1928 yılının Eylül ayında, Londra’daki St. Mary Hastanesi’nde Dr. Alexander Fleming tarafından bulundu. Fleming, bir ay önce tatile çıkarken, laboratuvannın güneş görmeyen bir köşesine bazı kültürler yerleştirmişti. D.M. Pryce’la birlikte, bunların antiseptik özelliklerini araştırıyordu. Tatil sonrası yaptığı incelemelerde, bu kültürlerden birinin farklı bir özellik gösterdiğini fark etti. Bunun üzerine yoğun bir çalışmaya başladı. Sonunda 13 Şubat 1929 günü, Tıbbi Araştırmalar Kulübü’nde, penisilini bulduğunu açıkladı.
Penisilinin ilk klinik uygulaması St. Mary’s Hastanesi’nde, 9 Ocak 1929 günü yapıldı. Fleming, asistanlarından Stuart Craddock’un sinüs iltihabını penisilinle iyileştirdi ve “steplokok” türü mikropları yok ederek tedavide başarı sağladı. İlacın çok daha etkin bir kullanımı, 1931 yılında Sheffield’da gerçekleştirildi. Dr. C.G. Paine iki çocuk hastada doğuştan gelen “gonokokal oftalmitis” denilen görme bozukluğu ile, bir erişkin hastada “pnomokokal enfeksiyon” sonucu oluşan göz hastalığını penisilinle iyileştirdi. Erişkin hastanın sağ gözüne düşme sonucu bir taş parçası çarpmış ve küçük bir taş parçası gözbebeğinin arkasına girerek hasara neden olmuştu. Enfeksiyon, penisilinle temizlendi ve göz, taşı çıkartmak için ameliyat edilebilir hale geldi. Hasta, kısa zamanda yeniden normal görme yeteneğine kavuştu.
Bu ilk başarılı penisilin tedavileri, yerel girişimler olarak kaldı ve penisilinin önemli bir “kemoterapi” unsuru olarak kabul edilmesi çok zaman aldı.
Arıtılmış ilk penisilin Sir William Dunn Patoloji Okulu’nda, 1940 yazında, Profesör Howard Florey ve Yahudi asıllı Alman Profesör Ernest Chain tarafından elde edildi. Prof. Florey, ortak çalışmalarının sonucunu, “Kemoterapik tedavi aracı olarak penisilin” başlıklı bir makalesiyle dünyaya duyurdu. Bu makale, 24 Ağustos 1940 günü, Lancet’te yayınlandı.
Arıtılmış ilk penisilinin ilk tedavide kullanılması 12 Şubat 1941 günü, Oxford’da Radcliffe Hastanesi’nde gerçekleşti. Bir polis memuru olan hasta, ağız kenarındaki yara sonucu, kan zehirlenmesine yakalanmıştı. 24 saat içinde hastaya 800 miligram penisilin verildi ve durumunda büyük bir düzelme gözlendi. Ancak 5 gün içinde, Profesör Florey’in ekibi, o dönemde, dünyada bulunan tüm arıtılmış penisilini tüketti ve hasta 15 Mart günü öldü. Kesin bir başarıyla sonuçlanan ilk penisilin tedavisi, yine Redcliffe Hastanesi’nde, 3 Mayıs 1941 günü başlatıldı. Büyük bir şirpençe çıban yarasıyla hastaneye getirilen hastaya, damardan penisilin verildi. 4 gün sonra, yaranın iyileşmeye yüz tuttuğu görüldü. 15 Mayıs günü, hasta, sağlığına tamamen kavuşmuş olarak hastaneden taburcu edildi. Geniş ölçüde penisilin üretmek üzere ilk tesis de Oxford’daki Sir William Dunn Patoloji Okulu’nda, 1941 yılının yazında, Prof. Chain’in yönetiminde faaliyete geçti. Penisilini de ürettiği ilaçlar arasına alan ilk eczacılık kuruluşu ise, Bromyey’deki Kemball and Bishop Co. şirketi oldu. Şirket, ürettiği 10 galonluk ilk 20 bidon penisilini, ücretsiz olarak 11 Eylül 1942 günü Patoloji Okulu’na armağan etti. Sir Alexander Fleming, Sir Howard Florey ve Dr. E.B. Chain, penisilinle ilgili çalışmalarından ötürü, 1945 yılının ekim ayında Nobel Ödülü’nü ortaklaşa paylaştılar.