Mempersiapkan Slide Mikroskop Memeriksa Hasil Pewarnaan Proses Pewarnaan Gram
Kenakan sarung tangan dan Ikat rambut yang panjang untuk mencegah kontaminasi bakteri terhadap sampel yang akan Anda uji. Bersihkan ruang kerja di bawah lemari asam, atau di daerah lain yang berventilasi baik. Periksa pembakar Bunsen dan pastikan mikroskop berfungsi dengan baik sebelum Anda mulai. Jika slide kaca kotor, cuci dengan air sabun untuk menghilangkan minyak dan kotoran. Bersihkan slide dengan etanol, pembersih kaca, atau metode lain yang digunakan oleh laboratorium Anda. Anda dapat menggunakan teknik pewarnaan Gram untuk membantu mengidentifikasi bakteri dalam sampel medis, atau kultur bakteri yang tumbuh dalam cawan petri. Agar hasilnya baik, gunakan pewarnaan Gram pada sapuan tipis dari sampel. Sebaiknya menggunakan sampel berumur kurang dari 24 jam, karena bakteri yang lebih tua mungkin telah mengalami kerusakan dinding sel dan kurang memberi respon terhadap pewarnaan Gram.  Jika menggunakan sampel jaringan, tambahkan 1-2 tetes ke slide kaca. Sebar secara merata pada slide untuk membentuk taburan sampel berlapis tipis, dengan menggesernya menggunakan tepi slide kaca steril lainnya. Biarkan mengering sebelum melakukan langkah berikutnya. Jika Anda mengambil bakteri dari cawan petri, sterilkan loop inokulasi dalam pembakar Bunsen sampai berpendar, kemudian biarkan mendingin. Gunakan loop tersebut untuk meneteskan air steril ke atas slide, kemudian sterilkan dan dinginkan lagi sebelum menggunakannya untuk mengambil sedikit sampel bakteri. Setelah itu aduk dengan lembut.  Bakteri yang disiapkan dalam kaldu harus diaduk kembali dengan menggunakan vortexer, kemudian diambil dengan loop inokulasi seperti di atas, tanpa menambahkan air.  Jika Anda memiliki sampel swab (biasanya dilakukan dengan gagang kecil berujung kapas), sentuh dan putar spons swab dengan lembut di atas slide. Panas akan menahan bakteri di atas slide, sehingga tidak mudah terlarut selama proses pewarnaan. Sentuhkan slide dengan cepat dua sampai tiga kali ke atas pembakar Bunsen, atau panaskan slide di atas pemanas slide listrik. Jangan terlalu panas, sampel dapat menjadi rusak. Jika menggunakan pembakar Bunsen, apinya cukup yang kecil tapi berwarna biru, bukan api oranye yang besar. Sebagai pilihan lain, apusan juga dapat dibuat dengan metanol, dengan menambahkan 1-2 tetes metanol ke atas apusan kering, keringkan metanol yang tersisa di atas slide dengan membiarkannya di udara terbuka. Teknik ini meminimalkan kerusakan sel dan memberikan latar belakang gambar slide yang bersih. Nampan pewarnaan terbuat dari logam, kaca, atau piring plastik dangkal dengan jaring-jaring lembut yang terletak di bagian atasnya. Tempatkan slide di atas jaring-jaring ini, sehingga cairan yang Anda gunakan dapat terbuang ke dalam nampan. Jika Anda tidak memiliki nampan pewarnaan, Anda dapat menempatkan slide di atas nampan plastik untuk mencetak es batu. Tempatkan slide di bawah mikroskop. Bakteri sangat bervariasi dalam hal ukurannya, sehingga total perbesaran yang diperlukan akan bervariasi dari 400x sampai 1000x. Lensa objektif dengan minyak imersi direkomendasikan untuk memperoleh gambar yang lebih tajam. Teteskan minyak imersi pada slide, hindari gerakan selama meneteskannya untuk mencegah terjadinya gelembung.Gerakkan gagang lensa mikroskop sehingga lensa objektif terpasang pada tempatnya dan menyentuh minyak Minyak imersi hanya dapat digunakan pada lensa yang dirancang khusus, bukan pada lensa "kering". Periksa slide di bawah mikroskop cahaya. Bakteri gram positif tampak berwarna ungu, karena kristal violet terperangkap di dalam dinding sel yang tebal. Bakteri gram negatif akan berwarna merah muda atau merah, karena Kristal violet terbilas keluar melalui dinding sel yang tipis, dimana pewarna tandingan merah muda masuk.  Jika sampel terlalu tebal, hasilnya dapat menjadi positif palsu. Lakukan pewarnaan pada sampel baru jika hasilnya menunjukkan semua bakteri gram positif, untuk memastikan hasilnya benar. Jika Anda menggunakan terlalu banyak peluntur warna, hasilnya dapat menjadi negatif palsu. Lakukan pewarnaan pada sampel baru jika hasilnya menunjukkan semua bakteri gram negatif, untuk memastikan hasilnya benar. Jika Anda tidak tahu bagaimana bentuk bakteri, pelajari koleksi gambar referensi yang biasanya diurutkan berdasarkan bentuk dan hasil pewarnaan Gram. Anda juga dapat melihat database online di [National Microbial Pathogen Database, Bacteria in Photos, dan banyak situs online lainnya. Untuk memudahkan identifikasi, di bawah ini adalah contoh-contoh bakteri yang biasa dijumpai atau penting untuk diagnosis, diklasifikasi berdasarkan status Gram dan bentuknya. Bakteri diklasifikasikan lebih lanjut menurut bentuknya di bawah mikroskop, paling sering sebagai kokus (bulat) atau batang (silinder). Berikut adalah beberapa contoh bakteri gram positif (berwarna ungu) menurut bentuknya:   Kokus Gram positif biasanya Stafilokokus (yang berarti kokus berkelompok) atau Streptokokus (yang berarti kokus berantai). 'Batang Gram positif  seperti Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, dan Listeria. Bakteri batang Actinomyces spp. biasanya memiliki cabang atau filamen. Bakteri gram negatif (berwarna merah muda) sering diklasifikasikan menjadi tiga kelompok. Bakteri kokus berbentuk bulat, bakteri batang berbentuk tipis panjang, sementara bakteri batang kokoid berbentuk diantara keduanya.   Kokus Gram negatif yang paling sering dijumpai adalah Neisseria spp.  Batang Gram-negatif misalnya E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas, dan banyak lagi yang lain. Vibrio cholerae dapat terlihat sebagai batang biasa atau batang yang menekuk.   Bakteri batang gram-negatif "kokoid" (atau "coccobacilli") misalnya Bordetella, Brucella, Haemophilus, dan Pasteurella Beberapa bakteri sulit untuk diberi warna secara tepat, karena kerapuhan atau sifat dinding selnya yang mirip lilin. Bakteri-bakteri ini mungkin menunjukkan campuran warna ungu atau merah muda dalam sel yang sama, atau di antara sel-sel yang berbeda dalam apusan yang sama. Sampel bakteri yang berumur lebih dari 24 jam dapat menunjukkan masalah ini, tetapi ada juga beberapa spesies bakteri yang tetap sulit untuk diberi warna pada umur pengambilan sampel berapapun. Bakteri-bakteri ini memerlukan tes yang lebih khusus untuk identifikasi, seperti pewarnaan tahan asam, pengamatan dalam kultur bakteri, media kultur TSI, atau tes genetik.   Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium, dan  Propionibacterium spp. semuanya adalalah bakteri gram positif, tetapi sering tidak terwarnai dengan jelas.  Bakteri kecil dan ramping seperti Treponema, Chlamydia, dan Rickettsia spp.  sulit untuk diwarnai dengan metode Gram. Prosedur pembuangan limbah ini bervariasi antar laboratorium dan disesuaikan dengan bahan yang digunakan. Biasanya, cairan dalam baki pewarnaan dibuang dalam botol yang dilabel sebagai limbah berbahaya. Rendam slide dalam larutan pemutih 10%, kemudian buang dalam wadah untuk benda tajam. Gunakan pipet untuk menyiramkannya ke atas sampel bakteri dengan beberapa tetes pewarna kristal violet, atau juga disebut gentian violet. Diamkan selama 30-60 detik. Kristal violet (KV) terpisah di dalam larutan air menjadi ion KV+ dan klorida (Cl-). Ion-ion ini menembus dinding sel dan membran sel dari bakteri gram positif maupun gram negatif. Ion KV+ berinteraksi dengan komponen bermuatan negatif dari sel-sel bakteri sehingga membuat sel berwarna ungu. Banyak laboratorium menggunakan Kristal violet "Hucker”, yang mengandung amonium oksalat untuk mencegah pengendapan. Miringkan slide dan gunakan botol pencuci untuk menyemprotkan aliran kecil air suling atau air keran ke atas slide. Air harus lari ke bawah di atas permukaan apusan, dan tidak boleh disemprotkan langsung pada apusan. Jangan membilas secara berlebihan. Hal ini dapat menghilangkan pewarnaan pada bakteri Gram positif. Gunakan pipet untuk menyiram apusan dengan yodium. Biarkan selama minimal 60 detik, kemudian bilas dengan hati-hati menurut cara yang yang sama dengan di atas.Yodium, dalam bentuk ion bermuatan negatif, berinteraksi dengan KV+ untuk membentuk kompleks senyawa yang besar antara Kristal violet dan yodium (Kompleks senyawa KV-I) di lapisan dalam dan luar sel. Kompleks senyawa ini akan menahan warna ungu dari Kristal violet di dalam sel, pada lokasi-lokasi yang terwarnai. Yodium adalah zat korosif. Jangan sampai terhirup, tertelan, atau kontak dengan kulit. Campuran 1:1 antara aseton dan etanol biasanya digunakan untuk langkah penting ini, yang harus diperhatikan waktunya secara cermat. Posisikan slide pada sudut tertentu, kemudian tambahkan peluntur warna sampai tidak ada lagi warna ungu terlihat dalam air yang digunakan untuk membilas. Ini biasanya memakan waktu kurang dari 10 detik, atau bahkan kurang waktu jika peluntur warna mengandung konsentrasi aseton yang tinggi. Segera hentikan langkah ini, jika tidak peluntur warna juga akan melunturkan kristal violet dari sel gram positif dan negatif, dan proses pewarnaan harus diulang. Segera bilas kelebihan peluntur warna dengan menggunakan teknik sebelumnya.  Aseton murni (95% +) dapat digunakan sebagai pengganti.Semakin banyak aseton yang digunakan, semakin cepat peluntur warna akan bekerja sehingga perlu memperhatikan waktunya dengan lebih cermat. Jika Anda kesulitan memperhatikan waktu untuk langkah ini, tambahkan peluntur warna tetes demi tetes. Pewarna tandingan, biasanya safranin atau fuchsin, digunakan untuk menambah kontras antara bakteri gram negatif dan gram positif, dengan memberi warna bakteri yang telah luntur warnanya (ter-dekolorisasi), yaitu bakteri gram negatif, dengan warna merah muda atau merah.Biarkan selama setidaknya 45 detik, lalu bilas. Fuchsin akan secara intensif memberi warna pada banyak bakteri gram negatif, seperti Haemophilus spp dan legionella spp. Cara ini baik untuk pemula. Anda dapat mengeringkannya di udara terbuka udara kering, atau mengeringkannya  menggunakan kertas bibulous yang dijual untuk tujuan ini.Proses pewarnaan Gram selesai.
Bersiaplah untuk bekerja di laboratorium. Sterilkan slide kaca mikroskop. Letakkan sampel ke atas slide kaca. Temperatur yang agak tinggi dapat membuat apusan yang baik. Posisikan slide di atas nampan pewarnaan. Siapkan Mikroskop cahaya. Coba identifikasi bakteri gram positif dan gram negatif. Bandingkan hasil yang Anda lihat dengan gambar referensi. Identifikasi bakteri gram positif berdasarkan bentuknya. Identifikasi bakteri gram negatif. Periksa dengan cermat jika hasilnya beragam. Buang bahan dan peralatan habis pakai yang tersisa. Siramkan cairan kristal violet ke atas apusan. Bilas Kristal violet dengan lembut. Siram apusan dengan yodium, lalu bilas. Tambahkan peluntur warna, lalu bilas dengan cepat. Siramkan pewarna tandingan ke atas apusan, lalu bilas. Keringkan slide.
https://www.wikihow.com/Gram-Stain https://www.wikihow.com/Gram-Stain https://www.wikihow.com/Gram-Stain
Preparing a Gram Stain Examining the Result Performing the Gram Stain