This translation into Turkish was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages
1Texas Therapeutics Institute, University of Texas Health Science Center at Houston, 2Deptartment of Pediatrics, Baylor College of Medicine
This article is a part ofJoVE Clinical and Translational Medicine. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.Recommend JoVE to Your Librarian
Current Access Through Your IP Address
Current Access Through Your Registered Email Address
Jiang, H., Parthasarathy, D., Torregrossa, A. C., Mian, A., Bryan, N. S. Analytical Techniques for Assaying Nitric Oxide Bioactivity. J. Vis. Exp. (64), e3722, doi:10.3791/3722 (2012).
Nitrik oksit (NO) biyolojik sistemler (kan dolaşımında, 1 saniyeden az) 1 derece kısa ömürlü bir iki atomlu serbest radikaldir. NO dahil olmak üzere temel işlevleri düzenleyen, vücudumuzda üretilen en önemli sinyal molekülleri biri olarak ancak kan basıncı, bağışıklık yanıtı ve sinirsel iletişim düzenleme ile sınırlı değildir olabilir. Bu nedenle biyolojik matrisler onun doğru tespiti ve miktar tayini sağlık ve hastalık NO rolünü anlamak için önemlidir. NO gibi kısa bir fizyolojik yarı ömrü ile, NO biyokimya reaksiyon ürünlerinin tespiti için alternatif stratejiler geliştirilmiştir. Çoklu biyolojik bölümlerinde ilgili NO metabolitleri miktarının in vivo açısından NO üretimini, biyoyararlanım ve metabolizması ile değerli bilgiler sağlar. Sadece kan veya plazma gibi tek bir bölme örnekleme her zaman tüm bo doğru bir değerlendirme sağlamak olmayabilirözellikle dokularda, NO durumu dy. Deney hayvanlarında seçin dokuları ile kan karşılaştırmak için yeteneği kadar sağlık ve hastalık NO biyobelirteçlerin tanısal ve prognostik programı gibi temel bilim ve klinik tıp arasındaki uçurumu yardımcı olacaktır. Bu nedenle, belirli ilgi dokulara plazma ya da kan NO durumu ekstrapolasyon artık geçerli bir yaklaşımdır. Sonuç olarak, metotları geliştirmiş ve in vivo deneysel hayvan birden bölümlerinde NO ve NO ile ilgili ürünler / metabolitlerinin saptanması ve miktarının izin hangi geçerliliği devam etmektedir. Ve nitrat (NO 3 -) - nitrit (NO 2) nihai oksidasyona çözünür guanil siklaz (SGC) aktivasyonu NO sentaz tarafından üretim NO biyokimya kurulan paradigması sadece in vivo NO etkilerini bir parçasını temsil edebilir. S-nitrosothi oluşturmak üzere proteini tiyoller, ikincil aminler, ve metaller ile NO ve NO-türevi metabolitlerinin etkileşimiols (RSNOs), N-nitrozaminler (RNNOs) ve nitrosil heme-sırasıyla NO cGMP bağımsız etkilerini temsil eder ve NO SGC aktivasyonu gibi fizyolojik olasılığı kadar önemlidir. Fizyolojisi NO gerçek bir anlayış aynı anda birden fazla bölmeli örnekleme in vivo deneyler türetilmiştir. Nitrik oksit (NO) metodolojisi YOK biyokimya ile ilgili pek çok tartışma ve tartışma karmaşık ve çoğu zaman kafa karıştırıcı bilim ve odak noktasıdır. Yeteneğimizi özellikle üzerine NO menteşeleri içeren yeni mekanizmalar ve sinyal yollarının aydınlatılması, seçici ve hassas tespit ve NO ile ilgili tüm kompleks biyolojik matrisler NO ürünleri ve metabolitleri ölçmek. Burada, bir HPLC ile nitrit ve nitrat hızlı ve duyarlı analiz yöntemi gibi NO moleküler kaynak yanı sıra ile ex vivo olarak belirlemek için kimyasal derivitazation ile in vitro ozon bazlı chemiluminescence kullanarak biyolojik örnekler serbest NO algılanmasıorgan banyosu kasılmaların kâğıda çizilmesi.
1. Tam Kan Toplama
2. Doku Ekstraksiyon ve Hazırlık
3. Endotel Fonksiyon için Aort Yüzük İzolasyonu
Doku Organ Banyosu
4. Temsilcisi Sonuçlar
ENO-20 özel HPLC kullanımı, nitrit ve nitrat spesifik ve duyarlı, yüksek verimlilik yöntemi kullanımı kolay sağlarbiyolojik matrisler. Algılama ve orijinal bir kromatogramıdır ilkesine Şekil 1 'de gösterilmiştir. Bu yöntem, nitrit ve nitrat belirlenmesi için herhangi bir biyolojik numune için kullanılabilir. NO metabolitlerinin CLD tabanlı algılama NO moleküler kaynağını belirlemek için bir kimyasal derivitization adım gerektirir. Kemilüminesans detektörü için eşzamanlı oksidatif denitrosation ve indirgeyici denitrosation için deney düzeneği Şekil 2 'de gösterilmiştir. Sağda Reaksiyon kabı PBS pH 7.4 'de 800mm ferrisiyanür ile doldurulur ve sol tepkime kabına redüksiyon denitrosation için asetik asit (Şekil 2A) potasyum iyodür / iyot karışımı ile doldurulur. Tüm kurulum Şekil 2B 'de gösterilmiştir. Şekil 3 grubunun spesifik denitrosation nitrit algılamak ve sayısal olarak deneyler, nitrozo, nitrozaminler gibi nitrosil heme ürünler göstermektedir. Bu yöntem, daha önce tarif olmuşturyatak ve 4,5 doğrulandı. Bu önemli biyokimyasal analizler kolayca endotel deney hayvanlarında NO üretimini belirlemek için izole aort halkaları üzerinde fonksiyonel çalışmalar ile korele edilebilir. Bu klasik farmakolojik deney kolayca ve doğru endotel fonksiyonu ve üretim NO değerlendirebilir. Gibi asetilkolin gibi endotelyal agonistlere damar reaktivitesi Ölçme doğrudan sonra deney hayvanlarının kan ve doku tespit biyokimyasal belirteçler ile korele edilebilir endotelyal NO üretimini belirleyebilirsiniz. Asetilkolin için bir doz-yanıt tipik bir temsilini Şekil 4 'de gösterilmiştir. Normal endotel fonksiyonu ile sağlıklı kontrol fareleri rahatlatarak asetilkolin yanıt. Endotel disfonksiyonu ile Fare (hiperkolesterolemik fareler) aynı uyarana NO üretimi azalır dolayı daha az rahatlama gösterir.
Incirure 1. ENO-20 ve örnek kromatogram tarafından nitrit ve nitrat saptama ilkesi. Nitrit ve nitrat için algılama ENO-20 yöntemi (Üst) Şematik. (Alt) 10 pmol nitrit ve nitrat standart chromotogram ENO-20 (nitrit ve nitrat 100 nM çözümü 100 ul) enjekte edildi. 100 ul her bir enjeksiyon hacmi ile anyon için 1 nM duyarlılığı. Proteini veya renkli türleri ile hiçbir müdahale.
Tasfiye nitrik oksit gaz gaz faz algılama ile iyodür / iyot testi kullanılarak ferrisiyanür ve indirgeyici denitrosation tarafından hem oksidatif denitrosation kullanarak Şekil 2. CLD deney düzeneği.
Şekil 3. (Panel A) grubu belirli Chemic ile örnek preinkübasyon tarafından indirgeyici denitrosation tayininde nitrit Kemilüminesans algılama, RSNO, RNNOal reaktifler. Pik alanlarının Çıkarma nitrit ve RSNOs algılanmasını sağlar. Ferrisiyanür oksidatif denitrosation çözeltisi kullanılarak nitrosil heme türlerinin (panel B) Chemiluminescent tespiti. Bu yöntem, RSNOs (GSNO ya SNO-albümini), ya da RNNO (NO-pirolidin ve N-nitrozo-albümini) ile bir çapraz reaktivitesi olan NO-heme ürünler için özel.
Şekil 4. Izole aort halkaları üzerinde ex vivo organ banyosu sonra HPLC ve CLD tarafından tespit biyokimyasal belirteçler ile korele edilebilir endotelyal NO üretimini doğrudan bir ölçü sağlar. Bu rakam NO üretiminin azalması nedeniyle endotel disfonksiyonu ile farelerde azalmış rahatlama gösterir.
Yöntemleri çoklu biyolojik bölümlerinde ilgili NO metabolitlerinin ölçümü için burada açıklanan endotelde NO fonksiyonel ölçümleri ile korele edilebilir sağlık ve hastalık NO biyoloji parmak izi için izin verecektir. Bu yöntemler, yüksek verimlilik için uyum potansiyeli olan basit örnek hazırlama gerektirir. Bu moleküllerin miktarı nispi hastalığın deneysel modellerinde ve insan hastalarda bile seri örnekleri arasında bir sayı, NO üretimini ve metabolik akıbeti anlamak yardımcı olabilir. Yapay numune hazırlama sırasında bu ürünlerin bazı üretmek NO bazlı biyolojik ve birçok analitik yöntemlerin belirlenmesinde birçok tuzaklar vardır. Biyolojik örneklerde nitrit dikkatli muhasebe nedeniyle sistein tiyoller 6 ve nitrozo 7 artefakt oluşumu ile reaktivite için çok önemlidir. Anaerobik koşullarda nitrit belirli tespiti için CLD tabanlı metodolojileri yolfarklı biyolojik bölmeleri 8 belirli nitrit redüktaz enzim aktivitesine bağlı tutarlıdır sonuçlanır. Burada anlatılan yöntemlerin tümü iyi belgelenmiş ve onaylanmış ve eserler 9 ortadan kaldırmak veya azaltmak için göz önünde adımlar vardır. Biz eserler önlemek için gerekli kritik adımları anlatacağız. NO metabolitleri Bu çok bölmeli tarama insanlarda tanı veya prognostik yardımcı olabilir ve daha sonra klinikte veya standart laboratuar analizi için kullanılan standart yöntemlerin gelişmesi için olanak sağlayacak ilgili biyolojik belirlenmesine yardımcı olacaktır. Nitrat ve nitrit nitrat 10,11 bir enterosalivary sirkülasyonu ile NO indirgenir sayede bir insan azot döngüsünün son tanınması artık bazı hastalıklarda NO durumu için potansiyel bir belirteç olarak tükürük kullanarak potansiyel açılır. NO durumu Bugüne kadar hastalarda tanı amacıyla rutin olarak kullanılan standart kan kimyası bir parçası değildir. ThNO birçok hastalık sürecinin kritik doğası nedeniyle şok olduğu edilir. Sonuçta, kolay bu NO ilgili biyobelirteçlerin belirlenmesi düzeyde kullanmak için ve yeterli doğrulama sonra belki de hızlı yatakta yan nokta-bakım testleri moleküler tıp rollerini gerçek bir kanıtı olacaktır. İnsanlarda doğrulama için hayvan modellerinde NO statüsünün belirlenmesi için bir standart ve doğru tahlil doğrulamak ve geliştirme alanında yoğun ve birleşik çabaları bu noktada isabetli olmuştur. Bu protokolün açıklanan yöntemler diğerleri hızla bu ölçümler için bir uzlaşma yöntemini benimsemeye sağlayacaktır.
Çıkar çatışması ilan etti.
Yazarlar Hong Jiang, doktora teşekkür etmek istiyorum ve Deepa Parathasarthy, MPH, teknik yardım için BDS.
|Name||Company||Catalog Number||Comments|
|N-ethylmaleimide||Thermo Fisher Scientific, Inc.||23030|
|EDTA||Sigma-Aldrich||E7889|
|Potassium Ferricyanide||Fluka||60299|
|HPLC||Eicom Corp||ENO-20|
|Autosampler||Alcott|
|DMT Myograph||ADInstruments|
|PowerLab||ADInstruments|
|Chemiluminescent||EcoPhysics||CLD 88Y|
|Centrifuge||Eppendorf||5415D|
|Acetylcholine||Sigma-Aldrich||A6625|
|R-(-) Phenylephrine||Sigma-Aldrich||P6126|