This action might not be possible to undo. Are you sure you want to continue?
Besiyerleri 1
Prof. Dr. A. Kadir Halkman Ankara Üniv. Mühendislik Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü 03.01. Genel Bilgiler 03.02. Kısa Tarihçe 03.03. Besiyeri Hazırlama Şekilleri #03.03.01. Formülden Hazırlama #03.03.02. Dehidre Besiyerlerinden Hazırlama #03.03.03. Kullanıma Hazır Besiyerleri #03.03.04. Özel Uygulamalar 03.04. Besiyeri Bileşimine Giren Maddeler #03.04.01. Su #03.04.02. Peptonlar #03.04.03. Maya Ekstraktı #03.04.04. Et Ekstraktı #03.04.05. Malt Ekstraktı #03.04.06. Beyin ve Kalp Ekstraktı #03.04.07. Agar #03.04.08. Karbohidratlar #03.04.09. Tuz #03.04.10. Tampon Maddeler #03.04.11. pH İndikatörleri #03.04.12. Redoks İndikatörleri #03.04.13. Diğer İndikatörler #03.04.14. İnhibitörler #03.04.15. Diğer Maddeler 03.05. Besiyeri Çeşitleri #03.05.01. Genel Besiyerleri #03.05.02. Selektif Besiyerleri #03.05.03. Diferansiyel (Ayırt Edici; Fark Ettirici) Besiyerleri #03.05.04. Zenginleştirme Besiyerleri #03.05.05. İdentifikasyon Besiyerleri #03.05.06. Diğerleri 03.06. Besiyerlerinin Hazırlanması #03.06.01. Cam Malzeme #03.06.02. Tartım ve Eritme #03.06.03. pH Ayarlama #03.06.04. Katkıların İlavesi #03.06.05. Petri Kutularına Döküm #03.06.06. Kurutma #03.06.07. Yeniden Eritme 03.07. Depolama #03.07.01. Dehidre Besiyerlerinin Depolanması #03.07.02. Çözeltilerin Depolanması #03.07.03. Katkıların Depolanması #03.07.04. Hazırlanmış Besiyerlerinin Depolanması 03.08. Çözeltilerin Hazırlanması 03.09. Besiyeri Kalite Kontrolü 03.10. Besiyeri Hataları 03.11. Tehlikeli Maddeler
www.mikrobiyoloji.org ana sayfasında görülen Merck Gıda Mikrobiyolojisi Uygulamaları; "Anonymous, 2005. Merck Gıda Mikrobiyolojisi Uygulamaları. Ed: A. K. Halkman. Başak Matbaacılık Ltd. Şti., Ankara, 358 sayfa." adlı kitabın 03. bölümüdür.
1
1
03.01. Genel Bilgiler
# Besiyerleri (besi ortamı, ortam, vasat, kültür ortamı, kültür vasatı, kültür besiyeri) mikroorganizmaların geliştirilmesi için formülize edilmiş ortamlardır. Bunlar, mikroorganizmaların geliştirilmesi, izolasyon, identifikasyon, sayım, duyarlılık testleri, sterilite testleri, klinik örneklerin incelenmesi, gıda, su ve çevre kontrolleri, biyolojik ürünlerin elde edilmesi, antibiyotik ve vitamin analizleri, endüstriyel analizler vb. gibi çok farklı amaçlara yönelik olabilir. # Besiyerleri çok farklı şekillerde hazırlanabilir ve kullanılabilir. Örneğin, süt bir "genel besiyeri" olup, mikroorganizmaların gelişmeleri için gerekli bütün besin maddelerini ve bunların kullanılabilmesi için yeterli suyu içerir. Üzüm suyunda da gelişme için gereken besin maddeleri ve su bulunmasına karşın, yüksek asitliği nedeni ile sadece bu asitlikte gelişebilecek olan mikroorganizmaların (bazı bakteriler ve özellikle mayaların) gelişimine uygundur. # Besiyerleri hakkında TS EN 12322; "Vücut Dışı Kullanılan Tıbbi Tanı CihazlarıMikrobiyoloji Kültür Besiyerleri- Kültür Besiyerlerinin Performans Kriterleri, Direktif: 93/42/EEC, 98/79/EC" adlı yayın Türk Standartları Enstitüsü'nden sağlanabilir. # #
03.02. Kısa Tarihçe
# Mikrobiyolojinin tarihçesinde kilometre taşı olarak anılan iki gelişme; 1674 yılında Antoni van Leeuwenhoek'un mikroskobu icat etmesi ve bundan yaklaşık 2 yüzyıl sonra 1881 yılında Robert Koch'un jelatin kullanarak elde ettiği katı besiyerinden Bacillus anthracis 'i izole etmesidir. Böylece, hastalık etmeni olan pek çok bakteri izole edilebilmiş ve "Hasta bireyden muhtemel hastalık etmenini saf halde izole et. Bu etmeni sağlıklı bireye aşıla. Hastalık semptomlarının aynı olduğunu izle. Hastalandırılmış bireyden saf halde izole edeceğin etmenin, ilk hasta bireyden izole ettiğin ile aynı olduğunu göster." şeklindeki Koch postulatı, giderek sistematik analiz yöntemi haline dönüşmüştür. Louis Pasteur tarafından 1882'de aşılamanın bulunması, 1928'de Alexander Fleming'in penisilini keşfetmesi de mikrobiyoloji tarihinin önemli kilometre taşları arasındadır. Bu bölümdeki amaç, tüm mikrobiyoloji tarihini vermek değildir ve bu konu, kitabın kapsamı dışında kalır. Aşağıda besiyerlerinin geliştirilmesi üzerine kısa bir kronoloji verilmiştir. #1817: Bartholomeo Bizio, ekmek üzerindeki kan gibi kırmızı renklenmelerin gerçekte ne olduğunu araştırmış, bunları mikroskop altında incelemiş ve mikroorganizmaları görmüştür. Kırmızı renkli sütlü ekmeği taze sütlü ekmeğe değdirerek, Serratia marcescens olarak adlandırdığı bu mikroorganizmanın gelişmesini sağlamış ve renklenmenin insan eliyle yapıldığını kanıtlamıştır. #1861: Louis Pasteur, mayaların oksijenli ve oksijensiz ortamda gelişimini inceleyip, bunların geliştirilmesi için sıvı besiyeri formülünü açıklayan ilk bilim adamı olarak tarihe geçmiştir. #1869: Ferdinand Cohn, besiyeri bileşiminde mineral maddelerin önemini göstermiştir. Böylece farklı grup mikroorganizmalar ile çalışma olanağı doğmuştur. #1872: Alman botanikçi Oscar Brefeld, sıvı besiyerine jelatin ekleyerek elde ettiği katı besiyerinde tek spordan küf kolonilerini ürettiğini bildirmiştir. #1873: Edwin Klebs, "fraksiyon yöntemi" olarak adlandırdığı bir seyreltme tekniği kullanarak ayrı kültürler elde eden ilk bakteriyologlardan biridir. Bu yöntem basit olarak, sıvı ortamdan 2
az miktarda örneğin başka bir besiyerine inokülasyonudur. Bu yöntemin dezavantajları karışık kültürlerden sadece baskın türün izole edilebilmesi ile çok fazla işgücü ve malzeme gerektirmesidir. #1877: John Tyndall, bugün Tindelizasyon olarak anılan ardışık ısıl işlem ile sterilizasyonu açıklamıştır. #1878: İlk saf kültür, "seyreltme tekniği" ile Joseph Lister tarafından elde edilmiştir. Lister, Pasteur'ün laktik fermentinden, sütte ekşimeye yol açan Bacterium lactis adını verdiği bakteriyi izole etmiştir. Bir öze ucu dolusu kesilmiş sütü steril kaynamış suya aktarmış, gerekli seyreltmeyi mikroskop kullanarak belirlemiş ve tek bakterinin olduğu seyreltiyi inokülasyon amacıyla kullanmıştır. #1880: İsviçreli bir botanikçi olan Karl Wilhelm von Nägeli, besiyeri hazırlamada pepton kullanımını öneren ilk bilim adamıdır. #1881: Robert Koch, aseptik olarak kesilmiş patates dilimlerinin, katı besiyeri olarak kullanımındaki yetersizliği üzerine, %10 jelatin eklenmiş sıvı besiyeri kullanarak Bacillus anthracis 'in saf kültürünü elde etmiştir. #1882: Koch'un çalışma arkadaşları olan Walter Hesse ile eşi Fanny Eilshemius Hesse tarafından katılaştırıcı olarak agar önerilmesi ile birlikte sıvı besiyerinin katılaştırılmasında yeni bir dönem başlamıştır. #1883: Gayon ve Gabriel Dupetit, şekerler ve alkoller gibi basit organik bileşiklerin kompleks organiklerin yerini alabileceğini göstermişlerdir. #1889: Limbourg, inhibitör olarak safra tuzları kullanmıştır. Safra tuzları (Ox Bile) günümüzde de koliform bakteriler için olan besiyerlerinin çoğunda bulunmaktadır. #1891: Coprrado, safranın B. mallei gelişmesini teşvik ederken, B. anthracis için bakterisit olduğunu ve B. typhosus ile B. pneumoniae üzerinde etkisi olmadığını gözlemiştir. Bu şekilde inhibitör kullanımı üzerinde yoğunlaşılmıştır. #1900: MacConkey ve Hill, Safra Tuzu Glikoz Broth'u fekal kontaminasyon için basit bir test olarak önermişlerdir. Hemen arkasından MacConkey bu besiyerinde B. enteritidis 'i geliştirmek için glikoz yerine laktoz kullanmıştır. #1902: Wilhelm von Drigalski ve Heinrich Conradi, Salmonella typhi ile E. coli 'yi ayırt etmek için bu iki bakterinin şeker metabolizmasındaki farkını kullanmayı önermişlerdir. Böylece, selektif izolasyon kavramı daha da belirginleşmiştir. #1908: Christiaan Eijkman, sıcak kanlı hayvanların bağırsağından izole edilmiş koliform bakterilerin Glikoz Broth besiyerinde, 46 °C'da inkübe edildiğinde gaz ürettiğini göstermiştir. Bu test günümüzde de benzer bir şekilde kullanılmaktadır. #1908: Prof. R. Doerr, laboratuvarlar için Petri kutusuna Nutrient Agar dökerek hazırlanan besiyeri önermiştir. #1909: Prof. E.L. Marx, laboratuvar ölçeğinde dehidre Nutrient Broth, Nutrient Agar ve Endo Agar formüllerine öncülük etmiştir. #1910: Amerikan Bakteriyologlar Derneği toplantısında W.D. Frost tarafından hazır besiyeri için benzer bir proses açıklanmıştır. #1910: İlk ticari besiyeri üretimi Nutrient Agar ve Nutrient Broth ile başlamıştır.
3
# Benzer şekilde. Besiyeri Hazırlama Şekilleri # Standart bir gıda mikrobiyolojisi laboratuvarı tipik bir ev mutfağına benzer. patojenik enterobakteri tanımlama ve izolasyonu için kullanılmak üzere Eosin Methylene Blue Lactose Sucrose (EMB) Agar besiyerini geliştirmişlerdir. aranmasında kullanılan BAT Agar ile özellikle Listeria monocytogenes aranmasında kullanılan ALOA Agar besiyerlerinin de standart bir laboratuvarda bileşimden hazırlanması oldukça güçtür.000001 g/L folik asit gibi tartımın da bulunduğu dikkate alındığında. ya da hazır dehidre besiyeri doğrudan tartılarak su içinde çözülür. Nutrient Broth'un bileşimi litrede 5 gram pepton ve 3 gram et ekstraktı şeklindedir. # # 03. Nutrient Broth'u bileşimden hazırlamak genellikle sorun değildir. Ya da daha basit olarak. günümüzde de kullanılan bir besiyeridir. önce un yağda kavrulur. bundan 8 gram tartılarak. bunlar doğrudan tartılıp. 1 litre damıtık su içinde çözülür ve gerekli büyüklükteki cam kaplara dağıtılarak sterilize edilir. # Kuşkusuz. bileşimine 2 madde giren Nutrient Broth ile bileşimine 25 madde giren Lysine Medium besiyerleri uç noktalarda örneklendirilen besiyerleridir. pişirilerek "çorba" hazırlanır. En basit olarak. bunlar arasında 0. Besiyeri hazırlamak ise. 4 . # Nutrient Broth gibi basit bir besiyerine giren maddeler. besiyeri bileşimine giren maddeler ayrı ayrı tartılarak. # Alicyclobacillus spp. 1 litre damıtık su içinde çözülür ve yukarıdaki işleme devam edilir. #1950: Granül besiyeri üretimine başlandı. Laboratuvarda hazır dehidre Nutrient Broth varsa. #-Özellikle miligram düzeyinde tartım yapılacak besiyeri bileşenlerinde hata yapma olasılığı vardır. domates çorbası yapmak için yemek kitaplarında miktarları verilerek tarif edildiği şekli ile. bu tip besiyerlerini standart bir mikrobiyoloji laboratuvarında bileşimden hazırlamanın kolay ve günlük uygulamada hiçbir şekilde pratik olmadığı ortaya çıkar. # Besiyerinin bileşimi ister basit. ister kompleks olsun. bileşimden hazırlamak yerine dehidre hazır besiyeri kullanmanın 3 önemli üstünlüğü vardır: #-Her maddeyi ayrı ayrı tartmak yerine hazır besiyerinden 1 kez tartım yapmak çok daha kolay ve güvenilir bir uygulamadır. Örneğin. # Ancak. EMB Agar. üzerine domates suyu. Oysa bu maddeler hazır dehidre besiyerleri içinde homojen dağıtıldıklarından tartımlar çok daha güvenilir olur. süt ve tuz ilave edilir. Mikrobiyolojik amaçla kullanılacak bir besiyerinin hazırlanması çok basit olarak mutfakta çorba yapmaya benzetilebilir. Dolayısı ile. yabani maya izolasyonu ve sayımında kullanılan Lysine Medium besiyerinde 25 madde olduğu. hazır toz haldeki domates çorbası belirli miktarda su ile pişirilir.#1916: Holt-Harris ve Teague. Laboratuvarda pepton ve et ekstraktı varsa.03. evde yemek yapmaktan çok farklı değildir. çoğu mikrobiyoloji laboratuvarında her zaman "el altında" bulunur.
20 gram gerekiyorsa Mol ağırlığı 228 olan maddeden 0. MgSO4. Pazarda düşük fiyatla satılan. bu düşüş doğrudan besiyeri performansına yansıyacaktır. Laboratuvarda bulunabilen bu bileşenlerin tümünün yeterli performans göstermesi beklenmemelidir. 0. # 03. S: 32.02. o madde ile hazırlanan besiyerinin performansında kayda değer ölçüde kayba. aşağıda verilen 2 koşulda besiyerinin bileşim üzerinden hazırlanması bir anlamda zorunludur: #-Her besiyerinin ticari olarak pazarlanan dehidre hazır besiyeri formu yoktur.6H2O'da ise. Ayrı ayrı tartılan bileşenlerden birisinin dahi özelliğini yitirmiş olması. Buna göre bileşenlerin bir ya da bir kısmının performansında kayda değer düşme olmuş ise. bu nedenle cazip gösterilen. ancak kayda değer düzeyde performans eksikliği olan markaların bulunduğu da dikkate alınmalıdır. Genel olarak önerilen bir yöntem olmamakla birlikte.38 g/L MgSO4. Özellikle yeni geliştirilen besiyerleri -güvenilirliklerini kanıtlayana ve/veya yeterli pazarlama potansiyeline ulaşıncaya kadar.03.6H2O'da bulunan sudan kaynaklanmaktadır. # Buna göre. Laboratuvarın kimyasal madde deposunda MgSO4 yok. # MgSO4'ın molekül ağırlığı Mg: 24.2 g/L olarak verilmektedir.01. # İkinci aşamada basit orantı kurulur: Mol ağırlığı 120 olan maddeden 0. laktik asit bakterileri için kullanılan MRS Agar besiyerinin formülünde MgSO4 0. # Burada dikkat edilmesi gereken konu kalitedir.6H2O varsa molekül ağırlığı üzerinden hesaplanarak kullanılabilir.2 g/L MgSO4 yerine 0. # Örneğin. ama bunun yerine MgSO4. # 5 .38 gram gerekir. # Besiyerinin bileşimden hazırlanması gerektiğinde. O: 16 (4 atom oksijen olduğuna göre 4 X 16= 64) olmak üzere 120 mol gramdır. # Besiyerlerinin bileşimine çok genel bir ortalama olarak 5–7 madde girer.6H2O kullanılması aynı anlama gelmektedir. Aradaki fark MgSO4.03. hatta o besiyerinin tümüyle kullanılamaz hale gelmesine yol açar. Özellikle organik bileşenlerin depolanma ömürleri anorganik maddelere göre çok daha kısadır. bazen bileşime giren malzemelerin tümü formülde verildiği şekli ile laboratuvarda bulunmaz. #-Özellikle çeşitli bilimsel araştırmalarda yeni ve modifiye besiyeri çalışmaları için bileşenlerin ayrı ayrı kullanılması gerekmektedir.besiyeri üreticisi firmalar tarafından dehidre halde hazırlanmamaktadır. ilave 6 su olduğuna göre molekül ağırlığı 120 + 108= 228 mol gram olarak hesaplanır. # 03. Formülden Hazırlama # Yukarıda çeşitli örnekleri verildiği gibi besiyeri bileşenlerinin ayrı ayrı tartılarak besiyerinin hazırlanma şeklidir. Dehidre Besiyerlerinden Hazırlama # Besiyeri üreticisi firmalar tarafından üretilmiş dehidre besiyerleri kullanımının tartışılmaz bir üstünlüğü vardır.#-Hazır besiyeri kullanmanın en önemli üstünlüğü -hatta bir diğer deyiş ile zorunluluğubileşenlerin performansı ile ilgilidir.
steril dehidre besiyerini. Kullanıma Hazır Besiyerleri # 1950'li yıllardan bu yana. su örneğinin membran filtreden geçirilip. Bu tip besiyerlerini kullanmak işletme laboratuvarında büyük kolaylık sağlamaktadır.04. Bunların bir yüzü maya–küf. Serum içine steril koşullarda ilave edilen besiyeri kolaylıkla erir ve inkübasyon sonunda bulanıklık oluşursa serumun steril olmadığı anlaşılır. steril olması gereken sıvı ile çözerek bir çeşit besiyeri hazırlamaktır. besiyerinin konsantrasyonu yarı yarıya azalır ve burada sağlıklı bir mikrobiyel gelişme olmaz. ve 22. Membran filtrasyon sisteminde bazı sporlar ile Hydrogenophaga pseudoflava (Syn.03. dilüsyon şişesi.03. coli aranması ya da sayılması için en yaygın uygulamalardan biri. bu filtrenin uygun bir katı besiyerine yerleştirilerek inkübasyona bırakılmasıdır. aşağıda verilen kullanım amaçlarına yönelik olarak özel hazırlama şekilleri de bulunmaktadır. Burada. Bu hazır besiyerlerinin 2 farklı yüzünde 2 farklı besiyeri bulunan tipleri aynı örnekte hem toplam bakteri hem de koliform grup bakteri analizine olanak sağlamaktadır. Bölümde anlatılmıştır. başta sayım ve var/yok testlerinde kullanılmak üzere çeşitli amaçlarla membran filtreler kullanılmaktadır. Bunlar.02. iki ya da üçe bölünmüş kutularda farklı besiyerleri de bulunabilmektedir. 10 mL gıda örneği (homojenizat) ilave edilecek tüplerde.1µ porlu membran filtrelerden geçebilir ve bu nedenle membran filtre tekniği ile bu gibi bakterilerin varlığı fark edilemez. vida kapaklı tüp ve şişelerde sıvı ve katı besiyerleri ile oldukça yaygın olarak Petri kutularında agarlı besiyerleridir. # 03. # Kullanıma hazır besiyerleri içinde bir diğer yaklaşım gama radyasyonu ile sterilize edilmiş dehidre besiyerleridir. Işınlanmış Tryptic Soy Broth yönteminde ise böyle bir olumsuzluk yoktur. Aynı yaklaşım ile.03. 07. Bölümlerde verilmiştir. Genellikle. coli ile enterokok analizinde kullanılan ReadyCult sistemi sırası ile 12. plastik Petri kutularında hazırlanan agarlı besiyerleri sadece tek çeşit besiyerini içerebileceği gibi.03. # Mikrobiyolojide. Bu besiyerinin neden hazır halde sağlanması gerektiği ve bu uygulamanın neden daha ucuz olduğu 10. steril kap içinde. Bunlara ilaveten. bu amaçla hazırlanmış özel besiyerleri de kullanılabilir. Bunun önüne geçmek için. Bu testin mantığı. sularda koliform grup bakteri ve E. diğer yüzü toplam bakteri vb. Özel Uygulamalar # Standart bir gıda mikrobiyolojisi laboratuvarında kullanılan besiyerlerinin tamamına yakını tüpte ya da erlende (balon.01. genellikle serum gibi steril olması gereken tıbbi malzemede sterilite testi yapmak için kullanılır. Bu tip besiyerleri uygun bir pede emdirilmiş. # Yüzey kontaminasyonlarının belirlenmesi ve/veya kültürlerin taşınmasında kullanılan hazır agar slaytları da bulunmaktadır. kurutulmuş ve plastik bir kutu içine konularak sterilize edilmiş bir şekilde pazarlanmaktadır Kullanıcı için yapılacak tek işlem pedi steril su ile ıslatmak ve filtreyi bu pede yerleştirerek inkübasyona bırakmaktadır.03. amaca uygun bir şekilde hazırlanmış ve Petri kutusuna dökülmüş bir katı besiyeri kullanılabileceği gibi. içme ve kullanma sularında E.01. Bunlardan ışınlanmış Tryptic Soy Broth. bazı besiyeri üreticisi firmalar tarafından kullanıma hazır halde besiyerleri üretilmekte ve pazarlanmaktadır. Bölüm) 10 mL besiyerine 10 mL örnek aktarıldığında. Bunlar içinde en yaygın kullanılanlardan biri Kanlı (Blood) Agardır.) broth formunda ve Petri kutularında agar formunda hazırlanır. # Çift kuvvetli broth: EMS ile yapılan sayımda (bakınız. Pseudomonas pseudoflava) gibi küçük bakteriler ve Acholeplasma laidlawii gibi mikoplazmalar 0. çeşitleri de vardır. Örneğin. başlangıçta bu besiyerleri çift kuvvette (2 misli konsantrasyonda) 6 . vb.
Temel amaç. dökme yönteminde besiyerinin tam jelleşmesinden sonra. Çift kuvvetle hazırlanması gerektiğinde. Buna göre 100 mL kadar agarlı besiyeri ile birlikte sterilize edilir. Örneğin. Bu işlem. # Şekil 03. yayma yönteminde ise besiyerinin yayılan kültürü tam emmesi için 10 dakika beklendikten sonra üzerine 4–5 mL kadar ikinci kat besiyeri dökülür.5 g/L konsantrasyonda hazırlandığında. İnkübasyon sonrası yıkama ile kültür elde edilir. başlangıçta 71 g/L (0. pek çok amaçlarla kullanılan agarlı besiyeridir. kültür Şekil 02. bunun üzerine 10 mL örnek konulduğunda LST konsantrasyonu 0. Salmonella spp. Yüzey alanı 250 cm2 kadardır. Amaç. analizinde kullanılan Triple Sugar Iron Agar en tipik örnektir. tüpte geniş bir yüzey elde etmektir. koliform grup bakteri analizinde kullanılan LST Broth besiyeri normal olarak 35. kısmi bir mikroaerofil ortam yaratmaktır. Besiyeri hazırlanırken. Başta basiller olmak üzere aerobik bakteriler bu ortamda yine gelişir. Otoklav sonrasında düzgün bir yere yatırılarak agarın donması Üstten görünüş sağlanır. 10 mL tüp içinde 0.71 g/10 mL) olarak hazırlanır. Geniş ağzından sürtme (svap) çubuğu yardımı ile yoğun bir inokülasyon yapılabilir. Otoklav sonrasında besiyeri henüz sıvı iken tüpler bir çubuk üzerine yatırılarak katılaşması sağlanır. # 7 .355 g madde vardır. çok miktarda mikroorganizma kültürü elde etmek amacı ile kullanılır. Eğer toplam bakteri analizinde çift kat ekim yapıldı ise analiz raporunda bu durum belirtilmelidir. standart tüpün içine ters olarak yerleştirilen ve Durham tüpü olarak adlandırılan küçük tüplerde gaz birikimiyle anlaşılır. #########(+)###(–) Standart otoklavlamada tüpte kalan hava çıkar. Yayma ya da dökme yöntemiyle standart ekimde. Bu aşamada dikkat edilmesi gereken husus. Bu tip ekimler için yeteri büyüklükte tüp kullanılmalıdır. Roux Şişesi Roux Şişesi: Genel olarak. hasat Karşıdan görünüş (harvesting) olarak da adlandırılır. Durham Tüpü bakterilerin analizinde laktozdan gaz oluşumu tipik bir reaksiyondur. tüplerin dip kısımlarının yaklaşık 2.71 g/10 mL'den 0. Standart deney tüplerine 7 mL olacak şekilde tam olarak eritilmiş agarlı besiyeri dağıtılır ve otoklavlanır.5 cm derinliğinde olmasıdır. üzerine besiyeri ilavesi ile sterilizasyon öncesinde daha az hava kalması sağlanır.hazırlanır. Yatık Agar Hazırlanması koleksiyonu vb. Bu uygulamada genellikle aynı besiyeri kullanılmakla beraber. # Tüpte yatık agar: Tanımlama. standart tüpün içine önce Durham tüpünün atılması. Bu amaçla toplam bakteri sayımında da çift kat ekim yapılabilir. özel çalışmalar amacıyla farklı bir besiyeri de kullanılabilir. Besiyerinde gaz çıkışı. # Durham tüpü olan besiyerleri: Koliform grup Şekil 04. Çift Kat Ekim: Koliform grup bakteri ekiminde yaygın olarak uygulanır. ancak yayılıcı koloni oluşturamazlar.355 g/10 mL standart değere iner.
Besiyeri Bileşimine Giren Maddeler # Besiyerleri hazırlanırken amaç. bu su ısıtılarak CO2 uzaklaştırılır ve pH yeniden kontrol edilir.01. Bunların dışında yine gerektiğinde indikatörler. gıda mikrobiyolojisini ilgilendiren ve günlük (rutin) olarak analizleri yapılan mikroorganizmalar bu tip maddelere genellikle duyarlı değildir. Depolanmış saf su atmosferik karbondioksitin absorbe edilmesi sonucu asit pH gösterir. # İnhibitörler ise gelişmesi istenmeyen mikroorganizmalar için gerektiğinde selektif besiyerlerine ilave edilir. # 03. c)Diğerleri olmak üzere 3 gruba ayrılabilir. Bütün besin öğelerini oldukça fazla miktarda sağlayarak. # Gerek deiyonize gerek damıtık su elde edilmesinde saf su sisteminin ve benzer şekilde saf suyun depolandığı kapların belirli aralıklarla temizlenmesi gerekir. ilişkili bir amino asidin gelişme için kullanımını baskılayabilir. Eğer pH hala düşük ise. b)İnhibitörler. jelleştiriciler vb. başta bakır olmak üzere toksik metalleri içermemesi gerekir. # Besiyeri bileşimine giren maddeler gelişme açısından. Gelişme için gerekli olan maddeler doğrudan mikroorganizmaların beslenme şekilleri ile ilgilidir ve besiyeri içinde bir anlamda zorunlu olarak bulunur. NaOH ile nötral pH'ya getirilir ve saf su sistemi kontrol edilir. Dolayısıyla bu analizler için. cam sistemlerden elde edilen suyun kullanılmasıdır. Su # Besiyeri hazırlamada kullanılan suyun damıtma veya deiyonizasyon ile taze hazırlanmış olması. Bu gibi bakterilerle çalışıldığında suyun çok özenle hazırlanması gerekir. a)Gelişme için gerekli olanlar. Bu kaplarda zamanla alg gelişimi olabilir ve alg metabolitleri bazı duyarlı mikroorganizmaların gelişimini baskılayabilir.04. Damıtık (distile) su için en ideali. doğal kaynak suları besiyeri hazırlanması amacıyla kullanılabilir. Glikoz dahil olmak üzere tüm besin öğeleri. Ancak.5–7. # Taze hazırlanmış saf suyun pH'sı 6. Tersine olarak. Eğer saf suyun pH'sı 5. # Suyun çok kireçli olduğu bölgelerde damıtık su elde edilmesi bazen sorun olmaktadır.04. hedef organizmanın gelişmesini optimize edecek konsantrasyonlarda gerekli besin maddelerinin dengelenmiş karışımını sağlamaktır. Besiyeri hazırlamada kullanılan su asidik özellik gösteriyorsa ve besiyeri bileşimde bikarbonat tamponlar varsa. # Örneğin.5 arasında olmalıdır. konsantrasyonları arttıkça baskılayıcı etki yaparlar. olabildiğince zengin bir besiyeri yapma yaklaşımı ile optimal besiyeri elde edilemez. doğal kaynak suları bu amaçla kullanılıyor ise belirli aralıklarla (örneğin üç ayda bir) kullanılan 8 . bunları etkileyerek hazırlanan besiyerinde bir takım olumsuzluklara yol açabilir. İyon değiştirici reçineden geçirilerek elde edilen deiyonize (demineralize) su kullanıldığında bunun içinde yüksek sayıda mikroorganizma bulunabileceği dikkate alınmalıdır.03. pek çok madde de besiyeri bileşimine girer. # Özellikle klinik ve veteriner mikrobiyolojiyi ilgilendiren bazı bakteriler. besiyeri hazırlamada kullanılan suyun içindeki safsızlıklara karşı çok duyarlıdır. aminoasitlerin dengelenmemesi ve bir amino asidin fazla olması. Bu gibi yerlerde besiyeri hazırlamada doğal kaynak sularının kullanılması mümkündür.5'in altında ise.
kullanılacak su. Bu terim ilk kez R. # Proteinler. bu kriterlerden en az birisini sağlamalıdır.000 kob/mL'den. Bu kriterler sağlanamıyor ise. pepsin ve pankreatindir. Dolayısı ile değişik amaçlar için farklı peptonlar kullanılır. Cu.000 kob/mL'den az olmalıdır. Peptonlar # Pepton terimi. kemoorganotrof mikroorganizmaların kısmen parçalanmış (hazmedilmiş. # 03.05 mg/L'yi ve metaller toplamı 0. # Peptonlar. Ni ve Zn) için yapılan analizde. Aminoasitler birbirlerine peptit bağları ile bağlanırken 1 molekül su açığa çıkar. eğer su depolanmış ise 10. # Besiyeri hazırlamada kullanılan suda ayda bir olarak yapılacak ölçümlerde toplam bakteri sayısı 1. kuvvetli asitler ve kuvvetli alkaliler ile ya da enzimatik olarak temel bileşenleri olan peptit ve aminoasitlere ayrışır. besiyeri hazırlamada kullanılan suyun besin maddelerini ya da inhibe edici maddeleri içermemesi. proteinleri azot kaynağı olarak kolaylıkla kullanamaz. çok daha kolay kullanabildikleri protein hidrolizatlarından sağlar. Bu deneme basit olarak. Nägeli. Buna göre.04. Bu amaçla en çok kullanılan proteolitik enzimler papain. # Peptonlar sadece azot değil. en az 300. Birden fazla kriter test edildiğinde bunlardan birini sağlıyor. ancak diğer(ler)ini sağlamıyorsa bunun nedeni araştırılmalıdır.suyun -ya da bu su kullanılarak hazırlanmış besiyeri örneklerinin. Bu nedenle azotlu bileşikleri. sütten ve soyadan farklı yöntemlerle elde edilir ve farklı ticari isimlerle pazarlanır ve/veya dehidre besiyerleri içine katılır. Bunun yanında. ütü suyu gibi adlarla satılan suların kaynağı ve elde ediliş şekli bilinmedikçe kullanılmalarından olabildiğince kaçınılmalıdır. Koch'un çalışma arkadaşlarından Nägeli tarafından 1880 yılında kullanılmıştır. birçok ticari firma tarafından çeşitli hayvansal dokulardan. proteinlerin hidrolizi ile elde edilen ürünlere verilen genel isimdir. karbon. Cr. aynı gıda örneğinden iki farklı besiyerine ekim ve sayım sonuçlarının karşılaştırılması şeklindedir. aminoasit zincirlerinden oluşmuş makro moleküllerdir. # Kaynağı ne olursa olsun. İstisnalar dışında.02. # Ham madde ve üretim yöntemi farklılığı doğal olarak peptonların bileşimlerinde de farklılıklar oluşturur. her bir metal 0.1 mg/L'yi geçmemelidir. Benzer şekilde toplam klor kalıntısı negatif ya da kullanılan testin belirleme sınırından daha az olmalıdır. karbon kaynağı olarak da mikroorganizmalar tarafından kullanılır. # Yaşayan tüm hücrelerde olduğu gibi mikroorganizmalar da azot.000 Wcm direnç ve en fazla 10 mS (microSiemens) kondüktivite (iletkenlik) göstermesi.5 megohm/cm ya da kondüktans 2. Burada değinilen fiziksel değerler farklı kaynaklardan elde edilmiştir. Proteinler.0 umhos/cm'den daha az olması gerekir. Yılda bir kere toplam metaller (Pb.bir dış laboratuvara gönderilerek standart şekilde hazırlanmış besiyerine karşı performans denemesi yapılmalıdır. Cd. 25 °C'da rezistans 0. Peptit bağlarının kuvvetli asitler 9 . tuzlar ve diğer besin maddelerine gereksinim duyarlar. peptonların bileşiminde bulunan bazı aminoasitler ve vitaminler de bazı mikroorganizmalar için gelişme faktörü olarak oldukça önemli işlev görür. düzeltici ve tekrarını önleyici faaliyet (eylem) yapılmalı ve kayda geçilmelidir. mikroorganizma gruplarının oldukça büyük bir bölümü. sindirilmiş) protein içeren besiyerinde iyi geliştiklerini açıklayan ilk bilim adamıdır. Akü suyu.
Maya Ekstraktı # Maya ekstraktı (maya özütü. yüksek basınç ve yüksek sıcaklık altında tam olarak kırılması. Besiyerlerinin bileşiminde farklı peptonlar kullanılabilirken. pepton bünyesindeki vitaminler ciddi ölçüde zarar görür. # Besiyeri formülden hazırlanmak zorunda ise. Bu nedenle. # Aksine bir belirtme yoksa. vitaminler. pancreatic) anlaşılır.04. formülde verilen peptonun kullanılması gereklidir. Buna karşın. asparagin ve glutamin etkilenmez. serin ve treonin zarar görürken. Dolayısıyla. kuvvetli asitler ile peptonların elde edilmesinde peptit bağlarının tümden değil. asidik reaksiyon ile hidrolize edilir. # Mikrobiyolojinin değişik alanlarında farklı peptonlar kullanılır. Bu işlem sırasında bazı aminoasitler (örneğin triptofan) tümüyle kaybolur.pepton bileşimine daha az zarar verir. Pek çok bakteri.03. Kullanılan enzimler peptit bağlarına özel olup. yüksek B kompleks vitamini konsantrasyonu sayesinde çoğu mikroorganizmanın iyi bir şekilde gelişmesini sağlar. # Bileşimindeki aminoasitler. peptitler. sadece bu bağlarda parçalanmaya neden olur. Bu pepton ticari firmalar tarafından farklı isimlerle anılır. Benzer şekilde. Bazik olarak elde edilen peptonun ticari üretimi yoktur. aşı üretimi için bitki kökenli peptonlar uygun değildir. pankreatin enzimi ile hidrolize edilmiş et peptonu (Peptone from meat.belirli düzeyde parçalanarak peptonlar elde edilir. # Peptonlar mikrobiyolojide tek başlarına besiyeri olarak kullanılabilen ender maddeler arasındadır. # Proteinlerin enzimatik olarak parçalanması -asit hidrolizine göre.kullanılarak. mikrobiyolojide "pepton" denildiğinde. karbohidratlar ve mineraller nedeniyle pek çok mikrobiyolojik çalışmada besiyeri katkısı olarak kullanılır. proteolitik olarak otolize edilmiş (parçalanmış) bira mayasının (Saccharomyces cerevisiae) sulu ekstraksiyonu ile elde edilir. yeast extract). Sadece kazein. Teorik olarak farklı enzimler kullanılarak. proteini oluşturan tüm aminoasitlere kadar parçalanma mümkün ise de bunun pratik bir önemi yoktur ve besiyeri bileşiminde kullanılacak proteinler sadece -amaca uygun şekilde. bitkisel peptonlar enzim üretiminde başarılı bir şekilde kullanılabilir. Bu işlem sırasında karbohidratlar ile aminoasitler arasında meydana gelen bir seri reaksiyon sonunda oluşan bazı kimyasallar. Özellikle. sistin. # Günümüzde ticari olarak üretilen ve pazarlanan peptonların hemen hemen tümü enzimatik olarak elde edilmektedir. bileşimi sadece %1 pepton olan besiyerinde kolaylıkla geliştirilebilir. Son zamanlarda BSE tehlikesine karşı bazı ticari firmalar hayvansal dokulardan elde edilen peptonların BSE içermediğine ilişkin sertifika vermektedir. mikroorganizma gelişimi için toksik olur. mikroorganizma için yeterli azot kaynağı sağlayacak düzeyde -sadece bir kısmınınkırılması hedef alınır. # 10 . Karbohidrat içermesi nedeniyle karbohidratlardan asit oluşturma testlerinde kullanılmaz. # # 03. elde edilen peptonda kullanılan enzimin çeşidine göre protein parçalanma ürünü olan polipeptitler bulunur. böylece proteinin tümüyle kendisini oluşturan aminoasitlere dönüştürülmesi mümkün değildir.
05. Agardaki agaroz oranı en çok %75'e kadar çıkabilir. Bileşiminde bulunan agaroz ve agaropektin adlı iki polisakkarit. Böylelikle B kompleks vitaminleri korunmuş olur. Agar bir poligalaktozid olup. Bileşiminde ayrıca inorganik tuzlar. pneumokoklar. Mikrobiyolojik kullanım amacıyla en iyi kalitedeki agar Gelidium türünden elde edilir. besiyeri bileşimine sadece jelleştirici olarak katılır.mikroorganizmalar tarafından besin maddesi olarak kullanılamaz. Çoğu kez diğer agarlı besiyerleri ile karıştırılmaması için "agar agar" olarak anılır. Ayrıca. Özel çalışmalarda saf agaroz kullanılır. # 03. agarın etkisini belirler.Maya ekstraktı üretiminde otoliz düzeyi sürekli olarak kontrol edilir ve otolitik aktivite ısıtma ile durdurulur. Et Ekstraktı # Et ekstraktı (et özütü. Karbohidrat içermez. Başta maltoz olmak üzere. Gerekirse bu çözelti çeşitli peptonlar ile desteklenebilir ve/veya asitlendirilebilir ve/veya agar ve pepton eklenerek Malt Extract Agar şeklinde katı besiyeri olarak kullanılabilir. Uzun ve dallanmış zincir yapısı nedeniyle -bir kaç istisna dışında. # 03. ekstraksiyon öncesi hafifçe hidrolize edilmiş etten elde edilir. Eucheuma. Bazı hidroksil grupları sülfürik asit ile esterleştirilmiştir. çok az miktarda protein benzeri maddeler ve eser miktarda yağ vardır. Malt Ekstraktı # Malt ekstraktı (malt özütü. %1. # Agar. Agar # Besiyerlerinin katı hale getirilmesi için en çok kullanılan jelleştiricidir. # Agarın katılaştırma (jelleştirme) özelliğini bileşimindeki D-galakton sağlar. meningokoklar. "Agarophytes" olarak adlandırılan bazı kırmızı deniz yosunlarından (Gelidium.06.07.04. Çeşitli besiyerlerinde et peptonlarının yerini alabilir. gibi zor gelişen (fastidious) patojen bakterilerin geliştirilmesi için Brain Heart Broth ve Brain Heart Infusion gibi isimlerle anılan besiyerlerinin bileşimine katılır. genellikle yağı ve tendonları ayrılmış. biralık arpanın çimlendirilmesi ve kavrulması ile elde edilen malttan üretilir.04. gonokoklar vb. meat extract). agaropektin viskoz özellik verir. Agaroz. malt extract). Gracilaria.04. Pterocladia türleri) elde edilir. Agardaki agaroz/agaropektin oranı ham maddeye göre değişir. # 03. Gıda sanayisinde de jelleştirici olarak kullanılan agar. çeşitli toksin testleri için patojenlerin bu besiyerinde geliştirilmesi önerilmektedir. Beyin ve Kalp Ekstraktı # Beyin ekstraktı (brain extract) ve kalp ekstraktı (heart extract) streptokoklar. Bu nedenle karbohidratlardan asit oluşturma testlerinde kullanılabilir. # 11 . çeşitli karbohidratların yüksek konsantrasyonuna bağlı olarak maya ve küflerin geliştirilmesi için kullanılır. Mikrobiyolojide kullanılan agarlar özel olarak saflaştırılarak antimikrobiyel maddeler ve pigmentlerden arındırılır. # 03. yeteri kadar saf olmadığı için mikrobiyolojik analizlerde kullanılamaz.7 konsantrasyondaki çözeltisi maya ve küflerin geliştirilmesi için uygun bir besiyeridir. agarın yüksek jelleştirme özelliğinden sorumlu iken.04. Ahnfeltia.04. Acanthopeltis.
gerekli miktar asit ilave edilir.04. Daha yüksek agar konsantrasyonu bu olumsuzluğu gidermek içindir. melezitoz. laktoz. dulsitol. laktoz sakkaroz. laktoz ve sakkarozdur. Bu şekilde hazırlanmış besiyerleri tekrar eritilirse agar jelleşme özelliğini tümüyle yitirir. # 03. dekstroz (glikoz). ramnoz. # Agarın jelleşme sıcaklığı literatürde 32–39 oC olarak verilmektedir. galaktoz. # Nişasta kullanımı (hidrolizi) bazı bakteriler için tipik olduğundan çeşitli özel besiyerlerinin bileşimine katılır.5'tir. mannitol gibi bazı karbohidratlar çeşitli katı besiyerlerine yine karbohidratlardan asit oluşumunun izlenmesi ve buna göre koloninin ön identifikasyonu amacı ile katılır. # Adonitol. mannitol. Karbohidratlar # Bazı besiyerlerinin bileşimine bakteriler için enerji ve karbon kaynağı olarak katılan karbohidratların bir başka kullanım şekli karbohidratlardan asit oluşturmaya dayalı identifikasyon testleridir (bakınız. # Glikoz. Koliformların analizi için hazırlanmış sıvı besiyerlerinde laktozdan gaz oluşumu bu grup için belirleyicidir. inositol. pH'sı 5 ve daha altında olacak ise. # Koliform grubu bakterilerin geliştirileceği besiyerlerinin hemen hepsinde karbon kaynağı olarak laktoz kullanılır. # Besiyerine amaca göre %0.3) genellikle hareketliliğin belirlenmesi. inulin.Yaklaşık olarak 85–90 oC'da erir. Standart kullanım konsantrasyonu %1–1. 03. sakkaroz (sukroz). maltoz. Besiyeri pH'sını etkilemez. sakkaroz gibi şekerler besiyeri ile birlikte otoklavda da sterilize edilebilir. ancak düşük pH'dan olumsuz şekilde etkilenir. sorbitol. Döküm sırasında Petri kutularının oda sıcaklığında (20 oC) olduğu ve dolayısıyla Petri kutusu ile besiyeri arasında ısı değişimi olacağı dikkate alınarak döküm sıcaklığının 40–45 oC kadar olması gerekir. # 12 . Düşük agar konsantrasyonları (%0. levuloz (früktoz). Yukarıda da belirtildiği gibi agar yüksek sıcaklıkta yüksek asitlikten olumsuz etkilenir.08. 37. bu besiyeri nötral pH'da otoklavlanır ve 45 oC'a soğutulup. Çeşitli besiyerlerinin bileşimine katılan glikoz. # Genel olarak karbohidratların çözelti halinde filtrasyon ile sterilize edilmesi önerilir.04. nişasta. rafinoz.05–0. sellobiyoz. Gerek erime gerek jelleşme sıcaklığına besiyeri pH'sı etkilidir.03. mannoz. 40–45 oC'da jelleşir. laktoz. Bölüm). arabinoz. Yüksek konsantrasyonlar ise yüksek asitli besiyerlerinde agarın jelleşme özelliğini koruması amacıyla kullanılır. Gaz çıkışı basit olarak Durham tüpü ile belirlenir (bakınız. selüloz.07. melibiyoz. trehaloz ve ksiloz çeşitli karbohidrat testlerinde kullanılmak üzere çoğunlukla sıvı ya da katı besiyerlerine katılabilmektedir. mikroaerofil karakterdeki bakterilerin geliştirilmesi gibi özel amaçlarla kullanılır. # Besiyeri bileşiminde karbon kaynağı olarak en çok kullanılan karbohidratlar glikoz. Bunlardan glikoz pek çok bakteri tarafından kullanılabildiği için. daha çok genel besiyeri bileşimlerinde yer alır. salisin.05–2 gibi geniş bir sınırda ilave edilebilir. Bölüm). 6'dan daha düşük pH'ya sahip besiyerlerinde genel olarak daha fazla agar kullanılır.
85 NaCl. belirli pH aralığında tutmak üzere "pH–stat" denilen sistemlerle dışarıdan asit ya da baz ilavesi ile yapılır. # Metabolizmaya bağlı olarak besiyeri pH'sında değişmeler meydana gelir. # Örnek: pH'sı 5. geliştirilmesi istenen mikroorganizmaya zarar vereceği için istenmez. # 03.90 olan tampon çözelti hazırlanmak isteniyorsa. Skim Milk besiyerine 1 g/10 mL kalsiyum karbonat ilavesi ile laktik asit bakterilerinin oluşturduğu asitlik kayda değer ölçüde tamponlanır. Bazı mikroorganizmalar alkali pH'ları yeğlerken (örneğin Rhizobium bakterileri). # Tampon (buffer) olarak en çok kullanılan maddeler.04. Çoğu besiyerinin bileşimine izotonik bir ortam oluşturmak için katılır. Na2HPO4. Bu miktar "B" çözeltisinin (Na2HPO4) üzerine 100 mL'ye 13 . Buna karşın bileşiminde pepton yanında karbohidrat da olan besiyerinde karbohidrat tükenmediği sürece pH düşer. besiyerlerine selektivite kazandırmak amacıyla.067 M Na2HPO4 (11. Buna göre. pH değişiminin minimumda tutulması amacıyla besiyerine çeşitli tampon maddeler ilave edilir.866 g/L Na2HPO4).10.04. Tuz # Aksine bir belirtme yoksa "tuz" denilince sodyum klorür anlaşılır.03. # Asitlik/alkalilik. besiyeri pH'sı bu mikroorganizmanın gelişebileceği pH'ya ayarlanmalıdır.80 mL bulunur. ß gliserofosfat).0 arasında tampon çözelti hazırlamak için kullanılan tamponlar gösterilmiştir.09. çok kolay ve dolayısıyla çok yaygın olarak kullanılan bir faktördür.90'ın karşılığı olarak 9. # Çizelge 01'de 4. Tersine olarak geliştirilmesi istenen mikroorganizma yüksek asitliğe veya yüksek alkaliliğe dirençli ise. # Tuza dayanıklı (halotolerant) ve tuz seven (halofil) bakterilerin selektif izolasyonu için yüksek konsantrasyonlarda özel besiyerlerinin bileşimine katılır. Bazı çalışmalarda inkübasyon sırasında pH'nın değişmesi. # Büyük ölçekli endüstriyel üretimlerde pH stabilitesi tampon eklenerek değil. # Bir besiyerinde elden geldiğince çok sayıda mikroorganizma geliştirilmesi isteniyorsa pH nötre yakın değerde olmalıdır. Tampon Maddeler # Mikroorganizmalar genel olarak nötr ve nötre yakın pH'larda iyi gelişir. Örneğin maya ve küflerin. asidofilik bakteriler) asidik ortamları severler. serum fizyolojik adı ile seyreltme çözeltisi olarak yaygın olarak kullanılır. Basit olarak. Klinik birimlerde bu ad ile bilinen çözelti de budur ve insan vücudu için de aynı şekilde izotonik denge oluşturur.073 g/L KH2PO4) Çözelti "B": 0. asidofilik bakterilerin geliştirileceği ortamlarda pH düşürülerek pek çok bakterinin gelişmesi kayda değer ölçüde baskılanır.8–8. Sadece pepton olan ortamda geliştirilen bakteriler pH'yı yükseltir. bazıları (örneğin mayalar. fosfatlar (K2HPO4. çizelgeden 5. asetatlar ve sitratlardır. küfler. Çözelti "A": 0.067 M KH2PO4 (9. %0. KH2PO4. karbonatlar.
60 37.1 6.70 43.90 6.12.60 88.90 55. 2.70 6.90 0.2 * : Kaynak: www.1 7.00 96.80 6.0 / sarı 7.50 3. # 14 .org Bu çizelge.40 81.1 6.20 72. # 03.80 49. pH İndikatörleri # Mikrobiyel metabolizma sonunda bazı besiyeri bileşenlerinden çeşitli asit veya alkali ürünler meydana gelir.2 / sarı 8.2 / kırmızı # Bunlara ek olarak kimyasal analizlerde kullanılan pek çok pH indikatörü bulunmakla birlikte.04.35 5. Enterokokların selektif geliştirilmesinde yaygın olarak kullanılır ve buna bağlı olarak besiyeri bileşimlerinde yer alır.10 1. su yerine bu çözelti kullanıldığında besiyeri pH'sı 5.5 5.2 5.4 / mavi Bromocresol purple 5.90 9.kimyaevi. # Aşağıda.3.0 6.40 26.4 6.4 / kırmızı 6.00 12. Ayrıca besiyerinde stabilite. Tampon çözelti hazırlamak için "B" çözeltisinden alınacak miktar (mL) pH "B" pH "B" pH "B" pH "B" pH "B" pH "B" 4. Hazırlanan tampon çözeltisinin güvenilir olması için.4 / kırmızı Bromocresol green 3.8 / sarı 8.30 22.30 2.00 61.2 / sarı Neutral red 6.8 / kırmızı Litmus 5.20 1. besiyeri bileşimine girenler sınırlıdır.0 7.90 6. hedef pH'larda kesin renk dönüşümü vb.0 / sarı Rosalic acid 6.80 0.0 7.9 / mavi Fenol red 6.00 6. # Çizelge 02.3 / mavi Metil red 4. pH'daki değişme en kolay olarak pH indikatörleri ile belirlenir ve bunların renk değişimine bağlı reaksiyonlar o besiyerinde gelişen mikroorganizmalar için önemli göstergeler olur.0 / sarı 4. # Çizelge 01.30 5.6 7. desimali de gösteren şekilde bu sitede vardır.60 4.60 5.6 / kırmızı 8.80 7.90'a tamponlanmış olur.00 0.2 / sarı 6.8 8.04.5 Triphenyl-tetrazolium chloride)'dir.20 18. İndikatör.8 / kırmızı 8. Redoks İndikatörleri # En yaygın olarak kullanılan redoks indikatörü TTC (2.3 7.50 85.2 7. besiyeri bileşimlerinde yaygın olarak kullanılan pH indikatörleri ve pH'ya bağlı renkler verilmiştir.7 7.40 3. öncelikle geliştirilmesi istenen mikroorganizmaya zarar vermemelidir.50 31.10 67.3 / menekşe Bromothymol blue 6. özellikleri de olmalıdır.80 5.90 6.8 / sarı 5. "B" çözeltisi üzerine "A" çözeltisi ekleme işleminin pH metre kontrolü ile yapılması önerilir.6 / mavi Cresol red 7.95 5.5 5.10 15.20 6.30 77.80 93. Besiyeri bileşimine giren maddeler tartılır.70 91. pH İndikatörleri ve Renk Değişim Sınırları İndikatör Asit pH / renk Alkali pH / renk Fenol blue 3.2 7.6 4.20 mL "A" çözeltisi (KH2PO4) eklenir.tamamlayacak şekilde 90.35 5.8 / sarı 8.11. # 03.90 95.4 7.9 5.2 7.
#-MUP (Methylumbelliferyl-phosphate): Cl. # 03.Enterokoklar TTC'yi indirgeyerek kırmızı renkli bir bileşiğe (formazon) dönüştürür. doğrudan koloni rengi değişir ve bu değişim pH'dan etkilenmez. kromojenik substratın hedef bakteri ya da bakteri grubu için özgün olan enzim ile şeker ve kromojene parçalanması. Bu şekilde besiyerinde oluşan kırmızı renkli kolonilerin enterokok olduğu anlaşılır.13. Klasik pH indikatöründen farklı olarak bu sistemde koloni etrafında zon oluşmaz. oksijen varlığında sıvı besiyerinin ya da katı besiyerindeki koloninin renk değiştirmesidir. Gıda mikrobiyolojisinde Listeria tanımlanmasında yaygın olarak kullanılır. Gıda mikrobiyolojisinde Staphylococcus aureus ve Bacillus cereus besiyerlerinin bileşiminde yer alır.05. Çiğ sütlerde metabolizmaya dayalı bir sayım yönteminde kullanılmasına karşın. perfringens için karakteristik olan asit fosfataz enzimi MUP'u yine uzun dalga boylu UV ile floresan ışıma veren bir bileşiğe (methylumbelliferone) parçalar. Lipolitik bakteri kolonileri etrafında lipoliz sonunda berrak zonlar oluşur. E. ve kan hakkında bilgi 40.13. Hemoliz reaksiyonları 37. Bu sistemin prensibi. coli tanımında son yıllarda en yaygın olarak kullanılan bir bileşiktir. Bölümde ayrıntılı bilgi verilmiştir. # # # 15 . 5-bromo-6-chloro-3-indolyl ya da 6-chloro-3indolyl gibi indolil türevleri olan kromojenik substratların kullanımı giderek daha fazla önem kazanmaktadır. Hemoliz reaksiyonunun belirlenmesi için kullanılır. #-Kan: Aksine bir uyarı yoksa besiyeri bileşimine giren "defibrine koyun kanı"dır. bu besiyerlerinde gelişen mikroorganizmaların ön identifikasyonunda kullanılır. # Resazurin.04. Bu konuda 07. #-Kromojenik substratlar: Katı besiyerinde şeker ve pH indikatörüne bağlı selektif izolasyon sistemi yerine. Kazein kullanılan yöntemde ise proteolitik bakteri kolonileri etrafında proteolize bağlı olarak berrak zonlar meydana gelir. MUG hakkında 14. 5-bromo-4-chloro-3-indolyl.06. Bölümde ayrıntılı bilgi verilmiştir. Bu tip reaksiyonlarda kullanılan indikatör örnekleri aşağıda verilmiştir. Floresan ışıma. sütte antibiyotik ya da gelişmeyi engelleyici bir madde bulunması halinde doğru sonuç alınamaz. #-Lesitin: Yumurta sarısı ve soya fasulyesinde bulunan lesitin. yaygın olarak kullanılan bir diğer redoks indikatörüdür. proteolitik bakterilerin belirlenmesi amacıyla besiyeri bünyesine katılır. çeşitli bakterilerdeki lesitinaz enzim aktivitesi sonunda parçalanır ve lesitin katılmış katı besiyerinde koloni etrafında berrak zonlar görülür. #-Jelatin ve kazein: Bunlar. loş bir ortamda belirgin bir şekilde görülür. #-Tributirin: Lipolitik aktivitenin belirlenmesi için kullanılır. Jelatin kullanılan yöntemde inkübasyon sonrası soğutulan besiyerinin katılaşmaması jelatinin hidrolize edildiğini gösterir. Bölümde verilmiştir. Diğer İndikatörler # Mikrobiyel metabolizmaya bağlı olarak bazı kimyasalların çeşitli reaksiyonlar sonucu oluşturdukları belirli ürünlerin saptanması. coli 'deki ß-D-Glucuronidase (MUGase) enzimi MUG'u uzun dalga boylu (366 nm) UV ile floresan ışıma veren bir bileşiğe (methylumbelliferone) parçalar. # #-MUG (4-Methylumbelliferyl-ß-Glucuronide): E.
Örneğin. bu bakteri ile ilgili çalışmalarda besiyeri bileşimine katılır. İnhibitörler # Selektif besiyeri bileşimlerinde. Bununla beraber. # İnhibitör etki. coli O157:H7 serotipi diğer E. Belirli bir madde (örneğin tellurit). Örneğin. sonuçta gri–siyah renkli koloni oluşumu stafilokok ve mikrokoklar için tipik bir morfolojik göstergedir. Örneğin. #-Safra tuzları (Bile salts. coli O157:H7 serotipi ile ilgili çalışmalarda sefiksim yaygın olarak kullanılır. istenmeyen mikroorganizmaların gelişmesini önlemek iken. yüksek konsantrasyonlarda pek çok mikroorganizmanın gelişimini engeller. %50 konsantrasyonda ozmofilik/ozmotolerant mayaların gelişimine izin verirken. Salmonella besiyerlerinin çoğunda bulunur. #-Antibiyotikler: Genellikle bakterileri engellemek için geniş spektrumlu olarak küf geliştirme besiyerlerinde ya da refakatçi bakteriyel florayı inhibe etmek için dar spektrumlu olarak kullanılırlar. bazı bakteriler için inhibitör etki yaparken. Besiyerinde tek inhibitör yerine. Örneğin. Bunun dışında mikroorganizma cinsi ve hatta türü ile serotipi inhibisyonda önemlidir. birden fazla inhibitör de kullanılabilir. pek çok besiyerine ozmotik basınç sağlamak için katılan NaCl. 16 . # Bir yaklaşıma göre her maddenin yüksek konsantrasyonlarda inhibisyon etkisi vardır.03. İnhibitör olarak kullanılan maddenin görevi. selektif inhibitörler belirli mikroorganizmaların gelişimini etkiler. gelişmesi istenen mikroorganizma için inhibitör etki yapmaması gerekir. kısmen koliformları ve zayıf olarak Shigella 'yı engeller. Ox bile): Gram pozitif bakterilerin gelişimini engeller. malahit yeşili Pseudomonas aeruginosa dışındaki pek çok refakatçi floranın gelişimini baskılar. bazı bakteriler telluriti metalik tellura indirger. Sadece belirli bir türün dışındaki tüm mikroorganizmaların gelişimini etkileyen inhibitör madde kullanımı oldukça enderdir.04. diğer tüm bakteri. Genel inhibitörler daha geniş bir spektrumda istenmeyen mikroorganizmaların gelişimini engellerken. #-Sodyum azid: Gram negatif bakterilerin gelişimini engeller. yukarıda belirtildiği gibi öncelikle konsantrasyona bağlıdır. #-Deoksiçolat (Deoxycholate): Gram pozitif bakterileri. Cetrimide (cetyltrimethylammonium bromide) Pseudomonas aeruginosa dışında pek çok refakatçi florayı inhibe ettiği için Pseudomonas besiyerlerinin bileşiminde yer alır. coli 'ler ve refakatçi floraya oranla sefiksim–tellurit kombinasyonuna kayda değer ölçüde direnç gösterir. eosin Y ve metilen mavisi (methylen blue) Gram pozitif bakterilerin gelişimini. istenmeyen mikroorganizmaların gelişimini baskılayan çeşitli inhibitör maddeler kullanılır. Bacillus cereus refakatçi floraya göre Polimiksin B sülfattan daha az etkilendiği için. E. Benzer şekilde E. # Besiyerlerinde inhibitör olarak kullanılan maddeler genel ve selektif inhibitörler olarak kabaca ikiye ayrılabilir. # İnhibitör olarak kullanılan tüm maddelerin hangi mikroorganizmalar için hangi konsantrasyonda ve hangi mekanizma ile inhibisyon etki sağladığını listelemek çok güçtür ve bu kitabın konu kapsamı dışındadır. İnhibitör maddelerin etki şekilleri çok farklıdır ve güçleri konsantrasyonlarına bağlıdır.14. Mikroorganizma için C kaynağı olarak kullanılan glikoz. en çok kullanılan inhibitörler hakkında aşağıda kısaca bilgi verilmiştir: #-Boyalar: Metakrom sarısı (metachrome yellow) Proteus kolonilerinin yayılmasını. maya ve küflerin gelişimini inhibe eden bir etki gösterir.
bir başka bakış açısı ile kaynağına göre bitkisel.04. sütte bulunan bakteriler için süt tozu. şekillerde de sınıflandırılabilirler. Bunlara en tipik örnek azot kaynağı olarak nitrat (NO3) kullanılmasıdır. "Kanlı Agar" besiyeri bu konuda tipik bir örnek verilmiştir. #-Anorganikler: Mikroorganizmalar beslenme için çeşitli anorganik maddelere de gerek duyar. karışık vb. lauryl sülfat. bizmut. #-Doğal ortam oluşturanlar: Bazı bakterilerin gelişmesini teşvik etmek için onların doğal olarak bulundukları ortamlar besiyerine katılır. sentetik. Kimi araştırıcı ve kullanıcıya göre belirli bir grupta yer alan bir besiyeri. Özel besin maddeleri olarak nişasta ve glutamat da kullanabilir.05. # 03. Tween 80 ve çeşitli elementler ilk akla gelenlerdir. türev. Üre. Örneğin besiyerleri. ornithin vb.) identifikasyon amacı ile besiyeri bileşimine giren maddelerin tipik örnekleridir. birbirinden farklı mantıklar altında gruplandırılabilir. selenit. bir diğerlerine göre başka bir grupta sınıflandırılmaktadır. piruvat. Bunlardan bazıları aşağıda kısaca özetlenmiştir: #-İnaktivatörler: Lesitin. Aşağıda. Bunlar arasında vitaminler. yüksek konsantrasyonda asetat vb. Bunların dışında pek çok kimyasal madde çeşitli fizyolojik ve biyokimyasal testlerde kullanılmak üzere besiyerlerinin bünyesinde yer almaktadır. çeşitli aminoasitler (lisin. ara ürün ve son ürünlerindeki çeşitli antimikrobiyel maddeleri inaktive ederek bu gibi ürünlerde bulunması olası mikroorganizmaların belirlenmesini sağlarlar. Çeşitli makro ve iz (mikro) elementler -başta peptonlar ve ekstraktlar olmak üzere. 17 . Diğer Maddeler # Besiyerlerine çeşitli amaçlarla katılan ve yukarıdaki gruplara girmeyen daha pek çok madde vardır. hayvansal. Tween 80 gibi maddeler başta ilaç ve kozmetik endüstrisinde ham madde.çeşitli besin maddelerinin bileşiminde yeterli miktarlarda bulunmakla birlikte. arjinin. sistein. # Besiyerlerinin kullanım amacına göre sınıflandırılması ise bir anlamda besiyeri bileşimleri ile doğrudan ilgilidir ve sınıflandırmada en yaygın olarak kullanılan uygulamadır.Ayrıca.15. tetratiyonat. #-İndirgeyiciler: Anaerobik ortam oluşturmak için çeşitli maddeler kullanılır. #-Stimülatörler (Gelişmeyi teşvik ediciler): Analiz edilen örnekte gelişmesi istenen mikroorganizmayı teşvik etmek amacıyla besiyeri bileşimine çeşitli maddeler katılabilir. KCN. Tween 20. deniz balıklarındaki bakteriler için deniz suyu besiyeri bileşiminde yer alır. fiziksel özelliklerine göre sıvı ve katı olmak üzere iki gruba ayrılırken. Bunlar arasında ilk akla gelen thioglycollate'tır. #-Özel besin maddeleri: Besiyerleri içinde gelişmesi istenen mikroorganizmanın kullanabileceği. Örneğin. diğerleri için besin maddesi olarak yararlanılamayacak çeşitli maddeler yer alabilir. bu maddeler bazı besiyerlerine mikrobiyel gelişmenin sağlanması için katılmaktadır. maddeler çeşitli besiyerlerinde inhibitör madde olarak kullanılır. Kullanım amacına göre sınıflandırılmalarında da farklı yaklaşımlar vardır. #-İdentifikasyon amacıyla kullanılan bileşikler: Yukarıda ilgili bölümlerde identifikasyon amacıyla çeşitli kimyasalların besiyerleri bünyesinde yer aldığına değinilmiştir. glisin. # # 03. Besiyeri Çeşitleri # Besiyerleri.
# Gıda mikrobiyolojisi açısından ele alındığında. Gıda mikrobiyolojisinde bu tip uygulamalara genellikle gerek duyulmaz. zor gelişen bir mikroorganizma olabileceği varsayımı ile bu tip izolasyonlarda bunların gelişebileceği zenginleştirilmiş besiyerleri kullanmak daha doğru olur. # Bu grupta değerlendirilen besiyerleri genel olarak bakteriler için kullanılır. besin maddelerince yeterli veya zengin. Özel besiyerleri ise kendi içinde farklı alt gruplar altında değerlendirilir. basit olarak korunması vb. Genel Besiyerleri # Herhangi bir inhibitör madde içermeyen. Plate Count Agar. Toplam mezofil aerob bakteri sayısından kasıt 28–30 oC'da (kimi kaynaklara ve amaca göre 35–37 oC'da) gelişebilen aerob bakterilerin sayısıdır.Bu kitapta besiyerleri. bazı zor gelişenlerin de dahil olduğu çok sayıda mikroorganizmanın gelişmesini sağlayan besiyerleridir. bozulma ya da hastalık etmeninin ön izolasyonu gibi amaçlar için kullanılır. # Bir yaklaşıma göre genel besiyerleri dışında kalan tüm besiyerleri "özel besiyerleri" grubuna girer. #-Başta gıda maddeleri olmak üzere pek çok örnekte "toplam mezofil aerob bakteri sayısı" ile "toplam psikrofil aerob bakteri sayısı" tayinleri önemli kalite kriterleridir.01. # Genel besiyerleri. # Genel besiyerleri başlıca toplam mezofil aerob bakteri sayımı. #-Günlük kullanımdaki bakterilerin aktifleştirilmesi. toplam psikrofil aerob bakteri sayımı. coli fajları ile ilgili bir çalışmada genel nitelikli bir besiyeri kullanılabilir. bu besiyerlerinde maya ve küfler de gelişebilir. # 18 . CASO (Tryptic Soy) Agar ve CASO (Tryptic Soy) Broth en sık kullanılan genel besiyerleri içinde yer alırlar. # 03. termofillerin. Nutrient Agar ve Nutrient Broth. etmenin her ne olursa olsun öncelikle izole edilmesidir ve genel bir besiyeri kullanmak bir anlamda zorunludur. #-Nedeni hakkında bir ön fikir edinilemeyen bozulma ya da hastalık etmeninin izolasyonu için de genel besiyeri kullanılır.05. herhangi bir mikroorganizma grubunun gelişmesini özel olarak desteklemeyen. mikroaerofillerin. Buna göre. Genel besiyerleri zor gelişen bakterilerin sadece bir bölümünün gelişmesini sağlayabilir. Bu sınıflama şeklinde besiyerleri öncelikle "genel besiyerleri" ve "özel besiyerleri" olarak iki ana gruba ayrılmaktadır. kullanım amacına göre en çok kabul gören sınıflandırma şekline göre gruplandırılmıştır. amaçlarla da genel besiyerleri yaygın olarak kullanılır. Etmenin. Burada amaç. aerotolerantların ve özel inkübasyon koşullarının sağlanması ile kısmen anaerobların geliştirilmesinde de kullanılır. Klinik mikrobiyolojide farklı gruplardaki zor gelişen bakteriler için genel besiyerlerine başta kan olmak üzere katkılar ilave edilerek zenginleştirmeler yapılmaktadır. Tüm bakterilerin geliştirilebileceği nitelikte bir besiyeri yoktur. inkübasyon koşullarının değiştirilmesi ile psikrofillerin. Benzer şekilde E. Bununla beraber.
Ayrıca. Bir besiyerine selektivite kazandırılması sadece inhibitör madde ilavesi ile yapılmaz. # Kanlı agar üzerinde bir diğer yaklaşım. Selektif Besiyerleri # Selektif besiyerleri. 19 . basit bileşimli bir genel besiyerine kan ilavesi ile hazırlanır. # Nişasta ve glutamat Pseudomonas ve Aeromonas türleri tarafından besin maddesi olarak kullanılırken. gıda maddeleri. gelişmesi istenen mikroorganizmanın belirli bir inhibitöre aşırı direnç göstermesi ile ilgilidir. Cetrimide Agar ise oldukça ender örneklerden birisidir. sadece bir tür mikroorganizmanın gelişebileceği selektivitede besiyeri örneği çok azdır. Geliştirilmesi istenilen mikroorganizmanın kullanabileceği. # Ozmofil mayalar ve halofil bakterilerin analizi için geliştirilen besiyerleri bunların tipik örnekleridir. bazı inhibitörlerin insan sağlığına zararlı olması vb. orta veya yüksek selektivite gösterir. Brain–Heart (Infusion) Broth ve Brain–Heart Agar ile Tamponlanmış Peptonlu Su da genel besiyeri olarak değerlendirilir. Gıda mikrobiyolojisinde elde edilen bir izolatın hemoliz reaksiyonunun belirlenmesi amacı ile kullanıldığında ise identifikasyon besiyeridir. # Selektif besiyeri hazırlamak ve kullanmak. ancak refakatçi mikroflora tarafından kullanılamayan besin maddeleri besiyerine karbon ve azot kaynağı olarak verilerek de selektivite sağlanabilir. inhibitör kullanımı ile refakatçi flora inhibisyonun her zaman mümkün olmaması. selektif besiyerleri bunlar için zayıf. # 03.05. # Mikrobiyolojide besiyeri olarak selektif ortamlar yerine diferansiyel besiyerlerinin hazırlanması ve kullanılması ile çoğu kez tatmin edici sonuçlar alınmaktadır. Bu maddeleri çok kısıtlı olarak kullanabilenler ihmal edilebilecek kadar küçük koloni oluştururlar. # Yüksek selektivite gösteren besiyerleri. Bir klinik örnekten sadece ß hemoliz yapan bakterilerin izolasyonu için kullanılıyorsa bu kez diferansiyel besiyeri olarak değerlendirilir. karışık bir mikrobiyel floradan gelişmesi istenmeyenleri olabildiğince fazla baskılamak. besiyerlerinin kullanım amacına göre farklı gruplarda değerlendirebileceğini gösterir. Bu amaçla genellikle çeşitli inhibitör maddeler kullanılır. klinik mikrobiyolojide standart genel besiyerlerinde gelişemeyen "zor gelişen" bakterilerin izolasyonu için kullanıldığında "zenginleştirilmiş genel besiyeri" olarak değerlendirilir.02. selektif sayım ve hatta ön identifikasyon amaçları ile kullanılabilir. Kanlı Agar ise.minimum düzeyde olumsuz etki yapmak üzere formülize edilir. # İnhibitörlerin konsantrasyonu ile baskılanması hedeflenen mikroorganizmaların cins ve türlerine göre değişmek üzere. Kanlı agar. ancak gelişmesi istenenler için -tersine olarak. atık sular ve gıda endüstrisi ekipmanında bu bakteriler ile birlikte bulunan refakatçi mikroflora bu maddeleri metabolize edemediği için gelişemez. Örneğin. # Bununla birlikte. nedenlerle her zaman istenilen sonucu vermemektedir. gıda sanayisinde Pseudomonas aranması için kullanılan GSP Agar besiyerinde glutamat ve nişastadan başka besin maddesi yoktur. tek cins ya da türde mikroorganizma gelişmesine izin vereceğinden bu besiyerleri selektif izolasyon. Bu gibi örnekler. inhibitörlerin gelişmesi istenen mikroorganizmaya az da olsa bir miktar zarar verebilmesi.
# Diferansiyel besiyerleri sadece selektif besiyerlerinin bir modifikasyonu değildir. indirgeyiciler. enzim aktiviteleri besiyerinde oluşan berrak zonlar ile belirlenebilir. # Hemoliz reaksiyonları için kullanılan kanlı agar besiyeri bunun en tipik örneğidir. # Diferansiyel besiyerleri. lesitinaz vb.04. Diferansiyel (Ayırt Edici. diğer indikatörler vb. Çeşitli genel besiyerlerine ilave edilen özel bazı katkılar bu besiyerlerine diferansiyel bir nitelik kazandırabilir. floresansa dayalı olarak kolayca yapılabilmektedir. çıplak gözle yapılabileceği gibi. EC Broth'a MUG ilave edilerek hazırlanan bir besiyerinde. fekal koliform bakteriler yanında E. 03.05. Gaz görülen tüpte koliform grup bakteri olduğu kesindir.03. coli analizi de floresan testi ile yapılabilir.05. # Ayırt edici koloni özelliği. sıvı besiyerinde sadece hedef mikroorganizmanın var/yok olduğu anlaşılır. Fark Ettirici) Besiyerleri # Diferansiyel besiyerlerinde gelişmesi istenen mikroorganizma yanında diğer mikroorganizmalar da gelişebilir. Buna göre "özel amaçla kullanılan genel besiyerleri" olarak da nitelendirilebilirler. Diferansiyel besiyerinde gelişen mikroorganizmaların ayrımı koloni morfolojisi. Ancak. boya maddeleri. # Ön zenginleştirme besiyerleri genel olarak hasar görmüş (yaralanmış. # Bu besiyerleri sıvı ya da katı olabilir. bileşiminde inhibitör içermeyen. Ayrıca mikroorganizmanın jelatinaz.03. zayıf ve orta güçte selektivite gösteren selektif besiyerlerinin modifikasyonu olarak nitelendirilebilir. Zenginleştirme Besiyerleri # Karışık bir mikroflora içinde hedeflenen bir mikroorganizmayı geliştirmek. Pek çok mikroorganizma belirli bir karbohidratı kullanırken asit oluşturur ve bu asitlik pH indikatörü ile kolayca belirlenebilir. koliform grup bakteriler için laktozdan gaz oluşturulması tipik bir ayırt edici özelliktir ve gaz oluşumu Durham tüpleri kullanılarak belirlenir. enzimatik aktivitelerin belirlenmesi. amaçlarla kullanılan zenginleştirme besiyerleri. stres altında) mikroorganizmaların aktivitelerini kazanmaları için kullanılan. diğer bazı bakteriler besiyerinde gaz oluşturmadan gelişebilir (bakınız. selektif sayım ve ön identifikasyon amaçları ile kullanılmaktadır. ön zenginleştirme besiyerleri ve selektif zenginleştirme besiyerleri olarak 2 alt gruba ayrılır.03. # Örneğin. # 20 . maddelerin besiyerine ilavesi ile yapılır.04. sayısını artırmak. amaca göre selektif izolasyon. Bu tanımlamaya göre diferansiyel besiyerleri. gaz oluşumunun izlenmesi vb. Ancak başta koloni morfolojisi olmak üzere çeşitli farklılıklar ile hedef mikroorganizma diğerlerinden ayrılır. dolayısı ile aktivite kazanması istenen mikroorganizma yanında refakatçi mikrofloranın da gelişmesini sağlayan sıvı besiyerleridir. lipaz. çeşitli pH indikatörleri. Katılardan koloni izolasyonu mümkündür ancak. Bölüm). # 03. hücrede olası hasarların giderilmesini sağlamak vb.
# Bir besiyerinde birden çok mikrobiyolojik tanımlama testi aynı anda beraberce yapılabilir. 5 g/L NaCl ve 10 g/L fosfat tampon olan bu besiyerinde Salmonella yanında ortamdaki diğer bakteriler de kolaylıkla ve iyi bir şekilde gelişebilir. belirli bir besin maddesinden metabolizma sonunda tayin edilebilecek metabolitleri (örneğin. Bakterinin hareketli olup olmadığının saptanması amacıyla kullanılan yarı katı besiyerleri de bu gruba dahil edilmektedir. # Selektif zenginleştirme besiyerleri ise özel amaçla kullanılan selektif sıvı besiyerleridir. MUG içeren bir selektif katı besiyerinde floresan veren koloni E. triptofandan indol) oluşturup oluşturmadığının belirlenmesi vb. selektif izolasyonda başarı şansını artırmak için aranan bakterinin karışık kültür içindeki sayısını artırmaktır.05. # Selektif zenginleştirme aşamasında karışık kültür olarak bulunan bakterilerden gelişmesi istenmeyenler. E. çeşitli selektif inhibitörlerin kullanımı ile kısmen ya da tümüyle engellenir. Yarı katı olarak Nutrient Agar gibi genel besiyeri ya da SIM Medium gibi kombine bir besiyeri kullanılabilir. Bunlara en tipik örnekler Listeria ve Salmonella aranmasında kullanılan besiyerleridir. # 03. amaçlar ile kullanılır. # Selektif zenginleştirme aşamasını genellikle selektif bir katı besiyerine sürme yapılarak aranan bakterinin selektif izolasyonu aşaması izler. tüm zenginleştirme aşamalarının bağırsakta bitmiş olmasıdır. # Klinik mikrobiyolojide ise Salmonella kuşkusu duyulan dışkı örneği selektif zenginleştirme aşamasına alınmakta. mikroorganizmanın belirli bir besin maddesini (örneğin. hatta gerekirse bu aşama bile geçilip. laktoz) kullanıp kullanmadığının saptanması. laktoz ve sakkarozdan asit 21 . coli O157:H7 analizi doğrudan selektif zenginleştirme ile başlarken. Bunun en tipik örneği Salmonella analizinde yaygın olarak Triple Sugar Iron Agardır. Diferansiyel besiyerlerinde de aynı durum geçerlidir. Bu uygulamanın nedeni. coli olarak değerlendirilir. # Bir mikroorganizma izolatının tanımlanması için halen en çok kullanılan testler biyokimyasal nitelikli olanlardır. İdentifikasyon besiyerleri. Bileşimi 10 g/L et peptonu.Bu besiyerlerine en tipik örnek. Buna göre selektif zenginleştirmenin amacı. Hedef bakteri ve analiz edilecek örneğe göre doğrudan selektif zenginleştirme ile de analize başlanabilir. # Selektif zenginleştirme aşaması. # Tam selektif bir besiyerinde gelişen bir mikroorganizmanın identifikasyonu cins ve hatta tür bazında tamamlanabilir. her zaman ön zenginleştirme aşamasını izlemez. dışkıda aktif ve yüksek sayıda Salmonella varsa bunu zenginleştirmeye gerek yoktur. Yatık agar olarak tüplerde hazırlanan bu besiyerinde tek ekim ile glikoz. Örneğin. İdentifikasyon Besiyerleri # Selektif ve diferansiyel besiyerlerinin ön identifikasyonda kullanılabileceğine yukarıda değinilmiştir. Diğer bir deyişle.05. Listeria analizinde ise yarı selektif zenginleştirme ve selektif zenginleştirme şeklinde bir uygulama vardır. gıdalarda Salmonella aranmasına yönelik çalışmaların ilk aşaması olan ön zenginleştirmede kullanılan "Tamponlanmış Peptonlu Su" besiyeridir. selektif katı besiyerine sürme yapılmaktadır.
Bu kitabın 4. # Bir diğer deyiş ile. # Aşağıda besiyeri kutularında ve kataloglarında geçen bazı İngilizce sözcük ve terimlerin Türkçe karşılıkları gösterilmiştir. saf kültürlerin korunması (koleksiyonu). Çoğunda İngilizce'ye ek olarak Almanca. besiyeri ambalajı üzerindeki bilgiler her zaman çok dikkatlice okunmalıdır. kullanılan besiyerlerine göre değişmek üzere bunların hazırlanma şekillerinde kayda değer ölçüde farklar vardır.05. bir kısmı sadece kaynatılarak sterilize edilir. Bu gibi nedenlerle aynı marka kullanılıyor olsa da. sıvı. besiyeri formülüne ve dolayısı ile hazırlanış şekline de yansımaktadır. ISO gibi uluslararası bir kuruluşta yapılan talimat değişikliği. # 03. Fransızca. Besiyerlerinin Hazırlanması # Laboratuvarlarda kullanılan pek çok besiyeri. dehidre formdan hazırlanır.06. # 03. Besiyeri hazırlamada yaygın olarak kullanılan İngilizce sözcük ve terimlerin Türkçe karşılıkları İNGİLİZCE About Add Autoclave Autoclave under mild conditions Avoid TÜRKÇE Yaklaşık İlave edin Otoklav. o besiyerinin nasıl hazırlanması gerektiği son derece basit ve 40–50 sözcükle İngilizce olarak yazmaktadır. # Gerek kutu üzerinde yabancı dilde yazan hazırlama bilgileri gerek ilgili talimatlarda kuşkuya düşülür ise derhal bir üst yetkiliye danışılmalıdır. otoklavlayın Düşük sıcaklık ve sürede otoklavlayın Sakının. İtalyanca vb. taşınması gibi özel amaçlara yönelik olarak kullanılan çeşitli besiyerleri de vardır. selektif besiyerlerinin bir kısmına sterilizasyon sonrasında çeşitli katkılar ilave edilir. katalogunda ya da prospektüsünde. ana bölümünde gıda mikrobiyolojisini ilgilendiren besiyerlerinin büyük çoğunluğunun hazırlama şekilleri ayrıntılı olarak verilmiştir. Bu gibi identifikasyon amaçlı ve birden çok test uygulananlar "kombine besiyeri" olarak adlandırılır. Bunların dışında istenilen formülde "sipariş üzerine" üretilen besiyerleri de vardır. dillerde de açıklamalar bulunur.06. şişede ya da Petri kutusuna dökülmüş şekilde hazırlanabilmektedir. # Çizelge 03. Diğerleri # Agar disk difüzyonu ile yapılan antimikrobiyel duyarlılık ve minimal inhibisyon konsantrasyonu testleri.oluşturma. sterilize edilir. Hatta bazen aynı besiyerinin 2 farklı ticari markası arasında bile hazırlanma farkı görülebilmektedir. yapmayın 22 . # Her besiyeri kutusunda. Bu amaçla. gereken miktar dehidre besiyeri tartılıp. Bunlar talebe göre dehidre. Besiyerlerinin bir kısmı otoklavda. glikozdan gaz oluşturma ve H2S oluşturma testleri yapılmaktadır. üzerine damıtık su eklenir ve gerekli ise başka kaplara (örneğin tüplere) dağıtılıp. Bazı besiyerlerinin formülden hazırlanması gerektiği gibi. # Endüstriyel üretimde kullanılan besiyerleri ise oldukça farklı bir gruptur. vitamin ve aminoasitlerin mikrobiyel yolla belirlenmesi.
DO NOT AUTOCLAVE DO NOT OVER HEAT DO NOT REHEAT Filter–sterilize Filter–sterilized Flask Frequent stirring Freshly Gently Green Greenish Heat If Immediately Just before use Liquefy Medium Melt Min(ute) Mix Necessary Over Pale Plate(s) Pour Prepared Prior Red Reddish Refrigerator Reheat Reliquefy TÜRKÇE Altında. yeni hazırlanmış Yavaşça. yeniden eritin 23 .. tümüyle Soğutun Koyu Deiyonize (damıtık. eritme.. eritin Dakika Karıştırın Gerekli Üzerinde. mat Petri kutusu (kutuları) (Petri kutularına) Dökün Hazırlanmış Öncesinde Kırmızı Kırmızımsı Buzdolabı Yeniden ısıtmak. eritmeyin Filtre ile sterilize edin Filtre ile sterilize edilmiş Erlen Sürekli çalkalayarak Taze.İNGİLİZCE Below Blue Boil Briefly Brown Caution Clear Completely Cool Dark Demin. daha düşük Mavi Kaynatın Yavaşça. hafifçe Yeşil Yeşilimsi Isıtın. hemen Kullanımdan hemen önce Sıvılaştırma. dikkat Berrak Komple. yeniden ısıtın Yeniden eritmek.. ısıtmak Eğer Derhal. Yapmayın (Besiyerini) otoklavda sterilize etmeyin (Besiyerini) fazla ısıtmayın (Besiyerini) tekrar ısıtmayın. eritin Besiyeri Eritmek. hafifçe Kahverengi Uyarı. saf) su Dağıtın Eritin Damıtık su .. fazla Soluk. water Dispense Dissolve Distilled water DO NOT .
# 24 . besiyeri hazırlamada kullanılan kalitede sudan geçirilmiş ve yeterince kurutulmuş olması gerekmektedir. # Besiyerleri hazırlamak amacıyla kullanılan her türlü cam malzemenin yüksek kalitede ve düşük alkaliborosilikat özellikte. Cam Malzeme # Besiyeri hazırlamada kullanılacak cam malzemenin çok iyi bir şekilde yıkanmış ve durulanmış.01.İNGİLİZCE Room temperature Selective supplement Semi solid Shake Slant (agar) Steam Store Suitable Supplement Suspend Swarming Swirl Thick layer Thin layer Thoroughly Tube(s) Vial Vigorously Water Well White Yellow Yellowish TÜRKÇE Oda sıcaklığı Selektif katkı Yarı katı Sallamak. Kırık ve çatlak cam malzeme kullanılmamalıdır. sallayın. Sıvı besiyerleri için. ancak çok önemli bir ayrıntıdır. kuvvetlice Su İyice Beyaz Sarı Sarımsı *Kaynak: www. otoklavda ve etüvde (kuru hava sterilizatörü) sterilizasyona dayanıklı olması gereklidir.mikrobiyoloji. besiyeri hacmi cam kap hacminin en fazla 3/4'ü olabilir. 1 litrelik bir erlende 1 litre besiyeri hazırlanırsa soğuk noktanın yeri nedeni ile ya soğuk nokta yeterince sterilize edilemeyecektir ya da çepere yakın yerler gereğinden fazla ısıya maruz kalmış olacaktır. eritin Yayılıcı Çalkalayın Kalın tabaka İnce tabaka Düzgün (tam) bir şekilde Tüp(ler) Küçük şişe Sertçe. Cam kapların hacmi mutlaka yeterli bir karıştırma sağlanacak ölçüde olmalıdır.06. # Cam kabın büyük tutulmasının nedeni otoklavlama sırasında ısı geçişinin daha sağlıklı olması. karıştırın Yatık (agar) Buhar Saklayın (depolayın) Uygun Katkı Çözün. # İdeal olarak. karıştırmak. otoklav sonrasında da rahat ve güvenilir çalışma sağlamasıdır. Büyük miktarlardaki besiyerlerinin balonda hazırlanması aynı nedenle benimsenmez. Besiyerinin hazırlanacağı cam malzemenin yeterli büyüklükte olması çoğu kere ihmal edilen.org # 03. hazırlanacak besiyeri hacminin yaklaşık 2 katı hacimde cam kap kullanılmalıdır.
Bu uygulama ile cam kabın tabanına dehidre besiyerinin yapışarak erimemesine bağlı sterilizasyon yetersizliğinin önüne geçilir. besiyerinin hazırlanış şekli ile doğrudan ilgilidir. Özellikle bileşimden hazırlamalarda tartım sırasında her madde için temiz spatül (kaşık) kullanılması. Bazı besiyerleri ise "Broth" formunda olsalar bile eritilmeleri için mutlaka ısıtılmalarına gerek vardır. # Suyun yaklaşık 1/3'ü uygun bir kaba aktarılır. Agarlı besiyerleri hazırlandığı kapta otoklavlanacak olsa bile. doğrudan erlen ya da balona tartımdan olabildiğince kaçınılmalıdır. Tartım sırasında besiyeri ve/veya bileşenlerinin çok az da olsa toz bulutu oluşturmamasına özen gösterilmeli. Bunun dışında. # Eğer besiyeri sıvı ise. bazı besiyeri bileşenlerinin toksik olduğu göz ardı edilmemelidir. bunun üzerine tartılmış dehidre besiyeri ilave edilir. dehidre besiyerlerinin hepsinin higroskopik olduğu. # Tartım sonrasında oluşabilen toz bulutu terazinin iç parçalarına girerek.03. Özellikle bileşimden hazırlanarak çok düşük miktarda tartım yapılacak ise.Tartım ve Eritme # Tartımın yapılacağı terazinin duyarlılığı. iyice karıştırılıp sonra otoklavlanmalıdır. eğer toz bulutu oluştu ise kesinlikle solunulmamalıdır. terazide fark edilemeyecek arızalara neden olur ve bunun sonucunda hatalı tartımlar yapılır. Prensip olarak suyun hacmi ile silindirin hacmi birbirine yakın olmalıdır.02. Bu tip ayrıntılara NaCl. laboratuvar disiplini açısından son derece önemlidir. Bileşimden giderek az miktarda hazırlanan besiyerlerinde bu duyarlılık yeterli olmaz ise seyreltme tekniği uygulanabilir ya da daha duyarlı bir terazi kullanılabilir. Eğer bu temas varsa bol su ile ivedilikle yıkanması gerekir. # Besiyerine ilave edilecek su ayrı bir ölçü silindirinde bulundurulmalıdır.1 gram duyarlılıktaki terazi kullanımı yeterlidir. # Bazı besiyerleri soğuk suda kendi halinde 5–10 dakika bırakılıp elle hafifçe bir çalkalama sonunda tümüyle eriyebilir. # Daha sonra suyun geri kalan kısmı cam kap boğazında ve iç çeperlerde kalmış olabilen besiyeri parçacıklarını yıkayarak kaba ilave edilir. terazinin kalibrasyonuna özellikle önem verilmelidir. dehidre besiyeri ya da besiyeri bileşenleri tümüyle eridikten sonra daha küçük cam kaplara dağıtılır ya da doğrudan sterilize edilebilir. solunulması halinde solunum sisteminde zamanla hastalıklara neden olabileceği. Tartım sırasında besiyeri ve/veya bileşenlerinin çıplak deriye ve özelikle göze temas etmemesi sağlanmalıdır.06. # 25 . Genel olarak günlük kullanımda 0. besiyeri ve/veya besiyeri bileşenlerinin kapakları açıldıktan sonra hata yapmamaya özen gösterilerek tartımın elden geldiğince çabuk bitirilmesi ve besiyeri kapağının sıkıca kapatılması gerekir. önce agarın erimesini sağlayacak şekilde ısıtılmalı. sakkaroz gibi günlük hayatta sürekli iç içe olunan maddelerin de dahil edilmesi. # Tartım için özel tartım kayıkçıkları ya da küçük beherler kullanılmalı. Bu nedenle tartım sonrasında terazi üzerinde toz oluşmuş ise yumuşak fırça ile temizlenmeli ve damıtık su ya da %70 etil alkol ile silinmelidir. Bir diğer deyiş ile 100 mL su ölçmek için 1 litrelik silindir kullanılmamalıdır.
Besiyeri hafifçe çalkalandığında erlen iç çeperinde partikül kalmaması erimenin tam olarak gerçekleştiğini gösterir. # Özellikle agarlı besiyerlerinin otoklav öncesinde agarın mutlaka tam olarak eritilmesi için farklı uygulamalar söz konusudur. # Besiyerine ilave edilecek su miktarı çoğu kez hatalı ölçülür. Erlen ya da balona önce 1 litre su doldurulur. Manyetik karıştırıcıda kullanılan manyetin (balık) mikrodalga uygulaması sırasında erlenden çıkartılması önerilmektedir. işaretli yere kadar damıtık su ilave edilir. Eritme amacıyla kullanılan ısıtıcı tablanın iş bitiminde kolaylıkla soğumadığı ve çeşitli laboratuvar kazalarına neden olduğu da unutulmamalı ve laboratuvar personeli bu konuda uyarılmalıdır. Çoğunun ulaşacağı en yüksek sıcaklık 80 oC'dır ve buna bağlı olarak agarlı besiyeri eritilmesinde kullanılamazlar. Bu nedenle mikrodalga fırın kullanılarak eritme yapıldığında. erlen iç çeperinde agar ya da diğer besiyeri partiküllerinin kalmadığından emin olunmalı. #-Laboratuvarlarda genel olarak "sıcak su banyosu" bulunur. agar tam olarak eritildikten sonra sürekli karıştırılarak 50–55 oC'da su banyosunda tutulurken dağıtılması gereklidir. cam yazar kalemle su düzeyi hassas bir şekilde işaretlenir. erlen dibinde kalabilecek erimemiş parçaların yapışmasına ve yanmasına neden olunmamalıdır. ancak bileşenlerin tam olarak eritilmiş olduğundan da emin olunmalıdır. ısıtıcı tabla yaygın olarak kullanılır. # Eritme sırasında erlenin ağzı alüminyum folyo ile hafifçe kapatılarak buharlaşma ve buharın laboratuvara dağılması önlenmelidir. Besiyerinin kaynadığının görülmesi. ısının tüm besiyeri kütlesine eşit olarak dağıtılmış olması gerekir. Aksi halde sürekli olarak elle karıştırılıp.Besiyeri bileşiminde agar varsa ve daha küçük hacimli kaplara dağıtılması gerekli ise besiyeri ısıtılıp. endişe edilirse tekrar mikrodalga fırına konulmalı ve yeniden karıştırılmalıdır. eğer pipet ağızla çekilirse ağızda önemli yanmalara neden olabileceği unutulmamalıdır. Aksi halde tam erimemiş partiküllerin yanmasına neden olunabilir. Özellikle düşük miktarda agar içeren besiyerleri eritme sırasında aniden kaynayarak kaptan taşabilir. Erleni rahatça içine alacak ve su kaynatmaya uygun herhangi bir kap bu amaçla kullanılabilir. günlük kullanılan besiyerlerinde en zor eriyen bileşenin agar olduğu ve 90 oC'da eridiği. #-Mikrodalga fırın ani ısınmalara ve kaynamalara neden olacağı için dikkatli kullanılması gerekir. kaynamadan sonra erlen tercihen manyetik karıştırıcı kullanılarak karıştırılmalı. 1 litre suda çözülür" şeklindeki bildirişin anlamı 23 gram dehidre besiyeri üzerine toplam 1 litre su ilave edilmesi demek değildir. Eritme işleminin -başta agar olmak üzere. suyun yarısından fazlası bir başka temiz kaba alınır. besiyeri ya da besiyeri bileşenleri bu kapta -agar hariç olmak üzere. #-Erlen açık alevde ısıtılarak besiyeri eritme yoluna gidilmemelidir.bileşenlerin tam olarak eritilmesi amacıyla yapıldığı. bunlara dayanarak besiyerinin kaynatılmaması gerektiği unutulmamalı. kaynar su banyosu. Sonra tam eritme sağlanır. 26 . Bu amaç için tercihen "benmari" şeklindeki kaynar su banyoları kullanılmalıdır. besiyeri hazırlamada "dehidre hazır besiyerinden 23 gram. 60 oC üzerindeki agarlı besiyerinin 25 mL'lik pipetle tüplere dağıtılması sırasında. tartım yapılır.eritilir. agarın eridiği anlamına gelmez. Bunlar arasında mikrodalga fırın. Örneğin. #-Isıtıcı tabla kullanılıyorsa manyetik karıştırıcılı olanlar tercih edilmelidir. Sürekli karıştırılarak yapılmalıdır. # Otoklavlama öncesi ısıtarak eritme dikkatli yapılması gereken bir iştir.
# 03. 27 . Sıvı besiyerinde pH ayarlaması. Bu amaçla besiyerinden 10 mL gibi küçük bir örnek alınır. Ancak.01 N NaOH ya da 0. Bu uygulama standart besiyerlerinin hazırlanmasında ihmal edilebilecek bir ayrıntı iken.06. basit orantı ile asıl kaptaki besiyerine ilave edilecek asit ya da alkali miktarı hesaplanır.Burada ilave edilecek toplam su hacmi 1 litreden daha az olacaktır. Bu gibi analizlerde pH metre kalibrasyonunun son derece önemli olduğu açıktır. Usulüne uygun olarak depolanmış ve raf ömrü bitmemiş ticari dehidre besiyerlerinde nötral su ve temiz cam malzeme kullanılması. # Besiyeri pH'sının sterilizasyon öncesi ayarlanması yanlış olur. karıştırılır ve Petri kutularına dökülür. besiyeri erlende otoklavlanmalı. besiyeri pH'sından kasıt. pH kağıdı ile yapılan ölçümün çok duyarlı olmadığı. Katı besiyerinde pH ölçüm ve ayarlama işleminin agarın jelleşme sıcaklığının üzerinde yapılması.5'e düşürülmüş olur. # Sterilizasyon sonrasında pH ayarlanması gerekli ise. sterilizasyon sonu ve oda sıcaklığındaki (25 oC) pH'dır. özellikle %50 Glikoz Broth gibi besiyerlerinin hazırlanmasında çok önemlidir. Az olan kısım dehidre besiyerinin hacmi kadardır. katı besiyerine göre çok daha kolaydır. # pH ayarlaması için pH kağıdı da kullanılabilir.6'dan 3. Günlük uygulamada talimatta gösterildiği şekilde asit ilavesinden sonra pH kontrolüne gerek yoktur. # Örneğin. # Aksine bir belirtme yoksa. 0. pH Ayarlama # İster ticari olarak hazırlanmış dehidre besiyeri hazırlama katalogları ve prospektüslerinde ister bilimsel çalışmalara yönelik literatür bilgisinde olsun. # Tüpte hazırlanacak sıvı besiyerinde pH ayarlaması gerekli ise. besiyerinin doğru hazırlanması ve sterilizasyonun sulandırmadan sonra vakit geçirmeden yapılması ile besiyeri pH'sında bir sorun çıkmaz.03. Dolayısı ile besiyeri pH'sının sterilizasyon öncesinde ayarlanması. pH ayarlamasında filtre kullanılarak sterilize edilmiş olan 1 N NaOH ve 1 N HCl kullanılır. sonra orantı ile asıl besiyerine daha derişik (1 N) asit ya da baz ilave edilir. sterilizasyon sonrasında asit ilave edilir. # Potato Dextrose Agar." şeklinde bir açıklama getirmiştir. sadece "fikir vereceği" göz önünde tutulmalıdır. Bu işlem ile pH 5. Bunun için ölçüm ve ayar yapılacak sınırları açıkça gösteren pH kağıdı kullanılmalıdır. Pek çok ulusal ve uluslararası standart bu nedenle besiyeri hazırlanmasında "1 litre su ilave edilir. # Çeşitli bakterilerin tanımlama testleri içinde yer alan "belirli bir pH'da gelişebilme" gibi analizlerde besiyeri pH'sı tam olarak ayarlanmalıdır. otoklav çıkışında pH ayarlanmalı ve sonra steril tüplere dağıtım yapılmalıdır. Potato Dextrose Agar otoklavlanıp. sterilizasyon sonrasında yanlış pH elde edilmesine yol açar. pH'sı kontrol edilir. ilgili talimata göre asit ilavesinden sonra pH kontrolü isteniyor ise buna tümüyle uyulmalıdır." yerine "1 litreye su ile tamamlanır. pH metre kullanılıyor ise sıcaklık düzeltmesine dikkat edilmesi gereklidir. 45 oC'a soğutulduğunda üzerine filtre ile sterilize edilmiş %10 tartarik asit çözeltisinden 14 mL/L olacak şekilde ilave edilir. BAT Agar örneklerinde olduğu gibi besiyeri çok asitli ise. Çünkü sterilizasyon sonrasında pH az da olsa değişir.01 N HCl kullanılarak pH'nın istenilen değere gelmesi için gereken miktar belirlenir. aseptik koşullarda alınacak belirli bir hacimdeki besiyerinde titrasyon ile pH ayarlaması yapılır.
-sağlıklı hayvandan aseptik koşullar altında alındığı için. anafor oluşturacak kadar hızlı yapılan karıştırma ani soğumalara ve/veya besiyeri içinde hava kabarcığı oluşumuna neden olur. agarlı besiyeri ise 45–50 oC'da tutulmalıdır. Bu nedenle manyet. Besiyeri ve katkı maddeleri oda sıcaklığında aseptik olarak karıştırılır. antibiyotikler gibi bir kısmı ise küçük şişelerde (vial) liyofilize formdadır. Bu ilavede aşağıdaki konulara dikkat edilmesi gerekir: #-Katkı maddesi asla soğuk olmamalı. Petri kutularına döküm ve jelleşme sonrasında hava kabarcıkları görülmüyor ise karıştırma işleminin. dolayısıyla katkı ilavesinin agarlı besiyeri çok sıcak iken yapıldığı anlaşılır. Katkıların İlavesi # Çeşitli antibiyotikler.06. Böylelikle bazal (agarlı) besiyerlerinde katkının ilavesi ile ani soğumalar ve yerel jelleşmeler önlenmiş olur. # Küçük şişeler içinde bulunan ve genellikle antibiyotik içeren selektif katkılar şişe içinde tablet gibi durur.Her ne kadar. Bu işlemde. #-Gıda işletmelerinin iç standardında her otoklav sonrasında pH kontrolü varsa buna mutlaka uyulmalıdır. Bunun en tipik örneği asit–agar etkileşimidir. oda sıcaklığında hatta 30–35 oC'da. Kan. Asit ilave edilmiş ise agarın jelleşme gücü zayıflar. karıştırma işlemi bittikten sonra erlenden çıkartılmalıdır. Bunlar kırılmış gibi görülüyorsa sulandırılmaları sırasında toz oluşturmayacak 28 . Aksi halde katkı yüksek sıcaklıktan olumsuz etkilenir ve sahte negatif sonuçlar alınabilir. Yumurta sarısı içeren çözeltiler pastörize edilmiştir ve bunların steril olduğu kabul edilir. vitaminler. Asitler ve vitaminler ile bazı şekerlerin filtre ile sterilize edilmesi gerekir. #-Sıvı besiyerine de sterilizasyon öncesi manyet atılması yararlı olur. Bunların üzerine gereken miktarda steril damıtık su (bazen su ve alkol) ilavesinden sonra sterilize edilmiş besiyerine eklenirler. Anafor oluşturacak kadar hızlı karıştırma.04. # Sıvı besiyeri için katkıların ilavesinde herhangi bir sorun yoktur. #-Katkı ilave edilecek agarlı (bazal) besiyeri içine sterilizasyon öncesi manyet atılarak beraberce sterilize edilmesi. tartım doğru yapılıyor ve kurallarına uygun olarak sterilizasyon yapılıyor ise besiyeri pH'sının her defasında kontrolüne gerek yoktur. Ancak bu manyet -eğer kullanılacak ise. "Doğru depolanmış taze besiyeri ile taze hazırlanmış damıtık su kullanılıyor." şeklindeki görüş geçerli olmakla beraber. # Katkılardan. katkı ilavesinden sonra manyetik karıştırıcıda hafifçe karıştırarak katkının besiyeri içinde yeknesak olarak dağılması sağlanabilir. # 03.steril olduğu kabul edilir. #-En azından ayda bir kez sıvı besiyerlerinde otoklav sonrası kalibrasyonu yapılmış pH metre ile besiyerinde pH kontrolü yapılmalıdır.blender gövdesine ya da stomacher torbasına zarar verir. # Başta antibiyotikler olmak üzere katkı maddelerinin büyük bir kısmı steril olarak pazarlanır. Bu gibi maddeler otoklav sonrasında bazal besiyerine ilave edilir. kan ve yumurta sarısı başta olmak üzere besiyeri bileşimine giren bazı maddeler otoklavlama sırasında tahrip olur ya da yüksek sıcaklıkta bileşimdeki maddeler birbirleri ile reaksiyona girer. # Agarlı besiyerlerinde ise katkı maddeleri agarın henüz sıvı formda kalabildiği yeterince düşük bir sıcaklıkta ilave edilir. #-Katkı ilave edilmiş agarlı besiyeri hızla Petri kutularına dökülmelidir. yumurta sarısı içerenler gibi bir kısmı sıvı halde.
homojenliğinden emin olmak için çalkalanmalıdır.06. VRB Agar besiyerinde dökme yöntemi ile kültürel sayımda 10 mL besiyeri dökülmesi.5 mL'dir (100 mL agarlı besiyerinin 8 Petri kutusuna dağıtılması. 50 mL yumurta sarısı tellurit emülsiyonu 1 L Baird–Parker Agar hazırlanması içindir ve bu miktardan standart çaplı 80 Petri kutusu hazırlanır.şekilde dikkatlice su ilave edilmelidir. # Katkılar. # 03. Gerektiğinde eritilip Petri kutusuna aktarılır. 29 . Bu katkılar.05. Yüksek sıcaklıklarda dökme. # Benzer şekilde sadece antibiyotik içeren katkıların da depolanması mümkündür. # Küçük şişelerde pazarlanan katkılar genellikle 500 ya da 1000 mL besiyeri için hazırlanmıştır. Agarlı besiyerleri. 1 şişe katkının tümünün 1 defada kullanılması beklenmez. standart 9 cm çaplı Petri kutusunda 2 mm kalınlık).03. jelleştikten sonra üzerine 4–5 mL besiyeri ilavesi pek çok uluslararası standart tarafından önerilmektedir. otoklavlanır. # Petri kutularına dökülecek agarlı besiyeri miktarı farklı kaynaklarda farklı değerler ile verilmektedir. Agarlı besiyerlerinin diğer kullanılış şekilleri arasında tüplerde yatık veya dik agar ile Roux şişelerinde kullanım sayılabilir. Bu uygulamada dikkat edilmesi gereken bir diğer özellik. Bazı işletmelerde "el altında" bulundurma amacı ile eritilmiş agar tüplere dağıtılır. sterilize edilir ve bu şekilde korunur. Petri kutusunun kapağı içinde aşırı su yoğunlaşmasına yol açar. genel olarak belirli bir miktar besiyerinde 1 kerede kullanılmak üzere hazırlanmıştır. Ancak.07. Bu miktar. Buna göre bazal besiyeri hazırlanır. otoklav sonrası besiyerinin yaklaşık 45 oC'a soğutulması ve bu sıcaklıkta Petri kutularına dökülmesidir. soğutulduktan sonra üzerine katkı ilave edilir. Pratik uygulamada. Bu durumda katkıdan steril koşullara uyularak gereken miktarın alınmasından sonra yine steril koşullara uyularak ağzının kapanmasına özen gösterilmelidir. Bu diğer kullanım şekillerinde agarlı besiyeri genellikle anılan kaplarda sterilize edilir. Dairesel yavaş hareketlerle çalkalama erimeyi kolaylaştırır. Çözündürme sırasında kauçuk kapağa sıvının bulaşmamasına özen gösterilmeli ve şişe içeriğinin tam olarak çözülmüş olduğu kontrol edilmelidir. her zaman erlen gibi büyük kaplarda sterilize edilir ve sterilizasyon sonrası steril Petri kutularına aseptik koşularda dökülür. # Agarlı besiyerinin otoklavlama sonrası Petri kutusuna hangi sıcaklıkta döküleceği konusunda pek çok yanlış uygulamaya rastlanmaktadır. Bu kitapta önerilen standart dökme miktarı 12. # Eğer Petri kutusunda "dökme yöntemi ile kültürel sayım" amacıyla önceden ilave edilmiş örnek varsa dökme sıcaklığı 40 oC'ı geçmemelidir. Petri Kutularına Döküm # Otoklav veya daha geniş tarifi ile ısıl işlem ile sterilizasyon sonrası agarlı besiyerleri çoğunlukla Petri kutularına dökülerek kullanılır. Bölümde bilgi verilmiştir. agarlı besiyerlerinin Petri kutularında sterilize edilmesi uygulanan bir yöntem değildir. öncelikle Petri kutusu çapı ile ilgili olduğu için agarlı besiyeri döküldükten sonra kalınlığın "en az 2–3 mm" olması yaygın bir şekilde önerilmektedir. kendi halinde bırakıldığında genellikle birkaç dakika içinde çözülür. Ayrıca yüzey kurutması daha uzun zaman alır. Bu konuda 03. Agarlı besiyeri için doğru uygulama şekli. Petri kutusunda bulunan mikroorganizmaları olası termal şok zararlarından korumak için Petri kutularının oda sıcaklığında tutulması gerekliliğidir. Örneğin. Besiyeri dökülmeden önce.
Prensip olarak benimsenen şekil güvenli kurutmadır. istem dışı olarak agarlı 30 . 48 oC'da 4 saat beklemek izin verilebilecek en yüksek sıcaklık/süre kombinasyonudur. Çabuk kurutma sadece acil durumlarda uygulanmalıdır. # Şekil 05. # 03. Burada ilk akla gelen iki neden. # Besiyeri döküldükten sonra Petri kutuları yatay bir zeminde soğumaya ve katılaşmaya bırakılır. Ancak bu uygulamada besiyerinin aşırı kuruma riski de vardır. # Dökümden sonra besiyeri yüzeyinin kurutulması gerektiğinde Şekil 05'te gösterildiği gibi 2 farklı yöntem uygulanabilir. # Kurallara uygun olarak Petri kutularına dökümde yüzey hafif nemli olur. Kurutma # Petri kutularına dökülmüş agarlı besiyerlerinde yüzeyin ıslak olması istenmez. # Tersine olarak. ancak kontaminasyon riski yüksektir. sterilizasyon amacıyla kullanılan ve kurutma sırasında çalıştırılmayan etüvler (kuru hava sterilizasyon fırını) ve UV lamba ile sterilize edilen kabinler kurutma için kontaminasyon olmaması açısından en güvenilir yerler arasındadır.06. Islak yüzeylerde hareketli bakteriler yayılıcı tip koloni oluştururken. Yayma yöntemi ile çalışılacak ise dökme sırasında besiyerinde oluşabilecek hava kabarcıkları bunzen beki alevi ile uzaklaştırılabilir. # Kurutma.06.Herhangi bir nedenle otoklavlandıktan sonra 50 oC su banyosunda uzun süreli beklemeler agarın jelleşme özelliğinde kayıplara neden olur. Koloniler aşırı kurumuş bir besiyerinde normalinden daha küçük boyut oluşturacakları için yine hatalı değerlendirmelere neden olur. kuruma hızlı olur. Kuru hava sterilizatörlerinde kurutma sırasında sıcaklığın 50 oC'da tutulması hızlı bir kuruma sağlar. Yeniden Eritme # Sterilize edildikten sonra soğutulmuş ve jelleşmiş agarlı besiyerlerinin çeşitli nedenlerle yeniden eritilmesi gerekebilir. Öze ile sürme gibi bir çalışma yapılacaksa.06.07. mutlaka temiz ve serbest hava akımı olmayan yerlerde yapılmalıdır. hareketsizler olduklarından daha büyük koloni meydana getirir ve yanlış değerlendirmelere neden olur. kurutma özellikle yapılmalıdır. # Agarlı besiyerleri dökümden sonra bir süre depolanacaksa Petri kutularının tabanına döküm tarihi yazılmalıdır. Petri Kutularının Kurutulması a) Çabuk kurutma b) Güvenli kurutma # Petri kutularında agarlı besiyeri yüzeyinin çabuk kurutma yönteminde (a). aşırı kurumalar da olumsuz sonuç verir. tersine olarak geç kuruma ancak düşük kontaminasyon riski sağlar. Besiyerinin kurutma gerektirip gerektirmediği basit olarak yüzeyde su damlacıklarının görülmesi ile anlaşılır. Steril hava akımı ile çalışan aşılama kabini (Laminar air flow). Diğer uygulama (b). # 03.
Bazı ticari besiyerleri vida kapaklı şişe içinde pazarlanır. Otoklavlanmadan ve sadece ısıtılarak sterilize edilen besiyerleri (örneğin Rambach Agar) yeniden eritilmez. # # 03.0 verilmektedir. # Agarlı besiyerlerinin otoklav sonrası tekrar eritilmesinde performans azalması olur. besiyerinin bileşimi ile doğrudan ilgilidir. 1 hafta boyunca kullanılacak besiyerlerini bir kerede hazırlamak amacıyla yapılır. katkılar buzdolabı sıcaklığında 31 . Genel olarak dehidre besiyerleri oda sıcaklığında nem almayacak şekilde. # Hangi nedenle olursa olsun. Basit bir şekilde dairesel hareketlerle yapılan çalkalamada hava kabarcıkları merkeze toplanıyorsa besiyerinin tümüyle erimiş olduğu anlaşılır. Benzer şekilde yüksek sıcaklığa duyarlı olan besiyerlerinde yeniden eritme önerilmez. bu amaçla kaynar su banyosunda yaklaşık 90 oC'da tutularak erimenin gerçekleştirilmesi yeterlidir. Bu uygulama ise toplam ısı girişi açısından önerilmez. Laboratuvardaki iş akışı buna göre planlanmalıdır. # Yeniden eritilmiş agarlı besiyerinin 3 saat içinde Petri kutularına dökülmüş olması gerekir. pek çok laboratuvarda çeşitli besiyerleri arasında agarlı besiyerleri de sterilize edildikten sonra steril şekilde belirli bir süre depolanır. Yeniden yapılacak eritmeler ile performans azalması kabul edilemeyecek düzeye çıkar. örneğin. Bu azalma. Depolama # Her dehidre besiyeri ve katkı kutusu üzerinde depolama koşulları belirtilir. Düşük pH'lı besiyerlerini tekrar eritmekten kaçınılmalıdır. katkı ilave edilmiş ve/veya otoklavda sterilize edilmeyen agarlı besiyerleri yeniden eritilmez. Büyük hacimlerde besiyerlerinin eritilebilmesi için doğal olarak daha yüksek sıcaklık ve/veya süreye gerek vardır. Hatta bazı agarlı besiyerlerinin prospektüslerinde yeniden eritilmemesi gerektiğine özellikle dikkat çekilir. burada sınır olarak pH 6. 105 oC'da 5 dakika süre ile ısıl işlem uygulanmalıdır. Bununla birlikte. Agarlı besiyerlerinin yeniden eritilmesinde mikrodalga fırınlar da başarıyla kullanılmaktadır. jelleşmiş bir agarlı besiyerinin yeniden eritilmesi için 90 oC'da 1– 2 dakika tutulma zorunluluğu vardır. Burada. # Eritme amacıyla otoklav da kullanılabilir. Bazılarında "eritme" seçeneği vardır. # Prensip olarak. Bazı otoklavların 90 oC'a ayarlanması mümkün değildir. # Katkı ilave edilmiş agarlı besiyerinin yeniden eritilmesi söz konusu değildir. eritilecek besiyeri hacminin önemli olduğu açıktır. # Genel olarak Plate Count Agar gibi basit bileşimli besiyerleri daha az zarar görür. Bu uygulama daha çok günlük kontrol yapan laboratuvarlarda. Eritme amacıyla aşırı ısıtmadan kaçınılmalıdır.07. # Agarlı besiyerinin eritilmesi gerektiğinde elden geldiği ölçüde az ısı girişinin sağlanması. Bunların eritilmesi zaten zorunludur. Otoklav bu amaçla kullanılacak ise asla sterilizasyon normunda değil. Bu nedenle agarlı besiyerinin sadece bir kez eritilmesine izin verilir.besiyerinin jelleşmesi ile besiyerinin her an kullanılabilecek şekilde elde hazır tutulmasıdır.
Salmonella–Shigella Agar besiyerinde şahit Salmonella kullanılarak yapılan bir çalışmada. # Kutu ilk açıldığı gün envanter kayıt defterine ve kutu üzerine açılış tarihi kaydedilmeli. %5. Kutu açıldıktan sonra dehidre besiyerinin vida kapaklı renkli şişelere dağıtılarak ve ağızları sıkıca kapandıktan sonra kuru ve serin bir yerde tutulmaları raf ömrünü kayda değer ölçüde uzatır.1 nem almış besiyerinde %47. toz akışında değişim. # Kapağı açılmamış bir dehidre besiyerinin raf ömrü genellikle 3–5 yıl kadardır. kullanımdan sonra dehidre besiyeri kapaklarının sıkıca kapatılması ve bunların kuru bir yerde depolanmasıdır. Orijinal ambalaj kapağının açılmasından sonraki raf ömrü. Ticari firmalar tarafından üretilen besiyeri ambalajlarında son kullanım tarihi yazmaktadır. Dehidre Besiyerlerinin Depolanması # Kapağı açılmış besiyerleri ve besiyeri bileşenleri kuru. # Nemden korumanın en emin yolu. # Dehidre besiyerlerinin buzdolabında saklanması önerilmez. # Dehidre besiyerinin kalitesindeki kayıp. su banyosu ve kaynar su banyosu yakını gibi nemin yüksek olduğu yerlerde ve doğrudan güneş ışığı alan dolaplarda depolanmaması gereği ortaya çıkar. serin bir yerde depolanan ve kapağı açılmamış ambalaj ya da açıldıktan sonra doğru (serin ve kuru yerde. kalıplaşma. ilk açıldığında renk. Toz haldeki besiyeri ve bileşenleri için en büyük tehlike bunların nem almasıdır. # Burada verilen tüm bilgiler dehidre haldeki besiyeri bileşenleri için de geçerlidir. homojen yapı göstermeme. Bunun nedeni buzdolabından çıkarıldıktan sonra kutu üzerindeki kondensasyon riskidir. Genel olarak. Bazı besiyerleri ambalajlarında 15 oC altında saklanması önerisine uyulması gerekir. Nem almış ya da açıkça fiziksel değişim gösteren dehidre besiyerleri hiçbir koşulda mikrobiyolojik analizlerde kullanılamaz. kutu ağzı sıkıca kapatılmış olarak) depolama yapılması koşulunda geçerli olduğu unutulmamalıdır. dehidre besiyerlerinin otoklav. kontrol örneğine kıyasla geri alma oranları %1.depolanır. anorganik bileşenler organiklere kıyasla çok daha uzun süre ile depolanabilir. # # # # 32 . karanlık ve serin bir yerde saklanmalıdır. Daha küçük kaplara dağıtımda dehidre besiyeri aşırı toz bulutu oluşturabilir ve bunun solunması zararlıdır.5 nem almış olanda ise %22 olarak bulunmuştur. # Bu bilgiler ışığında. ile anlaşılır. saklama koşullarına doğrudan bağlıdır. Bununla beraber. yıkama odası. Hazırlanmış besiyerlerinin depolanma kuralları daha farklıdır. kutu üzerindeki uyarılara dikkat etmek ve bunlara tümüyle uymak gereklidir. renk değişimi vb. Bu işlemin çeker ocak sisteminde yapılması gerekir. # 03.07. Ancak bu tarihin.01. topaklanma ve kalıplaşma belirtileri için görsel olarak kontrol edilmelidir. # Aksine ve net bir uyarı yoksa dehidre besiyerlerinin oda sıcaklığında (15–25 oC) depolanması yeterlidir. Bu şekilde kullanım sırasında tüm besiyeri yerine sadece daha küçük bir ambalaj açılmış olur.
Bu şekilde depolanmış olan çözeltiler eritildikten sonra tekrar dondurulmamalıdır. Bunların depolanabilme süresi öncelikle bileşimine ve saklama koşullarına bağlıdır. Laboratuvar personeli bu konuda çok dikkatli olmalıdır. Çözeltilerde nem kaybı olması. Buna göre tercihen cam çözelti şişelerinde ve oda sıcaklığında depolanabilirler. Yumurta sarısı içeren katkılarda bu süre daha azdır. cam Petri kutusu vb. # Hazırlanmış besiyerlerinin stabilitesi sınırlıdır. depolama koşullarına bağlıdır. Çözeltilerin Depolanması # Laboratuvarda hazırlanmış çözeltilerin pek çoğu ışığa duyarsızdır ve soğukta saklanması gerekmez. Çoğu katkı için ağzı açılmamış (ya da açıldıktan sonra sıkıca kapatılmış halde.03. besiyerleri hazırlandıktan sonra sterilize edilir ve daha sonra kullanmak üzere depolanır. Bunlardan bazılarının hazırlandıkları gün kullanılma zorunluluğu varken. Benzer şekilde bazı çözeltiler buz dolabında korunmalıdır. kendi hazırlama. bazı besiyerlerinin hazırlandığı gün kullanılma zorunluluğu vardır. Bu uygulamaya çeşitli besiyeri katkıları da girer. Genel olarak. Benzer şekilde kullanıma hazır halde Petri kutularında. # Hazırlanmış besiyerlerinin ne kadar süre ile depolanacağı öncelikle besiyeri bileşimine. hangi ambalajda (tüp. Katkıların Depolanması # Aksine bir uyarı yoksa besiyeri katkıları 2–8 oC'da depolanır. # 03.02. paketleme ve saklama koşullarına göre hazırlanmış her besiyeri için depolama süresini belirlemeli. # 03. Alkol uçucu olduğu için. bu şekilde talimatlara geçmelidir. basit bileşime sahip ve içinde katkı içermeyen besiyerleri. 33 . # ISO 11133'e göre besiyerleri katkı ilave edilmemiş olmak kaydı ile buzdolabında en çok 3 ay.07. bazıları bir süre depolanabilir.03. soğuk ve kuru bir yerde) olmak kaydı ile depolama süresi 3–5 yıldır. oda sıcaklığında en çok 1 ay süre ile depolanabilir. # Işığa duyarlı olan çözeltilerin amber renkli şişelerde depolanması gerekir. vida kapaklı şişelerde vb. şekillerde kullanıma hazır halde besiyerleri sağlanabilmektedir. üzerlerine steril damıtık su ve/veya alkol eklenerek kullanıma hazır hale getirilir. # Sadece antibiyotik içeren katkılar sulandırıldıktan sonra uygun küçük miktarlar halinde (örneğin steril Eppendorf tüplerinde) dondurularak saklanabilir.07. ağzı açık kaplarda uzun süre beklerse konsantrasyonu düşer ve buna bağlı olarak dezenfeksiyon etkisi azalır.04. Her laboratuvar. bunların ağzı iyi kapatılan kaplarda depolanması gerekir. # Katkıda dondurma kaynaklı potansiyel aktivite kaybı olup olmadığı kullanıcı tarafından kontrol edilmeli ve bu şekilde bir katkının bazal besiyerine ilave edildiği laboratuvar kayıtlarında belirtilmelidir. konsantrasyon değişikliğine neden olacağı için. Bununla birlikte. plastik Petri kutusu. # Bazı katkılar. vida kapaklı şişe. Hazırlanmış Besiyerlerinin Depolanması # Çoğu laboratuvarda. diğerlerine göre daha stabildir ve buna bağlı olarak daha kolay depolanabilirler.07.) olduğuna.
Agarlı besiyerinde depolama sırasında (dara hariç olmak üzere) %15 ağırlık kaybı izin verilen sınırdır (bakınız. Rose Bengal gibi bazı bileşenler ışığa aşırı duyarlıdır. Gram negatif bakteriler besiyerindeki kurumaya bağlı olumsuzluklardan daha fazla etkilenir. özellikle selektif besiyerlerinde selektivite veren bileşenlerin %20 konsantrasyon artışı pek çok sahte negatif sonuca yol açar.01. # Işık # Hazırlanmış besiyerleri. Ancak. erlen ve balonlarda hazırlanmış besiyerlerinde nem kaybının önlenmesi kolaydır. 34 .02. # Petri kutularına dökülerek depolanacak agarlı besiyerlerinde nem kaybının önüne geçilmesi için. # Nem # Dehidre besiyerinin nem alması ne denli istenmiyor ise hazırlanmış besiyerlerinde nem kaybından da o denli kaçınmak gerekir. Kuşkusuz. Bu konuda da yine ev mutfaklarında çeşitli gıdaların vakum altında tutulması için üretilmiş basit makinelerden ve bunların özel torbalarından yararlanılabilir. # Petri kutularında nem kaybını önlemek daha güçtür. # Genel olarak plastik Petri kutularında. # Depolanacak Petri kutularında yüzey kurutması yapılmamalıdır. Besiyerinde ozmotik değişmeler olması yanında. Petri kutularını vakum altında depolamak önerilebilir. Petri kutusundaki besiyerinde nem kaybı tüptekinden çok daha fazla olacaktır.08. Bölüm). kapakların tam olarak kapanmasına bağlı olarak cam olanlara göre daha az nem kaybı olur. bu durum çok yaklaşık olarak %20 nem kaybının göstergesidir. ve 47. 47. Dolayısı ile bu bileşeni içeren hazırlanmış bir besiyerinin bulunduğu Petri kutularının (bakınız. Standart laboratuvar tüpünde hazırlanmış Nutrient Agar besiyeri ile sterilizasyondan sonra Petri kutularına dökülmüş Nutrient Agar arasında yüzey/hacim oranı farklılığından kaynaklanan bir nem kaybı farklılığı vardır. 06. özellikle agarlı besiyerlerinin dondurulmasından kesinlikle kaçınılması gerekir. Eğer kullanım öncesinde yüzeyde bir ıslaklık görülürse. peroksitler gibi bakterisit ve bakteriostatik bileşiklerin oluşmasını önlemek için renkli şişelerde ya da doğrudan ışık almayacak şekilde depolanmalıdır. Standart depolamada ilave bir önleme gerek yoktur. kurutma bu aşamada yapılmalıdır. # Sıcaklık Hazırlanmış besiyerleri elden geldiği ölçüde serin ortamlarda tutulmalıdır. Bu olanak yoksa Petri kutularının mutfak tipi strech film ile sarılarak depolanması basit. Tüplerde. Ayrıca kuruma yüzey ve yüzeye yakın yerlerde çok daha fazla olur. depolama başlangıcında 5 mm olan agarlı besiyeri kalınlığı depolama sürecinde 4 mm'ye inerse. # Basit bir örnek olarak. ancak raf ömrünü kayda değer ölçüde uzatan bir uygulamadır. Bu tip cam malzemede kap ağzının parafilm veya mutfak tipi strech film ile sarılması nem kaybını önemli ölçüde önler. Bölüm) mutfak tipi alüminyum folyo ile sarılarak depolanması (hatta inkübasyonu) önerilir.Hazırlanmış besiyerlerinde raf ömrünü belirleyen en önemli faktörler aşağıda kısaca açıklanmıştır.
bileşikteki atom ağırlıkları toplamıdır. sol alt köşeye 0 (sudaki alkol konsantrasyonu) karenin merkezine 76 (hedeflenen konsantrasyon) yazılır. Sonra karenin alt ve üst kenarları boyunca okuma yapılır: %96 konsantrasyondaki alkolden 76 kısım ve %0 konsantrasyonlu alkolden (damıtık su) 20 kısım karıştırıldığında %76'lık alkol elde edilir. Buna göre. Daha fazla sapma olursa. düzeltici uygulama yapılmalı ve kayda geçilmelidir. Genellikle %96 konsantrasyonda pazarlanır. Bunlar genel olarak. # ⇒ %96'lık alkolden 76 hacim # ⇒ %0'lık alkolden 20 hacim # Mikrobiyoloji laboratuvarlarında pH ayarlamak amacıyla genellikle 1 N NaOH ve 1 N HCl kullanılır. Alkol. istenirse 11 mL ilavesi ile 1:10 seyreltme için kullanılabilir. % (dolayısı ile ppm gibi) ifade edilen çözeltiler için kullanılır. Molekül ağırlığı. # İzin verilen sapma hacmi ±%2'dir. dezenfektan olarak %76 (v/v) konsantrasyonda kullanılır. Çözeltilerin Hazırlanması # Mikrobiyoloji laboratuvarında en çok kullanılan çözeltiler seyreltme amaçlı olanlardır. agarın jelleşme özelliğine önemli ölçüde zarar verir. 99 mL olarak hazırlanan çözeltiler istenirse 1 mL ilavesi ile 1:100. Aksine bir uyarı yoksa genel olarak hazırlanmış besiyerleri 4–12 oC'da karanlık ve nem kaybetmeyecek şekilde depolanmalıdır. nedeni araştırılıp.Dondurma. Hacim değişliklerinin temel nedenleri arasında otoklavın yanlış kullanılması da vardır. Rambach Agar gibi bazı besiyerleri için en düşük depolama sıcaklığı 6 oC'dır. Çiğ süt örneklerinde doğrudan 100 misli seyreltme için bu çözeltiler 99 mL olarak da hazırlanabilir. yumurta sarısı–tellurit emülsiyonu ve antibiyotik ilave edilmiş besiyerleri ise 2–8 oC'da depolanmalıdır. Kan. Aşağıda basit bir örnekle derişik olandan daha seyreltiğin hazırlanması verilmiştir: # #-%96'lık alkolden damıtık su ile %76'lık alkol hazırlanması için sol üst köşeye 96. Pearson karesi. # Bileşimi bağlı olmak üzere hazırlanmış besiyerleri için değişik depolama sıcaklıkları önerilmektedir.08. # 90 (ya da 99) mL olarak hazırlanan dilüsyon şişesindeki (erlendeki) sıvı hacmi sterilizasyondan sonra oda sıcaklığında kontrol edilir. # Derişik çözeltilerden daha seyreltik olanların hazırlanmasında. Köşegenler boyunca fark alınarak elde edilen değer diğer köşelere yazılır. Bu amaçla her 25 şişeden biri "A sınıf" dereceli silindir ya da eşdeğeri ile kontrol edilir. Pearson karesi ile hesaplama yapılır. 4 hacim alkol üzerine 1 hacim damıtık su eklendiğinde çok yaklaşık olarak bu değer elde edilir. Buna göre 96 – 76= 20 sağ alt köşeye. "Normal" çözeltilerin hazırlanmasında önce molekül ağırlığı hesaplanır. 90 ve 9 mL hacimde hazırlanır. Laboratuvarda hazırlanarak kullanılan diğer çözeltiler arasında alkol. # # 03. Fraser Broth gibi bazı besiyerlerinde katkı ilave edildiği gün kullanılması gerektiği unutulmamalıdır. asitler ve bazlar ile boyalar vardır. 35 . 76 – 0= 76 sağ üst köşeye yazılarak kare tamamlanır. yumurta sarısı. Hazırlanmış besiyerlerinin standart buzdolaplarının çok soğuk olmayan orta ve alt bölmelerinde depolanması yaygın ve doğru bir uygulamadır.
# 1 litre damıtık su içinde 40 g NaOH çözülmesi ile elde edilen çözelti 1 Molar (M) olarak tanımlanır. hazır besiyerleri ve katkılarını sistematik olarak kalite kontrolden geçirmektedirler. Buna karşın. # Sterilize edilmiş çözeltilerin kontamine edilmemesine özen gösterilmeli. kuşku duyulursa bu çözelti asla kullanılmamalıdır. Besiyeri Kalite Kontrolü # Besiyeri üreten firmalar. ekimlerin her iki grup besiyerinde beraberce (paralel) yapılması ile bir anlamda yeni kutu için kalite kontrol yapılmış olur. istatistik olarak analiz yapılmak üzere birbirlerinden farksız sonuç alınması gerekir. topaklaşma gibi kontroller yapılır. en az 0. Bu şekilde hazırlanmış çözeltide 36.5 g/L olacak şekilde damıtık su üzerine asit ilave edilir (hiçbir koşulda asit üzerine su ilave edilmez). Örneğin. NaOH gibi katı ve saf olmadığıdır. NaOH için tesir (etki) değeri: 1 olduğuna göre 40 g/L çözelti aynı zamanda 1 Normaldir.09.kimyaevi. bileşimi ve gerekli görülen diğer bilgiler şişe üzerinde açıkça belirtilmeli. halen kullanılmakta olan kutudan son parti besiyeri hazırlanırken yeni kutunun açılması. # Çözeltiler konusunda ayrıntılı bilgi www. # Dehidre besiyerleri. Molekül ağırlığının tesir değerine bölünmesi ve çıkan değerin 1 litre suda çözülmesi ile 1 Normal (N) çözelti elde edilir. Buna göre 108 g/L çözelti 1 M. standart derişik (%38) HCl asitten 80. 54 g/L çözelti 1 N'dir.1 mL alınıp. #-Besiyeri üreten firmalar tarafından hazırlanan kataloglarda hangi besiyerinde hangi mikroorganizmaların nasıl gelişeceği "kalite kontrol mikroorganizmaları" adı altında 36 . 1 N (1 M) HCl hazırlamak için son konsantrasyon 36. # Yukarıda besiyerlerinin formülden hazırlanması bölümünde örneği verilmiş olan MgSO4'ın mol ağırlığı 108 gram ve tesir değerliği 2'dir. Kapak açıldıktan sonra renkte anormallik. orijinal ambalajın fiziksel olarak zarar görmemiş olduğu kontrol edilir. #-Laboratuvarda sık kullanılan dehidre besiyerleri için. O: 16. bu kutudan da yeteri miktarda besiyeri hazırlanması. -özellikle kuşku duyulmayı gerektirecek bir durumla karşılaşıldığında. # # 03. Her iki grupta. Na: 23. ürettikleri ve pazarladıkları dehidre besiyerleri.NaOH için molekül (mol) ağırlığı.5 litre damıtık suya ilave edilir ve sonra damıtık su ile litreye tamamlanır.aşağıdaki kontrollerin kullanıcılar tarafından yapılması yararlı olacaktır: #-Önce. # Çözeltinin hazırlandığı tarih. Burada dikkat edilecek konu HCl'in. ISO 11133 sayılı standart üretici firmanın yükümlülüklerini belirlemektedir. # Asitlerden yapılan hesaplamalarda derişim de dikkate alınır. H: 1 olmak üzere 40'tır. #-Aynı uygulama besiyeri katkıları için de yapılmalıdır.org sitesinden sağlanabilir. bileşenleri ve katkılarını kullananlar için ilave kontrol uygulamalarına genellikle gerek duyulmaz. # Buna göre. etiket üzerindeki yazıların silinmemesi sağlanmalıdır.5 g/L saf HCl bulunur.
dehidre besiyerinin nem alması. pH'nın yanlış sıcaklıkta ölçülmesi. inhibitör içeren besiyerlerinde standart dışı uzun süre depolama. pH metre kalibrasyon hatası. yanlış tartım. Bu mikroorganizmaları besiyeri üreten ve/veya pazarlayan firmalardan sağlamanın maliyeti çok yüksek olabilir. #-Besiyerinde kullanıcı tarafından çözülemeyen bir hata kaynağı varsa. dehidre besiyerinin çok eski olması. Görüleceği gibi. cam malzeme ve/veya sudan çeşitli inhibitörler ve/veya yabancı maddelerin kontaminasyonu. erimiş halde uzun süre ile su banyosunda bekletme. Bu gibi hatalar gösteren ya da hatalı olduğundan yana kuşku duyulan besiyerleri mikrobiyolojik analizlerde kullanılamaz. öncelikle besiyerini pazarlayan firmayla temas kurulmalıdır. dehidre besiyerinin çok eski olması. Bölümde ayrıntılı olarak anlatılmıştır.gösterilir. selektif inhibitörlerin bozulacağı kadar yüksek sıcaklıkta katkı ilavesi. besiyerinin çok eski olması. aşırı ısıtma. doğrudan analiz sonucuna yansıyabilecek çeşitli hatalar ile bunların olası nedenleri aşağıda listelenmiştir. hatalı tartım. aşırı ısıtılmış. aşırı ısıtma. Laboratuvarda sürekli analizi yapılan mikroorganizmaların basit bir koleksiyonu ve otokontrol içerikli çalışmalar 09. nem almış. hazırlamasında damıtık su kullanılmamış besiyerlerinde pek çok hata görülmektedir. kirli cam malzeme. asidin besiyeri çok sıcakken ilave edilmesi. dehidre besiyerinin tam çözülmeden dağıtılmış olması. # # 03. #-Bulanıklık ve presipitasyon: Saf olmayan suyun kullanılması. besiyeri ve katkılarının hatalı tartımı ve/veya hatalı ilavesi. hatalı pH. uygun olmayan agar kullanılması. aşırı ısıtma. #-Zayıf gelişme: Yetersiz yıkanmış ve/veya durulanmamış cam malzemeden inhibitör madde kontaminasyonu. #-Anormal renk: Saf olmayan su kullanımı. dehidre besiyerinin çok eski olması. hatalı pH. #-Besiyerinde kararma: Aşırı ısıtma. dehidre besiyeri kutu kapağının nemli bir ortamda uzun süre açık kalması ve/veya gevşek kapatılmış olması. #-Yüksek jelleşme sıcaklığı: Hatalı tartım.10. #-Yanlış pH: Nötral olmayan su kullanımı. #-Kolonilerin yayılması: Besiyeri yüzeyinin çok ıslak olması. Besiyeri Hataları # Besiyerlerinde. #-Aşırı gelişme: Selektif inhibitörlerin bozulacağı kadar aşırı ısıtma veya selektif katkıların yüksek sıcaklıkta bazal besiyerine ilavesi. #-Zayıf jelleşme stabilitesi: Hatalı tartım. #-Dehidre besiyerinde topaklaşma: Depolamada aşırı nem. düşük pH. # 37 . yetersiz yıkanmış cam malzeme kullanılması. temiz olmayan cam malzemenin kullanılması. dehidre besiyerinin çok eski olması. sulandırmadan sonra sterilizasyonun zamanında yapılmaması. yanlış pH. aşırı ısıtma. yanlış tartılmış. dehidre besiyerinin çok eski olması. bileşimden hazırlanmış besiyerlerinde temel bileşen(ler)'in yeterli saflıkta olmaması. selektif inhibitörlerin eksik tartımı/ilavesi. aşırı ısıtma. hazırlanmış besiyerinde depolama sırasında nem kaybı. dehidre besiyerinin çok eski olması. hazırlanmış besiyerinin uygun olmayan koşullarda ve/veya uzun süreli depolanması. #-Atipik gelişme: Besiyerinin hatalı hazırlanması.
deri ve gözde tahriş yapar. Genel bakteri inhibitörü olarak DRBC ve RBC gibi bazı maya–küf besiyerleri bileşimindedir. Bu maddelerden bir kısmı sadece bu maddelere duyarlı kişiler için önemli iken. Fekal streptokoklar ve Cl. bir kısmının etkisi çok uzun süre sonra görülür. Aşağıda insan sağlığı için tehlikeli olan kimyasallara örnekler verilmiştir: #-Barbitone: "Narkotik" grupta değerlendirilir. # Ayrıca. Koliform grup bakteriler için kullanılan bazı besiyerlerinde bulunur. -Malachite green: Solunum sistemi. deri ve gözde tahriş yapar. Toz besiyerleri kullanıldığında tartım sırasında yayılan tozu solumamak için önlem alınması önerilir. Solunum sistemi. deri ve gözde tahriş yapar. göz ve deride tahriş yapar. Tehlikeli maddeler başlıca. Listeria besiyerlerinin bazılarında bulunur. Pseudomonas aeruginosa ve Fraser Broth gibi bazı Listeria besiyerlerinin bileşiminde bulunur. -Lithium choride: Yutulması zararlıdır. 38 . Gram pozitiflerin inhibisyonu için başta VRB Agar olmak üzere bazı koliform grup bakteri besiyerleri bileşiminde bulunur. göz ile temas ve yutma yolu ile çalışanlar için potansiyel hastalıklar oluşturur. #-Cetrimide: Yutulması zararlıdır. deri ile temas. deride tahrişe. Bu selektif katkı ile çalışılırken dikkatli olunması gerekir. Baird–Parker Agar ve Fraser Broth gibi bazı besiyerlerinin bileşiminde yer alır. deri ve gözde tahriş yapar. Solunum sisteminde mukoza irritasyonu ile öksürüğe. deri ve gözde tahriş yapar. # Bazı besiyerlerinin bileşiminde insan sağlığı açısından tehlikeli maddeler bulunur. boyalar vb. kusma ve ishale neden olur. Salmonella ve koliform grup bakteriler için hazırlanmış bazı besiyerlerinin bünyesinde bulunur. #-Brilliant green: Solunum sistemi. bazı besiyeri bileşenlerinin çevre açısından kirlilik oluşturduğu da dikkate alınmalı. selenit. göze bulaşması halinde irritasyona yol açar. tehlikeli olabilecek düzeyin altına iner. asit. deri ve gözde tahriş yapar. talyum gibi bazı kimyasallar ile çalışılırken özel önlem alınması gerekir. Gram pozitifleri inhibe eder. Tehlikeli Maddeler # Dehidre besiyerleri safra tuzları. deri ve gözde tahriş yapar. Bileşimden hazırlanan bazı besiyerlerinde kullanılır. deri ve gözde tahriş yapar. buna göre besiyeri ve bileşenlerinin çöpe atılmasında gereken özen gösterilmelidir.03. Ancak besiyerine ilave edildiğinde konsantrasyon. #-Chloramphenicol: Solunum sistemi. -Kanamycin: Solunum sistemi. görme bozukluğu ve kalp ritim bozukluğuna neden olur. Bunların bir kısmı vücuda kontamine olduğu anda etkisini gösterir. Başta Cetrimide Agar olmak üzere Gram pozitif bakterilerin inhibisyonu için bazı Pseudomonas besiyerlerinde bulunur. Özellikle Pseudomonas aeruginosa ve Salmonella için hazırlanmış RVS Broth gibi bazı besiyerlerinin bileşiminde bulunur. Koliform grup bakteriler için kullanılan bazı besiyerlerinde bulunur. soluma. -Deoxycholate: Solunum sistemi.11. perfringens için hazırlanmış bazı besiyerlerinin bünyesinde bulunur. #-Cycloheximide: Selektif katkı olarak bulunduğu konsantrasyonu tehlikelidir. -Nalidixic acid: Solunum sistemi. zehirli maddeler ile toz gibi zararlı maddeler içerir. #-Crystal violet: Solunum sistemi. Toksik doz. #-Bile salts (safra tuzları): Mukoz membranları tahriş eder.
Selenite Cystine Broth gibi bazı Salmonella besiyerlerinde yer alır. coli O157:H7 için kullanılan CT–SMAC Agar besiyeri katkısında bulunur. deri ve gözde tahriş yapar. başta bakır olmak üzere metaller ile temas ettiğinde patlayıcı metal azitleri oluşturur. Karaciğer. # 39 . çeker ocak). #-Thallium salts (talyum tuzları): Solunması veya sindirilmesi toksik etki yapar. Sindirilmesiyle bulantı. E. Teratojenik potansiyeli olduğundan doğurgan yaşta kadınlar bu madde ile çalışmaları sırasında çok dikkatli olmalıdır. böbrekler ve merkezi sinir sistemine zarar verir. sodium azide asitlerle temas ettiğinde toksik gaz oluşturur. Kümülatif etki riski vardır. Bunların dışında. Campylobacter analizinde kullanılan Bolton Selective Enrichment Broth (Base) bileşiminde bulunur. boğulma ve zatürre semptomlarına yol açar. Sodium azide. Anaeroblar için kullanılan bazı besiyerlerinin bileşiminde yer alır. bu gaz solunum sistemi ve deriyi tahriş eder. Bileşimden hazırlanan bazı besiyerlerinde bulunur. Çözeltisi deri ve gözde tahriş yapar. Enterokoklar için hazırlanan besiyerlerinin bazılarında bulunur. Kümülatif etki riski vardır.05 oranında katılarak Listeria monocytogenes zenginleştirmesinde kullanılabilir. Staphylococcus için hazırlanan besiyerlerinin çoğunda. deriyi tahriş eder. #-Sodium azide: Dehidre besiyerlerinde az miktarda bulunmakla beraber. #-Sodium selenite: Solunması ile bronşiyal spazmlara. Bu nedenle sodium azide içeren besiyerleri yıkama sırasında önce bol su ile muamele edilmelidir. solgunluk ve mide şikâyetleri oluşur. %1'den yüksek konsantrasyonlar ile çalışılırken gereken önlem alınmalıdır (örneğin. #-Sodium thioglycollate: Solunması ve yutulması toksik etki yapar. #-Sodium metabisulphite: Asit ile temasında toksik bir gaz olan sodium dioxide oluşur. Nutrient Broth'a %0. bazı kişilerde aşırı duyarlılık görülebilir. alerjik reaksiyonlara neden olabilir.#-Potassium tellurite: Solunum sistemi.
This action might not be possible to undo. Are you sure you want to continue?
We've moved you to where you read on your other device.
Get the full title to continue listening from where you left off, or restart the preview.