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यहां, हम ल्युकोसैट निकास के vivo ठहराव में भोले, सूजन, और घातक murine त्वचा के लिए तरीके प्रदर्शित करते हैं । हम दो मॉडलों की एक सिर से सिर की तुलना प्रदर्शनः ट्रांसडर्मल FITC आवेदन और सीटू photoconversion में । इसके अलावा, हम त्वचा के ट्यूमर से ल्युकोसैट निकास पर नज़र रखने के लिए photoconversion की उपयोगिता का प्रदर्शन ।
फोटोकंवर्सेशन ल्यूकोसिटे निवास में एक यंत्रवादी अंतर्दृष्टि के लिए ल्यूकोसिटे egress के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए वीवो विधि में एक ट्रैक करने योग्य प्रदान करता है और रोगग्रस्त राज्यों में कई ऊतक साइटों से बाहर निकलना गतिशीलता प्रदान करता है। खैर, यहां हम क्यूकोसाइट ट्रैकिंग की उपयोगिता को क्यूकॉयश ट्यूमर से प्रदर्शित करते हैं। अन्य ऊतकों और बीमारियों के लिए इस परख का आवेदन केवल प्रकाश को प्रशासित करने की क्षमता से सीमित है।
इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि विवो में सूजन ऊतकों से एक egress के रूप में प्रतिरक्षा कोशिका आबादी स्थानांतरित करने के बजाय अंतर्जात के मात्राकरण की अनुमति देता है। सूजन को प्रेरित करने के लिए, अंगुली चुटकी के लिए प्रतिक्रिया की कमी की पुष्टि करने के बाद, एक माइक्रोपिपेट का उपयोग डायब्यूटिल थैलेट या डीबीपी के 20 माइक्रोलीटर को एक एनेस्थेटाइज्ड काडे ट्रांसजेनिक माउस के कान पिन्ना के वेंट्रल साइड में प्रशासित करने के लिए करें। डीबीपी को सूखने की अनुमति देने के बाद, एल्यूमीनियम पन्नी के एक टुकड़े में एक भट्ठा के माध्यम से कान खींचें और ऊपर की ओर का सामना कर रहे पृष्ठीय पक्ष के साथ पन्नी के लिए कान को साफ सुरक्षित करने के लिए डबल-तरफा टेप का उपयोग करें।
फिर, स्थिति है कि आप सीधे एक 405 नैनोमीटर प्रकाश स्रोत और बिजली के 100 मिलीवाट पर तीन मिनट के लिए फोटोकनवर्ट के तहत कर रहे हैं। वैक्सिनिया संक्रमण के लिए, एक माइक्रोपिपेट का उपयोग 5 गुना 10 को पीबीएस के 10 माइक्रोलीटर में वैसिनिया वायरस की 6 पट्टिका बनाने वाली इकाइयों को एक एनेस्थेटाइज्ड काडे ट्रांसजेनिक माउस के कान पिन्ना पर करने और पिन्ना को 25 बार प्रहार करने के लिए करें। 24 घंटे बाद, फोटो पिन्ना के रूप में सिर्फ प्रदर्शन किया ।
उपयुक्त प्रायोगिक समय बिंदु पर, पिन्नी और सर्वाइकल और इंगिनल लिम्फ नोड्स की कटाई करें और प्रत्येक पिन्ना के वेंट्रल और पृष्ठीय पक्ष को अलग करने के लिए चिमटी के दो जोड़े का उपयोग करें। फिर लिम्फ नोड्स और पिन्ना टुकड़ों को कान के अंदर सामना करने के साथ, 24-अच्छी तरह से प्लेट के व्यक्तिगत कुओं में रखें जिसमें कोलेज डी के 1 मिलीलीटर प्रति मिलीलीटर और कैल्शियम और मैग्नीशियम युक्त एचबीबीएस में पतला डीएनएस के 80 इकाइयां प्रति मिलीलीटर होते हैं। प्रत्येक लिम्फ नोड कैप्सूल को खोलने के लिए दो 29 गेज सुइयों का उपयोग करें और प्लेट को 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
इनक्यूबेशन के अंत में, प्रत्येक ऊतक के एकल कोशिका निलंबन प्राप्त करने के लिए अलग-अलग 70 माइक्रोन नायलॉन सेल स्ट्रेनर्स के माध्यम से पचा पिन्ना और लिम्फ नोड ऊतकों को दबाएं। जब ट्यूमर उचित प्रयोगात्मक आकार के लिए हो गए हैं, ट्यूमर साइट के आसपास किसी भी नए regrown फर दाढ़ी और एल्यूमीनियम पन्नी का एक टुकड़ा में एक परिपत्र छेद कटौती के माध्यम से ट्यूमर खींच । ट्यूमर सीधे 405 नैनोमीटर प्रकाश स्रोत और 200 मिलीवाट बिजली पर 5 मिनट के लिए फोटोकनवर्ट के नीचे स्थिति।
फोटोकनॉवर्तन के 24 घंटे बाद, प्रत्येक जानवर से ट्यूमर और ब्रैकिल और इंगिनल लिम्फ नोड्स की कटाई करें और एचबीबीएस में कोलेजनेस डी और डीएनएसे युक्त 24-अच्छी तरह से प्लेट के व्यक्तिगत कुओं के भीतर ट्यूमर को कीमा बनाने के लिए कैंची का उपयोग करें। लिम्फ नोड्स को अलग-अलग कुओं में रखें और कैप्सूल को खोलें जैसा कि सिर्फ प्रदर्शन किया गया है। एक घंटे के लिए ट्यूमर इनक्यूबेटिंग और ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक आधे घंटे के लिए लिम्फ नोड्स इनक्यूबेटिंग के बाद, प्रत्येक ऊतक के एकल कोशिका निलंबन प्राप्त करने के लिए अलग ७० माइक्रोन छलनी के माध्यम से पचा ऊतकों को दबाएं ।
फ्लो साइटोमेट्री द्वारा एकल कोशिका निलंबन का विश्लेषण करने के लिए, सबसे पहले एक काडे ट्रांसजेनिक माउस से तिल्ली या रक्त एकत्र करें और अमोनियम क्लोराइड पोटेशियम बफर के साथ लाल रक्त कोशिकाओं को lyse करें। कोशिकाओं को एक अपरिवर्तित काडे फिटसी और एक परिवर्तित काडे पीई आबादी में विभाजित करें और 24-अच्छी प्लेट के एक कुएं में पीबीएस के एक मिलीलीटर में एकल रंग काडे पीई कोशिकाओं को फिर से खर्च करें, फिर 100 मिलीवाट में 405 नैनोमीटर प्रकाश स्रोत के तहत कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए फोटोकंवर्ट करें। अगला प्रत्येक फ्लोरोसेंट चैनल की कुल सीमा के 70 से 80% तक फोटोमल्टीप्लाज़ सेट करने के लिए फोटोकनवर्टेड काडे पीई कोशिकाओं और अपरिवर्तित काडे फिटसी कोशिकाओं का उपयोग करें।
एक बार Kaede प्रोटीन के लिए वोल्टेज सेट किया गया है, अंय प्राथमिक एंटीबॉडी दाग के सभी के लिए क्षतिपूर्ति एकल फ्लोरोफोर लेबल मुआवजा मोती का उपयोग कर, निर्माता के निर्देशों के अनुसार । फिर, मानक प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण प्रोटोकॉल के अनुसार प्रवाह साइटोमीटर पर नमूने चलाएं। फोटोकनॉवर्स एक्सपोजर के तुरंत बाद कान की त्वचा या सर्वाइकल ड्रेनिंग लिम्फ नोड्स से उत्पन्न सिंगल सेल सस्पेंशन त्वचा में सभी सीडी 45 पॉजिटिव ल्यूकोसाइट्स की 78% रूपांतरण दक्षता प्रकट करती है, जिसमें नोइंग लिम्फ नोड्स में कोई परिवर्तित कोशिकाएं नहीं दिखाई देती हैं।
फोटोकनवर्टेड कान शून्य और 24 घंटे बाद रूपांतरण में घुसपैठ सीडी 45 सकारात्मक ल्यूकोसाइट्स की संख्या की मात्रा से पता चलता है कि वायलेट प्रकाश जोखिम ल्यूकोसिटे घुसपैठ में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण वृद्धि का कारण बनता है। CD45 सकारात्मक ल्यूकोसिटे घुसपैठ में यह वृद्धि हालांकि, एक शक्तिशाली भड़काऊ उत्तेजना जैसे वैक्सिनिया वायरस से प्रेरित घुसपैठ के सापेक्ष छोटी है। फोटोकंवर्सेशन भी मीलों परख द्वारा मापा के रूप में कान pinnae में संवहनी पारगम्यता बढ़ जाती है, एक साथ यह दर्शाता है कि ऊतक सूजन पर बैंगनी प्रकाश के प्रभाव पर विचार किया जाना चाहिए जब खुराक, जोखिम समय और डेटा व्याख्या का अनुकूलन ।
फोटोकनवर्टेड जानवरों से अलग ट्यूमर कोशिकाओं के प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण काडे फिटक सकारात्मक से काडे पीई सकारात्मक करने के लिए इंट्राट्यूमोरल सीडी 45 सकारात्मक कोशिकाओं के एक महत्वपूर्ण रूपांतरण का पता चलता है, जबकि लिम्फ नोड कोशिकाओं को निकालने से अपरिवर्तित रहते हैं। CD45 सकारात्मक ल्यूकोसाइट्स की फोटोकन्वर्जन दक्षता ट्यूमर प्रकार और आकारों के बीच काफी भिन्न होती है, जिसमें सीडी 45 सकारात्मक ल्यूकोसाइट्स के साथ छोटे मेलानोमा ट्यूमर के भीतर सबसे कुशल फोटोकंवर्सन का प्रदर्शन होता है। ट्यूमर की मात्रा में वृद्धि के रूप में, रूपांतरण दक्षता लगभग 50% तक कम हो जाती है, विशेष रूप से, मेलेनिन का फोटोकन्वर्जन दक्षता पर एक उल्लेखनीय प्रभाव पड़ता है जिसमें सीडी 45 सकारात्मक कोशिकाओं की अधिकतम फोटोकन्वर्जन के साथ छोटे ट्यूमर में केवल लगभग 30% के ट्यूमर का उत्पादन होता है, जो ट्यूमर की मात्रा 400 घन मिलीमीटर तक पहुंचने के साथ 10% तक गिर जाता है।
फोटोकनॉवर्स के 24 घंटे बाद ट्यूमर की जांच लिम्फ नोड्स की जांच से विभिन्न फेनोटाइप की काडे रेड पॉजिटिव इम्यून सेल्स की मौजूदगी का पता चलता है, इस तरह फोटोकनवर्टेड ट्यूमर से ल्यूकोसिट इमीग्रेशन का प्रदर्शन होता है । इसके विकास के बाद, इस तकनीक ने इम्यूनोलॉजी के क्षेत्र में शोधकर्ताओं के लिए स्थिर राज्य के काइनेटिक्स को उजागर करने और परिधीय ऊतक में ल्यूकोसाइट टर्नओवर को उजागर करने का मार्ग प्रशस्त किया। इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि केवल ब्याज के ऊतकों को फोटोकनवर्ट किया गया है, क्योंकि आसपास के ऊतकों का अनजाना फोटोकनिवर्तन आपके परिणामों से समझौता करेगा।
इस विधि के लिए नए व्यक्तियों को अपने ऊतकों के रूपांतरण के लिए जोखिम समय का अनुकूलन करना चाहिए, साथ ही ऊतक संग्रह ब्याज की ल्यूकोसाइट की गतिशीलता के आधार पर समय की अवधि।

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Please note that all translations are automatically generated. यहां, हम ल्युकोसैट निकास के vivo ठहराव में भोले, सूजन, और घातक murine त्वचा के लिए तरीके प्रदर्शित करते हैं । हम दो मॉडलों की एक सिर से सिर की तुलना प्रदर्शनः ट्रांसडर्मल FITC आवेदन और सीटू photoconversion में । इसके अलावा, हम त्वचा के ट्यूमर से ल्युकोसैट निकास पर नज़र रखने के लिए photoconversion की उपयोगिता का प्रदर्शन । फोटोकंवर्सेशन ल्यूकोसिटे निवास में एक यंत्रवादी अंतर्दृष्टि के लिए ल्यूकोसिटे egress के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए वीवो विधि में एक ट्रैक करने योग्य प्रदान करता है और रोगग्रस्त राज्यों में कई ऊतक साइटों से बाहर निकलना गतिशीलता प्रदान करता है। खैर, यहां हम क्यूकोसाइट ट्रैकिंग की उपयोगिता को क्यूकॉयश ट्यूमर से प्रदर्शित करते हैं। अन्य ऊतकों और बीमारियों के लिए इस परख का आवेदन केवल प्रकाश को प्रशासित करने की क्षमता से सीमित है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि विवो में सूजन ऊतकों से एक egress के रूप में प्रतिरक्षा कोशिका आबादी स्थानांतरित करने के बजाय अंतर्जात के मात्राकरण की अनुमति देता है। सूजन को प्रेरित करने के लिए, अंगुली चुटकी के लिए प्रतिक्रिया की कमी की पुष्टि करने के बाद, एक माइक्रोपिपेट का उपयोग डायब्यूटिल थैलेट या डीबीपी के बीस माइक्रोलीटर को एक एनेस्थेटाइज्ड काडे ट्रांसजेनिक माउस के कान पिन्ना के वेंट्रल साइड में प्रशासित करने के लिए करें। डीबीपी को सूखने की अनुमति देने के बाद, एल्यूमीनियम पन्नी के एक टुकड़े में एक भट्ठा के माध्यम से कान खींचें और ऊपर की ओर का सामना कर रहे पृष्ठीय पक्ष के साथ पन्नी के लिए कान को साफ सुरक्षित करने के लिए डबल-तरफा टेप का उपयोग करें। फिर, स्थिति है कि आप सीधे एक चार सौ पाँच नैनोमीटर प्रकाश स्रोत और बिजली के एक सौ मिलीवाट पर तीन मिनट के लिए फोटोकनवर्ट के तहत कर रहे हैं। वैक्सिनिया संक्रमण के लिए, एक माइक्रोपिपेट का उपयोग पाँच गुना दस को पीबीएस के दस माइक्रोलीटर में वैसिनिया वायरस की छः पट्टिका बनाने वाली इकाइयों को एक एनेस्थेटाइज्ड काडे ट्रांसजेनिक माउस के कान पिन्ना पर करने और पिन्ना को पच्चीस बार प्रहार करने के लिए करें। चौबीस घंटाटे बाद, फोटो पिन्ना के रूप में सिर्फ प्रदर्शन किया । उपयुक्त प्रायोगिक समय बिंदु पर, पिन्नी और सर्वाइकल और इंगिनल लिम्फ नोड्स की कटाई करें और प्रत्येक पिन्ना के वेंट्रल और पृष्ठीय पक्ष को अलग करने के लिए चिमटी के दो जोड़े का उपयोग करें। फिर लिम्फ नोड्स और पिन्ना टुकड़ों को कान के अंदर सामना करने के साथ, चौबीस-अच्छी तरह से प्लेट के व्यक्तिगत कुओं में रखें जिसमें कोलेज डी के एक मिलीलीटर प्रति मिलीलीटर और कैल्शियम और मैग्नीशियम युक्त एचबीबीएस में पतला डीएनएस के अस्सी इकाइयां प्रति मिलीलीटर होते हैं। प्रत्येक लिम्फ नोड कैप्सूल को खोलने के लिए दो उनतीस गेज सुइयों का उपयोग करें और प्लेट को तीस मिनट के लिए सैंतीस डिग्री सेल्सियस पर रखें। इनक्यूबेशन के अंत में, प्रत्येक ऊतक के एकल कोशिका निलंबन प्राप्त करने के लिए अलग-अलग सत्तर माइक्रोन नायलॉन सेल स्ट्रेनर्स के माध्यम से पचा पिन्ना और लिम्फ नोड ऊतकों को दबाएं। जब ट्यूमर उचित प्रयोगात्मक आकार के लिए हो गए हैं, ट्यूमर साइट के आसपास किसी भी नए regrown फर दाढ़ी और एल्यूमीनियम पन्नी का एक टुकड़ा में एक परिपत्र छेद कटौती के माध्यम से ट्यूमर खींच । ट्यूमर सीधे चार सौ पाँच नैनोमीटर प्रकाश स्रोत और दो सौ मिलीवाट बिजली पर पाँच मिनट के लिए फोटोकनवर्ट के नीचे स्थिति। फोटोकनॉवर्तन के चौबीस घंटाटे बाद, प्रत्येक जानवर से ट्यूमर और ब्रैकिल और इंगिनल लिम्फ नोड्स की कटाई करें और एचबीबीएस में कोलेजनेस डी और डीएनएसे युक्त चौबीस-अच्छी तरह से प्लेट के व्यक्तिगत कुओं के भीतर ट्यूमर को कीमा बनाने के लिए कैंची का उपयोग करें। लिम्फ नोड्स को अलग-अलग कुओं में रखें और कैप्सूल को खोलें जैसा कि सिर्फ प्रदर्शन किया गया है। एक घंटे के लिए ट्यूमर इनक्यूबेटिंग और सैंतीस डिग्री सेल्सियस पर एक आधे घंटे के लिए लिम्फ नोड्स इनक्यूबेटिंग के बाद, प्रत्येक ऊतक के एकल कोशिका निलंबन प्राप्त करने के लिए अलग सत्तर माइक्रोन छलनी के माध्यम से पचा ऊतकों को दबाएं । फ्लो साइटोमेट्री द्वारा एकल कोशिका निलंबन का विश्लेषण करने के लिए, सबसे पहले एक काडे ट्रांसजेनिक माउस से तिल्ली या रक्त एकत्र करें और अमोनियम क्लोराइड पोटेशियम बफर के साथ लाल रक्त कोशिकाओं को lyse करें। कोशिकाओं को एक अपरिवर्तित काडे फिटसी और एक परिवर्तित काडे पीई आबादी में विभाजित करें और चौबीस-अच्छी प्लेट के एक कुएं में पीबीएस के एक मिलीलीटर में एकल रंग काडे पीई कोशिकाओं को फिर से खर्च करें, फिर एक सौ मिलीवाट में चार सौ पाँच नैनोमीटर प्रकाश स्रोत के तहत कोशिकाओं को पाँच मिनट के लिए फोटोकंवर्ट करें। अगला प्रत्येक फ्लोरोसेंट चैनल की कुल सीमा के सत्तर से अस्सी% तक फोटोमल्टीप्लाज़ सेट करने के लिए फोटोकनवर्टेड काडे पीई कोशिकाओं और अपरिवर्तित काडे फिटसी कोशिकाओं का उपयोग करें। एक बार Kaede प्रोटीन के लिए वोल्टेज सेट किया गया है, अंय प्राथमिक एंटीबॉडी दाग के सभी के लिए क्षतिपूर्ति एकल फ्लोरोफोर लेबल मुआवजा मोती का उपयोग कर, निर्माता के निर्देशों के अनुसार । फिर, मानक प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण प्रोटोकॉल के अनुसार प्रवाह साइटोमीटर पर नमूने चलाएं। फोटोकनॉवर्स एक्सपोजर के तुरंत बाद कान की त्वचा या सर्वाइकल ड्रेनिंग लिम्फ नोड्स से उत्पन्न सिंगल सेल सस्पेंशन त्वचा में सभी सीडी पैंतालीस पॉजिटिव ल्यूकोसाइट्स की अठहत्तर% रूपांतरण दक्षता प्रकट करती है, जिसमें नोइंग लिम्फ नोड्स में कोई परिवर्तित कोशिकाएं नहीं दिखाई देती हैं। फोटोकनवर्टेड कान शून्य और चौबीस घंटाटे बाद रूपांतरण में घुसपैठ सीडी पैंतालीस सकारात्मक ल्यूकोसाइट्स की संख्या की मात्रा से पता चलता है कि वायलेट प्रकाश जोखिम ल्यूकोसिटे घुसपैठ में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण वृद्धि का कारण बनता है। CDपैंतालीस सकारात्मक ल्यूकोसिटे घुसपैठ में यह वृद्धि हालांकि, एक शक्तिशाली भड़काऊ उत्तेजना जैसे वैक्सिनिया वायरस से प्रेरित घुसपैठ के सापेक्ष छोटी है। फोटोकंवर्सेशन भी मीलों परख द्वारा मापा के रूप में कान pinnae में संवहनी पारगम्यता बढ़ जाती है, एक साथ यह दर्शाता है कि ऊतक सूजन पर बैंगनी प्रकाश के प्रभाव पर विचार किया जाना चाहिए जब खुराक, जोखिम समय और डेटा व्याख्या का अनुकूलन । फोटोकनवर्टेड जानवरों से अलग ट्यूमर कोशिकाओं के प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण काडे फिटक सकारात्मक से काडे पीई सकारात्मक करने के लिए इंट्राट्यूमोरल सीडी पैंतालीस सकारात्मक कोशिकाओं के एक महत्वपूर्ण रूपांतरण का पता चलता है, जबकि लिम्फ नोड कोशिकाओं को निकालने से अपरिवर्तित रहते हैं। CDपैंतालीस सकारात्मक ल्यूकोसाइट्स की फोटोकन्वर्जन दक्षता ट्यूमर प्रकार और आकारों के बीच काफी भिन्न होती है, जिसमें सीडी पैंतालीस सकारात्मक ल्यूकोसाइट्स के साथ छोटे मेलानोमा ट्यूमर के भीतर सबसे कुशल फोटोकंवर्सन का प्रदर्शन होता है। ट्यूमर की मात्रा में वृद्धि के रूप में, रूपांतरण दक्षता लगभग पचास% तक कम हो जाती है, विशेष रूप से, मेलेनिन का फोटोकन्वर्जन दक्षता पर एक उल्लेखनीय प्रभाव पड़ता है जिसमें सीडी पैंतालीस सकारात्मक कोशिकाओं की अधिकतम फोटोकन्वर्जन के साथ छोटे ट्यूमर में केवल लगभग तीस% के ट्यूमर का उत्पादन होता है, जो ट्यूमर की मात्रा चार सौ घन मिलीमीटर तक पहुंचने के साथ दस% तक गिर जाता है। फोटोकनॉवर्स के चौबीस घंटाटे बाद ट्यूमर की जांच लिम्फ नोड्स की जांच से विभिन्न फेनोटाइप की काडे रेड पॉजिटिव इम्यून सेल्स की मौजूदगी का पता चलता है, इस तरह फोटोकनवर्टेड ट्यूमर से ल्यूकोसिट इमीग्रेशन का प्रदर्शन होता है । इसके विकास के बाद, इस तकनीक ने इम्यूनोलॉजी के क्षेत्र में शोधकर्ताओं के लिए स्थिर राज्य के काइनेटिक्स को उजागर करने और परिधीय ऊतक में ल्यूकोसाइट टर्नओवर को उजागर करने का मार्ग प्रशस्त किया। इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि केवल ब्याज के ऊतकों को फोटोकनवर्ट किया गया है, क्योंकि आसपास के ऊतकों का अनजाना फोटोकनिवर्तन आपके परिणामों से समझौता करेगा। इस विधि के लिए नए व्यक्तियों को अपने ऊतकों के रूपांतरण के लिए जोखिम समय का अनुकूलन करना चाहिए, साथ ही ऊतक संग्रह ब्याज की ल्यूकोसाइट की गतिशीलता के आधार पर समय की अवधि।