The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms | Protocol (Translated to Hebrew)
Assay חזותי לפקח תחרות קטריאלי T6SS…
זיהוי גנים הקשורים לרומן אלגינט ייצור בm> שימוש מיני…
הביטוי, solubilization דטרגנט, ועל טיהור חלבון ההתנגדות MexB Multidrug…
אנו מראים כי מכשיר ביו מעורב פיתחה טיפול לייזר מבוסס גלוי רציף או פעם שהוא בשילוב עם טיפול אנטיביוטי (gentamycin), גורם לאפקט סינרגיסטי מובהק סטטיסטי שמוביל לירידה בכדאיות של
לאחרונה היו כמה פרסומים על השפעת bactericidal של אור הנראה, רובם בטענה כי חלק כחול של הספקטרום (400 nm-500 ננומטר) הוא אחראי להרג פתוגנים שונים 1-5. השפעת phototoxic של אור הכחול הוצעה להיות תוצאה של מיני חמצן תגובתי המושרה אור (ROS) על ידי היווצרות פוטוסנסיטייזרים חיידקים אנדוגניים אשר רובם לקלוט אור באזור הכחול 4,6,7. ישנם גם דיווחים על השפעת biocidal של אדום וליד אינפרא אדום 8, כמו גם אור ירוק 9.
במחקר הנוכחי, שפתחנו שיטה שאפשרה לנו לאפיין את ההשפעה של מתח גבוה ירוק (אורך גל של 532 ננומטר) אור Q-Switched רציף (CW) ופעם (QS) בPseudomonas aeruginosa. שימוש בשיטה זו אנחנו גם בחנו את ההשפעה של אור הירוק בשילוב עם טיפול אנטיביוטי (gentamycin) על כדאיות החיידקים. פ aeruginosa הוא acהפתוגן האופורטוניסטי noscomial ommon גורם למחלות שונות. הזן הוא די עמיד לאנטיביוטיקה שונות ומכיל רבים מסוג Mex חזה AcrB / RND multidrug מערכות זרימה 10.
השיטה מנוצל חיידקים נטולי חיים נייחים שלב גראם שליליים (עמ 'זן aeruginosa PAO1), גדלו במרק לוריא (LB) בינונית חשוף לQ-Switched ו / או CW לייזרים עם ובלי התוספת של gentamycin האנטיביוטי. כדאיות תא נקבעו בנקודות זמן שונות. התוצאות שהתקבלו הראו כי טיפול לייזר לבד לא להפחית כדאיות תא בהשוואה לשליטת מטופל וכי טיפול gentamycin לבד רק הביאה לירידה של 0.5 לוג בספירה המעשית עבור פ aeruginosa. לייזר המשולב וטיפול gentamycin, לעומת זאת, הביאו לאפקט סינרגיסטי ואת הכדאיות של פ aeruginosa הופחת ב 8 היומן של.
השיטה המוצעת יכולה להיות עוד יותר impleעינה באמצעות פיתוח של צנתר כמו מכשיר שמסוגל הזרקת תמיסת אנטיביוטיקה לתוך האיבר הנגוע בזמן מאיר את האזור באור בו זמנית.
1. תרבות חיידקים
פ גראם שלילי aeruginosa זן PAO1 גדלו במרק לוריא (LB) על 37 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות.
התרבות של תאים הייתה אז centrifuged ב 7,500 סל"ד (סיבובים לדקה) במשך 5 דקות וsupernatant הוסר.
החיידקים היו resuspended ב10% LB מחדש גדלו במשך שעה 2 אחרת כדי לאפשר התרבות להזין מחדש שלב נייח.
ההשעיה החיידקים לאחר מכן לחלק לשתי קבוצות: בקבוצה הראשונה (2 צינורות) אין אנטיביוטיקה נוספו, בקבוצה השנייה הוספנו את האנטיביוטיקה gentamycin (50 מיקרוגרם / מ"ל).
2. נחישות של מושבה יוצרי יחידות (CFU)
כדי לקבוע כדאיות תא 20 דגימות μl נלקחו מהניסוי בערך כל שעה 2 במסגרת הזמן של 24 שעות. דילול סידורי של הדגימות נעשו ומצופה על צלחות אגר LB וטופחו לילה בשעה 37 ° C.
עבור כל טיפול, CFUs לפלאטהדואר נקבע ונערכה השוואה בין תקופות הזמן שונים וטיפולים. הירידה ביומן CFU חושב כמתואר במשוואה. (1):
התחבר הפחתה = LogU-LogC [CFU / מ"ל]
איפה U הוא המושבה להרכיב יחידות ערך בכל נקודת זמן; CFU הוא יחידת מושבה היוצרים בעוד שהיחידות של CFU / מ"ל ​​שווה ל:
CFU / מ"ל ​​= (מספר הגורם לדילול מושבות x) / (נפח מחוסן)
ו-C הוא CFU מצא במדגם השליטה בשלב ההתחלה. שימו לב שU מייעד מושבה להרכיב גורם ברגע מדידה.
הגורם לדילול הוא מספר דילולים ואילו בכל אחד מהם את ריכוז החיידקים צומצם בפקטור של 10. הנפח מחוסן תמיד היה 200 ליטר מיקרו וזה קשור לגודל של מבחנתנו.
לכן, כדי לסכם את נקודת מבט של הריכוז, האנטיביוטיקה gentamycin הייתה בריכוז של 50 מיקרוגרם / מ"ל. באשר לחיידקים, עד סוףהיה לנו התהליך כולל 8 דילולים. כל דילול היה בפקטור של 10 וזה נעשה בצינורות של 200 μl. נקודת המוצא הייתה 20 μl של דגימות שנוספו לתוך צינור μl 200 (ובכך הריכוז הראשוני היה 20/200C 0 = 0 0.1C0 עם C להיות הריכוז הראשוני ב20 μl של דגימות) והריכוז הסופי הופחת 8 סדרי גודל בשל דילולים 8.
CW Nd: YAG לייזר (אורך גל של 532 ננומטר וכוח אופטי הממוצע של 200 מגה ואט) פוצל לשני נתיבים אופטיים באמצעות 50% אופטיים / 50% מפצל קורה. קוטר האלומה היה על 10 מ"מ. משך החשיפה היה 24 שעות.
Q-Switched פעם Nd: YAG לייזר (אורך הגל של 532 ננומטר, הספק ממוצע של 300 מגה ואט ושיא כוח אופטי של 2.5 מגה וואט) פוצל לשני נתיבים גם באמצעות 50% אופטיים / 50% מפצל קורה. קוטר הנקודה היה 6 מ"מ. הרוחב פולס של לייזר ממותגת Q היה 6 NSEC ושיעור ההישנות היה 15Hz.צפיפות הספק ממוצעת הייתה 106 mW / 2 ס"מ ובצפיפות הספק השיא הייתה 8.83 קילוואט / 2 מ"מ. משך החשיפה היה 24 שעות.
שים לב כי ההשעיה החיידקים עוררה במהלך הקרנה וזה היה כל הזמן תחת תנאי התרבות מתאימים להתפתחות חיידקים (בכל הצינורות היה בינונית מרק לוריא, כדי לאפשר לחיידקים לגדול).
ההתקנה מבוססת לייזר מוצגת סכמטי באיור 1. תנאי הניסוי הראשון מנוצלים Nd CW: YAG לייזר בעל אורך גל של 532 ננומטר (ההרמוני שני של Nd: YAG) וכוח אופטי ממוצע של 200 מגה ואט. קרן זו פוצלה לשני נתיבים אופטיים באמצעות 50% 50% מפצל אופטי כך שכל קורה לי פיצול כוח של 100 מגה ואט אלומה /. קוטר האלומה היה על 10 מ"מ ובכך צפיפות ההספק הייתה על 100 mW / 2 ס"מ. משך החשיפה היה 24 שעות. למרות שכוח ההארה גבוה יחסית זה לא גבוה מספיק כדי לגרום לחימום של המדגם.
התנאי השני ניסיוני מנוצל Nd פעמו ממותגת Q: YAG לייזר בעל אורך גל של 532 ננומטר (שנייה הרמוני) וקוטר נקודה של 6 מ"מ. ההספק הממוצע היה 300 מגה ואט ושיא כוח אופטי של 2.5 מגה וואט. הרוחב פולס של לייזר ממותגת Q היה 6 NSEC ושיעור ההישנות היה 15Hz. קרן זו הייתה מפוצלת לשני נתיבים גם באמצעות אופטי50% / 50% מפצל קורה. צפיפות ההספק הממוצעת הייתה כ -100 mW / 2 ס"מ ובצפיפות כוח השיא היה 8.83 קילוואט / 2 מ"מ. צפיפות הספק שיא זה היא שווה ערך לאנרגיה שטף של 88.3 μJ / 2 מ"מ לכל דופק כדופק בכל 10 NSEC היה ארוך במישור הזמן. משך החשיפה היה 24 שעות. שני הניסויים בוצעו בתנאי גידול דומים עם חשיפה לא אור (כלומר עם ובלי gentamycin) ששימש כביקורת.
איורים 2 (א) ו 2 (ב) ההשפעה שהושגו עקב הארה של הדגימות עם אור לייזר CW ועם Q-Switched לייזר בהתאמה עם ובלי אנטיביוטיקה על פ aeruginosa מוצג.
בדגימות שלא נחשפו לאור (כלומר ביקורת) לא הייתה ירידה בכדאיויות תא עם או בלי טיפול gentamycin. תוצאה זו מרמזת כי החיידקים עמידים לטיפול gentamycin, מחקההמצב נתקל לעתים קרובות במרפאת.
אור לייזר לבד גם לא לגרום לכל הרג או. עם זאת, שילוב של אור לייזר וgentamycin הקטין כדאיות חיידקים בכמה סדרי גודל. ההשפעה הבולטת ביותר נמדדה לאחר 24 שעות שבו שילוב של שני CW או Q-switched לייזר הפחית את הכדאיות של 8 סדרי גודל בהשוואה למדידות שהתקבלו בקבוצת הביקורת (אנטיביוטיקה לבד או אור לבד).
זו תוצאה חשובה שעשויים להציע פתרון של טיפול לסוג זה של חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה זו. העובדה שכמה שעות נדרשות על מנת לקבל הרג יעיל של החיידקים אינה מפחיתה את הפוטנציאל הקליני של גישה זו שכן הטיפול המוצע יכול להיות משולב בתוך צנתרים והתקנים אחרים המשמשים בבית החולים. לדוגמה באיור 3 אנו מציגים דוגמה לקטטר תוכנן בי בaddition לערוץ הזרקת הנוזל יש ריבוי של חורים המאפשרים לנטרל תאורה נכונה בו זמנית לתוך האיבר הנגוע.
מספר הדגימות משמשות לסטטיסטיקה היה 6 (לא היה מקרה אחד או שניים של כמה מהצינורות שהיו מזוהמים בטעות ולאחר מכן הם הוצאו מהסטטיסטיקה). ערך p היה מתחת 0.05.
שימו לב שלא לחזור על הניסויים שלנו לרמות ריכוז שונות של האנטיביוטיקה. בכל הניסויים שלנו הריכוז היה גבוה מאוד. הסיבה לכך הייתה טוב יותר כדי להדגים את כוחה של גישתנו כאילו בריכוז הגבוה ביותר של החיידקים עדיין לא מושפע מהאנטיביוטיקה ללא תאורה ונהרס עם התאורה, זה כמובן לא יקרה לריכוזים נמוכים יותר.
אחד מהנימוקים לבחירת אורך גל התאורה הייתה לבחור באורך גל שעבורו bacteriוהאנטיביוטיקה הן שקופים. זו באה לידי הביטוי באיור 4. מוטיבציה נוסף לשימוש באורך גל 532 ננומטר לייזר הייתה בשל זמינותו במעבדה שלנו, ובשל העובדה שזה אפשר להשיג כוח הארה גבוה יותר (בהשוואה למקור אור לבן רגיל עם מסנני רפאים), כמו גם יכולת כוונון עבורנו גם כוח ולהתנהגות הזמנית של ההארה.
איור 1. . חיידקי תאורת התקנת לייזר הייתה או CW Nd: YAG לייזר או Q-Switched פעמה Nd: YAG לייזר. בצד השמאל ניתן לראות את התמונה של ההתקנה הניסיונית שבה לייזר הוא פיצול בין שני צינורות, אחד עם אנטיביוטיקה ואחד בלעדיו, על מנת להאיר את שניהם בתנאים זהים. שני הצינורות הם עמדה אד בstirrer. סקיצה סכמטי של הגדרת הניסוי היא לראות את החלק של הדמות הנכונה.
איור 2. (א). השפעה של CW-לייזר וgentamycin על פ aeruginosa. דגימות היו מוארות באור לייזר CW (כוח של 100 מגה ואט) עם ובלי gentamycin (50 מיקרוגרם / מ"ל). הממוצע של 3 ניסויים מוצג. (ב). השפעה של Q-switched לייזר וgentamycin על פ aeruginosa. דגימות היו מוארות עם Q-Switched אור לייזר (1.65 מגה וואט) עם ובלי gentamycin (50 מיקרוגרם / מ"ל) על פ כדאיות aeruginosa. הממוצע של 3 ניסויים מוצג.
איור 3. המכשיר מבוסס המוצע צנתר לטיפול ביו נגד פ aeruginosa. את הנקודות בדמות מייצגות נקודות פיזור אור גורמים לאור להיות מפוזר לתוך הרקמה המטופלת.
איור 4 ספקטרום הספיגה (בAU) סביב אורך גל של 532 ננומטר עבור:. (א). את החיידקים, (ב). Gentamycin. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
פוטותרפיה כבר תחום מחקר רב תחומי מתקדם בשנים האחרונות מתפתחות כגישה מבטיחה לטיפול במחלות רבות. בהקשר זה את השימוש באור בטווח הגלוי, נחקר בהרחבה. כך, למשל, נמצא כי ניתן לרפא פצעים מזוהמים בצורה יעילה יותר על ידי חשיפתם לאור הנראה אינטנסיבי למטרות עיקור. מנגנון הפעולה לגישה זו הוכיחה להיות באמצעות האינדוקציה של רדיקלים המושרה אור (ROS) שלהרוג את החיידקים 11.
מחקרים קודמים הדגימו 6 סכומים גבוהים בהרבה של ROS בחיידקים מוארים באור כחול מאלה הנגרמות על ידי אור אינפרא אדום אדום וקרוב. זה מסביר מדוע רוב הראיות בספרות מתרכזת בהשפעת bactericidal של אור כחול.
עוד דוגמה האחרונה לשימוש באור לייזר כדי להילחם בחיידקים עמידים הודגמה על ידי Krespאני et al. 12. במחקר שטכנולוגית לייזר שוקווייב שנוצר נוצלה למיגור biofilms. על ידי שימוש Q-Switched Nd מיניאטורי: YAG לייזר וסיבים דקים, בדיקות מיוחדות שנוצרו היווצרות פלזמה שהופקה השפעת שוקווייב. החוקרים הראו כי בשיטה זו הצליחה לשבש בצורה יעילה פ biofilms aeruginosa במבחנה.
הגישה שהוצגנו במחקר זה הייתה שונה במקצת 13 כפי שניסינו להגדיל את היעילות של סוכן מיקרוביאלית הלא פוטוסנסיטייזר שימוש באור לייזר. התוצאות שלנו מראות כי על ידי שילוב של טיפול אנטיביוטי עם תאורה, פעילות מיקרוביאלית ניתן להגדיל באופן דרמטי.
למעשה, מהפנוטיפ עמיד לחלוטין, שנצפה באנטיביוטיקה לבד את החיידקים הפכו רגישים בנוכחות טיפול אנטיביוטי ואור. מנגנון פעולה של השפעה זו אינו ברור וידרוש investigat נוספתיון. עם זאת, באלקטרונים פאראמגנטיים תהודה (EPR) המדידות שיש לנו לבצע כדי לבדוק אם ROS נוצרים במהלך הטיפול, לא נמצאים הבדל משמעותי בין הטיפולים השונים הושג 13. תוצאות אלו מצביעות על כך שההשפעה של הטיפול המשולב אינה כרוכה בייצור ROS ומנגנונים שונים צריכים להילקח בחשבון. ניתן לשער כי הטיפול באור משנה את חדירות הקרום וסופו של דבר מאפשר לאנטיביוטיקה לחדור לתוך תא חיידקי מניב ההרג שלה.
למרות שמנגנון פעולה שלו לא נחקר במלואו, הגישה שלנו להדגיש את הפוטנציאל של טיפול המשולב של אור עם אנטיביוטיקה מסחרית, שעשוי להיות מושלכים בשל התנגדות מיקרוביאלית אילו על ידי יישום השילוב הזה יכול כעת לעשות שימוש חוזר ביעילות במרפאות.
ברור שכפי שצוין בכתב היד, התאורה של מספר שעות דרושה כדי en Hance היעילות של האנטיביוטיקה. זה אכן חסרון של הגישה המוצעת. המימוש של תאורה כזו ניתן להשיג למשל על ידי התקנת תאורת המקור פנימי צנתרים (כפי שהוצע על ידי איור 3). בנוסף לכך, אם הפצע הוא חיצוני פסים מיוחדים כמו טיח עם מקור תאורה ניתן לשים על גבי הפצע ולהאיר אותו במשך כמה שעות למשל, בזמן שהמטופל נמצא במצב השינה בלילה. אם הזיהום הוא פנימי והמטופל מאושפז והוא / היא מחוברת לשקית עירוי לכמה שעות, לכמה איברים ניתן לגשת ערוץ תאורה כגון אנדוסקופ או סיבים מיוחדים לאיבר וכל הזמן להאיר אותו (עם הוחל טיפול אנטיביוטי) בזמן שהמטופל מאושפז (בדיוק כפי ששקית העירוי מחוברת לחולה במשך שעות רבות). אנו מסכימים לחלוטין שהגישה לא טובה לטיפול באיברים נגועים בדרך כלל.
NT "> שים לב כי בכתב היד הזה אנחנו מראים את היתרון של הטכניקה המוצעת ליישום מהיר ומעשי, אלא על מנת להשיג מחקרים האחרים הזה הם הכרחיים, כגון בניסויי vivo. המחקר על רעילות פיברובלסטים או תאי האפיתל יהיה שימושי גם כן כמו המחקרים שימחישו את המנגנון של הטיפול המוצע בתאים חיידקיים נדרשים. בנוסף במאמר זה אנו שערנו כי Induced שינויים הקלים של קרום החיידק שהפכו אותה ליותר חדיר לאנטיביוטיקה. ברור שדברים יהיו שונים ב . הגדרה קלינית שבו זיהומים חיידקיים הם עקב biofilms אז יש שתי בעיות עיקריות:. חיידקי biofilm יהיו עמידים יותר בהשוואה לעמיתיהם פלנקטון והחדירה של antimicrobials במסת biofilm יהיה מוגבל לכן, לחקור את ההשפעות של אור וgentamycin על מודל biofilm פ aeruginosa הוא מטרת המחקר העתידי שלנו.