DNS-replikáció
A DNS-replikáció vagy DNS-másolás az a folyamat, aminek eredményeképpen az eredeti dezoxiribonukleinsav alapján két, egymással azonos molekula keletkezik. A DNS-replikáció minden élőlényben lezajlik, ez az öröklődés alapját biztosító biológiai folyamat. A DNS két szálból áll, ezek a másolás során szétválnak és rajtuk, bázissorrendjüket templátnak használva enzimek új, komplementer (kiegészítő) szálat szintetizálnak. Ez az úgynevezett szemikonzervatív modell, amikor az utódmolekulák félig a kiindulási DNS-ből állnak. A másolás pontosságát szintén enzimek ellenőrzik.

A sejten belül a replikáció nem a DNS-molekula végén, hanem bizonyos köztes pontokon, az origókban kezdődik. A szétcsavarodó szálak és a rajtuk szintetizálódó új fonalak hozzák létre a replikációs villát. Az új szál szintézisét a DNS-polimeráz enzim végzi.

A DNS-replikáció kémcsőben, sejten kívül is elvégezhető. Ismert szekvenciájú DNS-mintát enzimek és szükséges vegyületek hozzáadásával sokszorosan le lehet másolni, ez szolgál alapul a polimeráz-láncreakció metodikájának, amelyet általánosan használnak kórokozók detektálására, az igazságügyi orvostanban, a kutatásban és egyéb területeken

A DNS szerkezete
A DNS többnyire kettős szálú struktúrába rendeződik, ahol a szálak egymás köré csavarodnak, ez az ún. kettős hélix. Az egyes szálak egymás után sorakozó nukleotidokból állnak. A nukleotidok egy dezoxiribóz cukormolekulából, egy foszfátcsoportból és egy nukleobázisból tevődnek össze. A DNS-ben négyféle nukleotid lehet, a nukleobázisuk alapján: az adenozin (bázisa az adenin), citidin (citozin), guanozin (guanin) és timidin (timin), melyeknek általánosan elterjedt rövidítése az A, C, G és T. Az adenin és a guanin purinbázis, míg a citozin és a timin pirimidin. A nukleotidok foszfát és cukorcsoportjai egymáshoz kapcsolódva alkotják a DNS-szál gerincét, amelyről oldalt lelógnak a bázisok. Két szál bázisai egymással hidrogénkötéseket tudnak létesíteni, bázispárokat hozva létre. Az adenin csak timinnel (két hidrogénkötés), míg a guanin csak citozinnal (három hidrogénkötés, ezért ez erősebb mint az A-T pár) képes összekapcsolódni. Emiatt a szétválasztott szálak egymás kiegészítői (komplementerei) és bármelyik alapul szolgálhat a másik szál szintéziséhez (egymás templátjai).

A DNS-szálaknak irányultsága van. A nukleotidok dezoxiribózához két foszfátcsoport kapcsolódik, egyik a 3., a másik az 5. szénatomhoz. Aszerint, hogy melyik foszfát van közelebb a végéhez, beszélünk 3' és 5' végről. A DNS másolása, leolvasása a biológiai rendszerekben mindig 5'->3' irányban történik, ezért a nukleotidok egymásutánját, szekvenciáját is ebben az irányban adják meg. A DNS két szála fordított irányultságú, egyikük 5'-3', míg a másik 3'-5' irányban áll.

A DNS-polimeráz

A DNS-polimeráz nem egy konkrét enzim, hanem egy enzimcsalád, mely tagjainak feladata a DNS másolása. Ők maguk nem képesek új szál szintézisét elkezdeni a régin, hanem csak a meglévő második szálat tudják hosszabbítani, ezért a kezdéshez egy rövid, egyszálú DNS-re vagy RNS-re, az úgynevezett primerre (ejtsd prájmer) van szükségük, amely a templáthoz kapcsolódva kis szakaszon kétszálú szerkezetet hoz létre, amelyet az enzim hosszabbíthat.

Az enzim az új DNS-szál 3' végéhez foszfodiészter kötéssel kapcsol új nukleotidokat, a régi szál bázissorrendjének megfelelően. Ehhez nukleozid-trifoszfátokat használ fel amelyekben a bázishoz és cukorhoz három foszfátcsoport csatlakozik nagyenergiájú kötéssel. Az enzim erről lehasít egy pirofoszfátot és a felszabaduló energia felhasználásával létrehozza a foszfodiészter kötést a keletkező nukleotid (nukleotid a bázis-cukor-foszfát hármas elnevezése) foszfátcsoportja és a DNS-szál 3' végének dezoxiribóza között. A felbomló nagyenergiájú kötés miatt a reakció gyakorlatilag irreverzibilis.

A DNS-polimeráz igen pontosan dolgozik, alapműködése során csak minden tízmilliomodik bázisnál téved. Emellett azonban hibaészlelő és -javító aktivitással is rendelkezik: a szál végéről eltávolítja az észlelt hibás nukleotidot, majd folytatja annak hosszabbítását. Ezenkívül a replikáció után egy másik javítómechanizmus is leellenőrzi a másolás hűségét és képes különbséget tenni a régi és az újonnan készült szál között. Összességében a DNS-replikáció hibarátája mindössze egy tévedés minden egymilliárd beépített bázisban.

Az élő sejtben zajló DNS-replikáció sebességét E. coli baktériumot fertőző T4 fág esetében határozták meg először. A vírus DNS-polimeráza 749 nukleotidot épített be másodpercenként és ennek során minden százhetvenmilliomodiknál ejtett hibát. A DNS másolása meglepően gyorsnak és pontosnak tekinthető.

A replikáció folyamata 
A replikáció három fázisból áll: kezdés (iniciáció), szálhosszabbítás (elongáció) és befejezés (termináció).

Iniciáció 

A sejt osztódása előtt annak DNS-tartalma megkettőződik. A folyamat bizonyos pontokon, az ún. replikációs origóknál indul, amelyekhez hozzákötődnek az iniciátor fehérjék. Escherichia coli esetében az iniciátor a DnaA, míg élesztőben az origófelismerő komplex. Az iniciátorok által felismert régiók többnyire A és T bázisokban gazdagok, mert két hidrogénkötésüket könnyebb felbontani, mint a G és C három kötését. Ha sikeresen megkötötték a DNS-t, egyéb proteinek segítségével létrehozzák a pre-replikációs komplexet, amely szétcsavarja a DNS egymás köré tekeredő szálait és ún. replikációs buborék keletkezik.

Elongáció
A DNS-polimeráznak egy szabad 3' OH-csoportra van szüksége a feladata elvégzéséhez, vagyis az új szál 5'-3' irányban készül és ennek megfelelően a templátszálon 3'-5' irányban halad a másolóenzim. A szintézis mechanizmusát illetően négy változat ismert:
valamennyi sejtes organizmus és sok DNS-vírus, bakteriofág és plazmid azt a módszert alkalmazza, hogy a primáz enzim egy rövid RNS-primert készít az egyszálú DNS-re, melynek szabad 3' OH-csoportjáról a DNS-polimeráz már képes elindulni.
a retrovírusok és retrotranszpozonok egy transzfer RNS-t használnak primerként a reverz transzkriptáz számára
az adenovírusok és a bakteriofágok φ29 családja esetében a szabad OH-csoportot egy DNS-kötő fehérje egyik aminosava szolgáltatja, ehhez kapcsolja a DNS-polimeráz az új szálat.
az egyszálú DNS-vírusok (circovírusok, geminivírusok, parvovírusok, stb) és azok a kétszálú fágok és plazmidok amelyek a másolás guruló kör modelljét használják, a cirkuláris DNS egyik szálát (vagy ha egyszálú akkor azt) egy endonukleázzal elvágják, a nukleáz megköti az 5' véget, míg a szabad 3' végen elkezdődhet a szálhosszabbítás.

Ezek közül az első a messze legelterjedtebb és legjobban feltárt mechanizmus. Ennek során, miután a dupla hélix két szála elvált egymástól, a primáz enzim RNS-primert készít rajtuk. A vezető szálon (lásd lejjebb) egy primer készül, melyet folyamatosan, hosszasan hosszabbít meg a DNS-polimeráz, míg a követő szálra több primer szintetizálódik, melyek a következő primerig egészülnek ki, így jönnek létre az Okazaki-fragmentumok. A primerek egy RNáz távolítja el, és a helyükön maradó réseket egy másik DNS-polimeráz (nem az, amelyik a szálhosszabbítást végzi) betölti. Ez nem képes kovalensen összekötni az általa szintetizált rövid DNS-szakaszt a korábban készült hosszú szállal, ezt a feladatot a ligáz enzim látja el, amely révén a replikáció befejeződik és végeredményül hosszú, folyamatos, kétszálú DNS jön létre.

A baktériumok és eukarióták/archeák által használt primáz jelentősen különbözik egymástól. A bakteriális primáz a DnaG családba tartozik, szerkezetileg a topoizomeráz Ia és II, egyes nukleázok és DNS-javító enzimek rokona. Az eukarióta primáz viszont egészen más szerkezetű, leginkább a vírusok RNS-függő RNS-polimerázára, a reverz transzkriptázra, a ciklikus nukleotidokat készítő ciklázra és egyes DNS-polimerázokra hasonlít.

A DNS replikációját többféle polimeráz végzi. E. coliban a gyors működésű DNS-polimeráz III (Pol III) végzi a szálhosszabbítást, míg a DNS-polimeráz I (Pol I) feladata az RNS-primerek lebontása és helyének DNS-sel való betöltése. A Pol I lassan (jóval lassabban, mint a Pol III) végighalad az RNS-DNS hibriden, maga előtt bontja az RNS-t, maga mögött pedig annak helyére dezoxiribóz-tartalmú nukleotidokat épít be. Eukariótákban a lassú Pol α segít a replikáció beindításában, míg a gyors szálhosszabbítók a Pol δ és Pol ε enzimek.

A DNS-szintézis előrehaladtával a buborék két oldalán folytatódik az eredeti kettős hélix szétcsavarása és mindkét végen ún. replikációs villa halad. A baktériumok kör alakú genomjában csak egy origó található és az előrehaladó replikációs formációt théta-struktúrának nevezik (a görög θ betű nyomán, amire alakja emlékeztet). Ezzel ellentétben az eukarióták kromoszómái lineárisak és rajtuk több replkációs origó is található.

A replikációs villa

Ahogyan a helikázok széttekerik a DNS két szálát és rajtuk folyik az új szálak szintézise, kétágú alakzat jön létre, a replikációs villa. Az egyik ág a vezető szál, a másik pedig a követő szál. Mivel a DNS-szintézis csak 5'-3' irányba történhet és a szálak egymással ellentétes orientációjúak, valahogyan meg kell oldani a fordított állású lánc replikációját.

A vezető szál annak a DNS-láncnak a neve, amelyen a replikáció iránya egybeesik a replikációs villa haladásának (vagyis a kettős hélix széttekerésének) irányával. A polimeráz ezen a szálon folyamatosan tudja olvasni a templátot és annak alapján megszakítás nélkül hosszabbítja az új láncot. Az enzim prokariótákban a Pol III, élesztőben pedig feltehetően a Pol ε. Emberi sejtekben a vezető szál polimeráza a Pol ε, a követő szálé a Pol δ, a mitokondriumokban pedig a Pol γ  A Pol ε szükség esetén helyettesíteni tudja a Pol δ-t.

A követő szál az, amelyiken a szintézis iránya ellentétes a replikációs villa haladásával. Ezért itt az új szál rövid szakaszokban, úgynevezett Okazaki-fragmentumokban készül. A replikáció ugyanúgy rövid RNS-primerrel kezdődik, amit később eltávolítanak és a fragmentumokat a ligázok összekapcsolják. Az Okazaki-fragmentumok baktériumokban 1000-2000 bázis, míg eukariótákban csak 100-200 bázis hosszúságúak.

Eukariótákban a primáz a Pol α enzimkomplex része. A fragmentumok hosszabbítását a Pol III (prokariótákban) vagy a Pol δ/Pol ε (eukariótákban) végzi. Az RNS-primert eukarióta sejtekben szintén a Pol δ távolítja el. Baktériumokban az utóbbit a Pol I végzi.

Amikor a helikáz szétcsavarja a kétszálú DNS-t, az előtte lévő hélix-szakasz forogni kényszerül és rövid időn belül akkora torziós feszültség gyülemlik fel benne, ami megállítaná a replikációs villa előrehaladását. Ezt elkerülendő, a topoizomeráz enzimek időnként eltörik, majd újból összekötik a dupla hélixet; sőt ezt nem csak meglévő feszültség esetén teszik meg, hanem előre negatív másodlagos struktúrába csavarják azt.

A csupasz egyszálú DNS hajlamos másodlagos struktúrákba rendeződni, amelyek zavarják a DNS-polimeráz működését. Ennek elkerülése érdekében speciális proteinek kötődnek hozzá, amelyek meggátolják a másodlagos hurkok kialakulását a második szál elkészültéig. Az egyszálú DNS-molekulát kapocsproteinek is körülveszik, amelyek belső üregében a lánc kényelmesen tud siklani és amelyekbe a DNS-polimeráz bele tud kapaszkodni, felgyorsítva a replikációt. Amikor a polimeráz eléri a templát végét vagy kettős szálat észlel maga előtt, a kapocs egy konformációs változás következtében leválik.:274-5

A replikációs villán összegyűlt különböző funkciójú enzimek és struktúrproteinek alkotják a repliszómát. Ennek fontosabb alkotóelemei a következők:

Termináció 
Az eukarióta kromoszómán több ponton kezdődik a másolás, majd amikor a replikációs villa eléri a következő szakasz kezdetét, a polimeráz különösebb szabályozás nélkül leválik a kettős hélixről. A lineáris kromoszómák legvégét azonban nem tudják elérni és a másolást annak közelében, az ismétlődő szakaszokat tartalmazó telomer régióban abbahagyják. Emiatt az új szálak mindig rövidebbek valamivel a kiindulási DNS-szálnál. A testi sejtek a DNS-vesztés miatt csak bizonyos számú osztódást képesek elvégezni, ez az ún. Hayflick-korlát. Az ivarsejtekben a telomeráz enzim újabb rövid, ismétlődő szakaszokat illeszt a kromoszóma végére, így kerülik meg a korlátot. A telomeráz mutáció következtében testi sejtekben is aktiválódhat, ami könnyen tumor kialakulásához vezethet, sőt a rosszindulatú rákos elváltozás egyik előfeltétele.
 
A baktériumok kör alakú kromoszómáin a másolás akkor ér véget, amikor az origóval ellentétes oldalon a két replikációs villa találkozik. E. coli-ban ezen a helyen egy terminációs szekvencia található; ehhez a Tus-protein köt, amely meggátolja a helikáz működését, így a villák mindig a terminációs régióban találkoznak.

Szabályozás

Az eukarióták esetében a DNS-replikáció a sejtciklushoz kötött. A sejt növekedése és osztódása során különböző fázisokon megy át; a DNS másolása az S (szintézis) fázisban zajlik le. A sejtciklus előrehaladása és a fázisváltás ún. ellenőrző pontok révén történik, ezeket a ciklin és ciklin-függő kináz proteinek szabályozzák.

A DNS-replikációja (és az azt követő osztódás) a G1/S ellenőrzőpont állapotától függ. Azok a sejtek, amelyek megállnak ennél a pontnál G0 fázisban maradnak és nem másolják DNS-üket.

A mitokondriumok és kloroplasztiszok osztódása és DNS-másolása nem függ a sejtciklustól.

A baktériumok többsége nem meghatározott szakaszokra oszló sejtciklus során osztódik és folyamatosan másolhatja a DNS-ét. Bőséges táplálék és gyors növekedés esetén az egymás követő DNS-replikációk miatt több genom is felhalmozódhat a sejtben. A legjobban ismert baktériumban, az E. coli-ban a DNS másolását több mechanizmus is szabályozza, mint például az hemimetilált origó (az egyik DNS-szálhoz való metilcsoport-kapcsolás), az ATP/ADP arány vagy a DnaA protein mennyisége. Valamennyi az iniciátorok origóhoz való hozzáférését gátolja.

Az E. coli vírusgátló restrikciós rendszere metilálja a saját GATC nukleotidszekvenciákat (mindkét szálon, lévén a GATC palindrom szekvencia). A replikáció után értelemszerűen csak a régi szál metilált, és ezt a hemi-(félig)metilált szakaszt felismeri a SeqA protein, amely hozzáköt és megakadályozza az újabb replikációt. Az iniciációt végző DnaA önmagában is nehezebben köti a hemimetilált DNS-t.

Bőséges táplálék esetén az ATP szintje megemelkedik és ha a sejt bizonyos méretet elért, megindítja az osztódást megelőző DNS-másolást. ATP és az ADP egymással verseng a DnaA egyik kötőhelyéért és a létrejövő DnaA-ATP komplex képes iniciálni a replikációt. A DnaA fehérjemolekulák száma is limitáló lehet; minden replikáció után újabb origók, újabb kötőhelyek jönnek létre a számára és a kritikus mennyiség elérésére újabb DnaA proteinek szintézisére van szükség.

A polimeráz-láncreakció
Bár a sejtekben a DNS-replikáció sok enzim koordinált és szabályozott munkáját igénylő folyamat, leegyszerűsített formában kémcsőben is gyorsan végbemegy. Ezt használják ki a polimeráz-láncreakció során. A kiindulási DNS-hez kész primereket (rövid, egyszálú DNS-szakaszokat, amelyek felismerik a templát bizonyos szakaszait és hozzákötődnek), nukleozid-trifoszfátokat és hőálló DNS-polimerázt adnak. A helikázokat magas hőmérséklettel pótolják, amelyen a DNS két szála elválik egymástól. Miután hagyták a polimerázt dolgozni egy ideig, a reakcióelegyet újból felmelegítik és szétválasztják egymástól az újonnan készült szálakat is, amelyek a lehűtés után maguk is primerkötőhellyé válnak. Minden ciklusban megduplázódik a primerek által közrefogott DNS-szekvencia és néhány tíz ciklus után a nagyon kis mennyiségben jelen lévő DNS-szakasz (például egy kórokozó vagy igazságügyi orvostani minta) könnyen kimutathatóvá válik.

Jegyzetek

Fordítás 

Molekuláris biológia
Sejtbiológia
Lefordítandó ábrát tartalmazó szócikkek
A DNS-replikáció vagy DNS-másolás az a folyamat , aminek eredményeképpen az eredeti dezoxiribonukleinsav alapján két , egymással azonos molekula keletkezik . A DNS-replikáció minden élőlényben lezajlik , ez az öröklődés alapját biztosító biológiai folyamat . A DNS két szálból áll , ezek a másolás során szétválnak és rajtuk , bázissorrendjüket templátnak használva enzimek új , komplementer ( kiegészítő ) szálat szintetizálnak . Ez az úgynevezett szemikonzervatív modell , amikor az utódmolekulák félig a kiindulási DNS-ből állnak . A másolás pontosságát szintén enzimek ellenőrzik . A sejten belül a replikáció nem a DNS-molekula végén , hanem bizonyos köztes pontokon , az origókban kezdődik . A szétcsavarodó szálak és a rajtuk szintetizálódó új fonalak hozzák létre a replikációs villát . Az új szál szintézisét a DNS-polimeráz enzim végzi . A DNS-replikáció kémcsőben , sejten kívül is elvégezhető . Ismert szekvenciájú DNS-mintát enzimek és szükséges vegyületek hozzáadásával sokszorosan le lehet másolni , ez szolgál alapul a polimeráz-láncreakció metodikájának , amelyet általánosan használnak kórokozók detektálására , az igazságügyi orvostanban , a kutatásban és egyéb területeken A DNS szerkezete A DNS többnyire kettős szálú struktúrába rendeződik , ahol a szálak egymás köré csavarodnak , ez az ún. kettős hélix . Az egyes szálak egymás után sorakozó nukleotidokból állnak . A nukleotidok egy dezoxiribóz cukormolekulából , egy foszfátcsoportból és egy nukleobázisból tevődnek össze . A DNS-ben négyféle nukleotid lehet , a nukleobázisuk alapján : az adenozin ( bázisa az adenin ) , citidin ( citozin ) , guanozin ( guanin ) és timidin ( timin ) , melyeknek általánosan elterjedt rövidítése az A , C , G és T. Az adenin és a guanin purinbázis , míg a citozin és a timin pirimidin . A nukleotidok foszfát és cukorcsoportjai egymáshoz kapcsolódva alkotják a DNS-szál gerincét , amelyről oldalt lelógnak a bázisok . Két szál bázisai egymással hidrogénkötéseket tudnak létesíteni , bázispárokat hozva létre . Az adenin csak timinnel ( két hidrogénkötés ) , míg a guanin csak citozinnal ( három hidrogénkötés , ezért ez erősebb mint az A-T pár ) képes összekapcsolódni . Emiatt a szétválasztott szálak egymás kiegészítői ( komplementerei ) és bármelyik alapul szolgálhat a másik szál szintéziséhez ( egymás templátjai ) . A DNS-szálaknak irányultsága van . A nukleotidok dezoxiribózához két foszfátcsoport kapcsolódik , egyik a , a másik az szénatomhoz . Aszerint , hogy melyik foszfát van közelebb a végéhez , beszélünk és végről . A DNS másolása , leolvasása a biológiai rendszerekben mindig->3' irányban történik , ezért a nukleotidok egymásutánját , szekvenciáját is ebben az irányban adják meg . A DNS két szála fordított irányultságú , egyikük-3' , míg a másik-5' irányban áll . A DNS-polimeráz A DNS-polimeráz nem egy konkrét enzim , hanem egy enzimcsalád , mely tagjainak feladata a DNS másolása . Ők maguk nem képesek új szál szintézisét elkezdeni a régin , hanem csak a meglévő második szálat tudják hosszabbítani , ezért a kezdéshez egy rövid , egyszálú DNS-re vagy RNS-re , az úgynevezett primerre ( ejtsd prájmer ) van szükségük , amely a templáthoz kapcsolódva kis szakaszon kétszálú szerkezetet hoz létre , amelyet az enzim hosszabbíthat . Az enzim az új DNS-szál végéhez foszfodiészter kötéssel kapcsol új nukleotidokat , a régi szál bázissorrendjének megfelelően . Ehhez nukleozid-trifoszfátokat használ fel amelyekben a bázishoz és cukorhoz három foszfátcsoport csatlakozik nagyenergiájú kötéssel . Az enzim erről lehasít egy pirofoszfátot és a felszabaduló energia felhasználásával létrehozza a foszfodiészter kötést a keletkező nukleotid ( nukleotid a bázis-cukor-foszfát hármas elnevezése ) foszfátcsoportja és a DNS-szál végének dezoxiribóza között . A felbomló nagyenergiájú kötés miatt a reakció gyakorlatilag irreverzibilis . A DNS-polimeráz igen pontosan dolgozik , alapműködése során csak minden tízmilliomodik bázisnál téved . Emellett azonban hibaészlelő és -javító aktivitással is rendelkezik : a szál végéről eltávolítja az észlelt hibás nukleotidot , majd folytatja annak hosszabbítását . Ezenkívül a replikáció után egy másik javítómechanizmus is leellenőrzi a másolás hűségét és képes különbséget tenni a régi és az újonnan készült szál között . Összességében a DNS-replikáció hibarátája mindössze egy tévedés minden egymilliárd beépített bázisban . Az élő sejtben zajló DNS-replikáció sebességét E. coli baktériumot fertőző T4 fág esetében határozták meg először . A vírus DNS-polimerázanukleotidot épített be másodpercenként és ennek során minden százhetvenmilliomodiknál ejtett hibát . A DNS másolása meglepően gyorsnak és pontosnak tekinthető . A replikáció folyamata A replikáció három fázisból áll : kezdés ( iniciáció ) , szálhosszabbítás ( elongáció ) és befejezés ( termináció ) . Iniciáció A sejt osztódása előtt annak DNS-tartalma megkettőződik . A folyamat bizonyos pontokon , az ún . replikációs origóknál indul , amelyekhez hozzákötődnek az iniciátor fehérjék . Escherichia coli esetében az iniciátor a DnaA , míg élesztőben az origófelismerő komplex . Az iniciátorok által felismert régiók többnyire A és T bázisokban gazdagok , mert két hidrogénkötésüket könnyebb felbontani , mint a G és C három kötését . Ha sikeresen megkötötték a DNS-t , egyéb proteinek segítségével létrehozzák a pre-replikációs komplexet , amely szétcsavarja a DNS egymás köré tekeredő szálait és ún . replikációs buborék keletkezik . Elongáció A DNS-polimeráznak egy szabad OH-csoportra van szüksége a feladata elvégzéséhez , vagyis az új szál-3' irányban készül és ennek megfelelően a templátszálon-5' irányban halad a másolóenzim . A szintézis mechanizmusát illetően négy változat ismert : valamennyi sejtes organizmus és sok DNS-vírus , bakteriofág és plazmid azt a módszert alkalmazza , hogy a primáz enzim egy rövid RNS-primert készít az egyszálú DNS-re , melynek szabad OH-csoportjáról a DNS-polimeráz már képes elindulni . a retrovírusok és retrotranszpozonok egy transzfer RNS-t használnak primerként a reverz transzkriptáz számára az adenovírusok és a bakteriofágok φ29 családja esetében a szabad OH-csoportot egy DNS-kötő fehérje egyik aminosava szolgáltatja , ehhez kapcsolja a DNS-polimeráz az új szálat . az egyszálú DNS-vírusok ( circovírusok , geminivírusok , parvovírusok , stb ) és azok a kétszálú fágok és plazmidok amelyek a másolás guruló kör modelljét használják , a cirkuláris DNS egyik szálát ( vagy ha egyszálú akkor azt ) egy endonukleázzal elvágják , a nukleáz megköti az véget , míg a szabad végen elkezdődhet a szálhosszabbítás . Ezek közül az első a messze legelterjedtebb és legjobban feltárt mechanizmus . Ennek során , miután a dupla hélix két szála elvált egymástól , a primáz enzim RNS-primert készít rajtuk . A vezető szálon ( lásd lejjebb ) egy primer készül , melyet folyamatosan , hosszasan hosszabbít meg a DNS-polimeráz , míg a követő szálra több primer szintetizálódik , melyek a következő primerig egészülnek ki , így jönnek létre az Okazaki-fragmentumok . A primerek egy RNáz távolítja el , és a helyükön maradó réseket egy másik DNS-polimeráz ( nem az , amelyik a szálhosszabbítást végzi ) betölti . Ez nem képes kovalensen összekötni az általa szintetizált rövid DNS-szakaszt a korábban készült hosszú szállal , ezt a feladatot a ligáz enzim látja el , amely révén a replikáció befejeződik és végeredményül hosszú , folyamatos , kétszálú DNS jön létre . A baktériumok és eukarióták / archeák által használt primáz jelentősen különbözik egymástól . A bakteriális primáz a DnaG családba tartozik , szerkezetileg a topoizomeráz Ia és II , egyes nukleázok és DNS-javító enzimek rokona . Az eukarióta primáz viszont egészen más szerkezetű , leginkább a vírusok RNS-függő RNS-polimerázára , a reverz transzkriptázra , a ciklikus nukleotidokat készítő ciklázra és egyes DNS-polimerázokra hasonlít . A DNS replikációját többféle polimeráz végzi . E. coliban a gyors működésű DNS-polimeráz III ( Pol III ) végzi a szálhosszabbítást , míg a DNS-polimeráz I ( Pol I ) feladata az RNS-primerek lebontása és helyének DNS-sel való betöltése . A Pol I lassan ( jóval lassabban , mint a Pol III ) végighalad az RNS-DNS hibriden , maga előtt bontja az RNS-t , maga mögött pedig annak helyére dezoxiribóz-tartalmú nukleotidokat épít be . Eukariótákban a lassú Pol α segít a replikáció beindításában , míg a gyors szálhosszabbítók a Pol δ és Pol ε enzimek . A DNS-szintézis előrehaladtával a buborék két oldalán folytatódik az eredeti kettős hélix szétcsavarása és mindkét végen ún . replikációs villa halad . A baktériumok kör alakú genomjában csak egy origó található és az előrehaladó replikációs formációt théta-struktúrának nevezik ( a görög θ betű nyomán , amire alakja emlékeztet ) . Ezzel ellentétben az eukarióták kromoszómái lineárisak és rajtuk több replkációs origó is található . A replikációs villa Ahogyan a helikázok széttekerik a DNS két szálát és rajtuk folyik az új szálak szintézise , kétágú alakzat jön létre , a replikációs villa . Az egyik ág a vezető szál , a másik pedig a követő szál . Mivel a DNS-szintézis csak-3' irányba történhet és a szálak egymással ellentétes orientációjúak , valahogyan meg kell oldani a fordított állású lánc replikációját . A vezető szál annak a DNS-láncnak a neve , amelyen a replikáció iránya egybeesik a replikációs villa haladásának ( vagyis a kettős hélix széttekerésének ) irányával . A polimeráz ezen a szálon folyamatosan tudja olvasni a templátot és annak alapján megszakítás nélkül hosszabbítja az új láncot . Az enzim prokariótákban a Pol III , élesztőben pedig feltehetően a Pol ε . Emberi sejtekben a vezető szál polimeráza a Pol ε , a követő szálé a Pol δ , a mitokondriumokban pedig a Pol γ A Pol ε szükség esetén helyettesíteni tudja a Pol δ-t . A követő szál az , amelyiken a szintézis iránya ellentétes a replikációs villa haladásával . Ezért itt az új szál rövid szakaszokban , úgynevezett Okazaki-fragmentumokban készül . A replikáció ugyanúgy rövid RNS-primerrel kezdődik , amit később eltávolítanak és a fragmentumokat a ligázok összekapcsolják . Az Okazaki-fragmentumok baktériumokbanbázis , míg eukariótákban csakbázis hosszúságúak . Eukariótákban a primáz a Pol α enzimkomplex része . A fragmentumok hosszabbítását a Pol III ( prokariótákban ) vagy a Pol δ/Pol ε ( eukariótákban ) végzi . Az RNS-primert eukarióta sejtekben szintén a Pol δ távolítja el . Baktériumokban az utóbbit a Pol I végzi . Amikor a helikáz szétcsavarja a kétszálú DNS-t , az előtte lévő hélix-szakasz forogni kényszerül és rövid időn belül akkora torziós feszültség gyülemlik fel benne , ami megállítaná a replikációs villa előrehaladását . Ezt elkerülendő , a topoizomeráz enzimek időnként eltörik , majd újból összekötik a dupla hélixet ; sőt ezt nem csak meglévő feszültség esetén teszik meg , hanem előre negatív másodlagos struktúrába csavarják azt . A csupasz egyszálú DNS hajlamos másodlagos struktúrákba rendeződni , amelyek zavarják a DNS-polimeráz működését . Ennek elkerülése érdekében speciális proteinek kötődnek hozzá , amelyek meggátolják a másodlagos hurkok kialakulását a második szál elkészültéig . Az egyszálú DNS-molekulát kapocsproteinek is körülveszik , amelyek belső üregében a lánc kényelmesen tud siklani és amelyekbe a DNS-polimeráz bele tud kapaszkodni , felgyorsítva a replikációt . Amikor a polimeráz eléri a templát végét vagy kettős szálat észlel maga előtt , a kapocs egy konformációs változás következtében leválik. :274-5 A replikációs villán összegyűlt különböző funkciójú enzimek és struktúrproteinek alkotják a repliszómát . Ennek fontosabb alkotóelemei a következők : Termináció Az eukarióta kromoszómán több ponton kezdődik a másolás , majd amikor a replikációs villa eléri a következő szakasz kezdetét , a polimeráz különösebb szabályozás nélkül leválik a kettős hélixről . A lineáris kromoszómák legvégét azonban nem tudják elérni és a másolást annak közelében , az ismétlődő szakaszokat tartalmazó telomer régióban abbahagyják . Emiatt az új szálak mindig rövidebbek valamivel a kiindulási DNS-szálnál . A testi sejtek a DNS-vesztés miatt csak bizonyos számú osztódást képesek elvégezni , ez az ún . Hayflick-korlát . Az ivarsejtekben a telomeráz enzim újabb rövid , ismétlődő szakaszokat illeszt a kromoszóma végére , így kerülik meg a korlátot . A telomeráz mutáció következtében testi sejtekben is aktiválódhat , ami könnyen tumor kialakulásához vezethet , sőt a rosszindulatú rákos elváltozás egyik előfeltétele . A baktériumok kör alakú kromoszómáin a másolás akkor ér véget , amikor az origóval ellentétes oldalon a két replikációs villa találkozik . E. coli-ban ezen a helyen egy terminációs szekvencia található ; ehhez a Tus-protein köt , amely meggátolja a helikáz működését , így a villák mindig a terminációs régióban találkoznak . Szabályozás Az eukarióták esetében a DNS-replikáció a sejtciklushoz kötött . A sejt növekedése és osztódása során különböző fázisokon megy át ; a DNS másolása az S ( szintézis ) fázisban zajlik le . A sejtciklus előrehaladása és a fázisváltás ún. ellenőrző pontok révén történik , ezeket a ciklin és ciklin-függő kináz proteinek szabályozzák . A DNS-replikációja ( és az azt követő osztódás ) a G1/S ellenőrzőpont állapotától függ . Azok a sejtek , amelyek megállnak ennél a pontnál G0 fázisban maradnak és nem másolják DNS-üket . A mitokondriumok és kloroplasztiszok osztódása és DNS-másolása nem függ a sejtciklustól . A baktériumok többsége nem meghatározott szakaszokra oszló sejtciklus során osztódik és folyamatosan másolhatja a DNS-ét . Bőséges táplálék és gyors növekedés esetén az egymás követő DNS-replikációk miatt több genom is felhalmozódhat a sejtben . A legjobban ismert baktériumban , az E. coli-ban a DNS másolását több mechanizmus is szabályozza , mint például az hemimetilált origó ( az egyik DNS-szálhoz való metilcsoport-kapcsolás ) , az ATP/ADP arány vagy a DnaA protein mennyisége . Valamennyi az iniciátorok origóhoz való hozzáférését gátolja . Az E. coli vírusgátló restrikciós rendszere metilálja a saját GATC nukleotidszekvenciákat ( mindkét szálon , lévén a GATC palindrom szekvencia ) . A replikáció után értelemszerűen csak a régi szál metilált , és ezt a hemi-( félig) metilált szakaszt felismeri a SeqA protein , amely hozzáköt és megakadályozza az újabb replikációt . Az iniciációt végző DnaA önmagában is nehezebben köti a hemimetilált DNS-t . Bőséges táplálék esetén az ATP szintje megemelkedik és ha a sejt bizonyos méretet elért , megindítja az osztódást megelőző DNS-másolást . ATP és az ADP egymással verseng a DnaA egyik kötőhelyéért és a létrejövő DnaA-ATP komplex képes iniciálni a replikációt . A DnaA fehérjemolekulák száma is limitáló lehet ; minden replikáció után újabb origók , újabb kötőhelyek jönnek létre a számára és a kritikus mennyiség elérésére újabb DnaA proteinek szintézisére van szükség . A polimeráz-láncreakció Bár a sejtekben a DNS-replikáció sok enzim koordinált és szabályozott munkáját igénylő folyamat , leegyszerűsített formában kémcsőben is gyorsan végbemegy . Ezt használják ki a polimeráz-láncreakció során . A kiindulási DNS-hez kész primereket ( rövid , egyszálú DNS-szakaszokat , amelyek felismerik a templát bizonyos szakaszait és hozzákötődnek ) , nukleozid-trifoszfátokat és hőálló DNS-polimerázt adnak . A helikázokat magas hőmérséklettel pótolják , amelyen a DNS két szála elválik egymástól . Miután hagyták a polimerázt dolgozni egy ideig , a reakcióelegyet újból felmelegítik és szétválasztják egymástól az újonnan készült szálakat is , amelyek a lehűtés után maguk is primerkötőhellyé válnak . Minden ciklusban megduplázódik a primerek által közrefogott DNS-szekvencia és néhány tíz ciklus után a nagyon kis mennyiségben jelen lévő DNS-szakasz ( például egy kórokozó vagy igazságügyi orvostani minta ) könnyen kimutathatóvá válik . Jegyzetek Fordítás Molekuláris biológia Sejtbiológia Lefordítandó ábrát tartalmazó szócikkek