TESPİT EDİLMİŞ DOKULARI BOYAMADAKİ GENEL FAKTÖRLER
1-Fiksasyonun Boyama Üzerine Etkisi: Fiksasyon, dokularla boyaların etkileşimine yardım eder. Formaldehit ve civa klorür bazik boyaların; trikloroasetik asit, pikrik asit ve krom bileşikleri asit boyaların hareketini kolaylaştırır. Etil alkol veya asedik asitle fiksasyondan sonra asidik ve bazik boyalar dokular tarafından kolaylıkla alınır. Bazen tespit edici ajan doku-boya arasında mordant olarak hareket edebilir. Bu duruma, hematoksilenle miyelin gösteriminde dokunun potasyum bikromatla tespiti örnek verilebilir.
2-Progressif ve Regressif Boyama: Progressif boyama tekniğinde, doku bileşenleri sıra ile renklenir ve boya çözeltisinde uygun süre sonunda dokular tatmin edici biçimde differensiyel olarak renklenir.
Regressif teknikte ise dokular önce fazla boyanır, ayrıntılar izlenemez. Sonra dokunun istenmiyen kısımlarından fazla boyanın alınır veya differensiye edilir. Regressif teknik daha çok kullanılır.
3-Direkt ve İndirekt Boyama: Anilin boyaların sulu veya alkolik çözeltileri dokuları mükemmel olarak renklendirir ve direkt boyama olarak bilinir. Hematoksilen gibi boyalarda ise dokunun boya ile birleşebilmesi için mordant adı verilen ara bir maddeye gerek duyulur ve indirekt boyama olarak bilinir. Mordant olarak genellikle alumlar kullanılır. Demir, aliminyum ve krom bileşikleri boyalarla bazik boyalar oluşturmak için birleşen mordantlardır.
Mordantlardan farklı olarak kullanıldıkları boyanın boyama gücünü ve seçiciliğini artıran ve boya-doku birleşmesi için gerekli olmayan bileşiklere vurgulayıcı (accentuator) adı verilir. Vurgulayıcılar anyonik boyaya eklendiklerinde asit; katyonik boyaya eklendiklerinde ise alkalidir. Anyonik boyaya asit eklendiğinde, dokuların bazik gruplarının iyonizasyonun artışı ile boyama yoğunlaşır. Fenol, karbol thionin ve karbol fuksin vurgulayıcı olarak sıklıkla kullanılırlar.
a-Direkt boyama b-Mordant ile indirekt boyama, c-Vurgulayıcı ile indirekt boyama.
D:doku, B:boya , M: mordant, A: accentuator
Metal çöktürme yöntemlerinde kullanılan hızlandırıcılar (accelerator) da vurgulayıcılarla aynı şekilde hareket ederler (Cajal yöntemindeki kloral hidrat ve veronal). Tuzağa düşürücü ajanlar (trapping) (tannik asit, iyodin), boyaları dokularla ve bakterilerle bir arada tutar. Metilen mavisi-eozinle boyanan kan yayması, tannik asitle muamele edilirse kromatindeki metilen mavisini tutar. Boyama sonrası alkolle dehidrasyonda boya kaybı olmaz.
4-Differansiyasyon: Regressif teknikle aşırı boyanmış dokunun differansiyasyonu veya boyanın geri alımı (de-staining), basit çözeltilerle yıkama, asitler ve oksitleyici ajanların kullanımı ile sağlanabilir. Mordantlar ve bazı boyalar, differansiyasyon ajanı olarak da hareket edebilir. Suda veya alkolde yıkama, differansiyasyonun temelidir ancak başka çözücüler de kullanılabilir. Dokularla sıkı kimyasal bağlarla birleşen boyalar bu yolla kolaylıkla differensiye olamaz fakat asit kullanımı ile parçalanabilir. Boyalar, kullanılan boyalardan doku bileşenleri için daha çok affiniteleri olduğunda differensiyasyon ajanı gibi hareket eder. Orange G gibi kuvvetli bir boya, diğer daha az hırslı boyayı yerinden çıkarır.
Boya Çözeltilerinin Olgunlaşması: Bazı boya çözeltileri, günlerce, haftalarca, aylarca havaya, ışığa, ısıya maruz kaldıktan sonra boyama özelliği kazanır. Hematoksilen hazırlandıktan birkaç hafta sonra hemateine okside olarak boyama özelliği kazanır. Sodyum iyodat, civa oksit, potasyum permanganat gibi kimyasal oksitleyici ajanların kullanımıyla hemen oksidasyon sağlanır ve boya hemen kullanılarak tüketilmelidir. Süper oksidasyonla boyama etkisi ortadan kalkar.