title: Directiva 2000/33/CE a Comisiei din 25 aprilie 2000 de efectuare a celei de-a douăzeci și șaptea adaptări la progresul tehnic a Directivei 67/548/CEE a Consiliului privind apropierea actelor cu putere de lege și a actelor administrative referitoare la clasificarea, ambalarea și etichetarea substanțelor periculoaseText cu relevanță pentru SEE.

formats: pdf print xhtml

text: 13/vol. 29 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 125 32000L0033 L 136/90 JURNALUL OFICIAL AL COMUNITĂȚILOR EUROPENE 8. 6. 2000 DIRECTIVA 2000/33/CE A COMISIEI din 25 aprilie 2000 de efectuare a celei de-a douăzeci ș(cid:13)iș (cid:13)aptea adaptări la progresul tehnic a Directivei 67/548/CEE a Consiliului privind apropierea actelor cu putere de lege ș(cid:13)i a actelor administrative referitoare la clasificarea, ambalarea ș(cid:13)i etichetarea substanțelor periculoase (*) (Text cu relevanță pentru SEE) COMISIA COMUNITĂȚILOR EUROPENE, ADOPTĂ PREZENTA DIRECTIVĂ: având în vedere Tratatul de instituire a Comunității Europene, având în vedere Directiva 67/548/CEE a Consiliului din 27 iunie 1967 privind apropierea actelor cu putere de lege ș(cid:13)i a actelor administrative referitoare la clasificarea, ambalarea ș(cid:13)i etichetarea substanțelor periculoase (1), astfel cum a fost modificată ultima dată prin Directiva 1999/33/CE a Parlamentului European ș(cid:13)i a Consiliului (2)ș(cid:13)i, în special, articolul 28 al acesteia, întrucât: (1) (2) (3) (4) Anexa V la Directiva 67/548/CEE stabileș(cid:13)te metodele pen- tru determinarea proprietăților fizico-chimice, a toxicității ș(cid:13)i a ecotoxicității substanțelor ș(cid:13)i preparatelor. Este necesară adaptarea anexei menționate la progresul tehnic. Conform articolului 7 alineatul (2) din Directiva 86/609/CEE a Consiliului din 24 noiembrie 1986 privind apropierea actelor cu putere de lege ș(cid:13)i a actelor administrative ale statelor membre referitoare la protecția animalelor utilizate în scopuri experimentale ș(cid:13)i alte scopuri ș(cid:13)tiințifice (3), nu se realizează un experiment care impune utilizarea animalelor, dacă se dispune în mod practic ș(cid:13)i rezonabil de o altă metodă, satisfăcătoare din punct de vedere ș(cid:13)tiințific, pentru obținerea rezultatului căutat. Comisia intenționează să introducă în anexa V la Directiva 67/548/CEE anumite metode de încercare alternative, care să nu necesite utilizarea animalelor, pentru a le face dispo- nibile pentru testarea produselor chimice în conformitate cu articolul 3 alineatul (1) din Directiva 67/548/CEE. în prezenta directivă Măsurile prevăzute în conformitate cu avizul Comitetului pentru adaptarea la progresul tehnic a directivelor privind eliminarea bariere- lor tehnice din calea comerțului cu substanțe ș(cid:13)i preparate periculoase, sunt Articolul 1 Textele anexelor I ș(cid:13)i II la prezenta directivă se adaugă la anexa V partea B la Directiva 67/548/CEE. Articolul 2 (1) Statele membre adoptă ș(cid:13)i pun în aplicare actele cu putere de lege ș(cid:13)i actele administrative necesare pentru a se conforma pre- zentei directive până la 1 octombrie 2001. Statele membre infor- mează de îndată Comisia cu privire la aceasta. Atunci când statele membre adoptă aceste dispoziții, ele cuprind o trimitere la prezenta directivă sau sunt însoțite de o asemenea trimitere la data publicării lor oficiale. Statele membre stabilesc modalitatea de efectuare a acestei trimiteri. (2) Statele membre comunică Comisiei textul principalelor dis- poziții de drept intern pe care le adoptă în domeniul reglementat de prezenta directivă ș(cid:13)i un tabel de corespondență între prezenta directivă ș(cid:13)i dispozițiile naționale adoptate. Articolul 3 Prezenta directivă intră în vigoare în a treia zi de la data publicării în Jurnalul Oficial al Comunităților Europene. Articolul 4 Prezenta directivă se adresează statelor membre. Adoptată la Bruxelles, 25 aprilie 2000. Pentru Comisie Margot WALLSTRÖM Membru al Comisiei (*) Adoptată înaintea celei de a 26-a adaptări. (1) (2) (3) JO 196, 16. 8. 1967, p. 1. JO L 199, 30. 7. 1999, p. 57. JO L 358, 18. 12. 1986, p. 1. 126 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 29 ANEXA I „B. 40. COROZIUNEA PIELII 1. 1. 1. METODA Introducere Centrul european pentru validarea metodelor alternative (ECVAM, Centrul comun de cercetări al Comisiei Europene) a recunoscut validitatea ș(cid:13)tiințifică a două teste de corozivitate in vitro, testul de rezistență electrică transcutanată (RET) pe piele de ș(cid:13)obolan ș(cid:13)i un test care utilizează un model de piele umană (1) (2) (3). Studiul de validare întreprins de ECVAM a demonstrat că ambele teste au permis realizarea unei distincții fiabile între substanțele corozive ș(cid:13)i necorozive pentru piele. În plus, protocolul testului întemeiat pe utilizarea unui model de piele umană a permis realizarea unei distincții corecte între diferitele grade de corozivitate (substanțe puternic corozive pentru piele, deja cunoscute, R35, ș(cid:13)i alte substanțe corozive pentru piele, R34) (2). Sunt descrise procedurile pentru ambele teste; selectarea testului utilizat depinde de cerințele specifice ș(cid:13)i de preferințele utilizatorului. A se vedea ș(cid:13)i Introducerea generală, partea B. 1. 2. Definiții Coroziunea pielii: producerea unei leziuni tisulare ireversibile a pielii, în urma aplicării materialului de testat. 1. 3. Substanțe de referință Nu se specifică, dar a se vedea punctele 1. 5. 3. 4 ș(cid:13)i 1. 7. 2. 3. 1. 4. Principiul metodei de încercare – testul RET pe piele de ș(cid:13)obolan Materialul de testat se aplică timp de până la 24 ore pe suprafața epidermei unor rondele de piele prelevate din pieile jupuite de la ș(cid:13)obolani tineri, eutanasiați. Materialele corozive sunt identificate în funcție de capacitatea acestora de a produce o pierdere a integrității stratului cornos normal al pielii ș(cid:13)i a funcției de barieră, care se măsoară prin reducerea valorii RET inerente sub o valoare prag (5 κΩ) (4) (5). Materialele iritante ș(cid:13)i neiritante nu reduc valoarea RET sub valoarea prag. Pentru agenții tensioactivi sau substanțele organice neutre [pentru definiția acestora a se vedea referința bibliografică (6)], în modul de lucru, se poate introduce o etapă de fixare a unui colorant, în vederea reducerii numărului de rezultate fals pozitive, obținute în special la testarea acestor tipuri de produse chimice (2) (7). 1. 5. Descrierea metodei de încercare – testul RET pe piele de ș(cid:13)obolan 1. 5. 1. Animalele Sunt necesari ș(cid:13)obolani tineri (20-23 zile) (suș(cid:13)ă Wistar sau una comparabilă) pentru pregătirea rondelelor de piele. Părul dorsal ș(cid:13)i cel de pe flancuri se îndepărtează cu grijă, cu un foarfece de tuns animale mici. Animalele sunt apoi curățate atent prin ș(cid:13)tergere cu o cârpă umedă, imersând pielea tunsă în soluție de antibiotice (ce conține, de exemplu, streptomicină, penicilină, cloramfenicol ș(cid:13)i amfotericină în concentrații eficiente pentru a inhiba dezvoltarea bacteriilor). Spălarea animalelor cu antibiotice se repetă în a treia ș(cid:13)i a patra zi de la prima spălare ș(cid:13)i animalele se utilizează în termen de trei zile (pentru pregătirea pielii, vârsta animalelor nu trebuie să fie mai mare de 31 de zile). 1. 5. 2. Pregătirea rondelelor de piele Animalele sunt eutanasiate. Apoi se îndepărtează pielea dorsală a fiecărui animal ș(cid:13)i se scoate cu grijă tub din excesul de grăsime de pe piele. Pielea jupuită se aș(cid:13)ează peste extremitatea unui politetrafluoroetilenă (PTFE), având grijă ca suprafața epidermei să fie în contact cu tubul. Pielea este fixată bine pe extremitatea tubului prin strângere cu un inel de cauciuc ș(cid:13)i se decupează țesutul în exces. Dimensiunile tubului ș(cid:13)i ale inelului din cauciuc sunt prezentate în figura 1. Apoi inelul din cauciuc este strâns etanș(cid:13) cu vaselină pe extremitatea tubului din PTFE. Tubul este menținut cu ajutorul unei cleme elastice în interiorul unei camere receptoare ce conține soluție de sulfat de magneziu (154 mM) (figura 2). 1. 5. 3. Modul de lucru 1. 5. 3. 1. A p l i c a r e a m a t e r i a l u l d e t e s t a t Substanțele de testat în stare lichidă (150 μl) se aplică pe suprafața epidermei din interiorul tubului (figura 2). Când sunt testate materiale solide, se aplică o cantitate suficientă din acesta pe o rondea pentru a asigura acoperirea în întregime a suprafeței epidermei. Se adaugă apoi apă deionizată (150 μl) pe suprafața solidului ș(cid:13)i se agită tubul uș(cid:13)or. Substanța de testat ar trebui să vină cât se poate de mult în contact cu pielea. Pentru unele substanțe solide, acest lucru se poate realiza prin încălzire până la 30 °C pentru a topi substanța de testat, sau prin măcinarea acesteia, pentru a obține granule sau pulbere. 13/vol. 29 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 127 Pentru fiecare substanță de testat se utilizează trei rondele de piele. Substanțele de testat se aplică timp de 24 de ore (a se vedea ș(cid:13)i 1. 5. 3. 4. ) Substanța de testat este îndepărtată prin spălare cu un jet de apă de la robinet cu o temperatură de până la 30 °C, până nu a mai rămas substanță de îndepărtat. Pentru a uș(cid:13)ura scoaterea substanței de testat care s-a solidificat în tub se utilizează un jet de apă caldă la aproximativ 30 °C. 1. 5. 3. 2. M ă s u r ă t o r i d e R E T RET se măsoară cu ajutorul unei unei punți de măsură în curent alternativ de voltaj mic (de exemplu AIM 401 sau 6401, sau echivalent). Înainte de măsurarea rezistenței electrice, se reduce tensiunea superficială a pielii prin adăugarea unui volum suficient de etanol 70 % care să acopere epiderma. După câteva secunde, se scurge etanolul prin răsturnarea tubului ș(cid:13)i țesutul este apoi hidratat prin adăugarea a 3 ml de soluție de sulfat de magneziu (154 mM). Electrozii punții de măsură sunt amplasați pe ambele fețe ale rondelei de piele pentru a realiza măsurarea rezistenței în κΩ/rondea de piele (figura 2). Dimensiunile electrozilor ș(cid:13)i lungimea electrodului situat sub clemele-crocodil sunt prezentate în figura 1. În timp ce se efectuează măsurarea rezistenței, clema electrodului interior (gros) se sprijină pe capătul superior al tubului din PTFE, astfel încât o parte importantă din lungimea electrodului să fie imersată în soluția de sulfat de magneziu. Electrodul exterior (subțire) este poziționat în interiorul camerei receptoare, astfel încât să se sprijine pe fundul camerei. Distanța dintre partea inferioară a clemei elastice ș(cid:13)i fundul tubului din PTFE se menține constantă (figura 1), deoarece această distanță afectează valoarea rezistenței obținute. Trebuie menționat că atunci când valoarea rezistenței măsurate este mai mare de 20 κΩ, aceasta se poate datora stratului de substanță de testat de pe suprafața epidermei rondelei de piele. Se poate încerca îndepărtarea acestui strat, de exemplu prin închiderea etanș(cid:13)ă a tubului din PTFE, cu un deget îmbrăcat în mănuș(cid:13)ă, ș(cid:13)i agitarea tubului timp de aproximativ 10 secunde; soluția de sulfat de magneziu se scurge ș(cid:13)i se repetă măsurarea rezistenței cu sulfat de magneziu proaspăt. Valorile medii ale RET se acceptă, cu condiția ca valorile martorilor pozitiv ș(cid:13)i negativ testați în paralel să se situeze între limite acceptabile pentru metodă. Substanțele martor ș(cid:13)i limitele rezistențelor acceptabile aferente, propuse pentru metodologia ș(cid:13)i aparatura descrise, sunt prezentate în continuare: Martor Substanța Pozitiv Negativ Acid clorhidric 10 M (36 %) Apă distilată Rezistența (κΩ) 0,5-1,0 10-25 1. 5. 3. 3. M o d u l d e l u c r u m o d i f i c a t p e n t r u a g e n ț i i t e n s i o a c t i v i ș(cid:13) i s u b s t a n ț e l e o r g a n i c e n e u t r e Dacă valorile RET ale unor substanțe care sunt fie agenți tensioactivi, fie substanțe organice neutre sunt mai mici sau egale cu 5 κΩ, se poate realiza o determinare a penetrării colorantului în țesut. Prin acest procedeu se stabileș(cid:13)te dacă rezultatele sunt fals pozitive (2). 1. 5. 3. 3. 1. Aplicarea ș(cid:13)i îndepărtarea colorantului Sulforhodamine B După tratamentul inițial cu substanța de testat, se aplică 150 μl dintr-o soluție 10 % (greut. /vol. ) de colorant Sulforhodamine B diluat în apă distilată pe suprafața epidermică a fiecărei rondele de piele, timp de 2 ore. Apoi, rondelele de piele sunt spălate cu jet de apă de la robinet la temperatura camerei timp de aproximativ 10 secunde pentru eliminarea colorantului în exces/nefixat. Se scoate cu grijă fiecare rondea de piele de pe tubul de PTFE ș(cid:13)i se introduce într-un flacon (de exemplu un flacon scintilator din sticlă, de 20 ml) ce conține apă deionizată (8 ml). Flacoanele se agită uș(cid:13)or timp de 5 minute pentru eliminarea urmelor de colorant în exces/nefixat. Această spălare se repetă, după care rondelele de piele se scot ș(cid:13)i se introduc în flacoane care conțin 5 ml soluție 30 % (greut. /vol. ) de dodecilsulfat de sodiu (SDS) în apă distilată ș(cid:13)i se incubează peste noapte la 60 °C. După incubare, rondele de piele se scot din flacoane ș(cid:13)i soluția rămasă este centrifugată timp de 8 minute la 21 °C (forța relativă de centrifugare ~ 175). Apoi, o probă de 1 ml de supernatant se diluează în raport de 1: 5 (vol. /vol. ) (adică 1 ml + 4 ml) cu soluție 30 % (greutate/volum) de SDS în apă distilată. Se măsoară densitatea optică (DO) a soluției la aproximativ 565 nm. 1. 5. 3. 3. 2. Calcularea conținutului de colorant Conținutul de colorant Sulforhodamine B din fiecare rondea se calculează din valorile DO (coeficientul de extincție molară a colorantului Sulforhodamine B la 565 nm = 8,7 × 104; greutatea moleculară = 580). Se calculează conținutul de colorant Sulforhodamine B pentru fiecare rondea de piele ș(cid:13)i se calculează conținutul mediu de colorant pentru toate testele repetate. Se acceptă valorile medii ale colorantului fixat, cu condiția ca valorile martorilor testați în paralel să se situeze între limite acceptabile pentru metoda respectivă. Limitele acceptabile propuse ale conținutului de colorant pentru substanțele martor pentru metodologia ș(cid:13)i aparatura descrisă sunt următoarele: 128 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 29 Martorul Substanța Pozitiv Negativ Acid clorhidric 10 M (36 %) Apă distilată Conținutul de colorant (μg/rondea) 40-100 15-35 1. 5. 3. 4. I n f o r m a ț i i s u p l i m e n t a r e Substanțele de testat se mai pot aplica pe rondelele de piele pentru perioade scurte de timp (de exemplu 2 ore) pentru identificarea materialelor puternic corozive. Cu toate acestea, pentru studiul de validare, s-a constatat că testul RET supraestimează potențialul coroziv al câtorva produse chimice testate după aplicarea acestora pe rondelele de piele timp de 2 ore (2), deș(cid:13)i permite identificarea corectă a substanțelor corozive ș(cid:13)i necorozive după o aplicare de 24 de ore. Proprietățile ș(cid:13)i dimensiunile aparaturii de laborator utilizate ș(cid:13)i modul de lucru pot să influențeze valorile RET obținute. Pragul de coroziune de 5 κΩ a fost obținut din datele obținute cu aparatura specifică ș(cid:13)i modul de lucru descrise în prezenta metodă. Dacă se modifică semnificativ condițiile de testare, se aplică un prag ș(cid:13)i valori ale probelor martor diferite. Prin urmare, se recomandă calibrarea metodologiei ș(cid:13)i a pragului de rezistență prin realizarea testului cu o serie de substanțe etalon selectate dintre substanțele chimice utilizate în studiul de validare (3). 1. 6. Principiul metodei de testare - testul pe model de piele umană Materialul de testat se aplică pe suprafața unui model tridimensional de piele umană, ce conține o epidermă restructurată cu un strat cornos funcțional, ș(cid:13)i se menține până la 4 ore. Materialele corozive se identifică prin capacitatea lor de a reduce viabilitatea celulară {determinată, de exemplu, prin testul de reducere a MTT [bromură de (3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil) tetrazoliu]} sub valorile prag definite, la timpi de expunere determinați. Principiul testului se întemeiază pe ipoteza că substanțele chimice corozive pot să penetreze stratul cornos al pielii (prin difuzie sau eroziune) ș(cid:13)i sunt suficient de citotoxice pentru a provoca moartea celulelor din straturile celulare de dedesubt. 1. 7. Descrierea metodei de testare – testul cu model de piele umană 1. 7. 1. Modelele de piele umană Modelele de piele umană pot să provină din surse diferite, dar trebuie să îndeplinească anumite criterii. Modelul trebuie să fie constituit dintr-un strat cornos funcțional ș(cid:13)i un strat de celule vii sub acesta. Stratul cornos trebuie să aibă o funcție de barieră specifică. Acest lucru se poate demonstra prin rezistența modelului la citotoxicitate în urma aplicării substanțelor cunoscute ca fiind citotoxice pentru celule, dar care, în mod normal, nu trec prin stratul cornos. Trebuie să se demonstreze că modelul dă rezultate reproductibile în condiții experimentale stabilite. Viabilitatea celulelor vii din model trebuie să fie suficient de mare pentru a face distincție între substanțele martor pozitiv ș(cid:13)i negativ. Viabilitatea celulară (de exemplu, măsurată prin cantitatea de MTT redus, adică o valoare a DO) în urma expunerii la substanța martor negativ trebuie să se situeze între limite acceptabile pentru modelul în cauză. În mod similar, valorile viabilității celulare în cazul substanței martor pozitiv (în raport cu cele pentru martorul negativ) trebuie să se situeze între limite determinate. Ceea ce este foarte important, trebuie să se dovedească faptul că modelul predictiv utilizat respectă normele internaționale de validare (2). 1. 7. 2. Modul de lucru 1. 7. 2. 1. A p l i c a r e a m a t e r i a l u l u i d e t e s t a t Pentru substanțele lichide, substanța de testat trebuie să se aplice într-o cantitate suficientă pentru a acoperi suprafața pielii (minimum 25 μl/cm2). Pentru substanțele solide, substanța de testat trebuie să se aplice într-o cantitate suficientă pentru a acoperi suprafața pielii ș(cid:13)i, apoi, ar trebui să fie umezită pentru a asigura un contact bun cu pielea; dacă este cazul, substanțele solide ar trebui să fie măcinate pentru a obține o pulbere înainte de aplicare. Metoda de aplicare trebuie să fie adecvată pentru o gamă variată de substanțe chimice (2). La sfârș(cid:13)itul perioadei de expunere, materialul de testat trebuie să fie îndepărtat cu grijă de pe suprafața pielii, cu soluție salină. 1. 7. 2. 2. M ă s u r ă t o r i d e v i a b i l i t a t e c e l u l a r ă Se poate utiliza orice metodă cantitativă, validată pentru măsurarea viabilității celulare. Testul cel mai frecvent utilizat este cel de reducere a MTT, care s-a dovedit a da rezultate precise ș(cid:13)i reproductibile în diferite laboratoare (2). Rondeaua de piele se introduce într-o soluție de MTT de 0,3 mg/ml la temperatura de 20-28 °C timp de 3 ore. Produsul formazan sub formă de precipitat albastru se supune apoi extracției (extracție cu solvent) ș(cid:13)i se determină concentrația formazanului prin măsurarea DO la o lungime de undă situată între 545 ș(cid:13)i 595 nm. 13/vol. 29 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 129 1. 7. 2. 3. I n f o r m a ț i i s u p l i m e n t a r e Modelul de piele utilizat, precum ș(cid:13)i protocolul exact privind timpul de expunere ș(cid:13)i procedurile de spălare etc. au un impact important asupra rezultatelor de viabilitate celulară. Se recomandă etalonarea metodologiei ș(cid:13)i modelului predictiv prin testarea unei serii de substanțe etalon de referință, selectate dintre substanțele chimice utilizate în studiul de validare de la ECVAM (3). Este esențial să se demonstreze că metoda utilizată este reproductibilă în cadrul aceluiaș(cid:13)i laborator ș(cid:13)i între laboratoare, pentru o gamă variată de substanțe chimice, în conformitate cu normele internaționale. Metoda ar trebui să îndeplinească cel puțin criteriile de validitate ș(cid:13)tiințifică definite anterior (2), iar rezultatele validării trebuie să fie publicate într-o revistă ș(cid:13)tiințifică cu referenți anonimi (peer-reviewed). 2. DATELE 2. 1. Prezentarea rezultatelor 2. 1. 1. Testul RET pe pielea de ș(cid:13)obolan Valorile rezistenței (κΩ) pentru substanța de testat, martorii pozitiv ș(cid:13)i negativ ș(cid:13)i orice substanță chimică de referință ar trebui să se prezinte în raport sub formă de tabel, care să includă ș(cid:13)i datele de la experimentele concomitente/repetate, valorile medii ș(cid:13)i clasificarea rezultată. 2. 1. 2. Testul cu model de piele umană Valorile DO ș(cid:13)i datele de viabilitate celulară calculate în procente pentru materialul de testat, martorii pozitiv ș(cid:13)i negativ ș(cid:13)i substanțele chimice de referință ar trebui să se prezinte în raport sub fomă de tabel, care să includă ș(cid:13)i datele de la experimentele concomitente/repetate, valorile medii ș(cid:13)i clasificarea rezultată. 2. 2. Evaluarea ș(cid:13)i interpretarea rezultatelor 2. 2. 1. Testul RET pe pielea de ș(cid:13)obolan Dacă valoarea medie a RET obținută pentru substanța de testat este mai mare de 5 κΩ, atunci aceasta nu este corozivă. Dacă valoarea RET este mai mică sau egală cu 5 κΩ ș(cid:13)i substanța de testat nu este un agent tensioactiv sau o substanță organică neutră, atunci substanța respectivă este corozivă. Pentru agenții tensioactivi sau substanțele organice neutre la care rezultă valori ale RET mai mici sau egale cu 5 κΩ, se poate realiza testul de penetrare a colorantului. Atunci când conținutul mediu de colorant din rondeaua de piele este mai mare sau egal cu conținutul mediu de colorant din rondea pentru martorul pozitiv cu HCl 36 % testat în paralel, substanța de testat este real pozitivăș(cid:13)i este, prin urmare, corozivă. Atunci când conținutul mediu de colorant din rondeaua de piele este mai mic decât conținutul mediu de colorant din rondea pentru martorul pozitiv cu HCl 36 % testat în paralel, substanța de testat este fals pozitivă ș(cid:13)i, prin urmare, nu este corozivă. 2. 2. 2. T e s t u l c u m o d e l d e p i e l e u m a n ă Valoarea DO pentru martorul negativ reprezintă o viabilitate celulară de 100 %; deci, valorile DO pentru fiecare probă analizată se pot utiliza la calcularea procentajului de viabilitate în raport cu martorul negativ. Valoarea prag, exprimată în procente, a viabilității celulare, care face distincția dintre materialele de testat corozive ș(cid:13)i necorozive (sau distincția dintre diferite clase corozive) trebuie să fie definită în mod clar în modelul predictiv înainte de validarea metodei, iar studiul ulterior de validare trebuie să demonstreze că valoarea prag este corespunzătoare (2). 3. RAPORTAREA Raportul testului Raportul testului trebuie să includă cel puțin următoarele informații: Substanța de testat — datele de identificare, natura fizică ș(cid:13)i, dacă este relevant, proprietățile fizico-chimice. Informații similare ar trebui să se ofere pentru substanțele de referință, dacă s-au utilizat. Condițiile de testare: — detalii privind modul de lucru, — descrierea ș(cid:13)i justificarea oricăror modificări. 130 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 29 Rezultatele: — prezentarea sub formă de tabele a valorilor rezistenței (testul RET) sau a valorilor viabilității celulare în procente (testul cu model de piele umană) pentru materialul de testat, martorii pozitiv ș(cid:13)i negativ ș(cid:13)i orice inclusiv datele pentru experimentele referință, concomitente/repetate ș(cid:13)i valorile medii, etalon de substanță chimică — descrierea oricăror altor efecte observate. Discutarea rezultatelor Concluzii 4. BIBLIOGRAFIA (1) ECVAM (1998), ECVAM News & Views, ATLA 26, pp. 275-280. (2) Fentem, J. H. , Archer, G. E. B. , Balls, M. , Botham, P. A. , Curren, R. D. , Earl, L. K. , Esdaile, D. J. , Holzhutter, H-G. & Liebsch, M. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team, Toxicology in Vitro 12, pp. 483-524. (3) Barratt, M. D. , Brantom, P. G. , Fentem, J. H. , Gerner, I. , Walker, A. P. & Worth, A. P. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 1. Selection and distribution of the test chemicals, Toxicology in Vitro 12, pp. 471-482. (4) Oliver, G. J. A. , Pemberton, M. A. & Rhodes, C. (1986), An in vitro skin corrosivity test – modifications and validation, Food & Chemical Toxicology 24, pp. 507-512. (5) Botham, P. A. , Hall, T. J. , Dennett, R. , McCall, J. C. , Basketter, D. A. , Whittle, E. , Cheeseman, M. , Esdaile, D. J. & Gardner, J. (1992), The skin corrosivity test in vitro: results of an interlaboratory trial, Toxicology in Vitro 6, pp. 191-194. (6) Worth, A. P. , Fentem, J. H. , Balls, M. , Botham, P. A. , Curren, R. D. , Earl, L. K. , Esdaile, D. J. & Liebsch, M. (1998), An evaluation of the proposed OECD testing strategy for skin corrosion, ATLA 26, pp. 709-720. (7) Botham, P. A. , Chamberlain, M. , Barratt, M. D. , Curren, R. D. , Esdaile, D. J. , Gardner, J. R. , Gordon, V. C. , Hildebrand, B. , Lewis, R. W. , Liebsch, M. , Logemann, P. , Osborne, R. , Ponec, M. , Regnier, J. F. , Steiling, W. , Walker, A. P. & Balls, M. (1995), A prevalidation study on in vitro skin corrosivity testing. The report and recommendations of ECVAM workshop 6, ATLA 23, pp. 219-255. 13/vol. 29 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 131 Figura 1 132 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 29 Figura 2 13/vol. 29 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 133 ANEXA II „B. 41. FOTOTOXICITATEA - TESTUL DE FOTOTOXICITATE 3T3 NRU IN VITRO 1. METODA 1. 1. Introducere Fototoxicitatea se defineș(cid:13)te ca o reacție toxică care se declanș(cid:13)ează după o primă expunere a pielii la anumite produse chimice, urmată de o expunere la lumină, sau care este indusă în mod similar prin iradierea pielii după administrarea sistemică a unui produs chimic. Informațiile obținute din testul de fototoxicitate 3T3 NRU in vitro permit determinarea potențialului fototoxic al unei substanțe de testat, adică posibilele pericole (sau absența acestora) pe care ar putea să le prezinte o substanță de testat în caz de expunere la lumină UV sau vizibilă. Deoarece finalitatea toxicologică a testului in vitro constă în determinarea fototoxicității induse prin acțiunea combinată a unui produs chimic ș(cid:13)i a luminii, prin prezentul test este posibilă determinarea compuș(cid:13)ilor care sunt fototoxici in vivo după o aplicare sistemică ș(cid:13)i distribuție în piele, precum ș(cid:13)i a compuș(cid:13)ilor care au o acțiune fotoiritantă după aplicarea locală pe piele. Testul de fototoxicitate 3T3 NRU in vitro a fost elaborat ș(cid:13)i validat într-un proiect comun UE/COLIPA din 1992-1997 (1) (2) (3), pentru stabilirea unei metode in vitro valide care să înlocuiască diferitele teste in vivo utilizate. În 1996, un grup de lucru al OCDE a recomandat un procedeu de testare secvențială in vitro pentru evaluarea fototoxicității (4). Rezultatele obținute din testul de fototoxicitate 3T3 NRU in vitro au fost comparate cu efectele de fototoxicitate/fotoiritare acută in vivo la animale ș(cid:13)i oameni ș(cid:13)i s-a dovedit că testul oferă o posibilitate excelentă de anticipare a efectelor respective. Testul nu este destinat pentru anticiparea altor efecte adverse care pot să apară în urma acțiunii combinate a produsului chimic ș(cid:13)i a luminii, de exemplu fotogenotoxicitatea, fotocarcinogenitatea, deș(cid:13)i multe produse chimice care prezintă proprietățile specifice menționate reacționează pozitiv la testul de fototoxicitate 3T3 NRU in vitro. În plus, testul nu este destinat să permită o evaluare a gradului de fototoxicitate. fotoalergia ș(cid:13)i În apendice se propune un procedeu secvențial pentru determinarea fototoxicității produselor chimice. 1. 2. Definiții Iradianța:intensitatea luminii ultraviolete (UV) sau vizibile incidente pe o suprafață, măsurată în W/m2 sau mW/cm2. Doza de lumină: cantitatea (= intensitatea × timp) de lumină ultravioletă (UV) sau vizibilă incidentă pe o suprafață, exprimată în jouli (= W × s) pe unitatea de suprafață, de exemplu J/m2 sau J/cm2. Benzi de lungimi de undă a luminii UV: specificațiile recomandate de CIE (Commission Internationale de l’Eclairage) sunt: UVA (315-400 nm), UVB (280-315 nm) ș(cid:13)i UVC (100-280 nm). Se utilizează ș(cid:13)i alte specificații: limita dintre UVB ș(cid:13)i UVA este plasată adesea la 320 nm ș(cid:13)i UVA se poate diviza în UV-A1 ș(cid:13)i UV-A2, limita dintre acestea fiind situată la aproximativ 340 nm. Viabilitatea celulară: parametru ce reprezintă măsura activității totale a populației de celule (de exemplu fixarea colorantului vital roș(cid:13)u neutru în lizozomii celulari) care, în funcție de efectul măsurat ș(cid:13)i de tipul testului utilizat, se corelează cu numărul total ș(cid:13)i/sau vitalitatea celulelor. Viabilitatea celulară relativă: viabilitatea celulară exprimată în funcție de probele martor negative (solvent) prelevate pe toată durata realizării testului (fie + UV, fie – UV), dar care nu au fost tratate cu un produs chimic. Model predictiv: un algoritm utilizat pentru transformarea rezultatelor unui test de toxicitate într-o estimare a potențialului toxic. În prezenta linie directoare, se pot utiliza PIF ș(cid:13)i MPE pentru transformarea rezultatelor testului de fototoxicitate 3T3 NRU in vitro într-o anticipare a potențialului fototoxic. PIF (photo irritation factor – factor de fotoiritare): factor obținut prin compararea a două concentrații citotoxice la fel de eficiente (EC50) ale produsului chimic de testat în absența (– UV) ș(cid:13)i în prezența (+ UV) unei iradieri necitotoxice cu lumină UV/vizibilă. MPE (mean photo effect – fotoefect mediu): o măsură nouă, rezultată din analiza matematică a traseului complet a două curbe concentrație-răspuns obținute fără (– UV) ș(cid:13)i cu (+ UV) iradiere necitotoxică cu lumină UVA/vizibilă. 134 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 29 Fototoxicitate: reacție toxică acută care apare după o primă expunere a pielii la anumite produse chimice ș(cid:13)i expunere ulterioară la lumină sau care este indusă în mod similar prin iradierea pielii după administrarea sistemică a unui produs chimic. Fotoiritare: termen ce indică o subcategorie a termenului «fototoxicitate», care se utilizează pentru a descrie doar acele reacții fototoxice care se manifestă la nivelul pielii după expunerea (locală sau orală) la produse chimice. Aceste reacții citotoxice conduc întotdeauna la deteriorarea nespecifică a celulelor (reacții de tipul arsurilor solare). Fotoalergie: o reactivitate imunologică dobândită, care nu apare la prima expunere la un produs chimic ș(cid:13)i la lumină ș(cid:13)i necesită o perioadă de inducție de una sau două săptămâni înainte de a fi posibil să se pună în evidență reactivitatea cutanată. Fotogenotoxicitate: o reacție genotoxică observată la un parametru genetic, care apare după expunerea celulelor la o doză negenotoxică de lumină UV/vizibilă ș(cid:13)i la un produs chimic negenotoxic. Fotocarcinogenitate: carcinogenitate indusă prin expunere repetată la lumină ș(cid:13)i la un produs chimic. Termenul «fotococarcinogenitate» se utilizează atunci când efectul tumorigen indus de UV este accentuat de expunerea la un produs chimic. 1. 3. Substanțe de referință În afară de substanței chimice clorpromazină utilizate ca martor pozitiv, care ar trebui să fie testată în paralel ca substanță de referință în fiecare test, pentru reînnoirea testului de fototoxicitate 3T3 NRU, se recomandă utilizarea ca substanțe de referință a unei subgrupe de produse chimice utilizate în experimentele interlaboratoare la prezentul test (1) (3) (13). 1. 4. Considerații inițiale S-au semnalat efecte fototoxice pentru multe tipuri de produse chimice (5) (6) (7) (8). Singura trăsătură comună este capacitatea acestor substanțe de a absorbi energia luminoasă din domeniul luminii solare. Conform primii legi din fotochimie (legea lui Grotthaus-Draper), reacția fotochimică necesită absorbția unui număr suficient de quante de lumină. Astfel, înainte de a avea în vedere realizarea unui test biologic în conformitate cu prezenta linie directoare, se recomandă determinarea unui spectru de absorbție UV/vizibil a produsului chimic analizat (de exemplu conform liniei directoare 101 a OCDE pentru teste). Dacă un coeficient de extincție/absorbție molară este mai mic de 10 litru × mol - 1 × cm - 1, produsul chimic respectiv nu posedă potențial fotoreactiv ș(cid:13)i nu este necesar să fie supus la testul de fototoxicitate 3T3 NRU in vitro sau la orice alt test biologic pentru efecte fotochimice adverse (apendicele). 1. 5. Principiul metodei de testare Sunt identificate patru mecanisme prin care lumina absorbită de un cromofor (chimic) poate antrena o reacție fototoxică (7). Toate aceste mecanisme conduc la o degradare celulară. Prin urmare, testul de fototoxicitate 3T3 NRU in vitro se întemeiază pe o comparare a citotoxicității unui produs chimic atunci când este testat cu expunere sau fără expunere la o doză necitotoxică de lumină UVA/vizibilă. În prezentul test, citotoxicitatea se exprimă printr-o diminuare, dependentă de concentrație, a colorantului vital roș(cid:13)u neutru (NR) fixat (9) după 24 de ore de la tratarea cu produsul chimic testat ș(cid:13)i iradierea acestuia. Celulele Balb/c 3T3 sunt păstrate în cultură timp de 24 de ore pentru formarea monostraturilor. Pentru fiecare produs chimic de testat, câte două plăci cu 96 de cavități se supun la preincubare cu opt concentrații diferite ale produsului chimic timp de 1 oră. Apoi, una dintre cele două plăci este expusă la o doză de lumină UVA/vizibilă necitotoxică, de 5 J/cm2 UVA (experimentul + UV), iar cealaltă placă se păstrează la întuneric (experimentul –UV). În ambele plăci, mediul de tratare este apoi înlocuit cu mediul de cultură ș(cid:13)i după alte 24 de ore de incubare se determină viabilitatea celulară prin fixarea colorantului roș(cid:13)u neutru (NRU) timp de 3 ore. Viabilitatea celulară relativă, exprimată în procente din probele martor negative netratate, se calculează pentru fiecare dintre cele opt concentrații de testare. Pentru estimarea potențialului fototoxic, se compară răspunsurile la concentrații, obținute în prezența (+ UV) ș(cid:13)i absența (– UV) iradierii, de obicei la nivelul EC50, adică la concentrația inhibitoare cu 50 % a viabilității celulare în raport cu probele martor netratate. 1. 6. Criterii de calitate Sensibilitatea la UVA a celulelor, date anterioare: ar trebui ca sensibilitatea celulelor la UVA să fie verificată periodic. Celulele se însămânțează la densitatea utilizată în testul de fototoxicitate 3T3 NRU in vitro, a doua zi se supun iradierii cu doze UVA de 1-9 J/cm2ș(cid:13)i se determină viabilitatea celulară o zi mai târziu printr-un test NRU. Dacă, după o iradiere cu 5 J/cm2 UVA, viabilitatea celulară nu este mai mică de 80 % din viabilitatea probelor martor ținute la întuneric, celulele satisfac criteriile de calitate. La doza maximă de UVA, de 9 J/cm2, viabilitatea ar trebui să nu fie mai mică de 50 % din cea a probelor martor ținute la întuneric. Această verificare ar trebui să se repete aproximativ la fiecare a 10-a reînsămânțare a celulelor. Sensibilitatea la UVA a celulelor de probe martor negative, testul curent: dacă probele martor negative [celule în soluție salină echilibrată Earl (EBSS)] cu sau fără 1 % dimetilsulfoxid (DMSO) sau 1 % etanol (EtOH) în experimentul + UVA prezintă o viabilitate care nu este mai mică de 80 % din cea a celulelor neiradiate aflate în acelaș(cid:13)i solvent, într-un experiment la întuneric (– UVA) realizat în paralel, testul îndeplineș(cid:13)te criteriile de calitate. 13/vol. 29 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 135 Viabilitatea probelor martor negative: densitatea optică absolută (DO540 NRU) măsurată în extractul NR al probelor martor negative indică dacă cele 1×104 celule însămânțate în fiecare cavitate se dezvoltă la dublarea normală a timpului în cele două zile cât durează testul. Dacă valoarea medie a DO540 NRU pentru probele martor netratatate este ≥ 0,2, testul îndeplineș(cid:13)te criteriile de acceptare. Proba martor pozitivă: un produs chimic fototoxic cunoscut se supune testării în paralel cu fiecare test de fototoxicitate 3T3 NRU. Clorpromazina (CPZ) s-a utilizat ca probă martor pozitivă în studiul de validare UE/COLIPA ș(cid:13)i, prin urmare, este cea recomandată. Pentru CPZ, testată conform protocolului standard în testul de fototoxicitate 3T3 NRU in vitro, s-au stabilit următoarele criterii de acceptare a testului: CPZ iradiată (+ UVA): EC50 = 0,1-2,0 μg/ml, CPZ neiradiată (– UVA): EC50 = 7,0-90,0 μg/ml. Factorul de fotoiritare (PIF), adică variația EC50 ar trebui să fie de cel puțin 6. În locul CPZ, se pot utiliza ca probe martor pozitive, testate în paralel, alte produse chimice fototoxice cunoscute, ce corespund clasei de produse chimice sau caracteristicilor de solubilitate ale produselor chimice de testat. În acest caz, în funcție de datele anterioare, se recomandă stabilirea specifică a limitelor pentru valorile EC50 ș(cid:13)i a PIF sau MPE (fotoefectul mediu) drept criterii de acceptare pentru test. 1. 7. Descrierea metodei de testare 1. 7. 1. Preparatele 1. 7. 1. 1. C e l u l e l e În studiul de validare s-a utilizat o linie permanentă de celule fibroblaste de ș(cid:13)oarece -- Balb/c 3T3, clona 31 – provenind fie de la ATCC (American Type Culture Collection), fie de la ECACC (European Collection of Cell Cultures) ș(cid:13)i, prin urmare, este cea recomandată. Dacă se adaptează condițiile de cultură la nevoile specifice ale celulelor, se pot utiliza cu succes alte celule sau linii celulare pentru acelaș(cid:13)i protocol al testului, cu condiția demonstrării echivalenței. Celulele ar trebui să fie controlate cu regularitate pentru a verifica absența contaminării acestora cu micoplasmă ș(cid:13)i ar trebui să fie utilizate numai dacă rezultatele acestui control sunt satisfăcătoare. Deoarece sensibilitatea la UVA a celulelor poate să crească cu numărul de reînsămânțări, ar trebui să se utilizeze celulele Balb/c 3T3 cu cel mai mic număr de reînsămânțări posibile, de preferință mai mic de 100. Este important ca sensibilitatea la UVA a celulelor Balb/c 3T3 să fie controlată cu regularitate în conformitate cu procedura pentru controlul calității descrisă în prezenta linie directoare. 1. 7. 1. 2. M e d i i l e ș(cid:13) i c o n d i ț i i l e d e c u l t u r ă Se recomandă utilizarea unor medii de cultură ș(cid:13)i condiții de incubare corespunzătoare la reînsămânțarea sistematică a celulelor ș(cid:13)i în timpul procedurii de testare. Pentru celulele Balb/c 3T3, mediul de cultură este DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) îmbogățit cu 10 % ser de vițel nou-născut, 4 mM de glutamină, penicilină ș(cid:13)i streptomicină; incubarea în atmosferă umidificată la 37 °C/7,5 % CO2. Este deosebit de important ca aceste condiții de cultură celulară să asigure o durată a ciclului celular în limitele normale pentru celulele sau linia celulară utilizată. 1. 7. 1. 3. P r e g ă t i r e a c u l t u r i l o r Celulele din cultura de rezervă congelată se însămânțează în mediul de cultură la o densitate corespunzătoare ș(cid:13)i se reînsămânțează cel puțin o dată înaintea zilei în care se utilizează în testul de fototoxicitate 3T3 NRU in vitro. Pentru testul de fototoxicitate, celulele sunt însămânțate în mediul de cultură la o anumită densitate, astfel încât culturile să nu ajungă la confluență înainte de încheierea testului, adică atunci când se determină viabilitatea celulară după 48 de ore de la însămânțarea celulelor. Pentru celulele Balb/c 3T3 cultivate pe plăci cu 96 de cavități, densitatea celulară recomandată este de 1 × 104 celule per cavitate. Pentru fiecare produs chimic testat, însămânțarea celulelor este identică pe cele două plăci separate, cu câte 96 de cavități, care se utilizează apoi concomitent pe toată durata testului în condiții de cultură identice, cu excepția intervalului de timp în care o placă este iradiată (+ UVA/vizibilă) ș(cid:13)i cealaltă este păstrată la întuneric (– UVA/vizibilă). 1. 7. 1. 4. A c t i v a r e a m e t a b o l i c ă În timp ce utilizarea sistemelor de activare metabolică este o cerință generală pentru toate testele in vitro utilizate pentru estimarea potențialului genotoxic ș(cid:13)i cancerigen, în cazul fototoxicologiei, nu se cunoaș(cid:13)te până în prezent nici un produs chimic care să necesite o transformare metabolică pentru a acționa ca o fototoxină in vivo sau in vitro. În consecință, nici nu se consideră ca fiind necesar, nici nu se justifică din punct de vedere ș(cid:13)tiințific ca prezentul test să se realizeze cu un sistem de activare metabolică. 136 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 29 1. 7. 1. 5. P r o d u s u l c h i m i c d e t e s t a t / p r e p a r a r e a Produsele chimice de testat trebuie să fie proaspăt preparate chiar înaintea utilizării, cu excepția cazului în care datele de stabilitate dovedesc o conservare care poate fi acceptată. Atunci când este posibilă o fotodegradare rapidă, poate fi necesară prepararea în lumină roș(cid:13)ie. Produsele chimice de testat ar trebui să fie dizolvate în soluții saline tamponate, de exemplu soluție salină echilibrată Earl (EBSS) sau soluție salină tamponată cu fosfat (PBS), care, pentru a evita interferența în timpul iradierii, nu trebuie să conțină componente proteinice ș(cid:13)i indicatori de pH colorați care absorb lumina. Produsele chimice de testat cu solubilitate limitată în apă ar trebui să fie dizolvate în solvenți corespunzători la concentrații de 100 de ori mai mari decât cele dorite în final ș(cid:13)i soluțiile obținute să fie apoi diluate 1:100 cu soluție salină tamponată. Dacă se utilizează un solvent, acesta trebuie să fie prezent în volum constant de 1 % (volum/volum) în toate culturile, adică în probele martor negative, precum ș(cid:13)i în toate concentrațiile produsului chimic de testat. Solvenții recomandați sunt dimetilsulfoxidul (DMSO) ș(cid:13)i etanolul (EtOH). Pot să fie corespunzători ș(cid:13)i alți solvenți cu citotoxicitate redusă (de exemplu acetona), dar se recomandă o evaluare atentă a proprietăților specifice ale acestora, de exemplu reacția cu produsul chimic de testat, atenuarea efectului fototoxic, proprietățile de fixare a radicalilor. Pentru facilitarea solubilizării, se pot utiliza, cumulativ sau alternativ, agitatorul Vortex, sonicarea ș(cid:13)i încălzirea până la 37 °C. 1. 7. 1. 6. I r a d i e r e a U V / p r e p a r a r e a Sursa de lumină: alegerea unei surse de lumină corespunzătoare ș(cid:13)i a unei filtrări corespunzătoare reprezintă factorul cel mai important pentru realizarea testului de fototoxicitate. Domeniile UVA ș(cid:13)i de lumină vizibilă sunt asociate adesea cu fotosensibilizarea (7) (10), în timp ce domeniul UVB prezintă o mai mică importanță din acest punct de vedere, deoarece este puternic citotoxic în mod direct, fototoxicitatea acestuia crescând de o mie de ori de la 313 nm la 280 nm (11). Criteriile pentru alegerea unei surse corespunzătoare de lumină ar trebui să includă cerința esențială ca sursa de lumină să emită lungimile de undă absorbite de produsul chimic de testat ș(cid:13)i ca doza de lumină (care se poate obține într-un timp rezonabil) să fie suficientă pentru detectarea substanțelor fotosensibilizante cunoscute. În plus, lungimile de undă ș(cid:13)i dozele utilizate nu ar trebui să dăuneze în mod nejustificat sistemului, în special în ceea ce priveș(cid:13)te emisia de căldură (domeniul infraroș(cid:13)u). Simularea luminii solare cu ajutorul simulatorilor solari se consideră a fi sursa optimă de lumină. În simulatoarele solare se utilizează atât arcurile cu xenon, cât ș(cid:13)i arcurile cu mercur (dopat) sau arcurile cu halogenuri metalice. Acestea din urmă prezintă avantajul că emit mai puțină căldură ș(cid:13)i sunt mai ieftine, dar reproducerea luminii solare nu este perfectă. Deoarece toate simulatoarele solare emit cantități importante de UVB, aceastea ar trebui să fie prevăzute cu filtre corespunzătoare pentru atenuarea lungimilor de undă UVB puternic citotoxice. Pentru testul de fototoxicitate 3T3 NRU in vitro, ar trebui să se utilizeze un spectru de iradianță practic lipsit de UVB (UVA:UVB ˜ 1:20). A fost publicat un exemplu de distribuție a iradianței spectrale la un simulator solar cu filtru, utilizat în studiul de validare a testului de fototoxicitate 3T3 NRU in vitro (3). Dozimetria: intensitatea luminii (iradianța) ar trebui să fie controlată cu regularitate înaintea fiecărui test de fototoxicitate, cu ajutorul unui radiometru UV cu bandă lată corespunzător. Radiometrul UV trebuie să fie etalonat în funcție de sursă. Performanța radiometrului UV ar trebui să fie controlată ș(cid:13)i pentru aceasta se recomandă un al doilea radiometru UV de referință, de acelaș(cid:13)i tip ș(cid:13)i etalonat în acelaș(cid:13)i mod. Ar fi ideal ca, la intervale mai mari, să se utilizeze un spectroradiometru pentru măsurarea iradianței spectrale a sursei de lumină filtrată ș(cid:13)i controlul etalonării radiometrului UV cu bandă largă, dar aceste instrumente necesită operații de înaltă performanță realizate de un personal calificat corespunzător. În studiul de validare, s-a stabilit că o doză de 5 J/cm2 (UVA) nu este citotoxică pentru celulele Balb/c 3T3, dar este suficient de puternică pentru a excita chiar ș(cid:13)i produsele chimice puțin fototoxice. Pentru a obține 5 J/cm2 într-un timp de 50 de minute, iradianța trebuie să fie reglată la 1,666 mW/cm2. Dacă se utilizează o altă linie de celule sau o sursă diferită de lumină, s-ar putea să fie necesară o uș(cid:13)oară reglare a dozei de UVA, prin respectarea criteriului conform căruia doza reespectivă nu trebuie să fie nocivă pentru celule, dar să fie suficientă pentru detectarea fototoxinelor standard. Timpul de expunere la lumină se calculează cu următoarea relație: 1. 7. 2. Condițiile de testare Concentrația maximă a produsului chimic de testat nu trebuie să fie mai mare de 100 μg/ml, deoarece toate produsele chimice fototoxice au fost detectate la concentrații mai mici, în timp ce la concentrații mai mari, creș(cid:13)te incidența rezultatelor fals pozitive (supraestimărilor) (13). PH-ul la concentrațiile cele mai mari ale produsului chimic de testat ar trebui să fie satisfăcător (limitele pH-ului: 6,5-7,8). 13/vol. 29 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 137 Limitele concentrațiilor unui produs chimic testat în prezența (+ UVA) ș(cid:13)i în absența (– UVA) luminii ar trebui să fie determinate în mod specific prin încercări prealabile. Limitele ș(cid:13)i intervalele unei serii de concentrații se reglează, astfel încât datele experimentale să confirme în mod satisfăcător curbele concentrație-răspuns. Ar trebui să se utilizeze o progresie geometrică a concentrațiilor (cu un factor de diluție constant). 1. 7. 3. Modul de lucru (1) 1. 7. 3. 1. P r i m a z i Se prepară o suspensie celulară de 1 × 105 celule/ml în mediul de cultură ș(cid:13)i se scurg 100 μl din mediul de cultură doar în cavitățile periferice ale unei plăci de microtitrare a culturii de țesut, cu 96 de cavități (probe oarbe). În celelalte cavități, se toarnă 100 μl dintr-o suspensie celulară de 1 × 105 celule/ml (= 1 × 104 celule/cavitate). Pentru fiecare compus chimic testat, se pregătesc două plăci: una pentru determinarea citotoxicității (– UVA) ș(cid:13)i cealaltă pentru determinarea fotocitotoxicității (+ UVA). Se incubează celulele timp de 24 de ore (7,5 % CO2, 37 °C) până când acestea formează un monostrat semi-confluent. Timpul de incubare menționat permite recuperarea ș(cid:13)i aderența celulelor, precum ș(cid:13)i dezvoltarea exponențială. 1. 7. 3. 2. A d o u a z i După incubare, se decantează mediul de cultură de celule ș(cid:13)i se spală de două ori cu 150 μl de EBSS/PBS pentru fiecare cavitate. Se adaugă 100 μl de EBSS/PBS ce conțin concentrația corespunzătoare a produsului chimic de testat sau doar solvent (martorul negativ). Se aplică 8 concentrații diferite de produs chimic de testat. Se incubează celulele cu produsul chimic de testat la întuneric timp de 60 de minute (7,5 % CO2, 37 °C). Pentru a realiza partea (+ UVA) a testului, se iradiază celulele la temperatura camerei timp de 50 de minute, prin capacul plăcii cu 96 de cavități, cu 1,7 mW/cm2 UVA (= 5 J/cm2). Se ventilează cu un ventilator pentru a preveni condensarea apei de sub capac. Se păstrează dubluri ale plăcilor (– UVA) la temperatura camerei într-o cutie întunecată timp de 50 de minute (= timpul de expunere la UVA). Soluția se decantează ș(cid:13)i se spală de două ori cu 150 μl EBSS//PBS. Se înlocuieș(cid:13)te EBSS/PBS cu mediul de cultură ș(cid:13)i se incubează (7,5 % CO2, 37 °C) peste noapte (18-22 de ore). 1. 7. 3. 3. A t r e i a z i Evaluarea microscopică Se examinează celulele la un microscop cu contrast de fază. Se înregistrează modificările morfologice ale celulelor datorită efectelor citotoxice ale produsului chimic testat. Acest control se recomandă pentru excluderea erorilor, dar observațiile nu se utilizează la evaluarea citotoxicității sau fototoxicității. Testul de fixare a roș(cid:13)ului neutru Se spală celulele cu 150 μl de EBSS/PBS preîncălzită. Se elimină soluția de spălare prin lovire uș(cid:13)oară. Se adaugă 100 μl de mediu NR ș(cid:13)i se incubează la 37 °C în atmosferă umedă de 7,5 % CO2, timp de 3 ore. După incubare, se înlătură mediul NR ș(cid:13)i se spală celulele cu 150 μl de EBSS/PBS. Se decantează ș(cid:13)i se absoarbe complet EBSS/PBS. (Facultativ: se centrifughează placa răsturnată. ) Se adaugă exact 150 μl soluție (etanol/acid acetic proaspăt preparată) de desorbție a NR. Se agită rapid placa de microtitrare pe un agitator pentru placa de microtitrare timp de 10 minute, până la extracția NR din celule ș(cid:13)i formarea unei soluții omogene. Se măsoară densitatea optică a extractului de NR la 540 nm într-un spectrofotometru, utilizând probe oarbe pentru referință. Datele se salvează într-un format de fiș(cid:13)ier corespunzător (de exemplu, ASCII) pentru o analiză ulterioară. 138 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 29 2. 2. 1. DATELE Calitatea ș(cid:13)i cantitatea datelor Datele ar trebui să permită o interpretare semnificativă a curbei concentrație-răspuns, obținută cu ș(cid:13)i fără iradiere cu lumină UVA/vizibilă. Dacă se constată o citotoxicitate, atât limitele concentrației, cât ș(cid:13)i intervalele concentrațiilor individuale ar trebui să fie stabilite, astfel încât să fie posibilă o concordanță a curbei cu datele experimentale. Datorită faptului că, în experimentul realizat la întuneric (– UVA), un produs chimic de testare ar putea să nu fie citotoxic până la concentrația limită determinată de 100 μg/ml, dar foarte citotoxic atunci când este iradiat (+ UVA), s-ar putea să fie necesară o variație cu câteva ordine de mărime a gamei de concentrații ce urmează să fie testate în ambele părți ale experimentului, pentru îndeplinirea cerințelor de calitate a datelor specifice. Dacă nu se constată citotoxicitate în ambele părți ale experimentului (– UVA ș(cid:13)i + UVA), este suficient să se realizeze testul cu un interval mare între fiecare doză până la concentrația maximă. Nu se cere verificarea unui rezultat clar pozitiv prin repetarea experimentului. În plus, rezultatele clar negative nu trebuie verificate, cu condiția ca produsul chimic respectiv să fi fost testat în concentrații suficient de mari. În aceste cazuri, este suficient un singur experiment principal, susținut de una sau mai multe experimente preliminare pentru determinarea gamei de concentrații. Testele cu rezultate la limită, aproape de pragul critic al modelului predictiv, ar trebui să fie repetate pentru verificare. Dacă se consideră că este necesară repetarea testului, atunci s-ar putea ca modificarea condițiilor experimentale să fie importantă pentru obținerea unor rezultate clare. Prepararea soluțiilor de produs chimic de testat reprezintă un parametru important în prezentul test. Prin urmare, s-a putea ca modificarea acestor condiții (cosolvent, măcinare fină, sonicare) să fie de cea mai mare importanță în repetarea testului. O altă posibilitate ar fi variația timpului de incubare, preiradiere. Un timp mai scurt poate să fie relevant pentru produsele chimice instabile în apă. 2. 2. Prezentarea datelor Dacă este posibil, se determină concentrația unui produs chimic de testat care reflectă o inhibare cu 50 % a fixării roș(cid:13)ului neutru de către celule (EC50). Acest lucru se poate realiza prin aplicarea unei metode de regresie neliniară corespunzătoare (de preferință o funcție Hill sau o regresie logistică) pentru prelucrarea datelor de concentrație-răspuns sau prin utilizarea altor metode de ajustare (14). Înaintea utilizării EC50 pentru alte calcule, ar trebui să se controleze în mod corespunzător calitatea ajustării. O altă posibilitate ar fi utilizarea metodelor de ajustare grafică pentru calcularea EC50. În acest caz, se recomandă utilizarea hârtiei semi-logaritmice (axa x: log, axa y: probit), deoarece în multe cazuri, funcția concentrație-răspuns devine aproape lineară după transformarea respectivă. 2. 3. Evaluarea rezultatelor (modelele predictive) 2. 3. 1. Modelul predictiv, versiunea 1: factorul de fotoiritare (PIF) Dacă, atât în prezența (+ UVA), cât ș(cid:13)i în absența (– UVA) luminii, se obțin curbe concentrație-răspuns complete, se calculează un factor de fotoiritare (PIF) cu ajutorul formulei următoare: O valoare PIF < 5 indică absența potențialului fototoxic, în timp ce PIF ≥ 5 indică un potențial fototoxic. Dacă un produs chimic este citotoxic doar în prezența luminii (+ UVA) ș(cid:13)i nu este citotoxic în condiții (– UVA), PIF nu se poate calcula, deș(cid:13)i acest rezultat indică un potențial fototoxic. În aceste cazuri, se poate calcula o valoare «> PIF», dacă testul de citotoxicitate (– UV) se realizează până la concentrația experimentală maximă (Cmax)ș(cid:13)i valoarea obținută se utilizează la calcularea «> PIF»: Dacă este posibilă obținerea doar a unei valori «> PIF», atunci orice valoare > 1 indică un potențial fototoxic. Dacă nu se pot calcula nici EC50 (– UV), nici EC50 (+ UV), datorită faptului că un produs chimic nu prezintă citotoxicitate până la concentrația experimentală maximă, acest lucru indică lipsa potențialului fototoxic. În aceste cazuri, se utilizează o valoare «PIF = *1» formal pentru caracterizarea rezultatului: 13/vol. 29 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 139 Dacă se poate obține doar o valoare «PIF = *1», aceasta indică lipsa potențialului fototoxic. În cazurile (b) ș(cid:13)i (c), concentrațiile atinse în testul de fototoxicitate 3T3 NRU in vitro ar trebui să fie luate atent în considerație la estimarea potențialului fototoxic. 2. 3. 2. Modelul predictiv, versiunea 2: fotoefectul mediu (MPE) Ca soluție alternativă, se poate aplica o nouă versiune a modelului pentru estimarea potențialului fototoxic, care a fost elaborată plecând de la datele studiului de validare UE/COLIPA (15) ș(cid:13)i experimentată în condiții oarbe într-un studiu ulterior privind fototoxicitatea in vitro a produselor chimice utilizate ca filtre UV (13). Modelul menționat permite depăș(cid:13)irea limitelor modelului PIF pentru cazurile în care nu este posibilă obținerea unei valori a EC50. Modelul utilizează «fotoefectul mediu» (MPE), care este o măsură bazată pe compararea curbelor concentrație-răspuns complete. Pentru aplicarea modelului MPE, la Universitatea Humboldt (Berlin) a fost elaborat un sistem special de programe de calculator, care se poate obține gratuit. 2. 4. Interpretarea rezultatelor Un rezultat pozitiv la testul de fototoxicitate 3T3 NRU in vitro (PIF ≥ 5 sau MPE ≥ 0,1) indică faptul că substanța testată are potențial fototoxic. Dacă acest tip de rezultat se obține la concentrații mai mici de 10 μg/ml, este posibil ca produsul chimic testat să acționeze ș(cid:13)i ca fototoxină în diferite condiții de expunere in vivo. Dacă se obține un rezultat pozitiv doar la concentrația experimentală maximă de 100 μg/ml, s-ar putea să fie necesare alte investigații pentru evaluarea pericolului sau a puterii fototoxice. Acestea ar putea să includă studii privind penetrarea, absorbția ș(cid:13)i posibila acumulare a produsului chimic în piele sau supunerea acestuia la alt tip de test pentru confirmarea rezultatelor, de exemplu utilizarea unui model de piele umană in vitro. Un rezultat negativ la testul de fototoxicitate 3T3 NRU in vitro (PIF < 5 sau MPE < 0,1) indică faptul că substanța testată nu este fototoxică pentru cultura de celule de mamifere în condițiile utilizate. În cazurile în care este posibil ca produsul chimic să fie testat până la concentrația maximă de 100 μg/ml, un rezultat negativ indică faptul că produsul chimic nu are potențial fototoxic ș(cid:13)i că o fototoxicitate in vivo se poate considera ca fiind improbabilă. În cazurile în care s-au obținut răspunsuri concentrație-toxicitate (EC50 + UV ș(cid:13)i EC50 – UV) identice la concentrații mici, interpretarea datelor ar fi aceeaș(cid:13)i. În caz contrar, dacă nu s-a evidențiat nici o toxicitate (+ UV ș(cid:13)i – UV) ș(cid:13)i dacă solubilitatea în apă a limitat concentrațiile la valori mai mici de 100 μg/ml, atunci compatibilitatea produsului de testat cu tipul de test poate să fie discutabilă ș(cid:13)i ar trebui să se aibă în vedere un test de confirmare (de exemplu, utilizarea unui model de piele umană in vitro sau în ex vivo sau un test in vivo). 3. RAPORTAREA Raportul testului Raportul testului trebuie să includă următoarele informații: Produsul chimic de testat: — datele de identificare ș(cid:13)i nr. CAS, dacă se cunoaș(cid:13)te; — natura fizică ș(cid:13)i puritatea; — proprietățile fizico-chimice relevante pentru realizarea studiului; — stabilitatea ș(cid:13)i fotostabilitatea, dacă se cunosc. Solventul: — justificarea alegerii solventului; — solubilitatea produsului chimic de testat în solventul ales; — procentul de solvent prezent în mediul de tratare (EBSS sau PBS). Celulele: — tipul ș(cid:13)i sursa celulelor; — absența micoplasmei; — numărul de reînsămânțări ale celulelor, dacă se cunosc; — sensibilitatea la UVA a celulelor, determinată cu aparatură de iradiere, utilizate în testul de fototoxicitate 3T3 NRU in vitro. Condițiile de testare (a) – incubarea înainte ș(cid:13)i după tratament: — tipul ș(cid:13)i compoziția mediului de cultură; — condițiile de incubare (concentrația CO2, temperatura, umiditatea); — timpul de incubare (pretratare, post tratare). 140 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 29 Condițiile de testare (b) – tratamentul cu produsul chimic: — justificarea concentrațiilor alese pentru produsul chimic de testat utilizat atât în prezența, cât ș(cid:13)i în absența iradierii cu limină UV/vizibilă; — în cazul unei solubilități limitate a produsului chimic de testat ș(cid:13)i în absența citotoxicității, justificarea concentrației maxime utilizate; — tipul ș(cid:13)i compoziția mediului de tratare (soluție salină tamponată); — durata tratamentului chimic. Condițiile de testare (c) – iradierea: — justificarea alegerii sursei de lumină utilizate; — caracteristicile iradianței spectrale a sursei de lumină; — caracteristicile de transmisie/absorbție ale filtrului sau filtrelor utilizate; — caracteristicile radiometrului ș(cid:13)i detalii privind etalonarea acestuia; — distanța dintre sursa de lumină ș(cid:13)i sistemul experimental; — iradianța UVA la distanța menționată, exprimată în mW/cm2; — timpul de expunere la lumină UV/vizibilă; — doza UVA (iradianța × timp), exprimată în J/cm2; — temperatura utilizată la culturile de celule în timpul iradierii, precumș(cid:13)i la culturile de celule păstrate în paralel la întuneric. Condițiile de testare (d) – testul NRU: — compoziția mediului NR; — durata de incubare în NR; — condițiile de incubare (concentrația CO2, temperatura, umiditatea); — condițiile de extracție a NR (agentul de extracție, timpul); — lungimea de undă utilizată pentru citirea spectrofotometrică a densității optice a NR; — a doua lungime de undă (de referință), dacă s-a utilizat; — compoziția eș(cid:13)antionului utilizat la realizarea probei oarbe a spectrofotometrului, dacă s-a utilizat. Rezultatele: — viabilitatea celulară obținută la fiecare concentrație a produsului chimic de testat, exprimată în procente de viabilitate medie a martorilor; — curbele concentrație-răspuns (concentrația produsului chimic de testat în funcție de viabilitatea celulară relativă), obținute în experimente + UVA ș(cid:13)i – UVA realizate în paralel; — analiza datelor din curbele concentrație-răspuns: dacă este posibil, calcularea/determinarea valorilor pentru EC50 (+ UVA) ș(cid:13)i EC50 (– UVA); — compararea celor două curbe concentrație-răspuns, obținute în prezențaș(cid:13)i în absența iradierii cu lumină UVA/vizibilă, fie prin calcularea factorului de fotoiritare (PIF), fie prin calcularea fotoefectului mediu (MPE); — clasificarea potențialului fototoxic; — criteriile de acceptare a testului (a) – martorul negativ paralel: — viabilitatea absolută (densitatea optică a extractului de NR) a celulelor iradiate ș(cid:13)i neiradiate; — date istorice cu privire la martorul negativ, deviația medie ș(cid:13)i deviația standard; — criteriile de acceptare a testului (a) – martorul pozitiv paralel: — valorile EC50 (+ UVA) ș(cid:13)i EC50 (– UVA) ș(cid:13)i PIF pentru produsul chimic utilizat ca martor pozitiv; — date istorice cu privire la produsul chimic utilizat ca martor pozitiv: valorile EC50 (+ UVA) ș(cid:13)i EC50 (– UVA) ș(cid:13)i PIF, deviația medie ș(cid:13)i deviația standard. Discutarea rezultatelor Concluziile 13/vol. 29 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 141 4. BIBLIOGRAFIA (1) Spielmann, H. , Balls, M. , Döring, B. , Holzhütter, H. G. , Kalweit, S. , Klecak, G. , L’Eplattenier, H. , Liebsch, M. , Lovell, W. W. , Maurer, T. , Moldenhauer, F. , Moore, L. , Pape, W. , Pfannbecker, U. , Potthast, J. , De Silva, O. , Steiling, W. and Willshaw, A. (1994), EEC/COLIPA project on in vitro phototoxicity testing: First results obtained with a Balb/c 3T3 cell phototoxicity assay, Toxicology in Vitro 8, p. 793-796. (2) Anon (1998), Statement on the scientific validity of the 3T3 NRU PT test (an in vitro test for phototoxicity), European Commission, Joint Research Centre: ECVAM and DGXI/E/2, 3 November 1997, ATLA 26, pp. 7-8. (3) Spielmann, H. , Balls, M. , Dupuis, J. , Pape, W. J. W. , Pechovitch, G. , De Silva, O. , Holzhütter, H. G. , Clothier, R. , Desolle, P. , Gerberick, F. , Liebsch, M. , Lovell, W. W. , Maurer, T. , Pfannenbecker, U. , Potthast, J. M. , Csato, M. , Sladowski, D. , Steiling, W. and Brantom, P. (1998), EU/COLIPA «In vitro phototoxicity» validation study, results of phase II (blind trial), part 1: the 3T3 NRU phototoxicity test, Toxicology in Vitro 12, pp. 305-327. (4) OECD Test Guidelines Programme, ENV/MC/CHEM/TG(96)9: Final Report of the OECD Workshop on Harmonisation of Validation and Acceptance Criteria of Alternative Toxicological Test Methods, OECD Publications Office, Paris, 1996. (5) (6) (7) (8) Lovell, W. W. (1993), A scheme for in vitro screening of substances for photoallergenic potential, Toxicology in Vitro 7, pp. 95-102. Santamaria, L. and Prino, G. (1972), List of the photodynamic substances, Research progress in organic, biological and medicinal chemistry Vol. 3 Part 1, North Holland Publishing Co, Amsterdam, pp. XI-XXXV. Spielmann, H. , Lovell, W. W. , Hölzle, E. , Johnson, B. E. , Maurer, T. , Miranda, M. A. , Pape, W. J. W. , Sapora, O. and Sladowski, D. (1994), In vitro phototoxicity testing: The report and recommendations of ECVAM workshop 2, ATLA 22, pp. 314-348. Spikes, J. D. (1989), Photosensitization, The science of photobiology, edited by KC Smith, Plenum Press, New York, 2nd edition, pp. 79-110. (9) Borenfreund, E. and Puerner, J. A. (1985), Toxicity determination in vitro by morphological alterations and neutral red absorption, Toxicology Letters 24, pp. 119-124. (10) Lambert L. A, Warner W. G. and Kornhauser A. (1996), Animal models for phototoxicity testing, Dermatotoxicology, edited by FN Marzulli and HI Maibach, published by Taylor & Francis, Washington DC, 5th Edition, pp. 515-530. (11) Tyrrell R. M. and Pidoux M (1987), Action spectra for human skin cells: estimates of the relative cytotoxicity of the middle ultraviolet, near ultraviolet and violet regions of sunlight on epidermal keratinocytes, Cancer Research 47, pp. 1825-1829. (12) ZEBET/ECVAM/COLIPA, Standard Operating Procedure: Balb/c 3T3 NRU Phototoxicity Test, drafted 23 December 1997 by M. Liebsch and approved 6 March 1998 by the Management Team of the EU/COLIPA project «In Vitro Photoirritation». (13) Spielmann, H. , Balls, M. , Dupuis, J. , Pape, W. J. W. , De Silva, O. , Holzhütter, H. G. , Gerberick, F. , Liebsch, M. , Lovell, W. W. and Pfannenbecker (1998), A Study on the Phototoxic Potential of UV Filter Chemicals from Annex VII of the EU Directive 76/768/EEC in the 3T3 NRU In Vitro Phototoxicity Test, ATLA 26, pp. 679-708. (14) Holzhütter, H. G. and Quedenau, J. (1995), Mathematical modelling of cellular responses to external signals, Journal of Biological Systems 3, pp. 127-138. (15) Holzhütter, H. G. (1997), A general measure of in vitro phototoxicity derived from pairs of dose-response curves and its use for predicting the in vivo phototoxicity of chemicals, ATLA 25, pp. 445-462. 142 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 13/vol. 29 Apendice (1) Detalii suplimentare se pot găsi în referința (12) din bibliografie. ”


title: Decizia Comisiei din 25 aprilie 2000 privind stabilirea condițiilor speciale pentru importul de moluște bivalve, echinoderme, tunicieri și gasteropode marine originare din Republica Socialistă Vietnam [notificată cu numărul C(2000) 1054]Text cu relevanță pentru SEE.

eurovoc_concepts:
Vietnam
health control
import
mollusc
originating product

text: 164 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 03/vol. 32 32000D0333 13. 5. 2000 JURNALUL OFICIAL AL COMUNITĂȚILOR EUROPENE L 114/42 DECIZIA COMISIEI din 25 aprilie 2000 privind stabilirea condițiilor speciale pentru importul de moluș(cid:13)te bivalve, echinoderme, tunicieri ș(cid:13)i gasteropode marine originare din Republica Socialistă Vietnam [notificată cu numărul C(2000) 1054] (Text cu relevanță pentru SEE) (2000/333/CE) COMISIA COMUNITĂȚILOR EUROPENE, având în vedere Tratatul de instituire a Comunității Europene, având în vedere Directiva 91/492/CEE a Consiliului din 15 iulie 1991 de stabilire a normelor sanitar-veterinare pentru produce- rea ș(cid:13)i introducerea pe piață a moluș(cid:13)telor bivalve (1), astfel cum a fost modificată ultima dată prin Directiva 97/79/CE (2), în special articolul 9 alineatul (3) litera (b), întrucât: (1) (2) (3) (4) (5) Un expert al Comisiei a efectuat o vizită de inspecție în Republica Socialistă Vietnam în scopul de a verifica condițiile în care sunt produse, antrepozitate ș(cid:13)i expediate produsele pescăreș(cid:13)ti destinate Comunității. Dispozițiile legislației Republicii Socialiste Vietnam conferă „National Fisheries Inspection and Quality Assurance Center (NAFIQACEN)” responsabilitatea pentru controlul de sănătate al moluș(cid:13)telor bivalve, a echinodermelor, tunicierilor ș(cid:13)i gasteropodelor marine ș(cid:13)i de control al igienei ș(cid:13)i al condițiilor de sănătate ale producției. Această legisla- ție împuterniceș(cid:13)te NAFIQACEN să autorizeze sau să inter- zică recoltarea moluș(cid:13)telor bivalve, a echinodermelor, tunicierilor ș(cid:13)i gasteropodelor marine din anumite zone. NAFIQACEN ș(cid:13)i laboratoarele sale sunt în măsură să veri- fice în mod eficient aplicarea legislației în vigoare în Repu- blica Socialistă Vietnam. Autoritățile competente din Republica Socialistă Vietnam s-au angajat să comunice periodic ș(cid:13)i rapid Comisiei datele privind prezența planctonului conținând toxine în zonele de recoltare. Autoritățile competente din Republica Socialistă Vietnam au dat oficial asigurări în ceea ce priveș(cid:13)te respectarea cerin- țelor enunțate în capitolul V din anexa la Directiva 91/492/CEE ș(cid:13)i a cerințelor echivalente cu cele stabilite de directiva în cauză pentru clasificarea zonelor de producere (1) (2) JO L 268, 24. 9. 1991, p. 1. JO L 24, 30. 1. 1998, p. 31. (6) (7) (8) ș(cid:13)i de relocare, autorizarea centrelor de expediere ș(cid:13)i de puri- ficare, controlul sănătății publice ș(cid:13)i supravegherea produc- ției. Republica Socialistă Vietnam este eligibilă pentru include- rea pe lista țărilor terțe care îndeplinesc condițiile de echi- valență prevăzute la articolul 9 alineatul (3) litera (a) din Directiva 91/492/CEE. Republica Socialistă Vietnam doreș(cid:13)te să exporte spre Comunitate moluș(cid:13)te bivalve, echinoderme, tunicieri ș(cid:13)i gasteropode marine congelate sau prelucrate care au fost sterilizate sau tratate termic în conformitate cu cerințele Deciziei 93/25/CEE (3) a Comisiei, astfel cum a fost modi- ficată prin Decizia 97/275/CE (4). În acest scop, este opor- tun să se desemneze zonele de producție din care pot fi recoltate ș(cid:13)i exportate spre Comunitate moluș(cid:13)tele bivalve, echinodermele, tunicierii ș(cid:13)i gasteropodele marine. Este oportun să se aplice condițiile speciale de import fără să se aducă atingere deciziilor adoptate în conformitate cu Directiva 91/67/CEE a Consiliului din 28 ianuarie 1991 privind condițiile de sănătate animală care reglementează introducerea pe piață a animalelor ș(cid:13)i a produselor de acvacultură (5), astfel cum a fost modificată ultima dată prin Directiva 95/22/CE (6). (9) Măsurile prevăzute de prezenta decizie sunt conforme cu avizul Comitetului veterinar permanent, ADOPTĂ PREZENTA DECIZIE: Articolul 1 „National Fisheries Inspection and Quality Assurance Center (NAFIQACEN) of the Ministry of Fisheries” este autoritatea competentă în Republica Socialistă Vietnam pentru verificarea ș(cid:13)i certificarea faptului că moluș(cid:13)tele bivalve, echinodermele, tunicierii ș(cid:13)i gasteropodele marine sunt conforme cu cerințele Directivei 91/492/CEE. (3) (4) (5) (6) JO L 16, 25. 1. 1993, p. 22. JO L 108, 25. 4. 1997, p. 52. JO L 46, 19. 2. 1991, p. 1. JO L 243, 11. 10. 1995, p. 1. 03/vol. 32 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 165 Articolul 2 Moluș(cid:13)tele bivalve, echinodermele, tunicierii ș(cid:13)i gasteropodele marine originare din Republica Socialistă Vietnam ș(cid:13)i destinate consumului uman trebuie să provină din zonele de producție autorizate enumerate la anexa prezentei decizii. Prezenta decizie se adresează statelor membre. Articolul 3 Adoptată la Bruxelles, 25 aprilie 2000. Pentru Comisie David BYRNE Membru al Comisiei 166 RO Jurnalul Oficial al Uniunii Europene 03/vol. 32 ANEXĂ Număr Nume 01 02 03 04 05 TAN THANH BINH DAI BA MUM AN THUY CON TRAU


title: Regulamento (CE) n.o 827/2000 da Comissão, de 25 de Abril de 2000, que altera o Regulamento (CE) n.o 2461/1999 que estabelece normas de execução do Regulamento (CE) n.o 1251/1999 do Conselho no que respeita à utilização de terras retiradas para a produção de matérias-primas destinadas ao fabrico, na Comunidade, de produtos não destinados directamente ao consumo humano ou animal

eurovoc_concepts:
agricultural product
crop production
fallow
land use
raw material

formats: html pdf print

text: 26. 4. 2000 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 101/21 REGULAMENTO (CE) N. o 827/2000 DA COMISSÃO de 25 de Abril de 2000 que altera o Regulamento (CE) n. o 2461/1999 que estabelece normas de execução do Regulamento (CE) n. o 1251/1999 do Conselho no que respeita à utilização de terras retiradas para a produção de matérias-primas destinadas ao fabrico, na Comunidade, de produtos não destinados directamente ao consumo humano ou animal A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS, Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Europeia, Tendo em conta o Regulamento (CE) n. o 1251/1999 do Conselho, de 17 de Maio de 1999, que institui um sistema de apoio aos produtores de determinadas culturas arvenses (1), alterado pelo Regulamento (CE) n. o 2704/1999 (2), e, nomeada- mente, o seu artigo 9. o, Considerando o seguinte: (1) (2) (3) (4) O n. o 3, primeiro parágrafo, do artigo 6. o do Regula- mento (CE) n. o 1251/1999 estabelece que a terra retirada da produção pode ser utilizada na produção de matérias- -primas para o fabrico, na Comunidade, de produtos não ao consumo humano ou destinados directamente animal, desde que sejam aplicados sistemas de controlo eficazes. aprovado 93/355/CEE A fim de assegurar o cumprimento do disposto no n. o 7 do memorando de acordo relativo às sementes oleagi- nosas concluído entre a Comunidade Económica Euro- peia e os Estados Unidos da América no âmbito do Acordo Geral sobre Pautas Aduaneiras e Comércio do pela Decisão (GATT) Conselho (3), o n. o 3, terceiro parágrafo, do artigo 6. o do Regulamento (CE) n. o 1251/1999 estabelece que, se a quantidade de subprodutos destinados ao consumo humano ou animal resultante do cultivo de sementes oleaginosas em terras retiradas da produção ao abrigo do primeiro parágrafo exceder anualmente, com base na previsão das quantidades abrangidas por contratos cele- brados com produtores, 1 milhão de toneladas métricas, expresso em equivalente-farinha de soja, será reduzida a quantidade prevista ao abrigo de cada contrato que pode ser utilizada para consumo humano ou animal, a fim de limitar essa quantidade a 1 milhão de toneladas métricas. Para poder aplicar o princípio estabelecido no n. o 3, terceiro parágrafo, do artigo 6. o do Regulamento (CE) n. o 1251/1999, convém completar o sistema de controlo estabelecido no Regulamento (CE) n. o 2461/1999 da Comissão (4) que permite avaliar as quantidades de subprodutos. É igualmente necessário precisar o método de cálculo a utilizar pela Comissão no âmbito do sistema de controlo e instituir um procedimento destinado a fixar o coefici- (1) JO L 160 de 26. 6. 1999, p. 1. (2) JO L 327 de 21. 12. 1999, p. 12. (3) JO L 147 de 18. 6. 1993, p. 25. (4) JO L 299 de 20. 11. 1999, p. 16. (5) (6) (7) (8) ente de redução para as quantidades de subprodutos destinados ao mercado da alimentação animal ou humana a aplicar a cada contrato em caso de superação do limite de 1 milhão de toneladas. Neste contexto, o teor de proteínas puras constitui o critério determinante para a elaboração do método de cálculo. Para garantir que a quantidade máxima de subprodutos que podem destinar-se à alimentação humana ou animal não será ultrapassada, convém exigir provas relativas ao escoamento das quantidades de subprodutos destinados ao mercado não alimentar, a serem fornecidas no momento da liberação da garantia constituída pelo colector ou pelo primeiro transformador. A fim de permitir o controlo eficaz do cumprimento da obrigação de não superar o limite de 1 milhão de tone- ladas, é necessário impor uma data-limite para o escoa- mento das quantidades de subprodutos destinados ao mercado não alimentar. Por outro lado, a nova regulamentação relativa ao apoio ao desenvolvimento rural adoptada em 1999 já não proíbe explicitamente as ajudas agroambientais para as superfícies que beneficiam do regime comunitário de retirada de terras utilizadas para uma produção não alimentar. É conveniente, por motivos de coerência, adaptar as disposições que proíbem o cúmulo com outros regimes de apoio comunitário. Dado que o memorando do acordo acima referido foi publicado no Jornal Oficial das Comunidades Europeias em 1993, presume-se que os operadores o conheçam desde essa data. Uma vez que existe o risco de o limite de 1 milhão de toneladas ser superado na campanha 2000/ /2001, é necessário prever a possibilidade de aplicar as medidas referidas no presente regulamento a todos os contratos celebrados a título da campanha 2000/2001. (9) As medidas previstas no presente regulamento estão em conformidade com o parecer do Comité de Gestão dos Cereais, ADOPTOU O PRESENTE REGULAMENTO: Artigo 1. o O Regulamento (CE) n. o 2461/1999 é alterado do seguinte modo: L 101/22 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias 26. 4. 2000 1. O n. o 4 do artigo 4. o passa a ter a seguinte redacção: «4. Sempre que incida sobre sementes de nabo silvestre, colza ou girassol ou soja dos códigos NC ex 1205 00 90, 1206 00 91, 1206 00 99 ou 1201 00 90, o requerente zelará por que, além das informações referidas no n. o 2, o contrato especifique a quantidade total prevista de subpro- dutos a obter e a quantidade prevista de subprodutos não destinados ao consumo humano ou animal, expressa, nos dois casos, por espécie. As quantidades são calculadas com base nas seguintes equi- valências: a) 100 kg de sementes de nabo silvestre e/ou de colza do código NC 1205 00 90 equivalem a 56 kg de subpro- dutos; b) 100 kg de sementes de girassol do código NC 1206 00 91 ou do código NC 1206 00 99 equivalem a 56 kg de subprodutos; c) 100 kg de soja do código NC 1201 00 90 equivalem a 78 kg de subprodutos. ». 2. O artigo 14. o passa a ter a seguinte redacção: Sem prejuízo do artigo 13. o, a autoridade competente «1. referida no n. o 1 daquele artigo informará a Comissão o mais cedo possível, mas nunca depois do dia 30 de Junho do ano em que a matéria-prima será colhida, da quantidade total prevista, por espécie, de subprodutos destinados ao consumo humano ou animal resultante dos contratos refe- ridos no artigo 4. o, sempre que tais contratos incidam sobre sementes de nabo silvestre, de colza ou de girassol ou soja dos códigos NC ex 1205 00 90, 1206 00 91, 1206 00 99 ou 1201 00 90. 2. A Comissão, com base nas informações fornecidas em conformidade com o n. o 1, calculará a quantidade total prevista de subprodutos destinados ao consumo humano ou animal, expressa em equivalente-farinha de soja, aplicando o método baseado nos coeficientes seguintes: — bagaços de soja: 48 %, — bagaços de colza: 32 %, — bagaços de girassol: 28 %. Se, com base no cálculo efectuado em conformidade com o primeiro parágrafo, constatar uma superação do limite de 1 milhão de toneladas de subprodutos destinados ao consumo humano ou animal, a Comissão fixará, o mais rapidamente possível, mas nunca depois do dia 31 de Julho do ano em que a matéria-prima será colhida, a percentagem de redução a aplicar a cada contrato, com vista a calcular a quantidade máxima de ser destinada ao consumo humano ou animal. ». subprodutos que pode 3. O n. o 4 do artigo 15. o passa a ter a seguinte redacção: «4. Relativamente a cada matéria-prima, a garantia será liberada proporcionalmente, desde que a autoridade compe- tente do colector ou primeiro transformador tenha obtido prova: a) De que essa quantidade de matéria-prima foi transfor- mada de acordo com as condições enunciadas no n. o 2, alínea f), do artigo 4. o, tidas em conta, se for caso disso, as alterações eventualmente efectuadas de acordo com o artigo 8. o, e 1206 00 91, b) Sempre que o contrato incidir sobre sementes de nabo silvestre, de colza ou de girassol ou soja dos códigos NC ex 1205 00 90, ou 1201 00 90 e for aplicável o procedimento previsto no n. o 2 do artigo 4. o, de que a quantidade de subprodutos que ultrapasse a quantidade máxima que pode ser desti- nada ao consumo humano ou animal tenha encontrado mercados distintos do mercado alimentar. ». 1206 00 99 4. O n. o 2 do artigo 16. o passa a ter a seguinte redacção: «2. As obrigações seguintes constituem exigências princi- pais na acepção do artigo 20. o do Regulamento (CEE) n. o 2220/85: a) A obrigação de transformar, a título principal, as quanti- dades de matérias-primas nos produtos finais especifi- cados no contrato; b) A obrigação de encontrar mercados distintos do mercado alimentar para as quantidades de subprodutos que ultrapassem a quantidade máxima que pode ser destinada ao consumo humano ou animal, sempre que for aplicável o procedimento previsto no n. o 2 do artigo 14. o A transformação num ou mais produtos finais constantes do anexo III deve ser efectuada pelo requerente até ao dia 31 de Julho, inclusive, do segundo ano seguinte ao da colheita da matéria-prima. Esta data-limite deve ser igual- fora do mercado mente respeitada para o escoamento, alimentar, das quantidades de subprodutos que ultrapassem a quantidade máxima que pode ser destinada ao consumo humano ou animal sempre que for aplicável o procedi- mento previsto no n. o 2 do artigo 14. o». 5. As alíneas a) e b) do artigo 25. o passam a ter a seguinte redacção: «a) Das acções financiadas pelo Fundo Europeu de Orien- tação e Garantia Agrícola, secção Garantia, em confor- midade com o n. o 2, alíneas a) e b), do artigo 1. o do Regulamento (CE) n. o 1258/1999; b) Das ajudas comunitárias previstas no capítulo VIII do Regulamento (CE) n. o 1257/1999, com excepção do apoio concedido a título dos custos de plantação para espécies de crescimento rápido previsto no n. o 3, segundo parágrafo, do artigo 31. o do referido regula- mento. ». Artigo 2. o O presente regulamento entra em vigor no vigésimo dia seguinte ao da sua publicação no Jornal Oficial das Comunidades Europeias. 26. 4. 2000 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 101/23 É aplicável a todos os contratos celebrados a título da campanha 2000/2001 e das campanhas seguintes, independentemente da sua data de celebração. Em derrogação do parágrafo anterior, as alterações do n. o 4 do artigo 4. o e do n. o 1 do artigo 14. o do Regulamento (CE) n. o 2461/1999 estatuídas no presente regulamento são aplicáveis aos contratos cele- brados a título da campanha 2001/2002 e das campanhas seguintes. O presente regulamento é obrigatório em todos os seus elementos e directamente aplicável em todos os Estados-Membros. Feito em Bruxelas, em 25 de Abril de 2000. Pela Comissão Franz FISCHLER Membro da Comissão