Real Time Quantitative PCR
# Real Time Quantitative PCR

Die quantitative Echtzeit-PCR oder engl. real-time quantitative PCR (kurz qPCR oder Real Time Detection PCR, kurz RTD-PCR) ist eine Vervielfältigungsmethode für Nukleinsäuren, die auf dem Prinzip der herkömmlichen Polymerase-Kettenreaktion (PCR) beruht und zusätzlich die Quantifizierung der gewonnenen DNA ermöglicht. Die qPCR wird gelegentlich auch uneindeutig zur reversen Transkription mit nachfolgender q-PCR (im selben Ansatz) als qRT-PCR oder RT-qPCR bezeichnet.

Die Quantifizierung wird mit Hilfe von Fluoreszenz-Messungen durchgeführt, die während eines PCR-Zyklus in Echtzeit (engl. real time) erfasst werden. Die Fluoreszenz nimmt proportional mit der Menge der PCR-Produkte zu. Am Ende eines Laufs (der aus mehreren Zyklen besteht) wird anhand von erhaltenen Fluoreszenzsignalen die Quantifizierung in der exponentiellen Phase der PCR vorgenommen. Nur in der exponentiellen Phase der PCR (die wenige Zyklen in einem Lauf dauert) ist die korrekte Quantifizierung möglich, da während dieser Phase die optimalen Reaktionsbedingungen herrschen. Diese Methode unterscheidet sich somit von anderen quantitativen PCR-Methoden (qPCR), die erst nach Ablauf der PCR eine quantitative Auswertung (z. B. Kompetitive PCR), meist unter Einbeziehung einer gelelektrophoretischen Auftrennung der PCR-Fragmente, vornehmen.

Die quantitative Echtzeit-PCR kann auch für andere Zwecke verwendet werden, z. B. zur Unterscheidung zwischen homozygoten und heterozygoten Merkmalsausprägungen.

Für die qPCR wird manchmal die Abkürzung RT-PCR oder qRT-PCR verwendet. Dies führt aber zu Verwechslungen, da diese Abkürzung bereits für die Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion verwendet wird.

## Methoden

### Farbstoffe

Die einfachste Möglichkeit der Quantifizierung der PCR-Produkte ist die Nutzung von DNA-Farbstoffen (z. B. Ethidiumbromid oder SYBR Green I). Diese Fluoreszenzfarbstoffe lagern sich in die DNA ein (interkalieren) bzw. binden an die kleine Furche der doppelsträngigen DNA (englisch minor groove binder), wodurch die Fluoreszenz dieser Farbstoffe ansteigt. Die Zunahme der gefärbten Target-DNA korreliert daher mit der Zunahme der Fluoreszenz von Zyklus zu Zyklus. Die Messung findet am Ende der Elongation in jedem Zyklus statt.

Ein Nachteil dieses Verfahrens ist die geringe Spezifität, da zwischen verschiedenen PCR-Produkten nicht unterschieden werden kann. Außerdem können keine Multiplex-Messungen durchgeführt werden. Den ersten Nachteil kann man ausgleichen, indem man nach abgelaufener PCR eine Schmelzkurvenanalyse durchführt, anhand derer die Fragmentlänge(n) und dadurch die Spezifität bestimmt werden kann.

Bei einer Schmelzkurvenanalyse wird die DNA aufgeschmolzen, indem die Temperatur langsam kontinuierlich erhöht wird (50 °C → 95 °C). Bei einer für das Fragment spezifischen Schmelztemperatur denaturiert der Doppelstrang zu zwei einzelsträngigen Molekülen. Dabei wird ein Fluoreszenzfarbstoff (z. B. SYBR Green I) freigesetzt und eine Änderung der Fluoreszenz gemessen. Die Schmelzkurve und die Schmelztemperatur eines dsDNA-Fragmentes sind im Wesentlichen abhängig von der Länge und Basenzusammensetzung des DNA-Fragmentes. Die Schmelzkurvenanalyse kann eingesetzt werden, um Auskunft über die Spezifität der PCR-Reaktion zu erhalten. Da die doppelsträngige DNA von spezifischen PCR-Produkten einen höheren Schmelzpunkt hat als unspezifisch entstehende Primerdimere, ist eine Unterscheidung möglich. Eine weitere Verwendung der Schmelzkurvenanalyse ist der Vergleich und die Unterscheidung unterschiedlicher PCR-Produkte (unterschiedliche DNA-Sequenz, eventuell unterschiedliche Fragmentgröße) bezüglich ihres Schmelzverhalten. Die Darstellung der Schmelzkurve erfolgt in vielen Fällen durch das Auftragen des Absolutwertes der ersten Ableitung des Fluoreszenzsignals (y-Achse) gegen die Temperatur (x-Achse). Die dadurch dargestellten Schmelzkurven-Peaks sind charakteristisch für ein jeweiliges PCR-Produkt und die Schmelzkurvenanalyse dient somit einer qualitativen Untersuchung des PCR-Produktes. Die Höhe (oder ein anderes Merkmal) der Schmelzkurven-Peaks ist kein Parameter zur Quantifizierung der DNA-Menge.

### FRET-Sonden

Eine andere Möglichkeit besteht darin, den Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) auszunutzen. Ein Donor-Fluorochrom (Reporter – im Zusammenhang mit TaqMan-Sonden), das durch eine Lichtquelle angeregt wird, gibt einen Teil seiner Energie an ein in ausreichender Nähe befindliches Akzeptor-Fluorochrom (bzw. einen dark Quencher – im Zusammenhang mit TaqMan Sonden) ab. Nimmt der Abstand zwischen Akzeptor und Donor zu, so nimmt FRET und somit das Fluoreszenzsignal des Akzeptors ab, während das des Donors zunimmt. Diese Methode ist sehr aufwendig und teuer, bietet aber die Vorteile der hohen Spezifität des Assays.

**LightCycler-Sonden (auch Hybridisierungs-Sonden)**

Die einfachste Möglichkeit der Nutzung des FRET zur Quantifizierung von Nukleinsäuren besteht in der Verwendung von LightCycler-Sonden. Zwei verschiedene, jeweils mit einem FRET-Donor bzw. FRET-Akzeptor (hier Reporter) markierte Oligonukleotide, die nebeneinander an die Ziel-Sequenz binden und damit die Fluorochrome in eine für den FRET ausreichende Nähe bringen, können als Sonden für die Quantifizierung der PCR-Produkte eingesetzt werden. Die Messung findet am Ende der Annealing-Phase in jedem Zyklus statt. Auch hier kann sich eine Schmelzkurvenanalyse anschließen.

**LoopTag-Sonden**

Das FRET-Prinzip kommt ebenfalls beim LoopTag-Sondensystem zum Einsatz. Dieses System besteht aus dem Vorwärtsprimer, an dessen 5‘-Ende eine sequenzunspezifische Nukleotidsequenz und der Fluoreszenz-Akzeptor gekoppelt ist. Der andere Teil ist die Detektionssonde (LoopTag-Sonde), an die am 3‘-Ende eine sequenzunspezifische Nukleotidsequenz und der Donor gekoppelt ist. Die LoopTag-Sonde hybridisiert mit ihrem 5‘-Ende spezifisch an der Zielsequenz und am 3‘-Ende spezifisch am verlängerten Vorwärtsprimer. Die sequenzunspezifischen Nukleotidsequenzen der Detektionssonde und des Vorwärtsprimers hybridisieren unter Ausbildung einer Sonden-Primer-Schleife miteinander und bilden einen Stamm. Durch die daraus resultierende räumliche Nähe der endständigen Farbstoffe (Donor/Sonde, Akzeptor/Primer) kann der Energietransfer erfolgen.

**TaqMan-Sonden (auch Hydrolyse-Sonden)**

Eine weitere häufig genutzte Möglichkeit des FRET besteht in der Anwendung einer Sonde, die an einem Ende mit einem Quencher, am anderen Ende mit einem Reporter-Fluoreszenzfarbstoff (z. B. TAMRA und FAM) markiert wurde (Double-Dye-Oligos, TaqMan-Sonde). Wenn die Taq-Polymerase, die zusätzlich zur Polymeraseaktivität eine 5'-3'-Exonuklease-Aktivität besitzt, die Sonde während der Synthese des Gegenstranges am 5'-Ende abbaut, entfernen sich dadurch Quencher und Fluorophor voneinander, und eine steigende Reporter-Fluoreszenz kann gemessen werden. Die Messung findet am Ende der Elongation in jedem Zyklus statt.

**Molecular Beacons**

Eine weitere Möglichkeit der Echtzeit-Quantifizierung von PCR-Produkten unter Ausnutzung des FRET bietet die Nutzung von Molecular Beacons als Sonden. Molecular Beacons sind Oligonukleotide, die sowohl mit einem Reporter-Fluorophor als auch mit einem Quencher gekoppelt sind. Die Nukleotide am 5'-Ende der Sonde sind zu denen am 3'-Ende komplementär, so dass sich eine für Molecular Beacons charakteristische Sekundärstruktur ausbilden kann. In diesem als stem loop (Haarnadelstruktur) bezeichneten Zustand zeigt der Reporter durch seinen geringen Abstand zum Quencher keine Fluoreszenz. Durch Anlagerung der Schleifen-Region an eine komplementäre DNA-Sequenz während eines PCR-Zyklus wird der Abstand zwischen Quencher und Reporter vergrößert. Eine Reporter-Fluoreszenz kann somit beobachtet werden.

**Scorpion-Primer**

Scorpion-Primer sind komplexe Oligonukleotide, welche die Eigenschaften von Real-Time-PCR-Sonden und PCR-Primern in einem (Uni-Scorpion) oder zwei Molekülen (Bi-Scorpion) vereinigen. Ähnlich den Molecular Beacons besitzen sie eine charakteristische Sekundärstruktur mit einer selbstkomplementären Schaft-Region, deren Enden mit einem Reporter-Fluorophor und einem Quencher modifiziert wurden. Zusätzlich tragen diese Sonden am 3'-Ende einen PCR-Primer. Während eines PCR-Zyklus kann mit steigender DNA-Konzentration eine Reporter-Fluoreszenz durch Anlagerung der Loop-Region an eine komplementäre DNA-Sequenz und damit vergrößerten Abstand zwischen Quencher und Reporter beobachtet werden.

### Lux-Primer

Lux-Primer sind mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierte Oligonucleotide, deren Fluoreszenzintensität von ihrer jeweiligen chemischen Umgebung abhängt. Werden diese Primer während einer PCR in eine DNA eingebaut, kann eine Zunahme der Fluoreszenz beobachtet werden.

### Lanthanoid-markierte Sonden

Lanthanoid-markierte Sonden sind an ihrem 5'-Ende mit einem Lanthanoid wie Europium oder Terbium markiert und mit einem Oligonukleotid hybridisiert, das am 3'-Ende mit einem Quencher markiert ist.

## Quantifizierung

Verschiedene Rechenmodelle werden für die Quantifizierung herangezogen, wobei meistens ein Referenz-Gen (z. B. GAPDH, Actin, Tubulin) mitgemessen wird, um einen relativen Menge-Vergleich durchzuführen (relative Quantifizierung). Andere, weitaus kompliziertere Methoden sollen eine absolute Quantifizierung ermöglichen, bei der die genaue Anzahl der in der Probe vorhandenen Templates bestimmt werden kann.

### Ct-Wert oder auch Cp-Wert

In der ersten Phase der Amplifikation einer PCR ist die Templatemenge begrenzt und die Wahrscheinlichkeit, dass sich Template, Primer und Polymerase treffen nicht optimal, während in der dritten Phase der Amplifikation die Menge der Produkte (DNA, Pyrophosphat, Monophosphatnukleotide) derart ansteigt, dass es zur Hemmung durch diese kommt, häufiger Produktfragmente miteinander hybridisieren, die Substrate langsam verbraucht werden und letztlich die Polymerasen und Nukleotide durch die Hitze langsam zerstört werden. Ein exponentieller und daher quantifizierbarer Anstieg findet sich nur in der Phase dazwischen. Exponentiell bleibt eine PCR bei 12 bis 400 Ausgangskopien für ca. 30 Zyklen, bei 200 bis 3200 für 25 Zyklen und bei anfänglich 3200 bis 51200 für höchstens 20 Zyklen. Um immer am Anfang der exponentiellen Phase messen zu können, wird häufig der Ct-Wert (engl. cycle threshold für Schwellenwert-Zyklus) bzw. der Cp-Wert (engl. crossing point) verwendet, der den Zyklus beschreibt, an dem die Fluoreszenz erstmals signifikant über die Hintergrund-Fluoreszenz ansteigt.

### Effizienz

Die Effizienz kann auf verschiedene Arten berechnet werden, die sich in ihrem Ergebnis leicht unterscheiden. Die einfachste Art ist folgende:

Die Effizienz E kann mit Hilfe der Steigung m einer Standardkurve berechnet werden. Dazu wird ein cDNA-Verdünnungsansatz (z. B. 100 %, 10 %, 1 %, 0,1 %) für eine qPCR verwendet, und die jeweiligen Ct-Werte für die grafische Erstellung einer Kurve genutzt. Eine lineare Regressionsgerade durch die Kurve besitzt die Steigung -m (bei Auftragung mit ansteigender DNA-Konzentration).

    $E=10^{-1/m}-1$

Eine Steigung m von −3,32 würde somit eine Effizienz von 1 (100 %) bedeuten, d. h. eine Verdopplung der Amplifikate pro Zyklus, eine Steigung von −3,58 eine Effizienz von 0,9 (90 %). Die Formel liefert sinnvolle Werte unter 100 % nur für Steigungswerte kleiner als −3,32.

### Absolute Quantifizierung

Eine absolute Quantifizierung ist aufwändig und die Ergebnisse fragwürdig, daher wird diese Art der Quantifizierung selten durchgeführt. So muss u. a. die Effizienz der reversen Transkription, die zwischen 5 und 95 % liegen kann, bestimmt werden, z. B. durch Verwendung synthetisierter RNA bekannter Menge.

### Relative Quantifizierung

Hierfür wird eine interne Kontrolle benötigt. Eine interne Kontrolle kann ein Gen-Transkript sein, dessen Signal verwendet wird, um Variationen in der Ausgangsmenge der eingesetzten RNA auszugleichen. Dafür werden z. B. Haushaltsgene verwendet. Der Mengenvergleich mit den Haushaltsgenen wird als Normierung bezeichnet. Weil die Gesamtanalyse auf diesem Signal beruht, ist die Wahl der internen Kontrolle ein wichtiger Aspekt des Experiments.

Die ideale interne Kontrolle ist leicht zu detektieren, und deren Expression sollte nicht während des Zellzyklus, zwischen Zelltypen oder als Antwort auf die experimentelle Behandlung (z. B. Stress, Medikamente, Krankheit) variieren.

**Berechnung mit Hilfe einer Standard-Kurve**

Es besteht eine lineare, umgekehrt proportionale Beziehung zwischen dem Logarithmus der eingesetzten Menge und dem Ct. Ist die Ausgangsmenge bekannt, kann eine Standardkurve durch Auftragen des Logarithmus der Ausgangsmenge gegen den Ct konstruiert werden. Durch die Geradengleichung

    x = (Ct − b) / m

kann an der Standardkurve für jede unbekannte Probe der Logarithmus der Kopienzahl bestimmt werden. Alle Proben werden normiert, indem die errechnete Kopienzahl des Targetgens durch die Kopienzahl der internen Referenz geteilt wird:

    Gen (normiert) = Kopienzahl Target / Kopienzahl Referenz

Die unterschiedliche Expression zweier Proben relativ zueinander lässt sich als Quotient darstellen und ergibt eine n-fache Expression:

    Gen (normalisiert) (Gruppe A) / Gen (normalisiert) (Gruppe B) = n-fache Expression Gruppe A zu Gruppe B

**Berechnung nach der ΔΔCt-Methode**

Die unterschiedliche Expression wird als n-fache Expression mit Hilfe des ΔΔCt-Wertes angegeben. Wichtig bei diesem Verfahren ist eine gleiche Effizienz der beiden beteiligten PCR-Reaktionen. Es werden hierbei zunächst die Ct-Werte von Zielgen und Referenz voneinander abgezogen (ΔCt), um anschließend die Differenz zwischen den beiden ΔCt-Werten der einzelnen Gruppen (z. B. krank/gesund, mit/ohne Wirkstoff) zu bilden (ΔΔCt-Wert). Der dadurch erhaltene Wert wird in die Gleichung n-fache Expression (Gruppe A zu Gruppe B) = 2 $^{−ΔΔCt}$ eingesetzt.

**Neue Quantifizierungsalgorithmen**

Um die Genauigkeit der relativen Quantifizierung zu verbessern, sind verschiedene, teils auf der ΔΔCt-Methode basierende Ansätze entwickelt worden.

* Erweiterung der Formel der ΔΔCt-Methode um die Effizienz des jeweiligen PCR-Ansatzes, die zuvor in einem Probelauf über eine Standardkurve bestimmt werden muss.
* Mittels regressionsanalytischer Verfahren eine Anpassung der qPCR-Datensätze an eine exponentielle Funktion bzw. in linearisierter Form an eine Geradengleichung. Der Schnittpunkt dieser Funktionen mit der y-Achse gibt dann Aufschluss über die ursprünglich im Ansatz vorhandene DNA-Menge (relative Angabe im Vergleich zu einer Referenzprobe).
* Anpassung der qPCR-Daten an eine drei- oder mehrparametrige sigmoide Funktion. Auch hier wird die relative DNA-Menge über y(0) bestimmt.

Vorteile dieser neuen, überwiegend noch nicht marktreifen Methoden liegen in der genaueren Analyse und geringeren Varianz der PCR-Ergebnisse. Bei einigen Methoden wird die Effizienz in jedem einzelnen Probenansatz berücksichtigt und ermöglicht so eine single tube-Analyse.

**Reproduzier- und Vergleichbarkeit der Ergebnisse**

Ein Experiment ist wertlos, wenn man es nicht wiederholen kann. Hierfür ist es absolut notwendig die Versuchsbedingungen konstant zu halten. Dabei ist hier nicht nur die Konsistenz der Assay-Qualität (Primer, Sonden, Polymerase, Puffer etc.) zu berücksichtigen, auch die Geräte müssen den Anforderungen genügen. Beispielsweise ist bei Block-Systemen (96- oder 384-Wells) die so genannte Homogenität das große Kriterium. Die Assays müssen in jedem Well des Blocks und zudem auf Blöcken baugleicher Geräte gleich gut laufen. Weiterhin darf sich im zeitlichen Verlauf diese Homogenität nicht verändern. Um sicherzustellen, ob man mit dem Gerät im Labor sichere Experimente durchführen kann, sollte man in regelmäßigen Abständen entsprechende Kontrollen durchführen (einige Modelle neigen extrem zum Altern). Dabei wird ein Assay in vielen Replikaten über den gesamten Block verteilt analysiert. Das Ergebnis sollte im Idealfall überall gleich sein. Jetzt sollte dem Experimentator bewusst sein, inwieweit Abweichungen auch relevante Auswirkungen haben können. Diese Abweichungen lassen sich nicht mittels teurer Wiederholungen ausgleichen, da diese ebenso konstant wiederholt werden würden.

