Hot start PCR
ಹಾಟ್ ಸ್ಟಾರ್ಟ್ ಪಿಸಿಆರ್ ಸಾಂಪ್ರದಾಯಿಕ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಚೈನ್ ರಿಯಾಕ್ಷನ್ (ಪಿಸಿಆರ್) ನ ಮಾರ್ಪಡಿಸಿದ ರೂಪವಾಗಿದ್ದು, ಕೋಣೆಯ (ಅಥವಾ ತಂಪಾದ) ತಾಪಮಾನದಲ್ಲಿ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ಡಿಎನ್ಎ ವರ್ಧನೆಯಿಂದಾಗಿ ಅನಪೇಕ್ಷಿತ ಉತ್ಪನ್ನಗಳು ಮತ್ತು ಪ್ರೈಮರ್ ಡೈಮರ್ಗಳ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ. ಹೆಚ್ಚಿನ ಇಳುವರಿಯನ್ನು ಸಾಧಿಸುವ ಸಲುವಾಗಿ ಪಿಸಿಆರ್ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನದ ಅನೇಕ ವ್ಯತ್ಯಾಸಗಳು ಮತ್ತು ಮಾರ್ಪಾಡುಗಳನ್ನು ಅಭಿವೃದ್ಧಿಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ; ಹಾಟ್ ಸ್ಟಾರ್ಟ್ ಪಿಸಿಆರ್ ಅವುಗಳಲ್ಲಿ ಒಂದಾಗಿದೆ. ಹಾಟ್ ಸ್ಟಾರ್ಟ್ ಪಿಸಿಆರ್ ಸಾಂಪ್ರದಾಯಿಕ ಪಿಸಿಆರ್ನಂತೆಯೇ ಅದೇ ತತ್ವಗಳನ್ನು ಅನುಸರಿಸುತ್ತದೆ-ಇದರಲ್ಲಿ ಇದು ಒಂದೇ ಸ್ಟ್ರಾಂಡೆಡ್ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ನಿಂದ ಡಿಎನ್ಎಯನ್ನು ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಲು ಡಿಎನ್ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಅನ್ನು ಬಳಸುತ್ತದೆ. ಆದಾಗ್ಯೂ, ಇದು ಉತ್ಪನ್ನದ ಇಳುವರಿಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಲು ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚಿನ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆ ಮತ್ತು ಸೂಕ್ಷ್ಮತೆಯನ್ನು ಒದಗಿಸಲು ಟಾಕ್ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ನ ಬಂಧವನ್ನು ನಿಷ್ಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವ ಅಥವಾ ತಡೆಯುವ ಮತ್ತು ಟಾಕ್ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ನ ತಡವಾದ ಸೇರ್ಪಡೆಯಂತಹ ಹೆಚ್ಚುವರಿ ತಾಪನ ಮತ್ತು ಬೇರ್ಪಡಿಸುವ ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಬಳಸುತ್ತದೆ. ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ಬಂಧಿಸುವಿಕೆ ಮತ್ತು ಪ್ರೈಮರ್ ಡೈಮರ್ಗಳ ಪ್ರೈಮಿಂಗ್ ಅಥವಾ ರಚನೆಯನ್ನು ವಿಕೃತೀಕರಣದ ನಂತರ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಮಿಶ್ರಣವನ್ನು ಪೂರ್ಣಗೊಳಿಸುವ ಮೂಲಕ ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ. ಹೆಚ್ಚಿನ ತಾಪಮಾನದಲ್ಲಿ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಮಿಶ್ರಣಗಳನ್ನು ಪೂರ್ಣಗೊಳಿಸುವ ಕೆಲವು ವಿಧಾನಗಳಲ್ಲಿ ಕಡಿಮೆ ತಾಪಮಾನದಲ್ಲಿ ಡಿಎನ್ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ನಿರ್ಬಂಧಿಸುವ ಮಾರ್ಪಾಡುಗಳು, ಮಾರ್ಪಡಿಸಿದ ಡಿಯೋಕ್ಸಿರೈಬೊನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೋಟೈಡ್ ಟ್ರೈಫಾಸ್ಫೇಟ್ಗಳ (ಡಿಎನ್ಟಿಪಿಗಳು) ಬಳಕೆ ಮತ್ತು ವಿಕೃತೀಕರಣದ ನಂತರ ಅಗತ್ಯವಾದ ಕಾರಕಗಳಲ್ಲಿ ಒಂದನ್ನು ಭೌತಿಕವಾಗಿ ಸೇರಿಸುವುದು ಸೇರಿವೆ. ಈ ಹೆಚ್ಚುವರಿ ವಿಧಾನಗಳ ಮೂಲಕ, ಹಾಟ್ ಸ್ಟಾರ್ಟ್ ಪಿಸಿಆರ್ ಕಡಿಮೆ ತಾಪಮಾನದಲ್ಲಿ ನೈಸರ್ಗಿಕವಾಗಿ ಸಂಭವಿಸುವ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ವರ್ಧನೆಗಳ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಲು ಸಾಧ್ಯವಾಗುತ್ತದೆ-ಇದು ಸಾಂಪ್ರದಾಯಿಕ ಪಿಸಿಆರ್ಗೆ ಸಮಸ್ಯೆಯಾಗಿ ಉಳಿದಿದೆ. ಈ ಮಾರ್ಪಾಡುಗಳು ದ್ರಾವಣದಲ್ಲಿರುವ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಕಿಣ್ವಗಳು ನಿಷ್ಕ್ರಿಯವಾಗಿ ಉಳಿಯುತ್ತವೆ ಅಥವಾ ಸೂಕ್ತವಾದ ಅನೀಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ತಲುಪುವವರೆಗೆ ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸಲ್ಪಡುತ್ತವೆ ಎಂದು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು ಒಟ್ಟಾರೆಯಾಗಿ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸುತ್ತವೆ. ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ಪಿಸಿಆರ್ ಉತ್ಪನ್ನಗಳ ರಚನೆಯನ್ನು ತಡೆಯುವುದು, ವಿಶೇಷವಾಗಿ ಆರಂಭಿಕ ಚಕ್ರಗಳಲ್ಲಿ, ಪಿಸಿಆರ್ನಿಂದ ವರ್ಧನೆಯ ಸೂಕ್ಷ್ಮತೆಯಲ್ಲಿ ಗಣನೀಯ ಹೆಚ್ಚಳಕ್ಕೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ. ಪಿಸಿಆರ್ ಅಥವಾ ಆರ್ಟಿ-ಪಿಸಿಆರ್ನ ರೋಗನಿರ್ಣಯದ ಅನ್ವಯಗಳಲ್ಲಿ ಇದು ಅತ್ಯಂತ ಮಹತ್ವದ್ದಾಗಿದೆ. ಹಿನ್ನೆಲೆ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಚೈನ್ ರಿಯಾಕ್ಷನ್ (ಪಿಸಿಆರ್) ಒಂದು ಆಣ್ವಿಕ ಜೀವಶಾಸ್ತ್ರದ ತಂತ್ರವಾಗಿದ್ದು, ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಡಿಎನ್ಎ ವಿಭಾಗಗಳನ್ನು ಹಲವಾರು ಪ್ರಮಾಣದಲ್ಲಿ ವರ್ಧಿಸಲು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಡಿಎನ್ಎಯ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಭಾಗಗಳನ್ನು ಮೂರು ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಗಳಲ್ಲಿ ವರ್ಧಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಡಿನೇಚುರೇಶನ್, ಅನೀಲಿಂಗ್ ಮತ್ತು ಎಕ್ಸ್ಟೆನ್ಶನ್-ಅಲ್ಲಿ ಡಿಎನ್ಎ ಎಳೆಗಳನ್ನು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಿಂದ ಗರಿಷ್ಠ ತಾಪಮಾನಕ್ಕೆ ಹೆಚ್ಚಿಸುವ ಮೂಲಕ ಬೇರ್ಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಪ್ರೈಮರ್ಗಳು ಬಂಧಿಸುವ ಮೊದಲು ಮತ್ತು ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೋಟೈಡ್ಗಳನ್ನು ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್ಗೆ ಜೋಡಿಸುತ್ತದೆ. ಇದು ಡಿಎನ್ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಅನ್ನು ಬಳಸುತ್ತದೆ, ಇದು ಕಡಿಮೆ ತಾಪಮಾನದಲ್ಲಿ ಸ್ವಲ್ಪ ಸಕ್ರಿಯವಾಗಿರುತ್ತದೆ. ಸಾಂಪ್ರದಾಯಿಕ ಪಿಸಿಆರ್ನಲ್ಲಿ, ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಮಿಶ್ರಣವು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ ಪೂರ್ಣಗೊಳ್ಳುತ್ತದೆ, ಮತ್ತು ಡಿಎನ್ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯಿಂದಾಗಿ, ಪ್ರೈಮರ್ಗಳು ಪ್ರೈಮರ್ ಡೈಮರ್ಗಳನ್ನು ಅಥವಾ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ಡಿಎನ್ಎಗೆ ಅನೀಲ್ ಅನ್ನು ರಚಿಸಬಹುದು. ಪಿಸಿಆರ್ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನದ ಸಮಯದಲ್ಲಿ, ಡಿಎನ್ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಡಿಎನ್ಎಯ ಯಾವುದೇ ತುಂಡನ್ನು ಬೌಂಡ್ ಪ್ರೈಮರ್ಗಳೊಂದಿಗೆ ವಿಸ್ತರಿಸುತ್ತದೆ, ಗುರಿ ಉತ್ಪನ್ನಗಳನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸುತ್ತದೆ ಆದರೆ ಇಳುವರಿಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುವ ಅನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಉತ್ಪನ್ನಗಳನ್ನು ಸಹ ಉತ್ಪಾದಿಸುತ್ತದೆ. ಬಿಸಿ ಆರಂಭದ ಪಿಸಿಆರ್ನಲ್ಲಿ, ಮಿಶ್ರಣವನ್ನು ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಅನೀಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನಕ್ಕೆ ಬಿಸಿ ಮಾಡುವವರೆಗೆ ಕೆಲವು ಕಾರಕಗಳನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕವಾಗಿ ಇಡಲಾಗುತ್ತದೆ. ಇದು ಅನೀಲಿಂಗ್ ಸಮಯವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ, ಇದು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ಡಿಎನ್ಎ ವಿಸ್ತರಣೆಯ ಸಾಧ್ಯತೆಯನ್ನು ಮತ್ತು ವಿಕೃತೀಕರಣಕ್ಕೆ ಮುಂಚಿತವಾಗಿ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ಪ್ರೈಮರ್ ಬಂಧದ ಪ್ರಭಾವವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ. ಸಾಂಪ್ರದಾಯಿಕ ಪಿಸಿಆರ್ನಲ್ಲಿ, ಸೂಕ್ತವಾದ ಅನೀಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನಕ್ಕಿಂತ (50-65 °ಸಿ) ಕಡಿಮೆ ತಾಪಮಾನವು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ವರ್ಧನೆಗಳಂತಹ ಗುರಿ ಮಾರ್ಪಾಡುಗಳಿಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ, ಅಲ್ಲಿ ಪ್ರೈಮರ್ಗಳು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲಕ್ಕೆ ಬಂಧಿಸುತ್ತವೆ. ಮಿಶ್ರಣದಲ್ಲಿ ಅಧಿಕವಾಗಿರುವ ಈ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ಪ್ರೈಮರ್ ಸಂಕೀರ್ಣಗಳು ಪ್ರೈಮರ್ ಡೈಮರ್ ಮತ್ತು ಮಿಸ್-ಪ್ರೈಮಿಂಗ್ನಂತಹ ಉಪ-ಉತ್ಪನ್ನಗಳ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗಿವೆ. ಮಿಸ್ಪ್ರೈಮಿಂಗ್, ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್ಗಾಗಿ ಗುರಿ ಅನುಕ್ರಮಗಳೊಂದಿಗೆ ಸಕ್ರಿಯವಾಗಿ ಸ್ಪರ್ಧಿಸುವ ಮೂಲಕ ಪಿಸಿಆರ್ ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್ನ ದಕ್ಷತೆಯನ್ನು ಬಹಳವಾಗಿ ಅಡ್ಡಿಪಡಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ. ಅಂತೆಯೇ, ಪ್ರೈಮರ್ ಡೈಮರ್ಗಳು ಸಂಕೀರ್ಣಗಳನ್ನು ರೂಪಿಸುತ್ತವೆ, ಇದು ಪಡೆದ ನಕಲು ಸಂಖ್ಯೆಯ ವರ್ಧನೆಗಳ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ. ಹಾಟ್ ಸ್ಟಾರ್ಟ್ ಪಿಸಿಆರ್ ಅನ್ನು ಅನುಷ್ಠಾನಗೊಳಿಸುವ ಮೂಲಕ ಇದನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸಬಹುದು, ಇದು ಅತ್ಯುತ್ತಮ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ತಲುಪುವವರೆಗೆ ಪ್ರೈಮರ್ ವಿಸ್ತರಣೆಗಳನ್ನು ನಿರ್ಬಂಧಿಸಲು ಅನುವು ಮಾಡಿಕೊಡುತ್ತದೆ. ಬಿಸಿ ಆರಂಭದ ಪಿಸಿಆರ್ನಲ್ಲಿ, ಪ್ರಮುಖ ಕಾರಕಗಳು (ಡಿಎನ್ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಮತ್ತು ಮೆಗ್ನೀಸಿಯಮ್ ಕೋಫ್ಯಾಕ್ಟರ್ಗಳಂತಹವು) ಪಿಸಿಆರ್ ಮಿಶ್ರಣದಲ್ಲಿ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಿಸುವುದನ್ನು ದೈಹಿಕ ಬೇರ್ಪಡಿಸುವಿಕೆ ಅಥವಾ ರಾಸಾಯನಿಕ ಮಾರ್ಪಾಡುಗಳ ಮೂಲಕ ಅತ್ಯುತ್ತಮ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ತಲುಪುವವರೆಗೆ ತಡೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ. ಟಾಕ್ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಅನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸಿದಾಗ/ನಿಷ್ಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಿದಾಗ ಅಥವಾ ಅದರ ಸೇರ್ಪಡೆಯು ಸೂಕ್ತವಾದ ಅನೀಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನದವರೆಗೆ ವಿಳಂಬವಾದಾಗ, ಡಿಯೋಕ್ಸಿರಿಬೋನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೋಟೈಡ್ ಟ್ರೈಫಾಸ್ಫೇಟ್ ಮಾರ್ಪಾಡುಗಳ ಮೂಲಕ ಅಥವಾ ಕೇಜಿಂಗ್ ಮತ್ತು ಸೆಕೆಂಡರಿ ಸ್ಟ್ರಕ್ಚರ್ ಕುಶಲತೆಯ ಮೂಲಕ ಪ್ರೈಮರ್ಗಳನ್ನು ಮಾರ್ಪಡಿಸುವ ಮೂಲಕ ಹಾಟ್ ಸ್ಟಾರ್ಟ್ ಪಿಸಿಆರ್ ಸಂಭವಿಸಬಹುದು. ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಮಿಶ್ರಣದಲ್ಲಿ ಡಿಎನ್ಎ ಕಡಿಮೆ ಸಾಂದ್ರತೆಯಿರುವ ಸಂದರ್ಭಗಳಲ್ಲಿ, ಡಿಎನ್ಎ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಹೆಚ್ಚು ಸಂಕೀರ್ಣವಾಗಿದೆ, ಅಥವಾ ಪಿಸಿಆರ್ನಲ್ಲಿ ಹಲವಾರು ಜೋಡಿ ಆಲಿಗೋನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೋಟೈಡ್ ಪ್ರೈಮರ್ಗಳಿದ್ದರೆ, ಹಾಟ್ ಸ್ಟಾರ್ಟ್ ಪಿಸಿಆರ್ ಸಾಂಪ್ರದಾಯಿಕ ಪಿಸಿಆರ್ಗೆ ವಿರುದ್ಧವಾದ ಉತ್ತಮ ವಿಧಾನವಾಗಿದೆ. ವಿಧಾನಗಳು ಹಾಟ್ ಸ್ಟಾರ್ಟ್ ಪಿಸಿಆರ್ ಎಂಬುದು ಇಳುವರಿ ನಷ್ಟವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಲು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ಬಂಧವನ್ನು ತಡೆಯಲು ಕಡಿಮೆ ತಾಪಮಾನದಲ್ಲಿ ಡಿಎನ್ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ವಿಸ್ತರಣೆಯನ್ನು ತಡೆಯುವ ಒಂದು ವಿಧಾನವಾಗಿದೆ. ಹಾಟ್ ಸ್ಟಾರ್ಟ್ ಪಿಸಿಆರ್, ಪಿಸಿಆರ್ನ ತಾಪನ ಹಂತಗಳವರೆಗೆ ಸೀಮಿತಗೊಳಿಸುವ ಮೂಲಕ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ಬಂಧದ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ-ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ಟಾಕ್ ಡಿಎನ್ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಅನ್ನು ಸೀಮಿತಗೊಳಿಸುವ ಮೂಲಕ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಮೊದಲೇ ಮಿತಿಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ. ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ಬಂಧವು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಪ್ರೈಮರ್ ಡೈಮರ್ಗಳು ಮತ್ತು ತಪ್ಪು-ಪ್ರಾಥಮಿಕ/ಸುಳ್ಳು ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಗುರಿಗಳಿಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ. ಇವುಗಳನ್ನು ಮಾರ್ಪಡಿಸಿದ ವಿಧಾನಗಳ ಮೂಲಕ ಸರಿಪಡಿಸಬಹುದುಃ ಟಾಕ್ ಡಿಎನ್ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಕಿಣ್ವಕ್ಕೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳನ್ನು ನಿಷ್ಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವುದು/ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸುವುದು/ಟಾಕ್ ಡಿಎನ್ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳೊಂದಿಗೆ ಸಂಕೀರ್ಣವಾಗಿರುವ ಟಾಕ್ ಡಿಎನ್ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ಃ ಕಿಣ್ವಕ್ಕೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳು ಟಾಕ್ ಡಿಎನ್ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಅನ್ನು ನಿಷ್ಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುತ್ತವೆ. ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳು ಪಾಲಿಮರೇಸ್ಗೆ ಸಂಪರ್ಕ ಕಲ್ಪಿಸುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಬಂಧಿಸುತ್ತವೆ, ಇದು ಕಡಿಮೆ ತಾಪಮಾನದಲ್ಲಿ ಸಂಭವಿಸಬಹುದಾದ ಆರಂಭಿಕ ಡಿಎನ್ಎ ವರ್ಧನೆಯನ್ನು ತಡೆಯುತ್ತದೆ. ಸೂಕ್ತವಾದ ಅನೀಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ಪೂರೈಸಿದ ನಂತರ, ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳು ಕ್ಷೀಣಿಸಲು ಮತ್ತು ಬೇರ್ಪಡಿಸಲು ಪ್ರಾರಂಭಿಸುತ್ತವೆ, ಟಾಕ್ ಡಿಎನ್ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಅನ್ನು ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯಾಗಿ ಬಿಡುಗಡೆ ಮಾಡುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ವರ್ಧನೆಯ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಪ್ರಾರಂಭಿಸಲು ಅನುವು ಮಾಡಿಕೊಡುತ್ತದೆ. ಪ್ಲಾಟಿನಂ ಟಾಕ್ ಡಿಎನ್ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಮತ್ತು ಅಕ್ಯುಸ್ಟಾರ್ಟ್ ಟಾಕ್ ಡಿಎನ್ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ (ಇವೆರಡನ್ನೂ ಆಯುಬ್ ರಾಶ್ಚಿಯಾನ್ ಅವರು ಲೈಫ್ ಟೆಕ್ನಾಲಜೀಸ್ ಮತ್ತು ಕ್ವಾಂಟಾ ಬಯೋಸೈನ್ಸಸ್ನಲ್ಲಿ ಅಭಿವೃದ್ಧಿಪಡಿಸಿದ್ದಾರೆ) ವಾಣಿಜ್ಯಿಕವಾಗಿ ಲಭ್ಯವಿರುವ ಪ್ರತಿಕಾಯ ಆಧಾರಿತ ಹಾಟ್ ಸ್ಟಾರ್ಟ್ ಟಾಕ್ ಡಿಎನ್ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ಗಳಿಗೆ ಉದಾಹರಣೆಗಳಾಗಿವೆ. ಈ ಟಾಕ್ ಡಿಎನ್ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ಗಳು ಟಾಕ್ ಡಿಎನ್ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ಗೆ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾದ ಮೊನೊಕ್ಲೋನಲ್ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳ ಮಿಶ್ರಣದೊಂದಿಗೆ ಪೂರ್ವಭಾವಿಯಾಗಿರುತ್ತವೆ. ಮೇಣದ ಮಣಿಗಳುಃ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ಅವಲಂಬಿಸಿರುವ ಮೇಣದ ಮಣಿಗಳಿಂದ ಟಾಕ್ ಡಿಎನ್ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಮತ್ತು ಉಳಿದ ಪಿಸಿಆರ್ ಘಟಕಗಳ ನಡುವೆ ಭೌತಿಕ ತಡೆಗೋಡೆ ಸೃಷ್ಟಿಯಾಗುತ್ತದೆ. ಮೊದಲ ಚಕ್ರದಲ್ಲಿ ಡಿನೇಚುರೇಶನ್ ಹಂತದ ಸಮಯದಲ್ಲಿ, ತಾಪಮಾನವು 70 ಡಿಗ್ರಿ ಸೆಲ್ಸಿಯಸ್ಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚಾದ ನಂತರ, ಮೇಣದ ಮಣಿ ಕರಗುತ್ತದೆ, ಇದು ಟಾಕ್ ಡಿಎನ್ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಅನ್ನು ತಡೆಗೋಡೆ ದಾಟಿ ತಪ್ಪಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು ಮತ್ತು ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗೆ ಬಿಡುಗಡೆ ಮಾಡಲು ಅನುವು ಮಾಡಿಕೊಡುತ್ತದೆ-ವರ್ಧನೆಯ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಪ್ರಾರಂಭಿಸುತ್ತದೆ. ಮೇಣದ ಪದರವು ನಂತರ ವರ್ಧನೆಯ ಹಂತದಲ್ಲಿ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಮಿಶ್ರಣದ ಮೇಲ್ಭಾಗಕ್ಕೆ ಚಲಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ನಂತರ ಆವಿಯ ತಡೆಗೋಡೆಯಾಗಿ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸುತ್ತದೆ. ಹೆಚ್ಚು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾದ ಒಲಿಗೋನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೋಟೈಡ್ಗಳುಃ ಒಲಿಗೋನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೋಟೈಡ್ಗಳು ಸುಲಭವಾಗಿ ಬಂಧಿಸುವ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲದ ಸಣ್ಣ ಪಾಲಿಮರ್ಗಳಾಗಿವೆ. ಆಪ್ಟಾಮರ್ಗಳಂತಹ ಹೆಚ್ಚು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾದ ಆಲಿಗೋನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೋಟೈಡ್ಗಳು, ಕಡಿಮೆ ತಾಪಮಾನದಲ್ಲಿ ಟಾಕ್ ಡಿಎನ್ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ಗೆ ಬಂಧಿಸಿ, ಅದನ್ನು ಮಿಶ್ರಣದಲ್ಲಿ ನಿಷ್ಕ್ರಿಯವಾಗಿಸುತ್ತವೆ. ಹೆಚ್ಚಿನ ತಾಪಮಾನದಲ್ಲಿ ಮಾತ್ರ ಒಲಿಗೋನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೋಟೈಡ್ಗಳು ಟಾಕ್ನಿಂದ ಬೇರ್ಪಟ್ಟು ಅದು ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಿಸಲು ಅನುವು ಮಾಡಿಕೊಡುತ್ತದೆ. ಬಿಸಿ ಆರಂಭದ ಪಿಸಿಆರ್ಗೆ ಇವು ಅತ್ಯಂತ ಪರಿಣಾಮಕಾರಿ ವಿಧಾನಗಳಾಗಿವೆ, ಕಿಣ್ವಕ್ಕೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳು ಮತ್ತು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ಹೆಚ್ಚು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾದ ಒಲಿಗೋನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೋಟೈಡ್ ವಿಧಾನಗಳು ಕಡಿಮೆ ನಿಷ್ಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವ ಸಮಯದ ಅಗತ್ಯವಿರುವ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚು ಸೂಕ್ತವಾಗಿವೆ. ಆದಾಗ್ಯೂ, ಇತರ ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಅಳವಡಿಸಲಾಗಿದೆ ಎಂದು ತಿಳಿದುಬಂದಿದೆ, ಉದಾಹರಣೆಗೆಃ ಟಾಕ್ ಡಿಎನ್ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಅನ್ನು ತಡವಾಗಿ ಸೇರಿಸುವುದುಃ ಪಿಸಿಆರ್ ಯಂತ್ರವನ್ನು ಮುಂಚಿತವಾಗಿ ಬಿಸಿಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಘಟಕಗಳನ್ನು ಮಂಜುಗಡ್ಡೆಯ ಮೇಲೆ ಬೆರೆಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ನಂತರ ಅದು ಗರಿಷ್ಠ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ತಲುಪಿದ ತಕ್ಷಣ ಪಿಸಿಆರ್ ಯಂತ್ರದಲ್ಲಿ ಇರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಇದು ಅಗತ್ಯವಾದ ವಾರ್ಮ್-ಅಪ್ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ತೊಡೆದುಹಾಕುತ್ತದೆ, ಪ್ರೈಮರ್ಗಳ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ಅನೀಲಿಂಗ್ ಅನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಮಿಶ್ರಣದಲ್ಲಿನ ಯಾವುದೇ ಮಿಸ್ ಪೇಯರ್ಡ್ ಪ್ರೈಮರ್ಗಳನ್ನು ಬೇರ್ಪಡಿಸಲಾಗಿದೆಯೆ ಎಂದು ಖಚಿತಪಡಿಸುತ್ತದೆ. ಘನೀಕರಿಸುವಿಕೆಃ ಘನೀಕರಿಸುವಿಕೆಯು ಮೇಣದ ಮಣಿಗಳಂತೆಯೇ ಭೌತಿಕ ಪ್ರತ್ಯೇಕತೆಯ ಒಂದು ರೂಪವಾಗಿ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸುತ್ತದೆ. ಪ್ರೈಮರ್ಗಳು, ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್, ನೀರು ಮತ್ತು ಡಿಯೋಕ್ಸಿರಿಬೋನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೋಟೈಡ್ ಟ್ರೈಫಾಸ್ಫೇಟ್ (ಡಿ. ಎನ್. ಟಿ. ಪಿ) ಅನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಮಿಶ್ರಣವನ್ನು ಟಾಕ್ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಮೊದಲು ಹೆಪ್ಪುಗಟ್ಟಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಉಳಿದ ಪಿಸಿಆರ್ ಘಟಕಗಳನ್ನು ಹೆಪ್ಪುಗಟ್ಟಿದ ಮಿಶ್ರಣದ ಮೇಲೆ ಸೇರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಇದು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ಬಂಧವನ್ನು ತಡೆಗಟ್ಟಲು ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸುತ್ತದೆ. ನಂತರ ಟಾಕ್ ಅನ್ನು ಸೇರಿಸುವುದುಃ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಮಿಶ್ರಣದಲ್ಲಿ ಪಿಸಿಆರ್ನ ಘಟಕಗಳನ್ನು ಟಾಕ್ ಅನ್ನು ಸೇರಿಸದೆ ತಯಾರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಬಿಸಿಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ. ಸೂಕ್ತವಾದ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ತಲುಪಿದ ನಂತರವೇ ಟಾಕ್ ಅನ್ನು ಮಿಶ್ರಣಕ್ಕೆ ಸೇರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಆದಾಗ್ಯೂ, ಈ ವಿಧಾನವು ಅತ್ಯಂತ ಕಡಿಮೆ ವಿಶ್ವಾಸಾರ್ಹವಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಘಟಕಗಳ ಮಾಲಿನ್ಯಕ್ಕೆ ಕಾರಣವಾಗಬಹುದು. ಮತ್ತೊಂದು ವಿಧಾನವೆಂದರೆ ಡಿಯೋಕ್ಸಿರಿಬೋನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೋಟೈಡ್ ಟ್ರೈಫಾಸ್ಫೇಟ್ ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆಯ ಬಿಸಿ ಆರಂಭ ಪಿಸಿಆರ್ ಮೂಲಕ ಇದು ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೋಟೈಡ್ ಬೇಸ್ಗಳನ್ನು ರಕ್ಷಿಸುವ ಗುಂಪಿನ ಮೂಲಕ ಮಾರ್ಪಡಿಸುತ್ತದೆ. ಡಿಯೋಕ್ಸಿರಿಬೋನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೋಟೈಡ್ ಟ್ರೈಫಾಸ್ಫೇಟ್ (ಡಿ. ಎನ್. ಟಿ. ಪಿ.) ಮಾರ್ಪಾಡುಗಳು ಹಾಟ್ ಸ್ಟಾರ್ಟ್ ಡಿ. ಎನ್. ಟಿ. ಪಿ. ಯನ್ನು 3 ಪ್ರಧಾನ ಟರ್ಮಿನಸ್ನಲ್ಲಿ ಶಾಖ ಸೂಕ್ಷ್ಮ ರಕ್ಷಣಾ ಗುಂಪನ್ನು ಸೇರಿಸಲು ರಾಸಾಯನಿಕವಾಗಿ ಮಾರ್ಪಡಿಸಬಹುದು. ಈ ಮಾರ್ಪಾಡು ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೋಟೈಡ್ಗಳು ಟಾಕ್ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ನೊಂದಿಗೆ ಸಂವಹನ ನಡೆಸಿ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್ಗೆ ಬಂಧಿಸುವುದನ್ನು ತಡೆಯುತ್ತದೆ, ಆದ್ದರಿಂದ ಸೂಕ್ತವಾದ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ತಲುಪುವವರೆಗೆ, ಶಾಖ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವ ಹಂತದಲ್ಲಿ ರಕ್ಷಿಸುವ ಗುಂಪನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾಗುತ್ತದೆ. ಬಿಸಿ ಆರಂಭದ ಡಿ. ಎನ್. ಟಿ. ಪಿ, ಡಿ. ಎ, ಡಿ. ಟಿ, ಡಿ. ಸಿ ಮತ್ತು ಡಿ. ಜಿ. ಗಳು ನೈಸರ್ಗಿಕ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೋಟೈಡ್ಗಳನ್ನು ಬದಲಾಯಿಸುತ್ತವೆ. ಎಲ್ಲಾ ನಾಲ್ಕು ಮಾರ್ಪಡಿಸಿದ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೋಟೈಡ್ಗಳನ್ನು ಬಳಸಲು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡಲಾಗಿದೆ, ಆದಾಗ್ಯೂ, ಹಿಂದಿನ ಸಂಶೋಧನೆಯು ಒಂದು ಅಥವಾ ಎರಡು ನೈಸರ್ಗಿಕ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೋಟೈಡ್ಗಳನ್ನು ಮಾರ್ಪಡಿಸಿದ ಡಿ. ಎನ್. ಟಿ. ಪಿ. ಗಳೊಂದಿಗೆ ಬದಲಿಸುವ ಮೂಲಕ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ವರ್ಧನೆಯು ಸಂಭವಿಸುವುದಿಲ್ಲ ಎಂದು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು ಸಾಕಾಗುತ್ತದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ. ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲದ ಮತ್ತೊಂದು ರಾಸಾಯನಿಕ ಮಾರ್ಪಾಡು ಶಾಖ-ಹಿಂತಿರುಗಿಸಬಹುದಾದ ಕೋವೆಲೆಂಟ್ ಮಾರ್ಪಾಡುಗಳ ಮೂಲಕವಾಗಿದೆ, ಇದು ಆಸಕ್ತಿಯ ಮಾದರಿಗೆ ಪ್ರೈಮರ್ಗಳ ಸಂಕರೀಕರಣವನ್ನು ತಡೆಯುತ್ತದೆ. ಗ್ವಾನೋಸಿನ್ ಅಮೈನೋ ಗುಂಪು ಗ್ಲೈಕ್ಸಲ್ನೊಂದಿಗೆ ಸಂವಹನ ನಡೆಸಿ ಡಿ. ಜಿ. ಯನ್ನು ರೂಪಿಸುತ್ತದೆ. ಮಾರ್ಪಡಿಸಿದ ಪ್ರೈಮರ್ಗಳ ದ್ವಿತೀಯಕ ರಚನೆಃ ಕೆಲವು ದ್ವಿತೀಯಕ ರಚನೆಗಳು ಪ್ರೈಮರ್ಗಳ ಕಾರ್ಯಗಳಿಗೆ ಅಡ್ಡಿಯಾಗಬಹುದು. ಉದಾಹರಣೆಗೆ, ಹೇರ್ಪಿನ್ ರಚನೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಒಲಿಗೋನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೋಟೈಡ್ಗಳು ಪ್ರೈಮರ್ ಆಗಿ ಪರಿಣಾಮಕಾರಿಯಾಗಿ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಿಲ್ಲ. ಆದಾಗ್ಯೂ, ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಮಿಶ್ರಣವನ್ನು ಅನೀಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನಕ್ಕೆ ಬಿಸಿ ಮಾಡಿದ ನಂತರ ಪ್ರೈಮರ್ ರಚನೆಯ ಬದಲಾವಣೆಗೆ ಒಳಗಾಗುತ್ತದೆ, ಪ್ರೈಮರ್ ಬದಲಿಗೆ ರೇಖೀಯ ರಚನೆಯನ್ನು ರೂಪಿಸಲು ಅನುವು ಮಾಡಿಕೊಡುತ್ತದೆ, ಇದು ಪ್ರೈಮರ್ ಅನ್ನು ಗುರಿ ವಿಭಾಗಕ್ಕೆ ಲಗತ್ತಿಸಲು ಮತ್ತು ಪಿಸಿಆರ್ ಅನ್ನು ಪ್ರಾರಂಭಿಸಲು ಅನುವು ಮಾಡಿಕೊಡುತ್ತದೆ. ವಾಸ್ತವವಾಗಿ, 'ಡಬಲ್-ಬಬಲ್' ಪ್ರೈಮರ್ಗಳು ಎಂದು ಕರೆಯಲ್ಪಡುವ ಹೇರ್ಪಿನ್ ಪ್ರೈಮರ್ಗಳಿಗೆ ಹೆಚ್ಚು ಸ್ಥಿರವಾದ ಸಂರಚನೆಯಿದೆ, ಇದು ಹೆಡ್ ಟು ಟೈಲ್ ಹೋಮೋಡೈಮರ್ ಸಂರಚನೆಯನ್ನು ರೂಪಿಸುತ್ತದೆ, ಇದನ್ನು ರಿವರ್ಸ್-ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ಮತ್ತು ಹಾಟ್-ಸ್ಟಾರ್ಟ್ ಪಿಸಿಆರ್ ಎರಡಕ್ಕೂ ಬಳಸಬಹುದು. ದ್ಯುತಿರಾಸಾಯನಿಕವಾಗಿ ತೆಗೆಯಬಹುದಾದ ಪಂಜರಗಳುಃ ದ್ಯುತಿರಾಸಾಯನಿಕವಾಗಿ ತೆಗೆಯಬಹುದಾದ ರಕ್ಷಣಾತ್ಮಕ ಗುಂಪಾಗಿರುವ ಪಂಜರದ ಗುಂಪು, ಉದಾಹರಣೆಗೆ ಪಂಜರದ ಥೈಮಿಡಿನ್ ಫಾಸ್ಫೋರಮಿಡೈಟ್ಗಳನ್ನು ಒಲಿಗೋನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೋಟೈಡ್ ಪ್ರೈಮರ್ನಲ್ಲಿ ಸೇರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಇದು ಯುವಿ ವಿಕಿರಣದ (365 ಎನ್ಎಂ) ಬಳಕೆಯ ಮೂಲಕ ಪ್ರೈಮರ್ನ ಕಾರ್ಯವನ್ನು ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಲು ಮತ್ತು ನಿಷ್ಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಲು ಅನುವು ಮಾಡಿಕೊಡುತ್ತದೆ. ಆದ್ದರಿಂದ, ಅನೀಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ತಲುಪಿದ ನಂತರ ಪ್ರೈಮರ್ಗಳನ್ನು ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಬಹುದು. ಪಿಸಿಆರ್ನಲ್ಲಿ ಮೆಗ್ನೀಸಿಯಮ್ ಮೆಗ್ನೀಸಿಯಮ್ನ ನಿಯಂತ್ರಿತ ಸೇರ್ಪಡೆಯು ಅಗತ್ಯವಾಗಿರುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಸಹ-ಅಂಶವಾಗಿ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸುತ್ತದೆ ಏಕೆಂದರೆ ಟಾಕ್ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಮೆಗ್ನೀಸಿಯಮ್ ಅನ್ನು ಅವಲಂಬಿಸಿದೆ. ಮೆಗ್ನೀಸಿಯಮ್ ಮತ್ತು ಫಾಸ್ಫೇಟ್ನ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಪ್ರಮಾಣಿತ ಬಫರ್ ಕಾರಕಗಳಿಗೆ ಹೆಚ್ಚಿಸುವುದರಿಂದ ಮೆಗ್ನೀಸಿಯಮ್ ಅವಕ್ಷೇಪವನ್ನು ಸೃಷ್ಟಿಸುತ್ತದೆ, ಉಷ್ಣ ಸೈಕ್ಲಿಂಗ್ ಹಂತದವರೆಗೆ ಡಿಎನ್ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ಗೆ ಯಾವುದೇ ಮೆಗ್ನೀಸಿಯಮ್ ಇಲ್ಲದ ಕಾರಣ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗೆ ಬಿಸಿ ಆರಂಭವನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ. ಥರ್ಮಲ್ ಸೈಕ್ಲಿಂಗ್ ಸಮಯದಲ್ಲಿ, ಮೆಗ್ನೀಸಿಯಮ್ ಮತ್ತೆ ದ್ರಾವಣದಲ್ಲಿ ಕರಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಅನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸಲು ಅನುವು ಮಾಡಿಕೊಡಲು ಲಭ್ಯವಾಗುತ್ತದೆ. ಪ್ರಯೋಜನಗಳು ಹಾಟ್ ಸ್ಟಾರ್ಟ್ ಪಿಸಿಆರ್ ಪ್ರಯೋಜನಕಾರಿಯಾಗಿದೆ ಏಕೆಂದರೆ ಇದಕ್ಕೆ ಕಡಿಮೆ ನಿರ್ವಹಣೆಯ ಅಗತ್ಯವಿರುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಮಾಲಿನ್ಯದ ಅಪಾಯವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ. ಹಾಟ್ ಸ್ಟಾರ್ಟ್ ಪಿಸಿಆರ್ ಅನ್ನು ರಾಸಾಯನಿಕವಾಗಿ ಮಾರ್ಪಡಿಸಬಹುದು ಅಥವಾ ಪ್ರತಿಕಾಯ ಆಧಾರಿತವಾಗಿರಬಹುದು, ಇದು ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಕ್ಕೆ ವಿಭಿನ್ನ ಪ್ರಯೋಜನಗಳನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ. ರಾಸಾಯನಿಕವಾಗಿ ಮಾರ್ಪಡಿಸಿದ ಹಾಟ್ ಸ್ಟಾರ್ಟ್ ಪಿಸಿಆರ್ನಲ್ಲಿ, ಕಾರ್ಯವಿಧಾನವನ್ನು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ ತೆಗೆದುಕೊಳ್ಳಬಹುದು ಮತ್ತು ಪಿಸಿಆರ್ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯು ಪ್ರಾರಂಭವಾಗುವ ಮೊದಲು ಪ್ರೈಮರ್ಗಳು ಒಂದಕ್ಕೊಂದು ಬಂಧಿಸುವುದನ್ನು ತಡೆಯುವ ಮೂಲಕ ಮತ್ತು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ಪ್ರೈಮಿಂಗ್ ಅನ್ನು ಸೀಮಿತಗೊಳಿಸುವ ಮೂಲಕ ಪ್ರೈಮರ್-ಡೈಮರ್ಗಳ ರಚನೆಯನ್ನು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ. ಅಂತೆಯೇ, ಹಾಟ್ ಸ್ಟಾರ್ಟ್ ಪಿಸಿಆರ್ ಕಡಿಮೆ ಹೋಮೋಲಜಿಯನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಅನುಕ್ರಮಗಳಿಗೆ ಪ್ರೈಮರ್ಗಳನ್ನು ಬಂಧಿಸುವುದನ್ನು ತಡೆಯುತ್ತದೆ, ಇದು ತಪ್ಪಾದ ಪ್ರೈಮಿಂಗ್ಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ. ಇದು ಕಠಿಣ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಿಂದಾಗಿ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆ ಮತ್ತು ಸೂಕ್ಷ್ಮತೆಯನ್ನು ಸುಧಾರಿಸಬಹುದು, ಜೊತೆಗೆ ಉದ್ದೇಶಿತ ತುಣುಕಿನ ಉತ್ಪನ್ನದ ಇಳುವರಿಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಬಹುದು. ಪ್ರತಿಕಾಯ ಆಧಾರಿತ ಹಾಟ್ ಸ್ಟಾರ್ಟ್ ಪಿಸಿಆರ್ನಲ್ಲಿ, ಸೈಕ್ಲಿಂಗ್ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಆರಂಭಿಕ ವಿಕೃತೀಕರಣ ಹಂತದ ನಂತರ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಅನ್ನು ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಆದ್ದರಿಂದ ಅಗತ್ಯವಿರುವ ಸಮಯವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ. ಇದು ಹೆಚ್ಚಿನ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ. ಮಿತಿಗಳು ಅದರ ಪ್ರಯೋಜನಗಳ ಜೊತೆಗೆ, ಹಾಟ್ ಸ್ಟಾರ್ಟ್ ಪಿಸಿಆರ್ ಸಹ ಮಿತಿಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ, ಇದನ್ನು ವಿಧಾನವನ್ನು ಕಾರ್ಯಗತಗೊಳಿಸುವ ಮೊದಲು ಪರಿಗಣಿಸಬೇಕು. ಹಾಟ್ ಸ್ಟಾರ್ಟ್ ಪಿಸಿಆರ್ಗೆ ಸಾಂಪ್ರದಾಯಿಕ ಪಿಸಿಆರ್ಗೆ ವಿರುದ್ಧವಾಗಿ ದೀರ್ಘಕಾಲದವರೆಗೆ ಶಾಖದ ಸೇರ್ಪಡೆಯ ಅಗತ್ಯವಿರುತ್ತದೆ, ಆದ್ದರಿಂದ, ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಡಿಎನ್ಎ ಹಾನಿಗೊಳಗಾಗುವ ಸಾಧ್ಯತೆ ಹೆಚ್ಚು. ಹೆಚ್ಚಿದ ತಾಪನ ಸಮಯವು ಒನ್ ಟ್ಯೂಬ್, ಸಿಂಗಲ್ ಬಫರ್ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಷನ್-ಪಿಸಿಆರ್ ವಿಧಾನದಂತಹ ಕೆಲವು ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳಿಗೆ ಹೊಂದಿಕೆಯಾಗುವುದಿಲ್ಲ ಎಂದರ್ಥ, ಇದಕ್ಕೆ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ಹಂತಕ್ಕೆ ಒಳಗಾಗಲು ಕಡಿಮೆ ತಾಪಮಾನದ ಅಗತ್ಯವಿರುತ್ತದೆ. ರಾಸಾಯನಿಕವಾಗಿ ಮಾರ್ಪಡಿಸಿದ ಹಾಟ್ ಸ್ಟಾರ್ಟ್ ಪಿಸಿಆರ್ನಲ್ಲಿ, ಡಿಎನ್ಎಯ ವರ್ಧನೆಯ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯು ಋಣಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರಬಹುದು, ಮೊದಲನೆಯದಾಗಿ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಅನ್ನು ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಲು ಅಗತ್ಯವಾದ ಪುನಃ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವ ಸಮಯದಲ್ಲಿನ ಗಮನಾರ್ಹ ಹೆಚ್ಚಳದಿಂದಾಗಿ ಮತ್ತು ಎರಡನೆಯದಾಗಿ ಗುರಿ ಡಿಎನ್ಎ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ನ ಉದ್ದವು ತುಂಬಾ ಉದ್ದವಾಗಿದ್ದರೆ. ಪ್ರತಿಕಾಯ ಆಧಾರಿತ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳಲ್ಲಿ, ಪ್ರತಿ ಕಿಣ್ವಕ್ಕೆ ವಿಭಿನ್ನ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳ ಅಗತ್ಯವಿರುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಆದ್ದರಿಂದ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನವನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸುವ ವೆಚ್ಚವು ಹೆಚ್ಚಾಗಿರುತ್ತದೆ. ಅನೇಕ ವಾಣಿಜ್ಯ ಬಿಸಿ ಆರಂಭದ ಕಿಣ್ವಗಳು ವಾಸ್ತವವಾಗಿ ವಿಕೃತೀಕರಣಕ್ಕೆ ಮುಂಚಿತವಾಗಿ ಕೆಲವು ಮಟ್ಟದ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ ಎಂಬುದಕ್ಕೆ ಪುರಾವೆಗಳಿವೆ, ಮತ್ತು ಕೆಲವು ಪೂರೈಕೆದಾರರು ಈ ಉಳಿದಿರುವ ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಪರೀಕ್ಷೆಯ ಬಗ್ಗೆ ಯಾವುದೇ ಮಾಹಿತಿಯನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತಾರೆ. ಇದರರ್ಥ ಬಿಸಿ ಆರಂಭದ ಕಿಣ್ವಗಳಿಗೆ ಕಾರಣವಾದ ಪ್ರಯೋಜನಗಳನ್ನು ಅರಿತುಕೊಳ್ಳಲಾಗುವುದಿಲ್ಲ, ಅಥವಾ ಅತ್ಯುತ್ತಮವಾಗಿ ಬ್ಯಾಚ್ಗಳು ಅಥವಾ ತಯಾರಕರ ನಡುವೆ ಬದಲಾಗುತ್ತದೆ. ಉಲ್ಲೇಖಗಳು ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಸರಪಳಿ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ