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CENP-A सर्वव्यापकता सेंट्रोमेरे में CENP-ए बयान के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है, जो सेल डिवीजन के बीच डामरीकरण के माध्यम से विरासत में मिली है, और सेल व्यवहार्यता के लिए अपरिहार्य है। यहां हम EYFP-टैग CENP-A (EYFP-CENP-A) प्रोटीन के सर्वव्यापकता की पहचान करने के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण का वर्णन करते हैं।
इस विधि से EYFP-टैग किए गए CENP-A प्रोटीन के सर्वव्यापकता की पहचान करना संभव हो जाता है। इसे विभिन्न परीक्षणों और अन्य प्रोटीन के साथ मानव CENP-A प्रोटीन पर भी लागू किया जा सकता है। इसका मुख्य लाभ यह है कि इसका उपयोग महत्वपूर्ण जैविक महत्व वाले EYFP CENP-A K124R सर्वव्यापी साइटों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है।
यह कार्यात्मक प्रोटीन की एक विस्तृत श्रृंखला के बाद अनुवाद संशोधनों की जांच करने के लिए बढ़ाया जा सकता है । प्रोटीन एक मोती विरोधी GFP एंटीबॉडी के साथ बंधे तैयार करके शुरू करते हैं । इथेनॉल को हटाने के लिए बफर ए1 के साथ प्रति इम्यूनोप्रिपिपिटेशन रिएक्शन के 25 माइक्रोलीटर धोएं।
फिर बफर A1 के साथ 50% मनका समाधान बनाएं। मोतियों में एंटी-जीएफपी एंटीबॉडी के दो माइक्रोलीटर जोड़ें। फिर बफर A1 को नेट मनका वॉल्यूम का 20 गुना तक जोड़ें। चार से 18 घंटे के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर अंत से अंत रोटेशन प्रदर्शन करते हैं ।
रोटेशन के लिए इष्टतम अवधि इम्यूनोप्रिपिपिटेशन की दक्षता के आधार पर अनुभवजन्य रूप से निर्धारित की जानी चाहिए। रोटेशन के बाद, एक मिनट के लिए 100 बार जी पर मोतियों को अपकेंद्रित्र करें और अनबाउंड सुपरनेट को हटा दें। मोतियों का 50% समाधान बनाने के लिए बफर A1 जोड़ें और प्रत्येक इम्यूनोप्रिपिटेशन प्रतिक्रिया के लिए इस समाधान के 25 माइक्रोलीटर का उपयोग करें।
इम्यूनोप्रिपिपिटेशन करने के लिए, बफर A1 में सोनीशन और फ्रीज/गल के माध्यम से कोशिकाओं को lyse । प्रोटीन सांद्रता को मापें और विभिन्न आईपी नमूनों के बीच प्रोटीन की मात्रा को सामान्य करें। फिर एसडीएस पेज में चलाने के लिए प्रत्येक ट्यूब से 5% नमूना निकालें।
प्रोटीन के 25 माइक्रोलीटर के साथ शेष lysate मिलाएं एक मोती विरोधी GFP एंटीबॉडी के लिए बाध्य है और चार से 18 घंटे के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर अंत से अंत रोटेशन प्रदर्शन करते हैं । बफर ए में कोशिकाओं को lysing और पहले वर्णित इम्यूनोप्रिपिपिटेशन प्रदर्शन के बाद, EYFP CENP-A सर्वव्यापकता की पुष्टि करने के लिए कुल इम्यूनोप्रिपिट्सेंट का 10% रखें और सर्वव्यापी EYFP CENP-A की स्थिति को ठीक से निर्धारित करें। बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए अन्य 90% का उपयोग करें।
व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 4-12% बीआईएस-ट्रिस प्रोटीन जेल में बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री नमूना चलाएं। फिर बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए 50-70 किलोडडलटन जेल क्षेत्र को कूमासी ब्लू धुंधला और उत्पादित करें। प्रत्येक जेल स्लाइस को छोटे टुकड़ों में पासा करें और उन्हें 0.5 मिलीलीटर कम प्रोटीन बाध्यकारी ट्यूब में रखें।
25 मिलीमोलर अमोनियम बाइकार्बोनेट में 50% एसीटोनिट्रिल के 100 माइक्रोलीटर के साथ जेल के टुकड़ों को धोएं। उन्हें 10-15 मिनट के लिए भंवर। फिर उन्हें नीचे स्पिन करें और सुपरनिटेंट को त्याग दें।
आखिरी धोने के बाद, जेल के टुकड़ों को 30 मिनट के लिए बेंच टॉप वैक्यूम सांचित के साथ सुखा लें। 10 नैनोग्राम प्रति माइक्रोलीटर अनुक्रमण ग्रेड ट्राइप्सिन जोड़ें और जेल के टुकड़ों को पांच मिनट के लिए फिर से हाइड्रेट होने दें। फिर 25 मिलीमोलर अमोनियम बाइकार्बोनेट जोड़ें, बस जेल के टुकड़ों को कवर करने के लिए पर्याप्त है और उन्हें रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर पचाता है।
अगले दिन, पचा सुपरनेट को एक साफ 0.65 मिलीलीटर सिलिकॉन ट्यूब में स्थानांतरित करें और 50% एसीटोनिट्रिल और 5% फॉरमिक एसिड समाधान जोड़ें। भंवर 10 मिनट के लिए नमूना। फिर इसे नीचे स्पिन करें और सुपरनैंट को एक निष्कर्षण ट्यूब में स्थानांतरित करें।
नमूना को फिर से दो माइक्रोलीटर पर केंद्रित करें। फिर 3% एसीटोनिट्रिल और 2% फॉरमिक एसिड समाधान के आठ माइक्रोलीटर जोड़ें। भंवर यह 15 मिनट के लिए और 30 मिनट के लिए 16, 000 बार जी पर नीचे स्पिन ।
एक बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री उपकरण के साथ मिलकर तरल क्रोमेटोग्राफी प्रणाली का उपयोग कर एलसी-एमएस/एमएस के साथ एमएस डेटा अधिग्रहण करें । नमूने के आठ माइक्रोलीटर को रिवर्स चरण तरल क्रोमेटोग्राफी कॉलम में इंजेक्ट करें और पांडुलिपि निर्देशों के बाद 60 मिनट में सॉल्वेंट बी के 2-80% ढाल के साथ पेप्टाइड्स को अलग करें। डेटा-निर्भर अधिग्रहण मोड का उपयोग करके बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा एकत्र करें।
डेस्कटॉप पर बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा का विश्लेषण करने के लिए वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर खोलें। नई खोज शुरू करने के लिए, शीर्ष मेनू पर एलसी बटन पर क्लिक करें। इसके बाद ओरिजनल एमएस रॉ डाटा फाइल्स को अपलोड करने के लिए ऐड बटन पर क्लिक करें।
डेटाबेस खोज विधि के रूप में पैरागॉन विधि में मानव प्रोटीन आईडी का चयन करें और यूनिप्रॉट होमो सेपियंस डेटाबेस के खिलाफ मूल एमएस कच्चे डेटा फ़ाइलों को खोजें। पाचन एंजाइम के रूप में ट्राइपसिन का चयन करें और पांडुलिपि निर्देशों के अनुसार बाकी मापदंडों को निर्धारित करें। परिणाम फाइलनेम दर्ज करें और मेनू के दाईं ओर बटन के रूप में सेव पर क्लिक करें।
इसके बाद सर्चिंग रिजल्ट्स को स्टोर करने के लिए फोल्डर चुनें और सेव बटन पर क्लिक करें। खोज शुरू करने के लिए प्रोसेस बटन पर क्लिक करें। खोज समाप्त होने के बाद, दर्ज खोज नाम वाला डेटा स्वचालित रूप से चयनित फ़ोल्डर में संग्रहीत हो जाएगा।
किसी भी विशिष्ट पेप्टाइड के एमएस/एमएस स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए, सॉफ्टवेयर F.तो शीर्ष मेनू में प्रोटीन सूची में प्रोटीन पर क्लिक करें और मध्य मेनू में पेप्टाइड पर क्लिक करें में खोज परिणाम खोलें । इस पेप्टाइड का एमएस/एमएस मेन्यू के नीचे दिखाई देगा । एमएस/एमएस स्पेक्ट्रा को निर्यात और सहेजने के लिए स्पेक्ट्रा की कॉपी करें और उसे उपयुक्त फाइल फॉर्मेट में चिपका दें ।
EYFP CENP-एक जंगली प्रकार या K124R उत्परिवर्ती जो अंतर्जात CENP-A के नुकसान को बचाता है के जीन निर्माण स्थिर व्यक्त किया गया था जब रेट्रोवायरल एकीकरण किया गया था । क्रे रिकॉम्बिनेज के शामिल होने के सात दिन बाद अंतर्जात सेनपी-ए की अभिव्यक्ति का पता नहीं चला । दोनों EYFP CENP-एक जंगली प्रकार और K124R प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रारंभिक अंतर्जात CENP-एक प्रोटीन के समान स्तर पर पाया गया था ।
दोनों EYFP CENP-एक जंगली प्रकार और K124R म्यूटेंट अंतर्जात CENP-ए की शेष अभिव्यक्ति के व्यवधान के बाद सात दिनों में सेंट्रोमेरे स्थानीयकरण दिखाया । EYFP CENP-एक जंगली प्रकार और K124R उत्परिवर्ती को झंडी दिखाकर चिह्नित टैग या बिना चलने वाले CENP-एक जंगली प्रकार और K124R उत्परिवर्ती के लिए मामले के विपरीत HJURP के साथ सर्वव्यापकता और बातचीत दिखाया । शेष अंतर्जात सेनपी-ए एलील के व्यवधान के 14 दिन बाद कॉलोनी आउटग्रोथ परख का प्रदर्शन करके सेल व्यवहार्यता का आकलन किया गया था।
दोनों EYFP CENP-एक जंगली प्रकार और K124R म्यूटेंट शेष अंतर्जात CENP-एक allele के व्यवधान के बाद 14 दिन बचाया कालोनियों की एक समान संख्या में दिखाया । आईपी मास स्पेक्ट्रोमेट्री ने CENP-A ऋण एफ कोशिकाओं में EYFP CENP-A K124R में lysine ३०६ में सर्वव्यापकता का पता चला । सभी एक साथ, इन परिणामों ने सुझाव दिया कि बड़े आकार के प्रोटीन का संलयन CENP-A में K124R के अलावा एक lysine पर सर्वव्यापकता लाती है जो मूल K124R एकल उत्परिवर्ती फेनोटाइप को रोकता है ।
इस प्रोटोकॉल का प्रयास करते समय, बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री नमूनों को चलाने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 4%12% बीआईएस-ट्रिस प्रोटीन जैल का उपयोग करें। जेल के टुकड़ों में पर्याप्त ट्राइप्सिन जोड़ें और सभी एंजाइमों को अवशोषित होने तक उन्हें फिर से हाइड्रेट करें। कम आणविक वजन टैगिंग या जांच तकनीक वास्तव में सर्वव्यापी कल्पना और स्थानिक लौकिक प्रोटीन सर्वव्यापकता और पूरे जीव के स्तर पर संकेत की जांच करने के लिए आवश्यक है ।

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CENP-A सर्वव्यापकता सेंट्रोमेरे में CENP-ए बयान के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है, जो सेल डिवीजन के बीच डामरीकरण के माध्यम से विरासत में मिली है, और सेल व्यवहार्यता के लिए अपरिहार्य है। यहां हम EYFP-टैग CENP-A प्रोटीन के सर्वव्यापकता की पहचान करने के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण का वर्णन करते हैं। इस विधि से EYFP-टैग किए गए CENP-A प्रोटीन के सर्वव्यापकता की पहचान करना संभव हो जाता है। इसे विभिन्न परीक्षणों और अन्य प्रोटीन के साथ मानव CENP-A प्रोटीन पर भी लागू किया जा सकता है। इसका मुख्य लाभ यह है कि इसका उपयोग महत्वपूर्ण जैविक महत्व वाले EYFP CENP-A Kएक सौ चौबीसR सर्वव्यापी साइटों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। यह कार्यात्मक प्रोटीन की एक विस्तृत श्रृंखला के बाद अनुवाद संशोधनों की जांच करने के लिए बढ़ाया जा सकता है । प्रोटीन एक मोती विरोधी GFP एंटीबॉडी के साथ बंधे तैयार करके शुरू करते हैं । इथेनॉल को हटाने के लिए बफर एएक के साथ प्रति इम्यूनोप्रिपिपिटेशन रिएक्शन के पच्चीस माइक्रोलीटर धोएं। फिर बफर Aएक के साथ पचास% मनका समाधान बनाएं। मोतियों में एंटी-जीएफपी एंटीबॉडी के दो माइक्रोलीटर जोड़ें। फिर बफर Aएक को नेट मनका वॉल्यूम का बीस गुना तक जोड़ें। चार से अट्ठारह घंटाटे के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर अंत से अंत रोटेशन प्रदर्शन करते हैं । रोटेशन के लिए इष्टतम अवधि इम्यूनोप्रिपिपिटेशन की दक्षता के आधार पर अनुभवजन्य रूप से निर्धारित की जानी चाहिए। रोटेशन के बाद, एक मिनट के लिए एक सौ बार जी पर मोतियों को अपकेंद्रित्र करें और अनबाउंड सुपरनेट को हटा दें। मोतियों का पचास% समाधान बनाने के लिए बफर Aएक जोड़ें और प्रत्येक इम्यूनोप्रिपिटेशन प्रतिक्रिया के लिए इस समाधान के पच्चीस माइक्रोलीटर का उपयोग करें। इम्यूनोप्रिपिपिटेशन करने के लिए, बफर Aएक में सोनीशन और फ्रीज/गल के माध्यम से कोशिकाओं को lyse । प्रोटीन सांद्रता को मापें और विभिन्न आईपी नमूनों के बीच प्रोटीन की मात्रा को सामान्य करें। फिर एसडीएस पेज में चलाने के लिए प्रत्येक ट्यूब से पाँच% नमूना निकालें। प्रोटीन के पच्चीस माइक्रोलीटर के साथ शेष lysate मिलाएं एक मोती विरोधी GFP एंटीबॉडी के लिए बाध्य है और चार से अट्ठारह घंटाटे के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर अंत से अंत रोटेशन प्रदर्शन करते हैं । बफर ए में कोशिकाओं को lysing और पहले वर्णित इम्यूनोप्रिपिपिटेशन प्रदर्शन के बाद, EYFP CENP-A सर्वव्यापकता की पुष्टि करने के लिए कुल इम्यूनोप्रिपिट्सेंट का दस% रखें और सर्वव्यापी EYFP CENP-A की स्थिति को ठीक से निर्धारित करें। बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए अन्य नब्बे% का उपयोग करें। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध चार-बारह% बीआईएस-ट्रिस प्रोटीन जेल में बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री नमूना चलाएं। फिर बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए पचास-सत्तर किलोग्रामडडलटन जेल क्षेत्र को कूमासी ब्लू धुंधला और उत्पादित करें। प्रत्येक जेल स्लाइस को छोटे टुकड़ों में पासा करें और उन्हें शून्य दशमलव पाँच मिलीलीटर कम प्रोटीन बाध्यकारी ट्यूब में रखें। पच्चीस मिलीमोलर अमोनियम बाइकार्बोनेट में पचास% एसीटोनिट्रिल के एक सौ माइक्रोलीटर के साथ जेल के टुकड़ों को धोएं। उन्हें दस-पंद्रह मिनट के लिए भंवर। फिर उन्हें नीचे स्पिन करें और सुपरनिटेंट को त्याग दें। आखिरी धोने के बाद, जेल के टुकड़ों को तीस मिनट के लिए बेंच टॉप वैक्यूम सांचित के साथ सुखा लें। दस नैनोग्राम प्रति माइक्रोलीटर अनुक्रमण ग्रेड ट्राइप्सिन जोड़ें और जेल के टुकड़ों को पांच मिनट के लिए फिर से हाइड्रेट होने दें। फिर पच्चीस मिलीमोलर अमोनियम बाइकार्बोनेट जोड़ें, बस जेल के टुकड़ों को कवर करने के लिए पर्याप्त है और उन्हें रात भर सैंतीस डिग्री सेल्सियस पर पचाता है। अगले दिन, पचा सुपरनेट को एक साफ शून्य दशमलव पैंसठ मिलीलीटर सिलिकॉन ट्यूब में स्थानांतरित करें और पचास% एसीटोनिट्रिल और पाँच% फॉरमिक एसिड समाधान जोड़ें। भंवर दस मिनट के लिए नमूना। फिर इसे नीचे स्पिन करें और सुपरनैंट को एक निष्कर्षण ट्यूब में स्थानांतरित करें। नमूना को फिर से दो माइक्रोलीटर पर केंद्रित करें। फिर तीन% एसीटोनिट्रिल और दो% फॉरमिक एसिड समाधान के आठ माइक्रोलीटर जोड़ें। भंवर यह पंद्रह मिनट के लिए और तीस मिनट के लिए सोलह, शून्य बार जी पर नीचे स्पिन । एक बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री उपकरण के साथ मिलकर तरल क्रोमेटोग्राफी प्रणाली का उपयोग कर एलसी-एमएस/एमएस के साथ एमएस डेटा अधिग्रहण करें । नमूने के आठ माइक्रोलीटर को रिवर्स चरण तरल क्रोमेटोग्राफी कॉलम में इंजेक्ट करें और पांडुलिपि निर्देशों के बाद साठ मिनट में सॉल्वेंट बी के दो-अस्सी% ढाल के साथ पेप्टाइड्स को अलग करें। डेटा-निर्भर अधिग्रहण मोड का उपयोग करके बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा एकत्र करें। डेस्कटॉप पर बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा का विश्लेषण करने के लिए वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर खोलें। नई खोज शुरू करने के लिए, शीर्ष मेनू पर एलसी बटन पर क्लिक करें। इसके बाद ओरिजनल एमएस रॉ डाटा फाइल्स को अपलोड करने के लिए ऐड बटन पर क्लिक करें। डेटाबेस खोज विधि के रूप में पैरागॉन विधि में मानव प्रोटीन आईडी का चयन करें और यूनिप्रॉट होमो सेपियंस डेटाबेस के खिलाफ मूल एमएस कच्चे डेटा फ़ाइलों को खोजें। पाचन एंजाइम के रूप में ट्राइपसिन का चयन करें और पांडुलिपि निर्देशों के अनुसार बाकी मापदंडों को निर्धारित करें। परिणाम फाइलनेम दर्ज करें और मेनू के दाईं ओर बटन के रूप में सेव पर क्लिक करें। इसके बाद सर्चिंग रिजल्ट्स को स्टोर करने के लिए फोल्डर चुनें और सेव बटन पर क्लिक करें। खोज शुरू करने के लिए प्रोसेस बटन पर क्लिक करें। खोज समाप्त होने के बाद, दर्ज खोज नाम वाला डेटा स्वचालित रूप से चयनित फ़ोल्डर में संग्रहीत हो जाएगा। किसी भी विशिष्ट पेप्टाइड के एमएस/एमएस स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए, सॉफ्टवेयर F.तो शीर्ष मेनू में प्रोटीन सूची में प्रोटीन पर क्लिक करें और मध्य मेनू में पेप्टाइड पर क्लिक करें में खोज परिणाम खोलें । इस पेप्टाइड का एमएस/एमएस मेन्यू के नीचे दिखाई देगा । एमएस/एमएस स्पेक्ट्रा को निर्यात और सहेजने के लिए स्पेक्ट्रा की कॉपी करें और उसे उपयुक्त फाइल फॉर्मेट में चिपका दें । EYFP CENP-एक जंगली प्रकार या Kएक सौ चौबीसR उत्परिवर्ती जो अंतर्जात CENP-A के नुकसान को बचाता है के जीन निर्माण स्थिर व्यक्त किया गया था जब रेट्रोवायरल एकीकरण किया गया था । क्रे रिकॉम्बिनेज के शामिल होने के सात दिन बाद अंतर्जात सेनपी-ए की अभिव्यक्ति का पता नहीं चला । दोनों EYFP CENP-एक जंगली प्रकार और Kएक सौ चौबीसR प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रारंभिक अंतर्जात CENP-एक प्रोटीन के समान स्तर पर पाया गया था । दोनों EYFP CENP-एक जंगली प्रकार और Kएक सौ चौबीसR म्यूटेंट अंतर्जात CENP-ए की शेष अभिव्यक्ति के व्यवधान के बाद सात दिनों में सेंट्रोमेरे स्थानीयकरण दिखाया । EYFP CENP-एक जंगली प्रकार और Kएक सौ चौबीसR उत्परिवर्ती को झंडी दिखाकर चिह्नित टैग या बिना चलने वाले CENP-एक जंगली प्रकार और Kएक सौ चौबीसR उत्परिवर्ती के लिए मामले के विपरीत HJURP के साथ सर्वव्यापकता और बातचीत दिखाया । शेष अंतर्जात सेनपी-ए एलील के व्यवधान के चौदह दिन बाद कॉलोनी आउटग्रोथ परख का प्रदर्शन करके सेल व्यवहार्यता का आकलन किया गया था। दोनों EYFP CENP-एक जंगली प्रकार और Kएक सौ चौबीसR म्यूटेंट शेष अंतर्जात CENP-एक allele के व्यवधान के बाद चौदह दिन बचाया कालोनियों की एक समान संख्या में दिखाया । आईपी मास स्पेक्ट्रोमेट्री ने CENP-A ऋण एफ कोशिकाओं में EYFP CENP-A Kएक सौ चौबीसR में lysine तीन सौ छः में सर्वव्यापकता का पता चला । सभी एक साथ, इन परिणामों ने सुझाव दिया कि बड़े आकार के प्रोटीन का संलयन CENP-A में Kएक सौ चौबीसR के अलावा एक lysine पर सर्वव्यापकता लाती है जो मूल Kएक सौ चौबीसR एकल उत्परिवर्ती फेनोटाइप को रोकता है । इस प्रोटोकॉल का प्रयास करते समय, बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री नमूनों को चलाने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध चार%बारह% बीआईएस-ट्रिस प्रोटीन जैल का उपयोग करें। जेल के टुकड़ों में पर्याप्त ट्राइप्सिन जोड़ें और सभी एंजाइमों को अवशोषित होने तक उन्हें फिर से हाइड्रेट करें। कम आणविक वजन टैगिंग या जांच तकनीक वास्तव में सर्वव्यापी कल्पना और स्थानिक लौकिक प्रोटीन सर्वव्यापकता और पूरे जीव के स्तर पर संकेत की जांच करने के लिए आवश्यक है ।