Polony sequencing
ಪೋಲನಿ ಸೀಕ್ವೆನ್ಸಿಂಗ್ ಒಂದು ಅಗ್ಗದ ಆದರೆ ಅತ್ಯಂತ ನಿಖರವಾದ ಮಲ್ಟಿಪ್ಲೆಕ್ಸ್ ಸೀಕ್ವೆನ್ಸಿಂಗ್ ತಂತ್ರವಾಗಿದ್ದು, ಇದನ್ನು ಲಕ್ಷಾಂತರ ಸ್ಥಿರವಾದ ಡಿಎನ್ಎ ಅನುಕ್ರಮಗಳನ್ನು ಸಮಾನಾಂತರವಾಗಿ "ಓದಲು" ಬಳಸಬಹುದು. ಈ ತಂತ್ರವನ್ನು ಮೊದಲು ಹಾರ್ವರ್ಡ್ ವೈದ್ಯಕೀಯ ಶಾಲೆಯ ಡಾ. ಜಾರ್ಜ್ ಚರ್ಚ್ನ ತಂಡವು ಅಭಿವೃದ್ಧಿಪಡಿಸಿತು. ಇತರ ಅನುಕ್ರಮ ತಂತ್ರಗಳಿಗಿಂತ ಭಿನ್ನವಾಗಿ, ಪೊಲೋನಿ ಅನುಕ್ರಮ ತಂತ್ರಜ್ಞಾನವು ಮುಕ್ತವಾಗಿ ಡೌನ್ಲೋಡ್ ಮಾಡಬಹುದಾದ, ಮುಕ್ತ ಮೂಲ ಸಾಫ್ಟ್ವೇರ್ ಮತ್ತು ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್ಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಮುಕ್ತ ವೇದಿಕೆಯಾಗಿದೆ. ಅಲ್ಲದೆ, ಈ ತಂತ್ರದ ಯಂತ್ರಾಂಶವನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಲಭ್ಯವಿರುವ ಎಪಿಫ್ಲೋರೋಸೆನ್ಸ್ ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪಿ ಮತ್ತು ಕಂಪ್ಯೂಟರ್-ನಿಯಂತ್ರಿತ ಫ್ಲೋಸೆಲ್/ಫ್ಲೂಯಿಡಿಕ್ಸ್ ಸಿಸ್ಟಮ್ನೊಂದಿಗೆ ಸುಲಭವಾಗಿ ಹೊಂದಿಸಬಹುದು. ಪೋಲೊನಿ ಸೀಕ್ವೆನ್ಸಿಂಗ್ ಅನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಜೋಡಿ-ಅಂತ್ಯದ ಟ್ಯಾಗ್ಗಳ ಲೈಬ್ರರಿಯಲ್ಲಿ ನಡೆಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಡಿಎನ್ಎ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ನ ಪ್ರತಿ ಅಣುವು 135 ಬಿಪಿ ಉದ್ದವಿರುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಎರಡು 17-18 ಬಿಪಿ ಜೋಡಿ ಜೀನೋಮಿಕ್ ಟ್ಯಾಗ್ಗಳನ್ನು ಬೇರ್ಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಸಾಮಾನ್ಯ ಅನುಕ್ರಮಗಳಿಂದ ಸುತ್ತುವರೆದಿರುತ್ತದೆ. ಈ ತಂತ್ರದ ಪ್ರಸ್ತುತ ಓದುವ ಉದ್ದವು ಪ್ರತಿ ಆಂಪ್ಲಿಕಾನ್ಗೆ 26 ಬೇಸ್ಗಳು ಮತ್ತು ಪ್ರತಿ ಟ್ಯಾಗ್ಗೆ 13 ಬೇಸ್ಗಳಾಗಿದ್ದು, ಪ್ರತಿ ಟ್ಯಾಗ್ನಲ್ಲಿ 4-5 ಬೇಸ್ಗಳ ಅಂತರವನ್ನು ಬಿಡುತ್ತದೆ. ವರ್ಕ್ಫ್ಲೋ ಪೊಲೊನಿ ಸೀಕ್ವೆನ್ಸಿಂಗ್ನ ಶಿಷ್ಟಾಚಾರವನ್ನು ಮೂರು ಮುಖ್ಯ ಭಾಗಗಳಾಗಿ ವಿಂಗಡಿಸಬಹುದು, ಅವುಗಳೆಂದರೆ ಜೋಡಿಯಾದ ಎಂಡ್-ಟ್ಯಾಗ್ ಲೈಬ್ರರಿ ನಿರ್ಮಾಣ, ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ವರ್ಧನೆ ಮತ್ತು ಡಿಎನ್ಎ ಸೀಕ್ವೆನ್ಸಿಂಗ್. ಜೋಡಿ ಎಂಡ್-ಟ್ಯಾಗ್ ಲೈಬ್ರರಿ ನಿರ್ಮಾಣ ಈ ಶಿಷ್ಟಾಚಾರವು ಪರೀಕ್ಷಿಸಿದ ಜೀನೋಮಿಕ್ ಡಿಎನ್ಎಯನ್ನು ಬಿಗಿಯಾದ ಗಾತ್ರದ ವಿತರಣೆಯಾಗಿ ಯಾದೃಚ್ಛಿಕವಾಗಿ ಕತ್ತರಿಸುವ ಮೂಲಕ ಪ್ರಾರಂಭವಾಗುತ್ತದೆ. ಕತ್ತರಿಸಿದ ಡಿಎನ್ಎ ಅಣುಗಳನ್ನು ನಂತರ ಅಂತಿಮ ದುರಸ್ತಿ ಮತ್ತು ಎ-ಬಾಲದ ಚಿಕಿತ್ಸೆಗಾಗಿ ಒಳಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಅಂತಿಮ ದುರಸ್ತಿ ಚಿಕಿತ್ಸೆಯು ಡಿಎನ್ಎಯ ಯಾವುದೇ ಹಾನಿಗೊಳಗಾದ ಅಥವಾ ಹೊಂದಾಣಿಕೆಯಾಗದ ಚಾಚಿಕೊಂಡಿರುವ ತುದಿಗಳನ್ನು 5 '-ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಟೆಡ್ ಮತ್ತು ಬ್ಲಂಟ್-ಎಂಡ್ ಡಿಎನ್ಎ ಆಗಿ ಪರಿವರ್ತಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು ತಕ್ಷಣದ ಬ್ಲಂಟ್-ಎಂಡ್ ಬಂಧನವನ್ನು ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ, ಆದರೆ ಎ-ಟೈಲಿಂಗ್ ಚಿಕಿತ್ಸೆಯು ಕತ್ತರಿಸಿದ ಡಿಎನ್ಎಯ 3' ತುದಿಯಲ್ಲಿ ಎ ಅನ್ನು ಸೇರಿಸುತ್ತದೆ. 1 ಕೆಬಿ ಉದ್ದದ ಡಿಎನ್ಎ ಅಣುಗಳನ್ನು 6 ಪ್ರತಿಶತ ಟಿಬಿಇ ಪೇಜ್ ಜೆಲ್ನಲ್ಲಿ ಲೋಡ್ ಮಾಡುವ ಮೂಲಕ ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ. ಮುಂದಿನ ಹಂತದಲ್ಲಿ, ಡಿಎನ್ಎ ಅಣುಗಳನ್ನು ಟಿ-ಬಾಲದ 30 ಬಿಪಿ ಉದ್ದದ ಸಂಶ್ಲೇಷಿತ ಆಲಿಗೋನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೋಟೈಡ್ಗಳೊಂದಿಗೆ (ಟಿ30) ವೃತ್ತಾಕಾರಗೊಳಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಇದು ಎರಡು ಬಾಹ್ಯ-ಮುಖದ ಎಂಎಂಇಐ ಗುರುತಿಸುವ ತಾಣಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ ವೃತ್ತಾಕಾರದ ಡಿಎನ್ಎ ಸುತ್ತುತ್ತಿರುವ ವೃತ್ತಾಕಾರದ ಪ್ರತಿಕೃತಿಗೆ ಒಳಗಾಗುತ್ತದೆ. ಆಂಪ್ಲಿಫೈಡ್ ಸರ್ಕ್ಯುಲರೈಸ್ಡ್ ಡಿಎನ್ಎ ಅಣುಗಳನ್ನು ನಂತರ ಎಂಎಂಇಐ (ಟೈಪ್ II ರ ನಿರ್ಬಂಧ ಎಂಡೋನ್ಯೂಕ್ಲೀಸ್) ನೊಂದಿಗೆ ಜೀರ್ಣಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಇದು ಅದರ ಗುರುತಿಸುವ ಸ್ಥಳದಿಂದ ಸ್ವಲ್ಪ ದೂರದಲ್ಲಿ ಕತ್ತರಿಸಿ, 17-18 ಬಿಪಿ ಟ್ಯಾಗ್ಗಳಿಂದ (≈ 70 ಬಿಪಿ ಉದ್ದ) ಸುತ್ತುವರಿದ ಟಿ30 ತುಣುಕನ್ನು ಬಿಡುಗಡೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ. ಜೋಡಿಯಾದ-ಟ್ಯಾಗ್ ಅಣುಗಳನ್ನು ಅವುಗಳ ಎರಡೂ ತುದಿಗಳಿಗೆ ಇಪಿಸಿಆರ್ (ಎಮಲ್ಷನ್ ಪಿಸಿಆರ್) ಪ್ರೈಮರ್ ಒಲಿಗೋನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೋಟೈಡ್ಗಳನ್ನು (ಎಫ್ಡಿವಿ2 ಮತ್ತು ಆರ್ಡಿವಿ2) ಬಂಧಿಸುವ ಮೊದಲು ಅಂತಿಮವಾಗಿ ದುರಸ್ತಿ ಮಾಡಬೇಕಾಗುತ್ತದೆ. ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ 135 ಬಿಪಿ ಲೈಬ್ರರಿ ಅಣುಗಳನ್ನು ಗಾತ್ರ-ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ನಿಕ್ ಅನುವಾದಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಕೊನೆಯದಾಗಿ, ಲೈಬ್ರರಿ ವಸ್ತುಗಳ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಲು ಮತ್ತು ಬಾಹ್ಯ ಬಂಧನ ಉತ್ಪನ್ನಗಳನ್ನು ಒಂದೇ ಹಂತದಲ್ಲಿ ತೊಡೆದುಹಾಕಲು ಪಿಸಿಆರ್ನೊಂದಿಗೆ 135 ಬಿಪಿ ಜೋಡಿಯಾದ ಎಂಡ್-ಟ್ಯಾಗ್ ಲೈಬ್ರರಿ ಅಣುಗಳನ್ನು ವರ್ಧಿಸಿ. ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ ಡಿಎನ್ಎ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ 44 ಬಿಪಿ ಎಫ್ಡಿವಿ ಅನುಕ್ರಮ, ಒಂದು 17-18 ಬಿಪಿ ಪ್ರಾಕ್ಸಿಮಲ್ ಟ್ಯಾಗ್, ಟಿ30 ಅನುಕ್ರಮ, ಒಂದು 17-18 ಬಿಪಿ ಡಿಸ್ಟಲ್ ಟ್ಯಾಗ್ ಮತ್ತು 25 ಬಿಪಿ ಆರ್ಡಿವಿ ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿದೆ. ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ವರ್ಧನೆ ಎಮಲ್ಷನ್ ಪಿಸಿಆರ್ ಮೋನೋ-ಗಾತ್ರದ, ಪ್ಯಾರಾಮ್ಯಾಗ್ನೆಟಿಕ್ ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟಾವಿಡಿನ್-ಲೇಪಿತ ಮಣಿಗಳನ್ನು ಡ್ಯುಯಲ್ ಬಯೋಟಿನ್ ಫಾರ್ವರ್ಡ್ ಪ್ರೈಮರ್ನೊಂದಿಗೆ ಮೊದಲೇ ಲೋಡ್ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ. ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟಾವಿಡಿನ್ ಬಯೋಟಿನ್ಗೆ ಬಹಳ ಬಲವಾದ ಸಂಬಂಧವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ, ಹೀಗಾಗಿ ಮುಂಭಾಗದ ಪ್ರೈಮರ್ ಮಣಿಗಳ ಮೇಲ್ಮೈಯಲ್ಲಿ ದೃಢವಾಗಿ ಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ. ಮುಂದೆ, ಮೊದಲೇ ಲೋಡ್ ಮಾಡಲಾದ ಮಣಿಗಳು, ಪಿಸಿಆರ್ ಮಿಶ್ರಣ, ಫಾರ್ವರ್ಡ್ ಮತ್ತು ರಿವರ್ಸ್ ಪ್ರೈಮರ್ಗಳು ಮತ್ತು ಜೋಡಿಯಾದ ಎಂಡ್-ಟ್ಯಾಗ್ ಲೈಬ್ರರಿಯೊಂದಿಗೆ ಜಲೀಯ ಹಂತವನ್ನು ತಯಾರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಎಮಲ್ಷನ್ ಅನ್ನು ರಚಿಸಲು ಇದನ್ನು ಬೆರೆಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ತೈಲ ಹಂತದೊಂದಿಗೆ ಸುಳಿದಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ. ಆದರ್ಶಪ್ರಾಯವಾಗಿ, ತೈಲ ಎಮಲ್ಷನ್ನಲ್ಲಿನ ನೀರಿನ ಪ್ರತಿ ಹನಿ ಒಂದು ಮಣಿ ಮತ್ತು ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಡಿಎನ್ಎಯ ಒಂದು ಅಣುವನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತದೆ, ಇದು ಪಿಸಿಆರ್ ಅನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸುವ ಮೂಲಕ ಮಿಲಿಲೀಟರ್-ಪ್ರಮಾಣದ ಪರಿಮಾಣದೊಳಗೆ ಲಕ್ಷಾಂತರ ಪರಸ್ಪರ ಸಂವಹನ ಮಾಡದ ವರ್ಧನೆಗೆ ಅವಕಾಶ ನೀಡುತ್ತದೆ. ಎಮಲ್ಷನ್ ಬ್ರೇಕಿಂಗ್ ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಷನ್ ನಂತರ, ಹಿಂದಿನ ಹಂತದಿಂದ ಎಮಲ್ಷನ್ ಅನ್ನು ಐಸೊಪ್ರೊಪನಾಲ್ ಮತ್ತು ಡಿಟರ್ಜೆಂಟ್ ಬಫರ್ (10 ಎಂಎಂ ಟ್ರಿಸ್ ಪಿಹೆಚ್ 7.5,1 ಎಂಎಂ ಇಡಿಟಿಎ ಪಿಹೆಚ್ 8.0,100 ಎಂಎಂ ಎನ್ಎಸಿಎಲ್, 1 ಪ್ರತಿಶತ (ವಿ/ವಿ) ಟ್ರೈಟಾನ್ ಎಕ್ಸ್-100,1 ಪ್ರತಿಶತ (ಡಬ್ಲ್ಯೂ/ವಿ) ಎಸ್. ಡಿ. ಎಸ್) ಬಳಸಿ ಒಡೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ, ನಂತರ ಸುಳಿಯುವಿಕೆ, ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಮತ್ತು ಕಾಂತೀಯ ಪ್ರತ್ಯೇಕತೆಯ ಸರಣಿಗಳನ್ನು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ ಉಂಟಾಗುವ ಪರಿಹಾರವೆಂದರೆ ಖಾಲಿ, ಕ್ಲೋನಲ್ ಮತ್ತು ಕ್ಲೋನಲ್ ಅಲ್ಲದ ಮಣಿಗಳ ಅಮಾನತು, ಇದು ಆರಂಭದಲ್ಲಿ ಅನುಕ್ರಮವಾಗಿ ಶೂನ್ಯ, ಒಂದು ಅಥವಾ ಅನೇಕ ಡಿಎನ್ಎ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಅಣುಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಎಮಲ್ಷನ್ ಹನಿಗಳಿಂದ ಉಂಟಾಗುತ್ತದೆ. ವರ್ಧಿತ ಮಣಿಗಳನ್ನು ಮುಂದಿನ ಹಂತದಲ್ಲಿ ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಬಹುದು. ಮಣಿಗಳ ಪುಷ್ಟೀಕರಣ ದೊಡ್ಡದಾದ, ಕಡಿಮೆ ಸಾಂದ್ರತೆಯ, ಆಯಸ್ಕಾಂತೀಯವಲ್ಲದ ಪಾಲಿಸ್ಟೈರೀನ್ ಮಣಿಗಳಿಗೆ ಸಂಕರೀಕರಣದ ಮೂಲಕ ವರ್ಧಿತ ಮಣಿಗಳ ಪುಷ್ಟೀಕರಣವನ್ನು ಸಾಧಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಇದು ಬಯೋಟಿನಿಲೇಟೆಡ್ ಕ್ಯಾಪ್ಚರ್ ಒಲಿಗೋನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೋಟೈಡ್ಗಳೊಂದಿಗೆ (ಇಪಿಸಿಆರ್ ಆಂಪ್ಲಿಕಾನ್ ಅನುಕ್ರಮಕ್ಕೆ ಪೂರಕವಾದ ಡಿಎನ್ಎ ಅನುಕ್ರಮ) ಮೊದಲೇ ಲೋಡ್ ಆಗಿದೆ. ಮಿಶ್ರಣವನ್ನು ನಂತರ ವರ್ಧಿತ ಮಣಿಗಳ ಸಂಕೀರ್ಣವನ್ನು ಬೇರ್ಪಡಿಸಲು ಮತ್ತು ವರ್ಧಿತವಲ್ಲದ ಮಣಿಗಳಿಂದ ಸೆರೆಹಿಡಿಯಲು ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ. ವರ್ಧಿತ, ಸೆರೆಹಿಡಿಯುವ ಮಣಿ ಸಂಕೀರ್ಣವು ಕಡಿಮೆ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಆದ್ದರಿಂದ ಸೂಪರ್ನೇಟಂಟ್ನಲ್ಲಿ ಉಳಿಯುತ್ತದೆ, ಆದರೆ ವರ್ಧಿತವಲ್ಲದ ಮಣಿಗಳು ಗುಳಿಗೆಗಳನ್ನು ರೂಪಿಸುತ್ತವೆ. ಸೂಪರ್ನೇಟಂಟ್ ಅನ್ನು ಮರುಪಡೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಸಂಕೀರ್ಣವನ್ನು ಒಡೆಯುವ NaOH ನೊಂದಿಗೆ ಚಿಕಿತ್ಸೆ ನೀಡಲಾಗುತ್ತದೆ. ಆಯಸ್ಕಾಂತೀಯ ವರ್ಧಿತ ಮಣಿಗಳನ್ನು ಆಯಸ್ಕಾಂತೀಯವಲ್ಲದ ಸೆರೆಹಿಡಿಯುವ ಮಣಿಗಳಿಂದ ಆಯಸ್ಕಾಂತೀಯ ಬೇರ್ಪಡಿಸುವಿಕೆಯಿಂದ ಬೇರ್ಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಈ ಪುಷ್ಟೀಕರಣ ಶಿಷ್ಟಾಚಾರವು ಐದು ಪಟ್ಟು ವರ್ಧಿತ ಮಣಿಗಳನ್ನು ಸಮೃದ್ಧಗೊಳಿಸುವ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ. ಬೀಡ್ ಕ್ಯಾಪಿಂಗ್ನ ಉದ್ದೇಶವೆಂದರೆ ವಿಸ್ತರಿಸದ ಫಾರ್ವರ್ಡ್ ಇಪಿಸಿಆರ್ ಪ್ರೈಮರ್ಗಳು ಮತ್ತು ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಡಿಎನ್ಎಯ ಆರ್ಡಿವಿ ವಿಭಾಗದ 3 'ತುದಿಯಲ್ಲಿ "ಕ್ಯಾಪಿಂಗ್" ಆಲಿಗೋನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೋಟೈಡ್ ಅನ್ನು ಲಗತ್ತಿಸುವುದು. ಬಳಸಲಾಗುವ ಕ್ಯಾಪ್ ಒಂದು ಅಮೈನೊ ಗುಂಪಾಗಿದ್ದು, ಇದು ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಶೋಧಕಗಳನ್ನು ಈ ತುದಿಗಳಿಗೆ ಲಗತ್ತಿಸುವುದನ್ನು ತಡೆಯುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಅದೇ ಸಮಯದಲ್ಲಿ, ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಡಿಎನ್ಎಯನ್ನು ಅಮಿನೊಸಿಲನೇಟೆಡ್ ಫ್ಲೋ ಸೆಲ್ ಕವರ್ಸ್ಲಿಪ್ಗೆ ತರುವಾಯ ಜೋಡಿಸಲು ಸಹಾಯ ಮಾಡುತ್ತದೆ. ಕವರ್ ಸ್ಲಿಪ್ ರಚನೆಯು ಮೊದಲನೆಯದಾಗಿ, ಕವರ್ ಸ್ಲಿಪ್ಗಳನ್ನು ತೊಳೆದು ಅಮಿನೊಸಿಲೇನ್-ಟ್ರೀಟ್ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ, ಇದು ಅದರ ಮೇಲೆ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಡಿಎನ್ಎಯ ನಂತರದ ಕೋವೆಲೆಂಟ್ ಜೋಡಣೆಯನ್ನು ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಯಾವುದೇ ಫ್ಲೋರೊಸೆಂಟ್ ಮಾಲಿನ್ಯವನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕುತ್ತದೆ. ವರ್ಧಿತ, ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಿದ ಮಣಿಗಳನ್ನು ಅಕ್ರಿಲಾಮೈಡ್ನೊಂದಿಗೆ ಬೆರೆಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಟೆಫ್ಲಾನ್-ಮುಖವಾಡದ ಸೂಕ್ಷ್ಮದರ್ಶಕ ಸ್ಲೈಡ್ನಿಂದ ರೂಪುಗೊಂಡ ಆಳವಿಲ್ಲದ ಅಚ್ಚಿನಲ್ಲಿ ಸುರಿಯಲಾಗುತ್ತದೆ. ತಕ್ಷಣವೇ, ಅಮೈನೋಸಿಲೇನ್-ಸಂಸ್ಕರಿಸಿದ ಕವರ್ ಸ್ಲಿಪ್ ಅನ್ನು ಅಕ್ರಿಲಾಮೈಡ್ ಜೆಲ್ನ ಮೇಲೆ ಇರಿಸಿ ಮತ್ತು 45 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಪಾಲಿಮರೈಸ್ ಮಾಡಲು ಬಿಡಿ. ಮುಂದೆ, ಸ್ಲೈಡ್/ಕವರ್ ಸ್ಲಿಪ್ ಸ್ಟ್ಯಾಕ್ ಅನ್ನು ತಿರುಗಿಸಿ ಮತ್ತು ಸೂಕ್ಷ್ಮದರ್ಶಕದ ಸ್ಲೈಡ್ ಅನ್ನು ಜೆಲ್ನಿಂದ ತೆಗೆದುಹಾಕಿ. ಸೈಲೇನ್-ಸಂಸ್ಕರಿಸಿದ ಕವರ್ ಸ್ಲಿಪ್ಗಳು ಜೆಲ್ಗೆ ಕೋವೆಲೆಂಟ್ ಆಗಿ ಬಂಧಿಸುತ್ತವೆ, ಆದರೆ ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪ್ ಸ್ಲೈಡ್ನ ಮೇಲ್ಮೈಯಲ್ಲಿರುವ ಟೆಫ್ಲಾನ್ ಅಕ್ರಿಲಾಮೈಡ್ ಜೆಲ್ನಿಂದ ಸ್ಲೈಡ್ ಅನ್ನು ಉತ್ತಮವಾಗಿ ತೆಗೆದುಹಾಕಲು ಅನುವು ಮಾಡಿಕೊಡುತ್ತದೆ. ಕವರ್ ಸ್ಲಿಪ್ಗಳನ್ನು ನಂತರ ಫ್ಲೋ ಸೆಲ್ ದೇಹಕ್ಕೆ ಬಂಧಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಯಾವುದೇ ಲಗತ್ತಿಸದ ಮಣಿಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾಗುತ್ತದೆ. ಪೋಲನಿ ಅನುಕ್ರಮದ ಜೀವರಸಾಯನಶಾಸ್ತ್ರವು ಮುಖ್ಯವಾಗಿ ಲಿಗೇಸ್ಗಳು ಮತ್ತು ಪಾಲಿಮರೇಸ್ಗಳ ತಾರತಮ್ಯದ ಸಾಮರ್ಥ್ಯಗಳನ್ನು ಅವಲಂಬಿಸಿದೆ. ಮೊದಲನೆಯದಾಗಿ, ಆಂಕರ್ ಪ್ರೈಮರ್ಗಳ ಸರಣಿಯು ಜೀವಕೋಶಗಳ ಮೂಲಕ ಹರಿಯುತ್ತದೆ ಮತ್ತು 17-18 ಬಿಪಿ ಪ್ರಾಕ್ಸಿಮಲ್ ಅಥವಾ ಡಿಸ್ಟಲ್ ಜೀನೋಮಿಕ್ ಡಿಎನ್ಎ ಟ್ಯಾಗ್ಗಳ ತಕ್ಷಣದ 3 'ಅಥವಾ 5' ತುದಿಯಲ್ಲಿ ಸಂಶ್ಲೇಷಿತ ಒಲಿಗೋನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೋಟೈಡ್ ಅನುಕ್ರಮಗಳಿಗೆ ಹೈಬ್ರಿಡೈಸ್ ಆಗುತ್ತದೆ. ಮುಂದೆ, ಪ್ರತಿದೀಪಕ ವರ್ಣಗಳಿಂದ ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ ಕ್ಷೀಣಗೊಳ್ಳುವ ನಾನಾಮರ್ಗಳ ಜನಸಂಖ್ಯೆಗೆ ಆಂಕರ್ ಪ್ರೈಮರ್ನ ಕಿಣ್ವಕ ಬಂಧನ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ನಡೆಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ವಿಭಿನ್ನವಾಗಿ ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ ನಾನಾಮರ್ಗಳುಃ 5 'Cy5-NNNNNNT 5' Cy3-NNNNNNNA 5 'ಟೆಕ್ಸಾಸ್ ರೆಡ್-NNNNNNC 5' 6FAM-NNNNNNG ಫ್ಲೋರೋಫೋರ್-ಟ್ಯಾಗ್ ಮಾಡಲಾದ ನಾನಾಮರ್ಗಳು ಕ್ಷೀಣಿಸಿದ ಪ್ರೈಮರ್ಗಳಂತೆಯೇ ಕಾರ್ಯತಂತ್ರದ ಪ್ರಕಾರ ಟ್ಯಾಗ್ ಅನುಕ್ರಮಗಳಿಗೆ ವಿಭಿನ್ನ ಯಶಸ್ಸನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ, ಆದರೆ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ಗಳಿಗೆ ಸಲ್ಲಿಸುವ ಬದಲು, ನಾನಾಮರ್ಗಳನ್ನು ಆಯ್ದ ಡಿಎನ್ಎ-ಆಂಕರ್ ಪ್ರೈಮರ್ಗೆ ಜೋಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಫ್ಲೋರೋಫೋರ್ ಅಣುವಿನ ಸ್ಥಿರೀಕರಣವು ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಸಂಕೇತವನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು ಜೀನೋಮಿಕ್ ಡಿಎನ್ಎ ಟ್ಯಾಗ್ನಲ್ಲಿ ಪ್ರಶ್ನೆಯ ಸ್ಥಾನದಲ್ಲಿ ಎ, ಸಿ, ಜಿ, ಅಥವಾ ಟಿ ಇದೆಯೇ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ನಾಲ್ಕು-ಬಣ್ಣದ ಚಿತ್ರಣದ ನಂತರ, ಆಂಕರ್ ಪ್ರೈಮರ್/ನಾನಾಮರ್ ಸಂಕೀರ್ಣಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಆಂಕರ್ ಪ್ರೈಮರ್ ಅನ್ನು ಬದಲಿಸುವ ಮೂಲಕ ಹೊಸ ಚಕ್ರವನ್ನು ಪ್ರಾರಂಭಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಪ್ರತಿದೀಪಕವಾಗಿ ಟ್ಯಾಗ್ ಮಾಡಲಾದ ನಾನಾಮರ್ಗಳ ಹೊಸ ಮಿಶ್ರಣವನ್ನು ಪರಿಚಯಿಸಲಾಗಿದೆ, ಇದಕ್ಕಾಗಿ ಪ್ರಶ್ನೆಯ ಸ್ಥಾನವನ್ನು ಜೀನೋಮಿಕ್ ಡಿಎನ್ಎ ಟ್ಯಾಗ್ಗೆ ಒಂದು ಬೇಸ್ ಅನ್ನು ಮತ್ತಷ್ಟು ಬದಲಾಯಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. 5 'ಸೈ5-ಎನ್. ಎನ್. ಎನ್. ಎನ್. ಎನ್. ಟಿ. ಎನ್. 5' ಸೈ3-ಎನ್. ಎನ್. ಎನ್. ಎನ್. ಎನ್. ಎನ್. ಎನ್. ಎನ್. 5 'ಟೆಕ್ಸಾಸ್ ರೆಡ್-ಎನ್. ಎನ್. ಎನ್. ಎನ್. ಎನ್. ಎನ್. ಎನ್. 5' 6ಎಫ್. ಎ. ಎಂ.-ಎನ್. ಎನ್. ಎನ್. ಎನ್. ಎನ್. ಎನ್. ಎನ್. ಎನ್. 5 'ದಿಕ್ಕಿನಿಂದ 3' ದಿಕ್ಕಿಗೆ ಏಳು ಬೇಸ್ಗಳು ಮತ್ತು 3 'ತುದಿಯಿಂದ ಆರು ಬೇಸ್ಗಳನ್ನು ಈ ರೀತಿಯಲ್ಲಿ ಪ್ರಶ್ನಿಸಬಹುದು. ಅಂತಿಮ ಫಲಿತಾಂಶವೆಂದರೆ ಪ್ರತಿ ಓಟಕ್ಕೆ 26 ಬೇಸ್ಗಳ ರೀಡ್ ಉದ್ದ (ಪ್ರತಿ ಜೋಡಿಯಾದ ಟ್ಯಾಗ್ಗಳಿಂದ 13 ಬೇಸ್ಗಳು) ಮತ್ತು ಪ್ರತಿ ಟ್ಯಾಗ್ನ ಮಧ್ಯದಲ್ಲಿ 4-ಬೇಸ್ನಿಂದ 5-ಬೇಸ್ ಅಂತರವಿರುತ್ತದೆ. ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ ಮತ್ತು ತಂತ್ರಾಂಶ ಪೊಲೊನಿ ಅನುಕ್ರಮವು ಪ್ರತಿ ಓಟಕ್ಕೆ ಲಕ್ಷಾಂತರ 26 ರೀಡ್ಗಳನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಈ ಮಾಹಿತಿಯನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯೀಕರಿಸುವ ಮತ್ತು ಅನುಕ್ರಮವಾಗಿ ಪರಿವರ್ತಿಸುವ ಅಗತ್ಯವಿದೆ. ಚರ್ಚ್ ಲ್ಯಾಬ್ ಅಭಿವೃದ್ಧಿಪಡಿಸಿದ ಸಾಫ್ಟ್ವೇರ್ ಮೂಲಕ ಇವುಗಳನ್ನು ಮಾಡಬಹುದು. ಎಲ್ಲಾ ಸಾಫ್ಟ್ವೇರ್ಗಳು ಉಚಿತವಾಗಿದ್ದು, ಜಾಲತಾಣದಿಂದ ಡೌನ್ಲೋಡ್ ಮಾಡಿಕೊಳ್ಳಬಹುದು. ಉಪಕರಣಗಳು ಈ ತಂತ್ರದಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾಗುವ ಅನುಕ್ರಮ ಸಾಧನವನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಲಭ್ಯವಿರುವ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಸೂಕ್ಷ್ಮದರ್ಶಕ ಮತ್ತು ಕಂಪ್ಯೂಟರ್ ನಿಯಂತ್ರಿತ ಫ್ಲೋಸೆಲ್ನಿಂದ ಸ್ಥಾಪಿಸಬಹುದು. 2005ರಲ್ಲಿ ಅಗತ್ಯವಾದ ಉಪಕರಣಗಳ ಬೆಲೆ ಸುಮಾರು ಯು. ಎಸ್. $130,000 ಆಗಿತ್ತು. ಪೊಲೊನೇಟರ್ ಎಂಬ ಮೀಸಲಾದ ಪೊಲೊನಿ ಸೀಕ್ವೆನ್ಸಿಂಗ್ ಯಂತ್ರವನ್ನು 2009ರಲ್ಲಿ ಅಭಿವೃದ್ಧಿಪಡಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಡೋವರ್ನಿಂದ US $170,000ಕ್ಕೆ ಮಾರಾಟವಾಯಿತು. ಇದು ತೆರೆದ ಮೂಲ ತಂತ್ರಾಂಶ, ಕಾರಕಗಳು ಮತ್ತು ಶಿಷ್ಟಾಚಾರಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿತ್ತು ಮತ್ತು ವೈಯಕ್ತಿಕ ಜೀನೋಮ್ ಯೋಜನೆಯಲ್ಲಿ ಬಳಸಲು ಉದ್ದೇಶಿಸಲಾಗಿತ್ತು. ಪೊಲೋನಿ ಸೀಕ್ವೆನ್ಸಿಂಗ್ ಸಾಮರ್ಥ್ಯ ಮತ್ತು ದೌರ್ಬಲ್ಯಗಳು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಲಭ್ಯವಿರುವ, ಅಗ್ಗದ ಸಾಧನದ ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ ಡಿಎನ್ಎ ಸೀಕ್ವೆನ್ಸಿಂಗ್ನ ಹೆಚ್ಚಿನ ಥ್ರೋಪುಟ್ ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚಿನ ಒಮ್ಮತದ ನಿಖರತೆಯನ್ನು ಅನುಮತಿಸುತ್ತದೆ. ಅಲ್ಲದೆ, ಇದು ಬಿ. ಎ. ಸಿ. (ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದ ಕೃತಕ ವರ್ಣತಂತು) ಮತ್ತು ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದ ಜೀನೋಮ್ ಅನುಕ್ರಮ, ಜೊತೆಗೆ ಎಸ್. ಎ. ಜಿ. ಇ. (ಜೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯ ಸರಣಿ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ) ಟ್ಯಾಗ್ ಮತ್ತು ಬಾರ್ಕೋಡ್ ಅನುಕ್ರಮ ಸೇರಿದಂತೆ ವೇರಿಯೇಬಲ್ ಅಪ್ಲಿಕೇಶನ್ ಅನ್ನು ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವ ಅತ್ಯಂತ ಹೊಂದಿಕೊಳ್ಳುವ ತಂತ್ರವಾಗಿದೆ. ಇದಲ್ಲದೆ, ಅಭಿವೃದ್ಧಿಪಡಿಸಲಾದ ಸಾಫ್ಟ್ವೇರ್, ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್ ಮತ್ತು ಕಾರಕಗಳು ಸೇರಿದಂತೆ ಎಲ್ಲವನ್ನೂ ಹಂಚಿಕೊಳ್ಳುವ ಮುಕ್ತ ವ್ಯವಸ್ಥೆಯಾಗಿ ಪೊಲೊನಿ ಸೀಕ್ವೆನ್ಸಿಂಗ್ ತಂತ್ರವನ್ನು ಒತ್ತಿಹೇಳಲಾಗಿದೆ. ಆದಾಗ್ಯೂ, ಕಚ್ಚಾ ದತ್ತಾಂಶ ಸ್ವಾಧೀನವನ್ನು 786 ಗಿಗಾಬಿಟ್ಗಳವರೆಗೆ ಸಾಧಿಸಬಹುದಾದರೂ, ಸಂಗ್ರಹಿಸಿದ 10,000 ಬಿಟ್ಗಳಲ್ಲಿ ಕೇವಲ 1 ಬಿಟ್ ಮಾಹಿತಿಯು ಮಾತ್ರ ಉಪಯುಕ್ತವಾಗಿದೆ. ಈ ತಂತ್ರದ ಮತ್ತೊಂದು ಸವಾಲೆಂದರೆ ವೈಯಕ್ತಿಕ ಗುರಿಗಳ ಸಾಪೇಕ್ಷ ವರ್ಧನೆಯ ಏಕರೂಪತೆ. ಏಕರೂಪವಲ್ಲದ ವರ್ಧನೆಯು ಅನುಕ್ರಮದ ದಕ್ಷತೆಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಈ ತಂತ್ರದಲ್ಲಿ ಅತಿದೊಡ್ಡ ಅಡಚಣೆಯಾಗಿದೆ. ಪೋಲನಿ ಅನುಕ್ರಮವು 1990ರ ದಶಕದ ಕೊನೆಯಲ್ಲಿ ಮತ್ತು 2000ರ ದಶಕದಿಂದ ಪೋಲನಿ ತಂತ್ರಜ್ಞಾನದ ಅಭಿವೃದ್ಧಿಯಾಗಿದೆ. ಏಕ-ಬೇಸ್ ವಿಸ್ತರಣೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಸಿಟು ಪೊಲೊನಿಗಳಲ್ಲಿ ಅನುಕ್ರಮಗೊಳಿಸಲು 2003ರಲ್ಲಿ ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಅಭಿವೃದ್ಧಿಪಡಿಸಲಾಯಿತು, ಇದು 5-6 ಬೇಸ್ ರೀಡ್ಗಳನ್ನು ಸಾಧಿಸಬಹುದು. 2005 ರ ಹೊತ್ತಿಗೆ, ಅಸ್ತಿತ್ವದಲ್ಲಿರುವ ಪೊಲೊನಿ ಸೀಕ್ವೆನ್ಸಿಂಗ್ ತಂತ್ರಜ್ಞಾನವನ್ನು ಅಭಿವೃದ್ಧಿಪಡಿಸಲು ಈ ಆರಂಭಿಕ ಪ್ರಯತ್ನಗಳನ್ನು ಕೂಲಂಕಷವಾಗಿ ಪರಿಶೀಲಿಸಲಾಯಿತು. ಪೊಲೊನಿ ಸೀಕ್ವೆನ್ಸಿಂಗ್ನ ಅತ್ಯಂತ ಸಮಾನಾಂತರ ಸೀಕ್ವೆನ್ಸಿಂಗ್-ಬೈ-ಲೈಗೇಷನ್ ಪರಿಕಲ್ಪನೆಗಳು ಎ. ಬಿ. ಐ ಸಾಲಿಡ್ ಸೀಕ್ವೆನ್ಸಿಂಗ್ನಂತಹ ನಂತರದ ಸೀಕ್ವೆನ್ಸಿಂಗ್ ತಂತ್ರಜ್ಞಾನಗಳಿಗೆ ಆಧಾರವನ್ನು ನೀಡಿವೆ. ಉಲ್ಲೇಖಗಳು ಬಾಹ್ಯ ಕೊಂಡಿಗಳು ಡಿಎನ್ಎ ಅನುಕ್ರಮ ವಿಧಾನಗಳು ಜೆನೆಟಿಕ್ಸ್ ತಂತ್ರಗಳು