Введение. Клеточные линии и культуры являются незаменимым инструментом в исследованиях физиологии клеток. Культуры В-лимфоцитов имеют важное значение для изучения В-клеточного ответа, генерации антител, а также для создания терапевтических моноклональных антител. Вместе с тем активация В-лимфоцитов и их продолжительное культивирование in vitro продолжают оставаться нерешенной проблемой. Цель исследования - разработка протокола стимуляции В-лимфоцитов человека in vitro, характеристика фенотипических и функциональных особенностей стимулированных В-клеток для последующего использования протокола для определения количества В-клеток памяти, секвенирования генов Ig, а также получения иммортализованных клонов В-лимфоцитов. Материал и методы. Клетки, стабильно трансфецированные геном CD40L, получали путем лентивирусной трансдукции. В-лимфоциты выделяли из периферической крови человека с помощью центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографина с дальнейшим обогащением методом отрицательной селекции с использованием магнитных микросфер. В-лимфоциты стимулировали in vitro с помощью фидерных клеток, несущих поверхностный CD40L, в присутствии экзогенного рекомбинантного интерлейкина (ИЛ) -21. Количество и фенотип стимулированных В-лимфоцитов определяли, используя многоцветную проточную цитометрию. Секрецию IgM и IgG в культурах В-лимфоцитов оценивали с помощью иммуноферментного анализа. Результаты. С помощью лентивирусной трансдукции были получены клетки HEK293, K562 и A549, стабильно трансфецированные геном CD40L. Исходя из экспрессии молекулы CD40L, а также ростовых свойств для дальнейшего исследования в качестве фидера была выбрана линия трансфецированных клеток A549. При совместном культивировании фидерных клеток и В -лимфоцитов в присутствии экзогенного ИЛ-21 наблюдалась стимуляция В-лимфоцитов. В-лимфоциты начинали пролиферировать и через 7 дней их количество увеличивалось в среднем в 8 раз. Стимулированные В-лимфоциты изменяли свою морфологию. Они приобретали неправильную форму с псевдоподиями, группировались вокруг фидерных клеток и начинали активно передвигаться. При ИЛ-21/ CD40L-стимуляции В-лимфоциты изменяли свой поверхностный фенотип и к 10-му дню около 40 % В-клеток дифференцировались в плазмабласты (CD19+CD27+CD38+). При этом доля CD20+-клеток снижалась до 20 %. Процент клеток с поверхностной экспрессией Ig также снижался. Секреция IgM и IgG в процессе стимуляции, напротив, возрастала. К 12-му дню пролиферативный потенциал В-клеток исчерпывался и они погибали. Заключение. Культивирование В-лимфоцитов in vitro в присутствии экзогенного ИЛ-21, а также фидерных клеток, экспрессирующих молекулу CD40L, является удобной системой для получения активированных В-лимфоцитов, которые могут использоваться для решения различных задач.
культураклеток, b-лимфоциты, плазмабласты