverture et de transparence, puisque les (cid:201)tats membres sont tenus d(cid:146)informer les citoyens et les parties concernØes lorsqu(cid:146)ils Øtablissent leurs plans de gestion de district hydrographique. Par ailleurs, il faut noter que la nouvelle politique de dØveloppement rural adoptØe par le Conseil en juin 1999, est devenue le second pilier de la politique agricole commune. Le soutien accordØ au dØveloppement rural durable, liØ aux activitØs agricoles et (cid:224) leur reconversion, peut concerner entre autres la prØservation et la promotion d(cid:146)une agriculture durable (cid:224) haute valeur naturelle, respectueuse de l(cid:146)environnement. Elle vise aussi au dØveloppement durable des forŒts, (cid:224) la prØservation et (cid:224) l(cid:146)amØlioration des ressources forestiŁres et (cid:224) l(cid:146)extension des surfaces boisØes. Des cofinancements pourraient Øgalement Œtre prØvus pour des investissements pour la protection de l(cid:146)environnement. Ces diffØrentes mesures peuvent Œtre (cid:224) mŒme de contribuer (cid:224) combattre la dØsertification dans les zones mentionnØes par l(cid:146)Honorable Parlemen- taire. C(cid:146)est (cid:224) l(cid:146)(cid:201)tat membre qu(cid:146)il revient de prØsenter ses programmes de dØveloppement rural, en plein respect du principe de subsidiaritØ. Le rŁglement (CE) no 1260/1999 du Conseil du 21 juin 1999, portant dispositions gØnØrales sur les fonds structurels dispose (4) que la Commission et les (cid:201)tats membres veillent (cid:224) l(cid:146)intØgration des exigences de protection de l(cid:146)environnement dans la dØfinition et la mise en (cid:156)uvre de l(cid:146)action des fonds. Le Fonds de cohØsion fournit une contribution financiŁre (cid:224) des projets qui contribuent (cid:224) la rØalisation des objectifs fixØs par le traitØ CE, dans le domaine de l(cid:146)environnement et dans celui des rØseaux transeuropØens d(cid:146)infras- tructures de transport. Il est Øgalement important de souligner (cid:224) cet Øgard que l(cid:146)Espagne fait partie de l(cid:146)annexe IV (MØditerranØe septentrionale) de la Convention des Nations unies sur la lutte contre la dØsertification, qui comprend Øgalement le Portugal, l(cid:146)Italie et la GrŁce. Ces (cid:201)tats membres ont ØlaborØ ou Ølaborent actuellement des 18. 4. 2001 FR Journal officiel des CommunautØs europØennes C 113 E/9 programmes d(cid:146)action nationaux et rØgionaux de lutte contre la dØsertification, et ils ont organisØ une sØrie de rencontres auxquelles la Commission a participØ. Les programmes d(cid:146)action nationaux et rØgionaux constituent le fondement de l(cid:146)application de la convention. En sa qualitØ de partie, la CommunautØ voit un intØrŒt particulier (cid:224) ce que la convention soit appliquØe de maniŁre effective en MØditerranØe septen- trionale. (1) Propositions de la Commission: JO C 184 du 17. 6. 1997, JO C 16 du 20. 1. 1998, et JO C 108 du 7. 4. 1998. (2) Position commune (CE) no 41/1999 du Conseil, du 22. 10. 1999 (JO C 343 du 30. 11. 1999). (3) Avis non encore publiØ au JO. (4) JO L 161 du 26. 6. 1999. (2001/C 113 E/008) QUESTION (cid:201)CRITE E-1318/00 posØe par Bart Staes (Verts/ALE) (cid:224) la Commission (27 avril 2000) Objet: (cid:201)volution de la pollution atmosphØrique due (cid:224) la circulation routiŁre d(cid:146)ici (cid:224) 2020 La Febiac, la FØdØration belge des assembleurs d(cid:146)automobiles, prØtend que l(cid:146)on peut «affirmer sans crainte qu(cid:146)en 2020 le problŁme de la pollution atmosphØrique due (cid:224) la circulation routiŁre sera rØsolu». Elle se base (cid:224) cet Øgard sur une Øtude qu(cid:146)elle a commanditØe (cid:224) l(cid:146)Institut f(cid:252)r (cid:201)nergie- und Umweltforschung (IFEU) d(cid:146)Heidelberg. Selon la FØdØration, l(cid:146)Ømission de matiŁres nocives due (cid:224) la circulation routiŁre a baissØ de 30 % depuis 1990. De nouveaux moteurs et la disparition progressive de vØhicules vØtustes du parc automobile entra(cid:238)neront entre 2002 et 2020 une baisse supplØmentaire de 70 (cid:224) 80 % des produits nocifs tels que le monoxide de carbone, les hydrocarbures, le benzŁne, les bioxydes d(cid:146)azote et les particules de suie. La Commission souscrit-elle (cid:224) la conclusion de la Febiac que «l(cid:146)on peut, affirmer sans crainte qu(cid:146)en 1. 2020 le problŁme de la pollution atmosphØrique due (cid:224) la circulation routiŁre sera rØsolu»? a) Dans l(cid:146)affirmative, sur la base de quelles Øtudes scientifiques la Commission en arrive-t-elle (cid:224) la mŒme conclusion? b) Dans la nØgative, comment Øvoluera, selon la Commission, la pollution atmosphØrique due (cid:224) la circulation routiŁre d(cid:146)ici (cid:224) 2020? Sur la base de quelles Øtudes scientifiques la Commission arrive-t-elle (cid:224) dØfinir sa position en ce qui concerne la pollution atmosphØrique due (cid:224) la circulation routiŁre d(cid:146)ici (cid:224) 2020? 2. Quelles dØmarches s(cid:146)imposent, selon la Commission, pour rØduire de fa(cid:231)on substantielle la pollution atmosphØrique due (cid:224) la circulation routiŁre d(cid:146)ici (cid:224) 2020? Quels programmes d(cid:146)action la Commission a-t- elle dØj(cid:224) dØveloppØs pour s(cid:146)attaquer (cid:224) la pollution atmosphØrique due (cid:224) la circulation routiŁre? (2001/C 113 E/009) QUESTION (cid:201)CRITE E-1567/00 posØe par Bart Staes (Verts/ALE) (cid:224) la Commission (19 mai 2000) Objet: RØgime fiscal privilØgiØ pour le diesel Plus de la moitiØ des vØhicules achetØs l(cid:146)annØe derniŁre en Belgique roulent au diesel. La Belgique est, aprŁs l(cid:146)Autriche, le pays qui compte le plus d(cid:146)adeptes du diesel. Dans les pays nordiques, le Royaume-Uni et les (cid:201)tats-Unis, son utilisation est trŁs peu rØpandue. Les rejets de diesel constituent non seulement la principale source d(cid:146)oxyde d(cid:146)azote, qui est (cid:224) l(cid:146)origine de problŁmes d(cid:146)environnement observØs au niveau mondial tels que la pollution de l(cid:146)ozone et les pluies acides. Les Ømanations de suie ou de fines particules sont encore plus nocives. On parle en jargon scientifique de PM10 (particules infØrieures (cid:224) 10 micromŁtres). Les particules de suie transportent des substances dangereuses tels que des mØtaux lourds et des hydrocarbures aromatiques polycycliques cancØrigŁnes


title: PERGUNTA ESCRITA E-1295/00 apresentada por Chris Davies (ELDR) à Comissão. Cartas de condução e diabetes.

eurovoc_concepts:
EC Directive
United Kingdom
diabetes
driving licence
interpretation of the law

text: C 72 E/40 Jornal Oficial das Comunidades Europeias PT 6. 3. 2001 (2001/C 72 E/043) PERGUNTA ESCRITA E-1295/00 apresentada por Chris Davies (ELDR) (cid:224) Comissªo (19 de Abril de 2000) Objecto: Cartas de condu(cid:231)ªo e diabetes O Governo brit(cid:226)nico interpretou a Directiva 91/439/CEE (1), no sentido de proibir praticamente todas as pessoas que sofram de diabetes que exija tratamento com insulina de conduzirem ve(cid:237)culos destinados ao transporte de passageiros e ve(cid:237)culos cuja massa mÆxima autorizada exceda 3,5 toneladas. Tem a Comissªo conhecimento de outros Estados-membros que tenham introduzido tais medidas 1. restritivas? O Governo brit(cid:226)nico argumenta que a sua pol(cid:237)tica Ø o resultado de uma avalia(cid:231)ªo que hÆ muito tem vindo a ser efectuada por peritos dos perigos associados (cid:224) condu(cid:231)ªo de ve(cid:237)culos de grandes dimensıes por diabØticos sujeitos a um tratamento de insulina. No entanto, a Comissªo das CiŒncias e da Tecnologia da C(cid:226)mara dos Comuns comunicou em Fevereiro de 2000 que a fonte destas informa(cid:231)ıes nªo era conhecida. Tem a Comissªo conhecimento de alguns elementos que possam servir de base (cid:224) interpreta(cid:231)ªo da 2. Directiva por parte do Governo brit(cid:226)nico? (1) JO L 237 de 24. 1. 1991, p. 1. Resposta dada pela ComissÆria de Palacio em nome da Comissªo (21 de Junho de 2000) A Directiva 91/439/CEE do Conselho, de 29 de Julho de 1991, relativa (cid:224) carta de condu(cid:231)ªo (1) prevŒ no ponto 10 do anexo III que: «A carta de condu(cid:231)ªo nªo deve ser emitida nem renovada a qualquer candidato ou condutor deste grupo que sofra de diabetes mellitus que exija tratamento com insulina, excepto em casos muito excepcionais devidamente justificados por um parecer mØdico abalizado e sob reserva de um controlo mØdico regular». Isto implica que as pessoas que sofrem de diabetes mellitus nªo devem, em geral, ser autorizadas a conduzir camiıes ou autocarros, visto existir o risco de sofrerem de perdas de consciŒncia. Caso isso aconte(cid:231)a quando o indiv(cid:237)duo estiver a conduzir tais ve(cid:237)culos de grandes dimensıes, existe um risco (cid:243)bvio de acidente grave. As disposi(cid:231)ıes de carÆcter mØdico enunciadas no anexo III da directiva baseiam-se no parecer especializado de peritos em medicina de toda a Comunidade. No que respeita (cid:224) interpreta(cid:231)ªo da directiva, cabe a cada Estado-membro estabelecer, conforme lhe pare(cid:231)a conveniente, as normas pormenorizadas aplicÆveis (cid:224) defini(cid:231)ªo de «casos muito excepcionais». (cid:201) todavia evidente que isto nªo se pode interpretar no sentido de que todos os diabØticos insulinodependentes podem conduzir camiıes ou autocarros. (1) JO L 237 de 24. 8. 1991. (2001/C 72 E/044) PERGUNTA ESCRITA E-1306/00 apresentada por Mark Watts (PSE) (cid:224) Comissªo (19 de Abril de 2000) Objecto: O bem-estar dos frangos de aviÆrio O recente relat(cid:243)rio do ComitØ Cient(cid:237)fico da Saœde e do Bem-Estar dos Animais, da Comissªo, sobre «O bem-estar dos frangos criados para a produ(cid:231)ªo de carne (frangos de carne)» conclui que a determina(cid:231)ªo por parte da indœstria de cria(cid:231)ªo de frangos em atingir taxas de crescimento rÆpido dÆ origem a que muitos frangos de aviÆrio sofram de dolorosas enfermidades nas patas, bem como de ascite. O ComitØ