Summary
Yeni bir antibiyotik modu-of-action açıklaması ilaç bulma sürecinde zor bir görevdir. Burada açıklanan yöntemin amacı ilaç-mikrop etkileşimleri içine ek fikir sağlamak için antibakteriyel profilleme calScreener kullanarak isothermal mikrocalorimetri uygulamasıdır.
Abstract
Artan antimikrobiyal direnç küresel tehdit nedeniyle, yeni antibiyotikler acilen ihtiyaç vardır. Bu tür yeni bileşiklerin yenilikçi bir kaynağı olarak Myxobacteria doğal ürünleri araştırmak. İşlemdeki bir darboğaz genellikle eylem tarzlarının açıklanmasıdır. Biz son zamanlarda rutin bir profilleme boru hattının bir parçası olarak izomal mikrocalorimetri kurdu. Bu teknoloji toplam bakteriyel metabolik yanıt antibiyotik maruziyetinin etkisini araştırmak için izin verir, biyokütle oluşumundan ayrılmış süreçler de dahil olmak üzere. Daha da önemlisi, bakteriyostatik ve bakterisidal etkiler ölçümler sırasında herhangi bir kullanıcı müdahalesi olmadan kolayca ayırt edilebilir. Ancak, izotermal mikrocalorimetri oldukça yeni bir yaklaşımdır ve bu yöntemi farklı bakteri türlerine uygulamak genellikle uygun ölçüm koşullarının ön değerlendirmesini gerektirir. Bazı bakterilerin bazı referans termogramlar mevcut, büyük ölçüde sonuçların yorumlanmasını kolaylaştıran vardır. Referans veri havuzu sürekli olarak büyürken, metodolojinin gelecekte artan bir etkiye sahip olmasını ve antibiyotik sınıflarının farklılaşmasını sağlayan derinlemesine parmak izi analizlerine olanak sağlamasını bekliyoruz.
Introduction
Bu yöntemin amacı, yeni antibakteriyel bileşiklerin etki-hareket modu (MoA) profilinde orta iş gücü olarak isothermal mikrokalorimetri (IMC) uygulamaktır. Bu yöntem, bakteriler üzerindeki bileşiklerin aktivitesine ilişkin verileri ortaya çıkarır ve bileşiğin bakterisidal veya bakteriyostatik doğası hakkında bilgi sağlar.
Ortaya çıkan antimikrobiyal direncin yükselişi (AMR) küresel bir sorundur ve bilinen antibiyotikler ile yaygın enfeksiyonların daha az etkili tedavileryol açar1. Ancak, yeni bileşikler ve bilinen antibiyotikler ile birlikte çalışabilir veya birlikte çalışabilir ilaçlar için arama devam etmektedir ve bu çeşitli yaklaşımlar üzerine inşa edilmiştir. Doğal ürünler mevcut ilaç keşif kampanyalarında önemli bir oyuncu ve özellikle anti-enfektif ilaç keşif2. Ancak, antibiyotik gelişimi için yeni kurşun yapıları belirlenmesi uzun ve mali zorlu birsüreçtir 3. Bu nedenle, keşif erken adımları zaten erken bir aşamada en umut verici iskeleler filtre lemek için son derece önemlidir. Doğal ürün ilaç keşfinde ilk adımlar bir bileşiğin yapısını elde etmek, MoA ile birlikte in vitro aktiviteyi belirlemek ve hedef tanımlamayı içerir. Daha fazla gelişmeye uygun olan en başarılı bileşikler, uygun bir aktivite spektrumu (yani, antibakteriyeller durumunda geniş spektrumlu aktivite) ve önceden var olan AMR'nin üstesinden gelinebileceği yeni bir MoA göstermelidir. Umut verici iskeleler sonra genellikle ikincil tahliller taranır, hangi in vivo biyoyararlanım dahil, toksisite, ve metabolizma4. Mali endişelerin yanı sıra, doğal ürün ilaç keşif maliyetleri ve bileşik izolasyon ve arıtma ile ilgili teknik zorluklar ile ilgili daha fazla zorluklarla karşı karşıya, hangi, sırayla, zor keşif sürecinin erken aşamalarında multi-miligram veya hatta gram miktarları elde etmek için yapabilirsiniz5,6. Bu nedenle, yeni bir doğal ürünü klinik öncesi gelişim için erişilebilir hale getirmek için daha fazla yatırım hakkında iyi bilgilendirilmiş bir karar almak için en az bileşik miktarlarda en son teknolojiürünü birincil tarama yapabilmek doğal ürün araştırmalarında son derece önemlidir. Antibakteriyel profilleme için IMC kullanımı ile, gerekli bileşik miktarı önemli ölçüde standart yöntemlere göre azalır. Bu teknik aynı zamanda yeni ilaçların mikrobiyal topluluk7ile etkileşimi ile ilgili daha ayrıntılı bilgi sağlar.
IMC, biyolojik sistemdeki tüm biyolojik, fiziksel ve biyokimyasal süreçler ve reaksiyonlar sonucunda toplam enerjiyi ölçmek için kurulmuş bir yöntemdir. Bakteriyel enerji salınımı toplam metabolik reaksiyonlar ile orantılıdır8. Kullanılan mikrocalorimetre gibi kapalı bir sistem içinde, ısı düzeyleri bakterilerin metabolik kinetik incelemek için mikrowatt aralığında ölçülebilir9,10,11,12. Bakteriler tarafından salınan ısı (enerji) metabolizmalarının altında yatan ve hücresel biyokütle ile orantılı olmayan hücresel fonksiyonlarla bağlantılıdır.
Başlangıçta, mikrobiyolojik tahliller için isothermal kalorimetre uygulanabilirliği düşük iş hacmi ve yüksek test hacimleri nedeniyle sınırlı olmuştur. Ancak, kullanılan mikrocalorimetre artan iş gücü ve daha düşük bileşik gereksinimleri ile izomal kalorimetre avantajlarını birleştirir gibi benzersizdir, hangi ilaç keşif uygulamaları için değerli bir araç yapar10. Ayrıca, cihaz 600 nm optik yoğunluğuölçümü dayalı standart bulanıklık yöntemi gibi bakteri büyüme kinetik ölçmek için alternatif yöntemler üzerinde daha fazla avantaj sağlar (OD<600). OD600'ün ölçülmesi, artan optik yoğunluğun mikrobiyal büyümeye eşit olduğu varsayımına dayanır ve böylece canlı olmayan hücrelerin varlığını ihmal eder. Bu yöntem, küçük koloni varyantlarını ve persister hücreleri hariç olduğu için de eleştirilmiştir11. Buna karşılık, IMC canlı hücrelerin her türlü gerçek zamanlı gözlem sağlar. Hücreler hareketsiz ise, hala metabolik aktivite sergilerler ve böylece IMC tarafından tespit edilebilirler, oysa bu tür fenomenler standart bulanıklık yöntemi11ile saptanamaz. IMC'nin diğer avantajları arasında daha kısa bir antimikrobiyal duyarlılık test süresi, karmaşık bir topluluktaki ilaç etkileşimlerinin ölçülmesi ve standart analiz yöntemleri nin örnek7'yiyok etmeden yer alması yer almaktadır.
IMC teknolojisi mikrobiyolojitermogenez ve kanser biyolojisi13,14,,15,16,17arasında değişen çalışmalar geniş bir yelpazede uygulanmıştır.17 Mikrobiyal uygulamalar çeşitli bakteriyel suşlara karşı bileşiklerin minimum inhibitör konsantrasyonları (MIC) belirlenmesi içerir. Çeşitli çalışmalar yapılmıştır ve bakteri türlerinin çoğunluğu için izopekmal kalorimetre MIC veri daha hızlı elde edilebilir ve sonuçlar MIC tayini için diğer (standart) yöntemlere göre benzer olduğu sonucuna varılmıştır12,18,19. IMC'nin diğer uygulamaları arasında ilaçların etkileşiminin ve ilaç tedavilerinin biyofilm11gibi karmaşık bakteri topluluklarıyla birleştirilmesinin gözlemleni yer almaktadır. MoA profilleme odaklanan bir çalışma da mikrocalorimetre birinci ve ikinci nesil sefalosporinler bir fark tespit edebilirsiniz gösterdi, aynı MoA ile farklı antibiyotikler birbirlerine göre benzer bir ısı akış eğrisi sergilerken18.
Burada, yeni izomal mikrocalorimetri aleti kullanarak yeni doğal ürünlerin MoA profilleme için IMC kullanımını açıklar. Bu yöntem etkili antibiyotik konsantrasyonlarını belirlemek ve bakterilerin veya bakteriyostatik mekanizmalar açısından antibiyotiklerin özelliklerini tanımlamak için kullanılır. Yöntem moa bileşikprofilleme de yaygın olarak uygulanabilir ve standart mikrobiyolojik yöntemlerin yerini alabilir veya en azından tamamlayıcı olabilir. Gelecekteki çalışmalar, hedef mekanizmalara dayalı antibiyotik sınıflarının farklılaşmasını sağlayacak derinlemesine parmak izi analizlerini içerecektir.
Protocol
NOT: Cihazın sıcaklığı, sistemin stabilitesini sağlamak için en az bir gün önceden kullanılan bakteriye göre ayarlanmalıdır. Burada Acinetobacter baumannii DSM30008 numuneleri 30 °C'de çalıştırılır.
1. Kültür hazırlama
- Bir CASO agar plakaüzerinde araştırma altında zorlanma çizgi (burada: A. baumannii) ve 30 °C statik bir kuluçka gece kuluçka.
- MHB 'de tek bir koloni (Mueller-Hinton suyu) aşılayarak bir gecede kültür hazırlayın ve 30 °C'de 180 rpm'de sallayarak bir kuluçka makinesine inkübatın.
2. Örnek hazırlama
- Seçilen ilacın veya bileşiğin konsantrasyon aralığını hazırlamak için 1,5 mL tüpler kullanın (örneğin, DMSO'da 100x stok çözeltisi 1,5 μL ekleyerek;
- MHB ortamda gece kültürünü seyreltin.
- 600 nm dalga boyunda bir spektrofotometre kullanarak gece kültürünün optik yoğunluğunu ölçün.
- Taze MHB ortamda 5 x 105 koloni oluşturan üniteler (CFU)/mL elde etmek için kültürü seyreltin. Bir OD600 yaklaşık 5 x 108 CFU/mL eşittir (örneğin, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, A. baumannii).
NOT: Uygulanan culturing koşulları altında her bir bakteri suşu için dönüşüm faktörü OD600 CFU/mL kalibre etmek önemlidir.
- Adım 2.1'de hazırlanan test tüplerine 150 μL'lik hücreleri ekleyerek test edilen ilacın veya bileşiğin doğru son konsantrasyonu ve doğru son hücre konsantrasyonu sağlar.
- Girdap tarafından hücreleri ile bileşik karıştırın.
NOT: Örnek plaka (bkz. Malzemeler Tablosu)her biri sekiz kuyu, toplam 48 kuyu içeren altı satırdan olenmiştir; A ve Satır F termodinamik referansvardır. Bu nedenle, hiçbir örnek bu kuyulara yüklenebilir, ilgili ortam bu kuyulara yüklenir. B-E satırlarında kuyular kullanılarak her çalışma başına 32 test örneği ölçülebilir. Tek tek test örneği en az yinelenen olarak çalıştırılmalıdır (burada: tüm örnekler üç kat olarak çalıştırıldı). Büyüme kontrolleri dahil edilmelidir.
3. Ekleme hazırlığı
- Adım 2.4'te hazırlanan karışımdan 120 μL'yi plastik kesici uçlara aktarın.
NOT: Plastik kesici uçların kenarlarına sıvı püskürtülmesini önlemek için 3.1 adımda ters pipetleme kullanın, bu da doğru sinyal okumalarıyla girişime yol açabilir.
- Tüm titanyum şişeleri tutucuların içine yerleştirin (bkz.
- Uçları yavaşça tutucu plakadaki titanyum şişelere aktarın.
- Tüm titanyum şişelere titanyum kapakları gevşek bir şekilde yerleştirin.
4. Ekleme yükleme
- Titanyum bardakile tutucuyu numune istasyonuna aktarın ve belirlenen alana yerleştirin.
- Tüm kapakları sıkmak için 40 cNm kuvvetine ayarlanmış tork anahtarını kullanın.
5. Örneklerin çalıştırıl
- calView yazılımında, yeni bir deneme başlatın(Ek Şekil 1).
- Numune ekleme kolunu aletten geri alın.
- Bardak tutucuyu "köprü"ye, örnek ekleme ye bakan 8 sütuna yerleştirin ve bardak tutucuyu belirtilen "Pozisyon 1"de yavaşça aletin içine itin. Sistemin sabitolması için 10 dakika bekleyin. Deneysel kuyuları etiketle.
- Numune ekleme kolunu, bardak tutucu belirlenen "Pozisyon 2"ye gelene kadar itin. Sistemin düzelmesi için 20 dakika bekleyin.
- Numune ekleme kolunu "Pozisyon 3"e doğru itin ve numune ekleme kolunu "Koşu pozisyonuna" gelene kadar geri alın. Yazılımdaki tüm kuyuları vurgulayın ve Reaksiyon Başlat 'ı seçin ( EkŞekil 4).
- Isı emisyonu okunan lar sıfıra inene kadar deneyi çalıştırın.
NOT: Tüm kuyuların bu adımlar içinde benzer şekilde olduğundan emin olun. Ek Şekil 5, kuyuların doğru yüklenmesi durumunda nelere dikkat edilmesi gerektiğini göstermektedir. Yanlış yüklenirse, 5.2-5.4 adımlarını yineleyin.
6. Bardak tutucuyu çıkarın
- Yazılımda Stop (Ek Şekil 6)seçeneğini belirleyin. Yazılım daha sonra "emin misiniz", Evet (Ek Şekil 7)seçin ve denemeyi veri analizi için bir sürücüye veya masaüstüne kaydedin(Ek Şekil 8).
- Numune ekleme kolunu tamamen aletin içine takın ve bardak tutucuyu almak için mıknatısları çalıştırın.
- Kapakları gevşetin, kesici uçları çıkarın ve şişeleri ve kapakları cam tutuculara yerleştirin ve 180 °C'de 4 saat boyunca yerleştirin ve ardından şişeleri ve kapakları kuru olduğundan emin olmak için kurubir kurutucuya yerleştirin.
7. Verilerin analizi
- Yazılımı açın (Ek Şekil 9), sol üst köşede deneyi aç'ı seçin (Ek Şekil 10). Açılır pencerede ilgi deneyini seçin ve Aç tuşuna basın (Ek Şekil 11). Uygulama varsayılan kuyugörünümünde denemeyi açar (Ek Şekil 12).
- Tümünü seçin veya Ctrl+A tuşuna basın (Ek Şekil 13).
- Temel Ii Tanımlatuşuna basın , bu parametre her konumdaki verileri normalleştirir (Ek Şekil 14). Açılır pencerede gecikme fazında bulunan >30 dk'lık bir süre seçin (ısı akışı düşük olmalı, sıfır ile on μW arasında; Ek Şekil 15). Taban çizgisi süresinin seçiminden sonra seçilen taban çizgisi termogramda yeşil olarak görünür. Taban Çizgisi Bölüm Tanımla penceresini kapatın.
- Kaydet veya Ctrl+S tuşuna basın ve yazılımı kapatın(Ek Şekil 16).
- Açık web tabanlı Symcel Kalorimetre analizi uygulaması (https://symcel.shinyapps.io/symcel_calorimetricgrowth/).
- Dosyayı Kalorimetre analiz uygulamasına yüklemek için Gözat (Ek Şekil 17)tuşuna basın, deneyi seçin ve Aç tuşuna basın (Ek Şekil 18). Metabolik parametreler, web uygulamasındaki 32 örnek için otomatik olarak hesaplanacaktır (Ek Şekil 19).
- Isı Akışı verilerini Gompertz'e ve/veya Richard'ın büyüme modellerine sığdırmak için Büyüme Fonksiyonu'nutıklatın. Büyüme modelleri uygun bölümünde görüntülenir "Kümülatif", ayrıca bölümünde ham verilerle karşılaştırıldığında "Akış" (Ek Şekil 20).
- Hesaplanan tüm parametreleri indirmek için İndirme Ölçüleri'nebasın. Dosya konumunu seçin ve Kaydet (Ek Şekil 21)tuşuna basın. Dosya, daha sonraki hesaplamalar için bir elektronik tabloya dışa aktarılacaktır.
Representative Results
Cihazın ısı sinyalini kaydetmesi için yeterli sayıda ısı üreten bakteri gereklidir. Isı akışı tespit edilene kadar zaman içinde bir gecikme varsa, bu bakteri nin henüz algılama sınırının üzerinde bir ısı sinyali üretemedikleri anlamına gelir. Bakteri örneğinden serbest ısı tespiti bu nedenle doğrudan bakteriyel aktiviteartan ile ilgilidir, bakteri üremesi de dahil olmak üzere. Bakteriyel büyüme ve diğer metabolik aktivitelerin bir antibakteriyel ilacın eklenmesinden güçlü bir şekilde etkilendiği bilinmektedir. Araştırma altındaki yeni bir doğal ürünün bakterisidal veya bakteriyostatik etkiler mi yoksa moa'ların bir kombinasyonu mu uyguladığını belirlemek için, küçük bir referans ilaç seti seçtik ve doğal ürünle yapılan deneylerden elde edilen verileri karşılaştırdığımız termogramları kaydettik. Seçilen antibiyotiklerin potensinaline bağlı olarak mikrobroth seyreltme ile belirlenen minimum inhibitör konsantrasyonu (MIC) yakın olan bir dizi konsantrasyon seçilmiştir.
Siprofloksasin bakteriyel DNA gyrase ve topoizomaz IV hedefler ve sonuç olarak, bir bakterisidal MoA sergiler. Ancak, siprofloksasin tarafından indüklenen bakteriyel öldürme konsantrasyona bağlıdır ve yetersiz konsantrasyonlarda dozlandığında da bir bakteriyostatik etkiye sahip olabilir21. Tetrasiklin ve kloramfenikol hedef ribozom 30S ve 50S alt birim, sırasıyla, ve protein sentezinin inhibisyonu nedeniyle bakteriyostatik hareket22,23. Rifampisin DNA'ya bağımlı RNA polimeraz inhibe ederek hareket eder ve kullanılan doza bağlı olarak, her ikisine de, bakteriyicidal ve bakteriyostatik etkilere sahip olabilir24. Burada araştırdığımız doğal ürün Miksobakterilerden izole edildi ve Gram-negatif ve Gram-pozitif bakteriyel patojenlere karşı güçlü bir aktivite gösterdi. MoA ve moleküler hedefini araştırırken, yeni doğal ürünün bakterisidal ve/veya bakteriyostatik etkiler kullanıp kullanmadığını ve tedavi edilen Acinetobacter baumannii'nin ısı profillerinin yukarıda belirtilen referans ilaçlarla tedavi edilen bakterilerin termogramlarına benzer olup olmadığını belirlemek le ilgileniyorduk.
Seri seyreltmede Siprofloksasin'e A. baumannii DSM-30008 teşhir edilerek elde edilen termogramlar Şekil 1A'dagösterilmiştir. 0.005 μM ile 0.1 μM arasındaki konsantrasyonlar A. baumannii'nin büyüme ve metabolizması üzerinde minimal etkiye sahiptir. Ancak, 0.5 μM siprofloksasin ile hücrelerin tedavisi gecikme faz süresi ve düşük maksimum ısı akışı nda önemli bir kayma yol açar. Bu iki değişiklik birlikte yaklaşık 6 saat artar pik(Şekil 1C)için zaman etkiler. Şekil 1B'de,kümülatif salınan ısı zamana göre çizilir. Burada, bir eğim eğimi ile yansıyan konsantrasyonların etkisini görüyoruz. Termogramın eğiminin ölçülmesi bize Şekil 1D'degösterildiği gibi siprofloksasin varlığında A. baumannii maksimum metabolik hızı verir , burada 0.5 μM siprofloksasin ile tedavi edilen hücrelerin metabolik hızında eşlik eden bir azalma gözlemleyebiliriz. Düşük konsantrasyonlarla tedavi edilen hücrelerin metabolik hızındaki değişiklikler çok azdır. Bu deney, 0.1-1 μM aralığını kapsayan ara konsantrasyonların eklenmesiyle daha da geliştirilerek, konsantrasyonlar arasında etkisi olmayan ve konsantrasyon arasında önemli bir gecikmeye yol açan gecikme fazı ve metabolik hızda daha belirgin bir kademeli değişim gözlemlenebilir. Ancak, değişim eğilimleri siprofloksasin bir bakterisidal MoA destek.
Şekil 1D: Siprofloksasinin A. baumannii DSM-30008 büyüme ve metabolizması üzerine etkisi. (A) Termogramlar ısı akışı olarak gösterilen (μW) ve zaman (h) yabani tip (WT) A. baumannii DSM-30008, tedavi edilmeyen ve siprofloksasin maruz. (B) Kümülatif ısı (mJ) ve zaman (h). (C) Hata çubukları (standart sapma) ile (h) zirveye kadar zaman. (D) Hata çubukları (standart sapma) ile metabolik hız (μW). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tetrasiklin durumunda, 8 saat sonra başlayan geç üstel faza kadar test edilen tüm konsantrasyonlar için termogramlarda önemli değişiklikler gözlendi (Bkz. Şekil 2A). Bununla birlikte, 5 μM ve 10 μM tetrasiklin ile tedavi edilen A. baumannii için ısı akışının ikinci zirvesinin önemli ölçüde düşürüldüğü sabit faz ısı salınımında büyük değişiklikler gözlenmektedir. Düşük konsantrasyonlarda da bir etkisi vardı, ancak daha az belirgin oldu. Bu etki aynı zamanda Şekil 2C'degösterildiği gibi zaman içinde zirveye ulaşmasına da neden olur. Kümülatif serbest ısı eğrileri(Şekil 2B)tedavi edilmeyen ve tedavi edilmeyen hücrelerin genel eğri şeklinde önemli farklılıklar göstermediğini, ancak eğilim olarak eğrilerin eğiminin tetrasiklin inmelerinin daha yüksek konsantrasyonlarda azaldığını göstermektedir. Bu aynı zamanda Şekil 2D'degösterilen nicel metabolik hızlara da dönüşür , konsantrasyona bağlı bir etki, (yani, artan antibiyotik konsantrasyonlarında metabolik hızın azaldığı) gözlenmektedir. Bu bulgular tetrasiklin bakteriyostatik etkisi olduğu gerçeğini destekler.
Şekil 2D: Tetrasiklinin A. baumannii DSM-30008 büyüme ve metabolizması üzerine etkisi. (A) Termogramlar ısı akışı olarak gösterilen (μW) ve zaman (h) yabani tip (WT) A. baumannii DSM-30008, tedavi edilmeyen ve tetrasiklin maruz. (B) Kümülatif ısı (mJ) ve zaman (h). (C) Hata çubukları (standart sapma) ile (h) zirveye kadar zaman. (D) Hata çubukları (standart sapma) ile metabolik hız (μW). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
A. baumannii 50S ribosomal alt üniteyi hedefleyen protein sentezinhibitörü kloramphenicol ile tedavi edilirken daha belirgin etkiler görülebilir. Kloramfenikol konsantrasyonlarının artmasına maruz kalmak gecikme fazının uzaması ve sabit fazdaki metabolik aktivitenin önemli değişikliklerine yol açar(Şekil 3A ve Şekil 3B). En düşük test konsantrasyonu için metabolik hızda bir değişiklik gözlenmez ve seçilen en yüksek test konsantrasyonu (50 μM) numunenin en fazla enerji salınımını önler. Ara test konsantrasyonlarına (5 μM ve 10 μM) bakıldığında, zirveye kadar olan süre yaklaşık 8-9 saat artmaktadır(Şekil 3C). Aynı anda, tedavi edilen hücrelerin metabolik hızı önemli ölçüde azalır, 50 μM öldürücü olmak(Şekil 3D). Genel olarak, 10 μM kloramfenikol'a kadar konsantrasyonlarda gözlenen değişiklikler bu antibiyotik sınıfının bakteriyostatik etkisi ile tutarlıdır.
Şekil 3D: Kloramfenikolun A. baumannii DSM-30008 büyüme ve metabolizması üzerine etkisi. (A) Termogramlar ısı akışı olarak gösterilen (μW) ve zaman (h) yabani tip (WT) A. baumannii DSM-30008, arıtılmayan ve kloramfenikol maruz. (B) Kümülatif ısı (mJ) ve zaman (h). (C) Hata çubukları (standart sapma) ile (h) zirveye kadar zaman. (D) Hata çubukları (standart sapma) ile metabolik hız (μW). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Seçilen konsantrasyon aralığındaki Rifampisin tedavisi, gecikme fazı süresi ve geç sabit faza kadar büyüme üzerindeki etkileri ile ilgili A. baumannii DSM-30008 termogramları üzerinde dramatik bir etkiye sahiptir(Şekil 4A). Metabolik aktivitede azalma ile birlikte gelen Şekil 4B'de ısı salınımında önemli bir azalma görülebilir. Şekil 4C ve Şekil 4D, gecikme fazının uzaması ve sabit fazdaki metabolik aktivitedeğişikliklerinin etkisini göstermektedir. Şekil 4C kullanılan tüm konsantrasyonlar için zirveye zaman kesin bir artış gösterir. Şekil 4D, genellikle bakterisidal etkiye atfedilen tüm konsantrasyonlar için eğimdeki azalmanın neden olduğu metabolik hızdaki düşüşü göstermektedir. Bakteri hücrelerinin antibiyotik kaynaklı öldürülmesi nedeniyle, metabolik aktivite aktif bakterilerin daha az sayıda mevcut nedeniyle daha düşük olması bekleniyor. Toplanan veriler, rifampisinin bakterisidal ve bakteriyostatik etki yaratabileceği gerçeğiyle uyuşmaktadır ve burada sunulan veriler seçilen konsantrasyonların esas olarak bakterisidal etkilerini desteklemez.
Şekil 4D: Rifampisinin A. baumannii DSM-30008 büyüme ve metabolizması üzerine etkisi. (A) Termogramlar ısı akışı olarak gösterilen (μW) ve zaman (h) yabani tip (WT) A. baumannii DSM-30008, tedavi edilmeyen ve rifampisin maruz. (B) Kümülatif ısı (mJ) ve zaman (h). (C) Hata çubukları (standart sapma) ile (h) zirveye kadar zaman. (D) Hata çubukları (standart sapma) ile metabolik hız (μW). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Doğal ürün antibiyotik (0.25 μM) en düşük seçilen test konsantrasyonu A. baumannii DSM-30008 termogram üzerinde hiçbir veya sadece marjinal etkileri vardır. Ancak, diğer test edilen konsantrasyonlar gecikme fazı süresi üzerinde bazı etkiler sergiler ve geç sabit faza kadar büyümeyi etkiler(Şekil 5A). En belirgin etkisi sabit fazda ısı emisyonunun önemli ölçüde azalmasıdır. Şekil 5B'de gösterilen veriler, serbest bırakılan enerjinin tüm etkili konsantrasyonlar için önemli ölçüde azaldığını ve eğimin de azaldığını açıkça göstermektedir. Bu etkiler pik zaman azalması anlamına gelir(Şekil 5C) ve daha da önemlisi, metabolik hızda önemli ve açıkça doza bağımlı azalma gözlenir (Şekil 5D). Yeni miksobakteriyel doğal ürünün araştırılması kombine bakteriyostatik ve bakterisidal etki ortaya koymuştur.
Şekil 5D: Yeni bir antibakteriyel doğal ürünün A. baumannii DSM-30008 büyüme ve metabolizması üzerine etkisi. (A) Termogramlar ısı akışı (μW) ve zaman (h) yabani tip (WT) A. baumannii DSM-30008 için, arıtılmayan ve doğal ürüne maruz olarak gösterilir. (B) Kümülatif ısı (mJ) ve zaman (h). (C) Hata çubukları (standart sapma) ile (h) zirveye kadar zaman. (D) Hata çubukları (standart sapma) ile metabolik hız (μW). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: Yazılım arabiriminde yeni bir deneme seçme. Kırmızı bir karede yeni bir deneme seçmek için adım tasvir edilir. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 2: Yazılım arabiriminde yeni bir denemenin adlandırılması. Kırmızı bir karede, yeni denemenin adını ve onayını verme adımı gösterilmiştir. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 3: Yazılım arabiriminde yeni bir deneme başlatma. Kırmızı bir karede yeni bir deneme başlatmak için adım tasvir edilir. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 4: Yazılım arabiriminde iyi seçim ve tepki başlar. Tüm reaksiyon kuyuları seçilir (koyu mavi renkte renkli kuyular, düğme Kırmızı karede tümünü seç) ve reaksiyon başlangıcı seçilir (kırmızı bir karede gösterilmiştir). Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 5: Bardak tutucunun doğru yüklenmesi. Referans kuyuları seçilir (koyu mavi renk, kırmızı kare) ve termogramlar açılır pencerede görüntülenir. Yükleme doğru yapıldığında, plato fazına ulaşması ve yaklaşık 2-3 dakika bu fazda kalması gereken ısı emisyon sinyalinde ani bir düşüş gözlemliyoruz, daha sonra sinyal başlangıç noktasına geri dönüyor. Bu gözlendiğinde bardak tutucunun yüklenmesi doğrudur. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 6: Deneyin sonu. Kırmızı ile denemedeki Durdur düğmesi gösterilmiştir. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 7: Deneyin sona ermesinin teyidi. Kırmızı yla, çalışan denemenin sonunu onaylamak için Evet düğmesi gösterilmiştir. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 8: Deneme dosyasını kaydetme. Kaydet dosya seçenekleriiçeren bir açılır pencere gösterilir ve kırmızı renkte Kaydet düğmesi gösterilir. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 9: Yazılım arabirimi. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 10: Kaydedilen deneylere erişim. Kırmızı ile kaydedilen denemelere erişmek için denemeyi aç düğmesi gösterilmiştir. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 11: Seçili deneme dosyasının açılması. Kırmızı ile Aç düğmesi gösterilmiştir. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 12: Varsayılan kuyugörünümü. Tüm deneysel kuyu ve karşılık gelen termogramlar görülebilir. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 13: Analiz için kuyu seçimi. Kırmızı düğmeyle tümünü seçin. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 14: Taban çizgisinin tanımlanması. Kırmızı ile Define taban çizgisi tanımlanır düğmesi gösterilmiştir. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 15: Temel sinyali seçmek. Gecikme fazında en az 30 dk sinyal seçilir (kırmızı kutu). Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 16: Deney dosyasındaki değişiklikleri kaydetme. Kırmızı ile Kaydet düğmesi gösterilmiştir. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 17: Web tabanlı Kalorimetre analizi uygulaması. Çevrimiçi yazılım arabirimi ve dosya yükleme yolu gösterilir. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 18: Seçilen deneysel dosyanın yüklenmesi. Kırmızı ile Aç düğmesi gösterilmiştir. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 19: Termogramların analizi. Her deney kuyusu için hesaplanan metabolik parametreler kırmızı ile gösterilmiştir. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 20: Deneysel verilerin teorik büyüme modellerine uydurması. Isı akışı verileri gompertz'e veya Richard'ın büyüme modeline takılır. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 21: Ölçümlerin dışa aktarılışı. Kırmızı düğmelerde İndirme Ölçüleri ve Kaydet gösterilmiştir. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Discussion
İzotermal mikrokalorimtri bir numuneden yayılan enerjiyi zaman içinde ölçer ve bu enerji salınımı tüm biyolojik, fiziksel ve (biyo-) kimyasal süreçlerin bir sonucudur. Ölçülen ısı akışı, metabolik aktivitenin sürekli gerçek zamanlı izlenmesini sağladığından maddelerin antibakteriyel etkilerini değerlendirmek veya belirlemek için kullanılabilir.
Analiz için güvenilir veri elde etmek için, doğru başlangıç koloni oluşturma birimleri (CFU) kullanılan her tür veya gerginlik için ayrı ayrı belirlenmelidir. CFU sayısının çok düşük olması durumunda, sistemin tespit edilmesi için yeterli ısı üreten kritik miktarda biyokütleye ulaşması daha uzun sürdüğünden, bu durum uzun bir gecikme fazına yol açar. CFU sayısının çok yüksek olması durumunda gecikme fazı çok kısa olacaktır ve üretilen ısı miktarı komşu sensör hücrelerine (referans ve deneysel kuyular) ısı transferine ve termogramların bozulmasına neden olabilir. CFU yüksek sayıda da daha hızlı bir oksijen tükenmesi yol açacaktır ve anaerobik koşullara geçmek. Ayrıca, denemenin ilk 30 dakikası boyunca, sistem dengelendiğinde, veri toplamanın mümkün olmadığı ve efektlerin gerçek kaydının geciktiği de göz önünde bulundurulmalıdır. Buna ek olarak, yanlış CFU tayini yanlış MIC tayini yol açar, sonuçta deney etkileyen ve değişiklikler25gözlenen . Bir diğer kritik nokta da taban çizgisinin doğru belirlenmesidir. Genellikle, ısı akışı sinyali sıfır olduğunda ve ideal olarak, taban çizgisi tanımı için zaman aralığı >30 dk olduğunda, gecikme aşamasında temel sinyal seçilir. Ancak, bakterilerin ısı sinyali algılama sınırına ulaşmak için ihtiyaç duyduğu süre suşlar ve türler arasında farklılık gösterirken, bu her zaman mümkün değildir. Diğer türler veya türler ilk 30 dakika içinde ulaşırken bazı türler veya suşlar ısı sinyali algılama sınırına ulaşmak için 30 dakikadan fazla zaman alar. Bu durumda, tüm ısı sinyalleri sıfıra düştüğünde ve sabit kaldığında deney sonundaki temel sinyali seçmek mümkündür. Alternatif olarak, aynı bakteriyel suşu ile diğer deneylerden taban çizgileri kullanılabilir, ancak tavsiye edilmez.
Sistem, denemelerin ve sorun gidermelerin tasarım ve optimizasyonu açısından bazı esneklikler sağlar. Kullanılan hacimler, plastik kesici uçlar ve 100-600 μL plastik kesici uçlar olmadan titanyum kaplar kullanılırken 100-300 μL aralığındadır. Üretici tarafından önerilen çalışma hacmi 120 μL'dir. Yeni bir deneysel seri kurarken farklı hacimlerin kullanılması ve ölçümler için en uygun koşulların bulunması, esas olarak iki parametre üzerinde bir etkiye sahiptir. Daha düşük hacimler kullanılarak, gerekli test bileşiği miktarı azaltılabilir, bu da özellikle küçük miktarlarda bulunan bileşikler için önemlidir. Buna ek olarak, kullanılan hacim, ölçüm sırasında oksijen kullanılabilirliğini doğrudan etkiler ve daha düşük hacimlerde bakteri büyümesi için gerekli olan mevcut oksijen miktarını artırır. Oksijen tükenmesi, deneyin mümkün olan en uzun süreye katkıda bulunan ana faktörlerden biridir. Daha da önemlisi, sadece sıvı ortam değil, katı ortam da kullanmak mümkündür. Katı ve gaz fazı arasındaki arayüz üzerinde büyüme daha iyi oksijen erişimi sağlar gibi bu özellikle yavaş büyüyen mikroorganizmalar için önemlidir9.
IMC fizik, kimya ve biyoloji uygulamaları ile bilinmeyen süreçleri keşfetmek için yararlı bir analitik araçtır. Yöntem kapalı bir sistem içinde ısı alışverişini ölçer ve kaydedilen ısı değişiminin analizi her zaman standart yöntemlerle elde edilemeyen ek bilgiler sağlar. Mikrobiyoloji ve antibiyotik araştırmalarında, IMC'nin en büyük avantajlarından biri canlı, ölü ve persister veya uykuda hücreler arasında ayrım yeteneğidir, hangi standart bulanıklık yöntemleri kullanılarak mümkün değildir11. Buna ek olarak, IMC son derece hassastır ve 10-105 hücre9gibi az ısı emisyonu algılayabilir. Başka bir avantajı deneysel kurulum hızlı ve kolay olmasıdır, ve hiçbir kullanıcı müdahalesi en az ile sürekli, gerçek zamanlı izleme için izin verir. Ayrıca, IMC örneklerin daha fazla analiz edilmesini sağlayan tahribatsızdır. Veri analizi geç üstel veya erken sabit faz ve sabit fazda metabolik aktivite kadar biyokütle oluşumunun ayrıştırma sağlar.
Yukarıda bahsedilen roman ve heyecan verici uygulama özelliklerinin yanı sıra, bu yöntemin sakıncaları da vardır. En büyük sınırlama, IMC cihazlarının belirli bir sistem içinde üretilen ve serbest bırakılan ve spesifik olmayan sinyalleri de içeren toplam ısıyı ölçmesidir. Bu, ısı akışı9,20kayıt ile ölçülen ısı sinyali değişiklikleri değerlendirmek edebilmek için uygun kontroller ile deneysel planlama önemini vurgulamaktadır.
Elimizde, IMC yeni doğal ürünlerin antibakteriyel etkilerini incelemek ve etkili konsantrasyon aralıklarını belirlemek için önemli bir araçtır. Bakteriyostatik ve bakterisidal etkilerin farklıolması nın yanı sıra, gelecekte hedef tanımlama çalışmaları ve MoA tayini nin bir parçası olarak kullanılabilir. Bu burada görüntülenen yeni aktif bileşiklerin termogramlar farklı antibiyotik sınıfların termogramlar karşılaştırarak yapılabilir. Ancak, ölçülen verilerden çıkarılabilen bazı ölçülebilir parametrelerin bu tür karşılaştırmalar için yeterli olup olmadığı veya tam termogramlara dayalı parmak izi veren algoritmalar üzerinde çalışmak gerekip gerekmediği hala araştırılmalıdır. Antibiyotik araştırma alanında başka bir olası uygulama dirençli klonlar wildtype karşılaştırılması, tüm genom dizilimi ile birleştiğinde, hangi yeni antibakteriyellerin modu-direnç (MoR) açıklığa kavuşturulması yardımcı olabilir. Yöntemin statik doğası nedeniyle, biyofilm oluşumu nda veya halihazırda kurulmuş biyofilmlerde yeni ajanların etkinliğinin araştırılması biyolojik sürecin daha iyi anlaşılmasına ve seçilen ajanların uykunun farklı aşamalarında mikroplar üzerindeki etkisinin daha iyi anlaşılmasına yol açabilir. IMC, ısı şeklinde açığa çıkan toplam enerjiyi kaydeder ve transkripsiyonla birleşen aktif maddelerin alt inhibitör etkilerini araştırmak için uygun bir yöntem dir. Bu yöntem aynı zamanda klinik ortamlarda numunelerin kontaminasyonunu tespit etmek veya hastaların kesin tedavisine hızla karar vermeye yardımcı olan antibiyogramların belirlenmesi nde de kullanılabilir11.
Disclosures
Proje Symcel, calScreener teknolojisigeliştiricisi ile işbirliği içinde gerçekleştirildi. Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar verimli tartışmalar için Symcel ekibi teşekkür etmek istiyorum ve biz Ganna Oliynyk ve Wilhelm Paulander büyük destek kabul etmek istiyorum. Biz de usta teknik destek için doğal ürün ve Stefanie Schmidt sağlamak için Daniel Kohnhäuser teşekkür etmek istiyorum.
Materials
|Name||Company||Catalog Number||Comments|
|Acinetobacter baumannii||DSMZ||DSM-30008||reference strain used in this study|
|calPlate||Symcel||1220093||48-well plate for titanium cups to be inserted|
|calScreener||Symcel||1200001||isothermal microcalorimetry instrument|
|calView software||Symcel||collection and analysis software|
|calWell||Symcel||1901004||micro-bio grade (non-active) 48-well plate with plastic inserts which are inserted into the titanium cups|
|CASO agar||Carl Roth||X937.1||isolation and cultivation of microorganisms|
|Chloroamphenicol||Sigma-Aldrich||C0378||antibiotic|
|Ciprofloxacin||Sigma-Aldrich||17850||antibiotic|
|Cuvettes||Brand||759015||1.5 mL cuvettes|
|Disposable inoculation loops||Sarsted||86.1562.050||10 µL inoculation loops|
|Dimethylsulfoxid (DMSO)||Thermo Fisher Scientific||85190|
|Eppendorf tubes||Eppendorf||30120086||1.5 mL eppendorf safe-lock tubes|
|Ethanol||Thermo Fisher Scientific||10428671|
|Falcon Tubes||Sarsted||62.554.502||15 mL falcon tubes|
|Hydrochloride (HCL)||Thermo Fisher Scientific||10316380|
|Methanol||Thermo Fisher Scientific||A412-500|
|Mueller Hinton Broth||Sigma-Aldrich||70192||liquid medium for antibiotic susceptibility studies|
|Mueller Hinton Broth II cation adjusted media||Sigma-Aldrich||90922||Mueller Hinton Broth cation-adjusted to 1.25 mM CaCl2, 0.8 mM MgCl2|
|Petri dishes||LABSOLUTE||7696404|
|Pipette 100 - 1000 µL||Brand||705880|
|Pipette 2 - 20 µL||Brand||705872|
|Pipette 20 - 200 µL||Brand||705878|
|Pipette tips 100 - 1000 L||Brand||732032|
|Pipette tips 2 - 200 µL||Brand||732028|
|Polymyxin B sulfate||Sigma-Aldrich||P0972||antibiotic|
|Rifampicin||Sigma-Aldrich||R3501||antibiotic|
|Serological pipette||Thermo Fisher Scientific||170356N||10 mL Nunc serological pipette|
|Spectrophotometer||Eppendorf AG||6135 000.017|
|Sterile filters||Minisart||16534----------K||0.2 µm pore size sterile filters|
|Syringe 50 mL||NORM-JECT||22778|
|Tetracycline||Sigma-Aldrich||87128||antibiotic|
|Titanium cups||Symcel||1220089||inserted in 48-well titanium calPlate|
|Titanium lids||Symcel||1220091||screwed and tightend to the titanium cups|
|Trimethroprim||Sigma-Aldrich||T7883||antibiotic|
|Tweezers||Symcel||1900602|
References
- World Health Organization (WHO). Antibiotic resistance. World Health Organization (WHO). Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/antibiotic-resistance (2018).
- Herrmann, J., Abou Fayad, A., Müller, R. Natural products from myxobacteria: novel metabolites and bioactivities. Natural Product Reports. 34, (2), 135-160 (2017).
- Cassar, S., et al. Use of Zebrafish in Drug Discovery Toxicology. Chemical Research in Toxicology. 33, (1), 95-118 (2020).
- Bhusnure, O. G., et al. Drug Target Screening and its Validation by Zebrafish as a Novel Tool. Pharmaceutica Analytica Acta. 6, (10), 426 (2015).
- Kraus, J., Tobin, G., Development, Discovery, Deveopment, and Regulation of Natural Products. Using Old Solutions to New Problems - Natural Drug Discovery in the 21st Century. Kulka, M. InTech. Rijeka, HR. 4-36 (2013).
- Tabassum, N., Tai, H., Jung, D., Williams, D. R. Fishing for Nature's Hits: Establishment of the Zebrafish as a Model for Screening Antidiabetic Natural Products. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2015, (1), 287847 (2015).
- Antimicrobial Development. Symcel. Available from: https://symcel.com/applications/microbiology/antimicrobials-development (2019).
- Robador, A., LaRowe, D. E., Finkel, S. E., Amend, J. P., Nealson, K. H. Changes in Microbial Energy Metabolism Measured by Nanocalorimetry during Growth Phase Transitions. Frontiers in Microbiology. 2018, (9), 109 (2018).
- Braissant, O., Wirz, D., Göpfert, B., Daniels, A. U. Use of isothermal microcalorimetry to monitor microbial activities. FEMS Microbiology Letter. 303, (1), 1-8 (2010).
- Braissant, O., et al. Isothermal microcalorimetry accurately detects bacteria, tumorous microtissues, and parasitic worms in a label-free well-plate assay. Biotechnology Journal. 10, (3), 460-468 (2015).
- Butini, M. E., Abbandonato, G., Di Rienzo, C., Trampuz, J., Di Luca, M. Isothermal microcalorimetry detects the presence of persister cells in a Staphylococcus aureus biofilm after vancomycin treatment. Frontiers in Microbiology. 25, (10), 332 (2019).
- Tellapragda, C., et al. Isothermal microcalorimetry minimal inhibitory concentration testing in extensively drug resistant Gram-negative bacilli - A multicenter study. Clinical Microbiology and Infection. (2020).
- Abdillahi, S., et al. Collagen VI Contains Multiple Host Defense Peptides with Potent In Vivo Activity. The Journal of Immunology. 201, (3), 1007-1020 (2018).
- Astasov-Frauenhoffer, M., et al. Exopolysaccharides regulate calcium flow in cariogenic biofilms. PLoS ONE. 12, (10), 1-14 (2017).
- Gros, S., et al. Personalized Treatment Response Assessment for Rare Childhood Tumors Using Microcalorimetry-Exemplified by Use of Carbonic Anhydrase IX and Aquaporin 1 Inhibitors. International Journal of Molecular Sciences. 20, (20), 4984 (2019).
- Kriszt, R., et al. Optical visualisation of thermogenesis in stimulated single-cell brown adipocytes. Scientific Reports. 7, (1), 1-14 (2017).
- Wadsö, I., et al. A well-plate format isothermal multi-channel microcalorimeter for monitoring the activity of living cells and tissues. Thermochimica Acta. 652, (1), 141-149 (2017).
- von Ah, U., Wirz, D., Daniels, A. U. Isothermal micro calorimetry - a new method for MIC determinations: results for 12 antibiotics and reference strains of E. coli and S. aureus. BMC Microbiology. 9, (106), (2009).
- Howell, M., Wirz, D., Daniels, A. U., Braissant, O. Application of a Microcalorimetric Method for Determining Drug Susceptibility in Mycobacterium Species. Journal of Clinical Microbiology. 50, (1), (2012).
- Wadsö, I. Isothermal Microcalorimetry: Current problems and prospects. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. 64, (2001), 75-84 (2001).
- LeBel, M. Ciprofloxacin: chemistry, mechanism of action, resistance, antimicrobial spectrum, pharmacokinetics, clinical trials, and adverse reactions. Pharmacotherapy. 8, (1), 3-33 (1988).
- Chopra, I., Roberts, M. Tetracycline antibiotics: mode of action, applications, molecular biology, and epidemiology of bacterial resistance. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 65, (2), 232-260 (2001).
- Allison, J. L., et al. Mode of action of chloramphenicol. VII. Growth and multiplication of Escherichia coli in the presence of chloramphenicol. Journal of Bacteriology. 83, (3), 609-615 (1962).
- Wehrli, W. Rifampin: mechanisms of action and resistance. Reviews of Infectious Diseases. 5, Suppl 3 407-411 (1983).
- Hancock, R. E. W., et al. Agar and broth methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nature Protocols. 3, (2), 163-175 (2008).