Illumina dye sequencing
ಇಲ್ಯೂಮಿನಾ ಡೈ ಸೀಕ್ವೆನ್ಸಿಂಗ್ ಎಂಬುದು ಡಿಎನ್ಎಯಲ್ಲಿನ ಬೇಸ್ ಜೋಡಿಗಳ ಸರಣಿಯನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲು ಬಳಸುವ ತಂತ್ರವಾಗಿದೆ, ಇದನ್ನು ಡಿಎನ್ಎ ಸೀಕ್ವೆನ್ಸಿಂಗ್ ಎಂದೂ ಕರೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ. ರಿವರ್ಸಿಬಲ್ ಟರ್ಮಿನೇಟೆಡ್ ಕೆಮಿಸ್ಟ್ರಿ ಪರಿಕಲ್ಪನೆಯನ್ನು ಪ್ಯಾರಿಸ್ನ ಪಾಶ್ಚರ್ ಇನ್ಸ್ಟಿಟ್ಯೂಟ್ನಲ್ಲಿ ಬ್ರೂನೋ ಕ್ಯಾನರ್ಡ್ ಮತ್ತು ಸೈಮನ್ ಸರ್ಫಾತಿ ಕಂಡುಹಿಡಿದರು. ಇದನ್ನು ಕೇಂಬ್ರಿಡ್ಜ್ ವಿಶ್ವವಿದ್ಯಾನಿಲಯದ ಶಂಕರ್ ಬಾಲಸುಬ್ರಮಣಿಯನ್ ಮತ್ತು ಡೇವಿಡ್ ಕ್ಲೆನರ್ಮಾನ್ ಅಭಿವೃದ್ಧಿಪಡಿಸಿದರು, ಅವರು ತರುವಾಯ ಸೊಲೆಕ್ಸಾವನ್ನು ಸ್ಥಾಪಿಸಿದರು, ನಂತರ ಇದನ್ನು ಇಲ್ಲುಮಿನಾ ಸ್ವಾಧೀನಪಡಿಸಿಕೊಂಡಿತು. ಈ ಅನುಕ್ರಮ ವಿಧಾನವು ಹಿಂತಿರುಗಿಸಬಹುದಾದ ಡೈ-ಟರ್ಮಿನೇಟರ್ಗಳನ್ನು ಆಧರಿಸಿದೆ, ಇದು ಏಕ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೋಟೈಡ್ಗಳನ್ನು ಡಿಎನ್ಎ ಎಳೆಗಳ ಮೇಲೆ ತೊಳೆದುಕೊಳ್ಳುವುದರಿಂದ ಅವುಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಲು ಅನುವು ಮಾಡಿಕೊಡುತ್ತದೆ. ಇದನ್ನು ಸಂಪೂರ್ಣ ಜೀನೋಮ್ ಮತ್ತು ಪ್ರದೇಶದ ಅನುಕ್ರಮ, ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟೋಮ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ, ಮೆಟಾಜೆನೊಮಿಕ್ಸ್, ಸಣ್ಣ ಆರ್ಎನ್ಎ ಆವಿಷ್ಕಾರ, ಮೀಥೈಲೇಷನ್ ಪ್ರೊಫೈಲಿಂಗ್ ಮತ್ತು ಜೀನೋಮ್-ವೈಡ್ ಪ್ರೋಟೀನ್-ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಸಿಡ್ ಪರಸ್ಪರ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗೂ ಬಳಸಬಹುದು. ಇದು ಮೂರು ಮೂಲಭೂತ ಹಂತಗಳಲ್ಲಿ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸುತ್ತದೆಃ ವರ್ಧನೆ, ಅನುಕ್ರಮ ಮತ್ತು ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ. ಈ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯು ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಿದ ಡಿ. ಎನ್. ಎ. ಯೊಂದಿಗೆ ಪ್ರಾರಂಭವಾಗುತ್ತದೆ. ಡಿಎನ್ಎ ವಿಭಜಿತವಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ವರ್ಧನೆ, ಅನುಕ್ರಮ ಮತ್ತು ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಉಲ್ಲೇಖ ಬಿಂದುಗಳಾಗಿ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸುವ ಭಾಗಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಅಡಾಪ್ಟರ್ಗಳನ್ನು ಸೇರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಮಾರ್ಪಡಿಸಿದ ಡಿಎನ್ಎಯನ್ನು ಹರಿವಿನ ಕೋಶದ ಮೇಲೆ ಲೋಡ್ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ, ಅಲ್ಲಿ ವರ್ಧನೆ ಮತ್ತು ಅನುಕ್ರಮವು ನಡೆಯುತ್ತದೆ. ಹರಿವಿನ ಕೋಶವು ನ್ಯಾನೊವೆಲ್ಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತದೆ, ಅದು ತುಣುಕುಗಳನ್ನು ಹೊರಹಾಕುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಜನದಟ್ಟಣೆಗೆ ಸಹಾಯ ಮಾಡುತ್ತದೆ. ಪ್ರತಿ ನ್ಯಾನೊವೆಲ್ ಆಲಿಗೋನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೋಟೈಡ್ಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತದೆ, ಇದು ಅಡಾಪ್ಟರ್ಗಳು ಲಗತ್ತಿಸಲು ಲಂಗರು ಹಾಕುವ ಬಿಂದುವನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ. ತುಣುಕುಗಳು ಜೋಡಿಸಲ್ಪಟ್ಟ ನಂತರ, ಕ್ಲಸ್ಟರ್ ಜನರೇಷನ್ ಎಂಬ ಹಂತವು ಪ್ರಾರಂಭವಾಗುತ್ತದೆ. ಈ ಹಂತವು ಡಿಎನ್ಎಯ ಪ್ರತಿಯೊಂದು ತುಣುಕಿನ ಸುಮಾರು ಒಂದು ಸಾವಿರ ಪ್ರತಿಗಳನ್ನು ಮಾಡುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಇದನ್ನು ಬ್ರಿಡ್ಜ್ ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಷನ್ ಪಿಸಿಆರ್ ಮೂಲಕ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ. ಮುಂದೆ, ಪ್ರೈಮರ್ಗಳು ಮತ್ತು ಮಾರ್ಪಡಿಸಿದ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೋಟೈಡ್ಗಳನ್ನು ಚಿಪ್ ಮೇಲೆ ತೊಳೆದುಕೊಳ್ಳಲಾಗುತ್ತದೆ. ಈ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೋಟೈಡ್ಗಳು ರಿವರ್ಸಿಬಲ್ ಫ್ಲೋರೊಸೆಂಟ್ ಬ್ಲಾಕರ್ ಅನ್ನು ಹೊಂದಿರುವುದರಿಂದ ಡಿಎನ್ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಡಿಎನ್ಎ ತುಣುಕಿನ ಮೇಲೆ ಒಂದು ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಕೇವಲ ಒಂದು ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೋಟೈಡ್ ಅನ್ನು ಮಾತ್ರ ಸೇರಿಸಬಹುದು. ಪ್ರತಿ ಸುತ್ತಿನ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯ ನಂತರ, ಕ್ಯಾಮೆರಾವು ಚಿಪ್ನ ಚಿತ್ರವನ್ನು ತೆಗೆದುಕೊಳ್ಳುತ್ತದೆ. ಫ್ಲೋರೊಸೆಂಟ್ ಟ್ಯಾಗ್ನ ತರಂಗಾಂತರದಿಂದ ಯಾವ ಬೇಸ್ ಅನ್ನು ಸೇರಿಸಲಾಗಿದೆ ಎಂಬುದನ್ನು ಕಂಪ್ಯೂಟರ್ ನಿರ್ಧರಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಚಿಪ್ನಲ್ಲಿರುವ ಪ್ರತಿಯೊಂದು ತಾಣಕ್ಕೂ ಅದನ್ನು ದಾಖಲಿಸುತ್ತದೆ. ಪ್ರತಿ ಸುತ್ತಿನ ನಂತರ, ಸಂಯೋಜಿತವಲ್ಲದ ಅಣುಗಳನ್ನು ತೊಳೆದುಕೊಳ್ಳಲಾಗುತ್ತದೆ. 3 'ಫ್ಲೋರೊಸೆಂಟ್ ಟರ್ಮಿನಲ್ ಬ್ಲಾಕಿಂಗ್ ಗುಂಪನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲು ರಾಸಾಯನಿಕ ಡೀಬ್ಲಾಕ್ ಮಾಡುವ ಹಂತವನ್ನು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಸಂಪೂರ್ಣ ಡಿಎನ್ಎ ಅಣುವನ್ನು ಅನುಕ್ರಮಗೊಳಿಸುವವರೆಗೆ ಈ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯು ಮುಂದುವರಿಯುತ್ತದೆ. ಈ ತಂತ್ರಜ್ಞಾನದೊಂದಿಗೆ, ಜೀನೋಮ್ನ ಉದ್ದಕ್ಕೂ ಸಾವಿರಾರು ಸ್ಥಳಗಳನ್ನು ಬೃಹತ್ ಸಮಾನಾಂತರ ಅನುಕ್ರಮದ ಮೂಲಕ ಏಕಕಾಲದಲ್ಲಿ ಅನುಕ್ರಮಗೊಳಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಪ್ರೊಸೀಜರ್ ಜೀನೋಮಿಕ್ ಲೈಬ್ರರಿ ಡಿಎನ್ಎಯನ್ನು ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಿದ ನಂತರ ಡಿಎನ್ಎ ಲೈಬ್ರರಿ, ಜೀನೋಮಿಕ್ ಲೈಬ್ರರಿಯನ್ನು ರಚಿಸಬೇಕಾಗಿದೆ. ಜೀನೋಮಿಕ್ ಲೈಬ್ರರಿಯನ್ನು ರಚಿಸಲು ಎರಡು ಮಾರ್ಗಗಳಿವೆ, ಸೊನಿಕೇಶನ್ ಮತ್ತು ಟ್ಯಾಗ್ಮೆಂಟೇಶನ್. ಟ್ಯಾಗ್ಮೆಂಟೇಶನ್ನೊಂದಿಗೆ, ಟ್ರಾನ್ಸ್ಪೊಸೇಸ್ಗಳು ಯಾದೃಚ್ಛಿಕವಾಗಿ ಡಿಎನ್ಎಯನ್ನು 50 ಮತ್ತು 500 ಬಿಪಿ ತುಣುಕುಗಳ ನಡುವಿನ ಗಾತ್ರಗಳಾಗಿ ಕತ್ತರಿಸುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಏಕಕಾಲದಲ್ಲಿ ಅಡಾಪ್ಟರ್ಗಳನ್ನು ಸೇರಿಸುತ್ತವೆ. ಜೀನೋಮಿಕ್ ಡಿಎನ್ಎಯನ್ನು ತುಣುಕು ಮಾಡಲು ಸೋನಿಕೇಶನ್ ಅನ್ನು ಬಳಸುವ ಮೂಲಕ ಜೆನೆಟಿಕ್ ಲೈಬ್ರರಿಯನ್ನು ಸಹ ರಚಿಸಬಹುದು. ಅಲ್ಟ್ರಾಸಾನಿಕ್ ಧ್ವನಿ ತರಂಗಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಸೋನಿಕೇಶನ್ ಡಿಎನ್ಎಯನ್ನು ಒಂದೇ ರೀತಿಯ ಗಾತ್ರಗಳಾಗಿ ವಿಭಜಿಸುತ್ತದೆ. ಸೊನಿಕೇಶನ್ ನಂತರ ಬಲ ಮತ್ತು ಎಡ ಅಡಾಪ್ಟರ್ಗಳನ್ನು ಟಿ7 ಡಿಎನ್ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಮತ್ತು ಟಿ4 ಡಿಎನ್ಎ ಲಿಗೇಸ್ನಿಂದ ಜೋಡಿಸಬೇಕಾಗುತ್ತದೆ. ಅಡಾಪ್ಟರ್ಗಳನ್ನು ಲಗತ್ತಿಸಲು ವಿಫಲವಾದ ಸ್ಟ್ರ್ಯಾಂಡ್ಗಳನ್ನು ತೊಳೆದುಕೊಳ್ಳಲಾಗುತ್ತದೆ. ಅಡಾಪ್ಟರು ಅಡಾಪ್ಟರುಗಳು ಮೂರು ವಿಭಿನ್ನ ವಿಭಾಗಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತವೆಃ ಘನ ಬೆಂಬಲಕ್ಕೆ ಪೂರಕವಾದ ಅನುಕ್ರಮ (ಹರಿವಿನ ಕೋಶದ ಮೇಲಿನ ಆಲಿಗೋನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೋಟೈಡ್ಗಳು), ಬಾರ್ಕೋಡ್ ಅನುಕ್ರಮ (ಸೂಚ್ಯಂಕಗಳು), ಮತ್ತು ಅನುಕ್ರಮ ಪ್ರೈಮರ್ಗಾಗಿ ಬಂಧಿಸುವ ತಾಣ. ಸೂಚ್ಯಂಕಗಳು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಆರು ಬೇಸ್ ಜೋಡಿಗಳ ಉದ್ದವಿರುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಲು ಡಿಎನ್ಎ ಅನುಕ್ರಮ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಸೂಚ್ಯಂಕಗಳು 96 ವಿವಿಧ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಒಟ್ಟಿಗೆ ಚಲಾಯಿಸಲು ಅವಕಾಶ ಮಾಡಿಕೊಡುತ್ತವೆ, ಇದನ್ನು ಮಲ್ಟಿಪ್ಲೆಕ್ಸಿಂಗ್ ಎಂದೂ ಕರೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ. ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ, ಕಂಪ್ಯೂಟರ್ ಎಲ್ಲಾ ರೀಡ್ಗಳನ್ನು ಒಂದೇ ಸೂಚ್ಯಂಕದೊಂದಿಗೆ ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸುತ್ತದೆ. ಇಲ್ಯೂಮಿನಾ "ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಅನುಕ್ರಮ" ವಿಧಾನವನ್ನು ಬಳಸುತ್ತದೆ. ಈ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯು ಅಕ್ರಿಲಾಮೈಡ್-ಲೇಪಿತ ಗಾಜಿನ ಹರಿವಿನ ಕೋಶದೊಳಗೆ ನಡೆಯುತ್ತದೆ. ಹರಿವಿನ ಜೀವಕೋಶವು ಜೀವಕೋಶದ ಕೆಳಭಾಗವನ್ನು ಲೇಪಿಸುವ ಒಲಿಗೋನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೋಟೈಡ್ಗಳನ್ನು (ಸಣ್ಣ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೋಟೈಡ್ ಅನುಕ್ರಮಗಳು) ಹೊಂದಿರುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಅನುಕ್ರಮಗೊಳಿಸುವ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಡಿಎನ್ಎ ಎಳೆಗಳನ್ನು ಹಿಡಿದಿಡಲು ಅವು ಘನವಾದ ಬೆಂಬಲವಾಗಿ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸುತ್ತವೆ. ವಿಭಜಿತ ಡಿಎನ್ಎಯನ್ನು ಹರಿವಿನ ಜೀವಕೋಶದ ಮೇಲೆ ತೊಳೆದಾಗ, ಸೂಕ್ತ ಅಡಾಪ್ಟರ್ ಪೂರಕ ಘನ ಬೆಂಬಲಕ್ಕೆ ಅಂಟಿಕೊಳ್ಳುತ್ತದೆ. ಸೇತುವೆಯ ವರ್ಧನೆಯು ಒಮ್ಮೆ ಲಗತ್ತಿಸಿದ ನಂತರ, ಕ್ಲಸ್ಟರ್ ಉತ್ಪಾದನೆಯನ್ನು ಪ್ರಾರಂಭಿಸಬಹುದು. ನೂರಾರು ಒಂದೇ ರೀತಿಯ ಡಿಎನ್ಎ ಎಳೆಗಳನ್ನು ರಚಿಸುವುದು ಇದರ ಗುರಿಯಾಗಿದೆ. ಕೆಲವು ಮುಂಭಾಗದ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್ ಆಗಿರುತ್ತವೆ; ಉಳಿದವು, ಹಿಮ್ಮುಖವಾಗಿರುತ್ತವೆ. ಇದಕ್ಕಾಗಿಯೇ ಬಲ ಮತ್ತು ಎಡ ಅಡಾಪ್ಟರ್ಗಳನ್ನು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಸೇತುವೆ ವರ್ಧನೆಯ ಮೂಲಕ ಸಮೂಹಗಳು ಉತ್ಪತ್ತಿಯಾಗುತ್ತವೆ. ಡಿಎನ್ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಡಿಎನ್ಎಯ ಎಳೆಗಳ ಉದ್ದಕ್ಕೂ ಚಲಿಸುತ್ತದೆ, ಅದರ ಪೂರಕ ಎಳೆಗಳನ್ನು ಸೃಷ್ಟಿಸುತ್ತದೆ. ಮೂಲ ಎಳೆ ತೊಳೆದು, ಹಿಮ್ಮುಖ ಎಳೆ ಮಾತ್ರ ಉಳಿದಿದೆ. ರಿವರ್ಸ್ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್ನ ಮೇಲ್ಭಾಗದಲ್ಲಿ ಅಡಾಪ್ಟರ್ ಅನುಕ್ರಮವಿದೆ. ಡಿಎನ್ಎ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್ ಬಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಮೇಲಿನ ಅಡಾಪ್ಟರ್ ಅನುಕ್ರಮಕ್ಕೆ ಪೂರಕವಾದ ಒಲಿಗೊಗೆ ಲಗತ್ತಿಸುತ್ತದೆ. ಪಾಲಿಮರೇಸ್ಗಳು ಹಿಮ್ಮುಖ ಎಳೆಗೆ ಅಂಟಿಕೊಳ್ಳುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಅದರ ಪೂರಕ ಎಳೆಗಳನ್ನು (ಮೂಲಕ್ಕೆ ಹೋಲುತ್ತದೆ) ತಯಾರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಈಗ ಡಬಲ್ ಸ್ಟ್ರ್ಯಾಂಡೆಡ್ ಡಿಎನ್ಎಯನ್ನು ವಿಕೃತೀಕರಿಸಲಾಗಿದೆ, ಇದರಿಂದಾಗಿ ಪ್ರತಿ ಎಳೆ ಹರಿವಿನ ಕೋಶಕ್ಕೆ ಲಂಗರು ಹಾಕಿದ ಒಲಿಗೋನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೋಟೈಡ್ ಅನುಕ್ರಮಕ್ಕೆ ಪ್ರತ್ಯೇಕವಾಗಿ ಲಗತ್ತಿಸಬಹುದು. ಒಂದು ರಿವರ್ಸ್ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್ ಆಗಿರುತ್ತದೆ; ಇನ್ನೊಂದು, ಫಾರ್ವರ್ಡ್. ಈ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಸೇತುವೆ ವರ್ಧನೆ ಎಂದು ಕರೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ, ಮತ್ತು ಇದು ಹರಿವಿನ ಕೋಶದಾದ್ಯಂತ ಸಾವಿರಾರು ಸಮೂಹಗಳಿಗೆ ಏಕಕಾಲದಲ್ಲಿ ಸಂಭವಿಸುತ್ತದೆ. ಕ್ಲೋನಲ್ ವರ್ಧನೆಯು ಪದೇ ಪದೇ, ಡಿಎನ್ಎ ಎಳೆಗಳು ಬಾಗುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಘನ ಬೆಂಬಲಕ್ಕೆ ಅಂಟಿಕೊಳ್ಳುತ್ತವೆ. ಡಿಎನ್ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಹೊಸ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್ ಅನ್ನು ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಿ ಡಬಲ್ ಸ್ಟ್ರ್ಯಾಂಡೆಡ್ ಸೆಗ್ಮೆಂಟ್ ಅನ್ನು ರಚಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಅದನ್ನು ವಿಕೃತೀಕರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಇದರಿಂದಾಗಿ ಒಂದು ಪ್ರದೇಶದಲ್ಲಿನ ಎಲ್ಲಾ ಡಿಎನ್ಎ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್ಗಳು ಒಂದೇ ಮೂಲದಿಂದ ಬರುತ್ತವೆ (ಕ್ಲೋನಲ್ ವರ್ಧನೆ). ಗುಣಮಟ್ಟ ನಿಯಂತ್ರಣ ಉದ್ದೇಶಗಳಿಗಾಗಿ ಕ್ಲೋನಲ್ ವರ್ಧನೆಯು ಮುಖ್ಯವಾಗಿದೆ. ಒಂದು ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್ ಬೆಸ ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವುದು ಕಂಡುಬಂದರೆ, ವಿಜ್ಞಾನಿಗಳು ಅದೇ ವಿಚಿತ್ರತೆಯ ಪೂರಕವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆಯೇ ಎಂದು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು ಹಿಮ್ಮುಖ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್ ಅನ್ನು ಪರಿಶೀಲಿಸಬಹುದು. ಮುಂಭಾಗ ಮತ್ತು ಹಿಂಭಾಗದ ಎಳೆಗಳು ಕಲಾಕೃತಿಗಳ ವಿರುದ್ಧ ರಕ್ಷಿಸಲು ಚೆಕ್ಗಳಾಗಿ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸುತ್ತವೆ. ಇಲ್ಯೂಮಿನಾ ಸೀಕ್ವೆನ್ಸಿಂಗ್ ಡಿಎನ್ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಅನ್ನು ಬಳಸುವುದರಿಂದ, ಬೇಸ್ ಸಬ್ಸ್ಟಿಟ್ಯೂಷನ್ ದೋಷಗಳನ್ನು ಗಮನಿಸಲಾಗಿದೆ, ವಿಶೇಷವಾಗಿ 3 'ತುದಿಯಲ್ಲಿ. ಕ್ಲಸ್ಟರ್ ಉತ್ಪಾದನೆಯೊಂದಿಗೆ ಜೋಡಿಸಲಾದ ಎಂಡ್ ರೀಡ್ಗಳು ದೋಷ ಸಂಭವಿಸಿದೆ ಎಂದು ಖಚಿತಪಡಿಸಬಹುದು. ರಿವರ್ಸ್ ಮತ್ತು ಫಾರ್ವರ್ಡ್ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್ಗಳು ಪರಸ್ಪರ ಪೂರಕವಾಗಿರಬೇಕು, ಎಲ್ಲಾ ರಿವರ್ಸ್ ರೀಡ್ಗಳು ಪರಸ್ಪರ ಹೊಂದಿಕೆಯಾಗಬೇಕು ಮತ್ತು ಎಲ್ಲಾ ಫಾರ್ವರ್ಡ್ ರೀಡ್ಗಳು ಪರಸ್ಪರ ಹೊಂದಿಕೆಯಾಗಬೇಕು. ಒಂದು ರೀಡ್ ಅದರ ಪ್ರತಿರೂಪಗಳಿಗೆ ಸಾಕಷ್ಟು ಹೋಲುವಂತಿಲ್ಲದಿದ್ದರೆ (ಅದರೊಂದಿಗೆ ಅದು ತದ್ರೂಪಿಯಾಗಿರಬೇಕು), ದೋಷವು ಸಂಭವಿಸಿರಬಹುದು. ಕೆಲವು ಪ್ರಯೋಗಾಲಯಗಳ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಳಲ್ಲಿ ಕನಿಷ್ಠ 97 ಪ್ರತಿಶತ ಹೋಲಿಕೆಯನ್ನು ಬಳಸಲಾಗಿದೆ. ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಮೂಲಕ ಅನುಕ್ರಮ ಕ್ಲೋನಲ್ ವರ್ಧನೆಯ ಕೊನೆಯಲ್ಲಿ, ಎಲ್ಲಾ ಹಿಮ್ಮುಖ ಎಳೆಗಳನ್ನು ಹರಿವಿನ ಕೋಶದಿಂದ ತೊಳೆದು, ಮುಂದೆ ಎಳೆಗಳನ್ನು ಮಾತ್ರ ಬಿಡಲಾಗುತ್ತದೆ. ಒಂದು ಪ್ರೈಮರ್ ಫಾರ್ವರ್ಡ್ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್ಸ್ ಅಡಾಪ್ಟರ್ ಪ್ರೈಮರ್ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸೈಟ್ಗೆ ಲಗತ್ತಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಡಿಎನ್ಎ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್ಗೆ ಪ್ರತಿದೀಪಕವಾಗಿ ಟ್ಯಾಗ್ ಮಾಡಲಾದ ಡಿಎನ್ಟಿಪಿಯನ್ನು ಸೇರಿಸುತ್ತದೆ. ಫ್ಲೋರೋಫೋರ್ ತಡೆಯುವ ಗುಂಪಾಗಿ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸುವುದರಿಂದ ಪ್ರತಿ ಸುತ್ತಿಗೆ ಕೇವಲ ಒಂದು ಬೇಸ್ ಅನ್ನು ಮಾತ್ರ ಸೇರಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಾಗುತ್ತದೆ; ಆದಾಗ್ಯೂ, ತಡೆಯುವ ಗುಂಪನ್ನು ಹಿಂತಿರುಗಿಸಬಹುದು. ನಾಲ್ಕು ಬಣ್ಣದ ರಸಾಯನಶಾಸ್ತ್ರವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು, ನಾಲ್ಕು ಬೇಸ್ಗಳಲ್ಲಿ ಪ್ರತಿಯೊಂದೂ ವಿಶಿಷ್ಟವಾದ ಹೊರಸೂಸುವಿಕೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಪ್ರತಿ ಸುತ್ತಿನ ನಂತರ, ಯಂತ್ರವು ಯಾವ ಬೇಸ್ ಅನ್ನು ಸೇರಿಸಲಾಗಿದೆ ಎಂಬುದನ್ನು ದಾಖಲಿಸುತ್ತದೆ. ಬಣ್ಣವನ್ನು ದಾಖಲಿಸಿದ ನಂತರ ಫ್ಲೋರೋಫೋರ್ ಅನ್ನು ತೊಳೆದು ಮತ್ತೊಂದು ಡಿ. ಎನ್. ಟಿ. ಪಿ. ಯನ್ನು ಹರಿವಿನ ಕೋಶದ ಮೇಲೆ ತೊಳೆದು ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಪುನರಾವರ್ತಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ನೆಕ್ಸ್ಟ್ಸೆಕ್ ಮತ್ತು ನಂತರ ಮಿನಿಸೆಕ್ನ ಬಿಡುಗಡೆಯೊಂದಿಗೆ ಪ್ರಾರಂಭಿಸಿ, ಇಲ್ಯೂಮಿನಾ ಹೊಸ ಎರಡು-ಬಣ್ಣದ ಅನುಕ್ರಮ ರಸಾಯನಶಾಸ್ತ್ರವನ್ನು ಪರಿಚಯಿಸಿತು. ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೋಟೈಡ್ಗಳನ್ನು ಎರಡು ಬಣ್ಣಗಳಲ್ಲಿ ಒಂದರಿಂದ (ಕೆಂಪು ಅಥವಾ ಹಸಿರು), ಯಾವುದೇ ಬಣ್ಣದಿಂದ ("ಕಪ್ಪು") ಅಥವಾ ಎರಡೂ ಬಣ್ಣಗಳನ್ನು ಸಂಯೋಜಿಸುವುದರಿಂದ (ಕಿತ್ತಳೆ ಬಣ್ಣವು ಕೆಂಪು ಮತ್ತು ಹಸಿರು ಬಣ್ಣಗಳ ಮಿಶ್ರಣವಾಗಿ ಕಾಣಿಸಿಕೊಳ್ಳುತ್ತದೆ) ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಡಿಎನ್ಎ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್ ಅನ್ನು ಓದಿದ ನಂತರ, ಈಗಷ್ಟೇ ಸೇರಿಸಲಾದ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್ ಅನ್ನು ತೊಳೆದುಕೊಳ್ಳಲಾಗುತ್ತದೆ. ನಂತರ, ಸೂಚ್ಯಂಕ 1 ಪ್ರೈಮರ್ ಲಗತ್ತಿಸುತ್ತದೆ, ಸೂಚ್ಯಂಕ 1 ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ಪಾಲಿಮರೈಸ್ ಮಾಡುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಅದನ್ನು ತೊಳೆದುಕೊಳ್ಳಲಾಗುತ್ತದೆ. ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್ ಮತ್ತೆ ಸೇತುವೆಯನ್ನು ರೂಪಿಸುತ್ತದೆ, ಮತ್ತು ಡಿಎನ್ಎ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್ನ 3 'ತುದಿಯು ಹರಿವಿನ ಜೀವಕೋಶದ ಮೇಲೆ ಒಲಿಗೊಗೆ ಅಂಟಿಕೊಳ್ಳುತ್ತದೆ. ಸೂಚ್ಯಂಕ 2 ಪ್ರೈಮರ್ ಲಗತ್ತಿಸುತ್ತದೆ, ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ಪಾಲಿಮರೈಸ್ ಮಾಡುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ತೊಳೆದುಕೊಳ್ಳುತ್ತದೆ. ಒಂದು ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಕಮಾನಿನ ಎಳೆಗಳ ಮೇಲಿರುವ ಪೂರಕ ಎಳೆಗಳನ್ನು ಅನುಕ್ರಮಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ. ಅವು ಪ್ರತ್ಯೇಕವಾಗುತ್ತವೆ, ಮತ್ತು ಪ್ರತಿ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್ನ 3 'ತುದಿಯನ್ನು ನಿರ್ಬಂಧಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಮುಂಭಾಗದ ಎಳೆ ತೊಳೆದುಹೋಗುತ್ತದೆ, ಮತ್ತು ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಮೂಲಕ ಅನುಕ್ರಮದ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯು ಹಿಮ್ಮುಖ ಎಳೆಗೆ ಪುನರಾವರ್ತನೆಯಾಗುತ್ತದೆ. ದತ್ತಾಂಶ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ ಅನುಕ್ರಮವು ಏಕಕಾಲದಲ್ಲಿ ಲಕ್ಷಾಂತರ ಸಮೂಹಗಳಿಗೆ ಸಂಭವಿಸುತ್ತದೆ, ಮತ್ತು ಪ್ರತಿ ಸಮೂಹವು ಡಿ. ಎನ್. ಎ. ಅಳವಡಿಕೆಯ 1,000 ಒಂದೇ ರೀತಿಯ ಪ್ರತಿಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತದೆ. ಅನುಕ್ರಮ ದತ್ತಾಂಶವನ್ನು ಕಾಂಟಿಗ್ಸ್ ಎಂದು ಕರೆಯಲಾಗುವ ಅತಿಕ್ರಮಿಸುವ ಪ್ರದೇಶಗಳೊಂದಿಗೆ ತುಣುಕುಗಳನ್ನು ಕಂಡುಹಿಡಿಯುವ ಮೂಲಕ ಮತ್ತು ಅವುಗಳನ್ನು ಜೋಡಿಸುವ ಮೂಲಕ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಒಂದು ಉಲ್ಲೇಖ ಅನುಕ್ರಮವು ತಿಳಿದಿದ್ದರೆ, ರೂಪಾಂತರ ಗುರುತಿಸುವಿಕೆಗಾಗಿ ಅದರೊಂದಿಗೆ ಕಾಂಟಿಗ್ಗಳನ್ನು ಹೋಲಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಈ ಪೀಸ್ಮೀಲ್ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯು ವಿಜ್ಞಾನಿಗಳಿಗೆ ವಿಭಜಿತ ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ಎಂದಿಗೂ ಚಲಾಯಿಸದಿದ್ದರೂ ಸಹ ಸಂಪೂರ್ಣ ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ನೋಡಲು ಅನುವು ಮಾಡಿಕೊಡುತ್ತದೆ; ಆದಾಗ್ಯೂ, ಇಲ್ಯೂಮಿನಾ ಓದುವ ಉದ್ದಗಳು ಬಹಳ ಉದ್ದವಾಗಿಲ್ಲವಾದ್ದರಿಂದ (ಹೈಸೆಕ್ ಅನುಕ್ರಮವು ಸುಮಾರು 90 ಬಿಪಿ ಉದ್ದದ ಓದುವ ಉದ್ದವನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸಬಹುದು), ಇದು ಸಣ್ಣ ಅನುಕ್ರಮ ಪುನರಾವರ್ತಿತ ಪ್ರದೇಶಗಳನ್ನು ಪರಿಹರಿಸಲು ಹೋರಾಟವಾಗಬಹುದು. ಅಲ್ಲದೆ, ಅನುಕ್ರಮವು ಡಿ ನೊವೊ ಆಗಿದ್ದರೆ ಮತ್ತು ಉಲ್ಲೇಖವು ಅಸ್ತಿತ್ವದಲ್ಲಿಲ್ಲದಿದ್ದರೆ, ಪುನರಾವರ್ತಿತ ಪ್ರದೇಶಗಳು ಅನುಕ್ರಮ ಜೋಡಣೆಯಲ್ಲಿ ಬಹಳಷ್ಟು ತೊಂದರೆಗಳನ್ನು ಉಂಟುಮಾಡಬಹುದು. ಹೆಚ್ಚುವರಿ ತೊಂದರೆಗಳಲ್ಲಿ ತಪ್ಪಾದ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ಗಳು, ಚಿಮೆರಿಕ್ ಅನುಕ್ರಮಗಳು ಮತ್ತು ಪಿಸಿಆರ್-ಬಯಾಸ್ಗಳಿಂದ ಬೇಸ್ ಬದಲಿಗಳು (ವಿಶೇಷವಾಗಿ 3 'ರೀಡ್ಗಳ ಕೊನೆಯಲ್ಲಿ) ಸೇರಿವೆ, ಇವೆಲ್ಲವೂ ತಪ್ಪಾದ ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸಲು ಕಾರಣವಾಗಬಹುದು. ಇತರ ಸೀಕ್ವೆನ್ಸಿಂಗ್ ವಿಧಾನಗಳೊಂದಿಗೆ ಹೋಲಿಕೆ ಈ ತಂತ್ರವು ಸ್ಯಾಂಗರ್ ಸೀಕ್ವೆನ್ಸಿಂಗ್ನಂತಹ ಸಾಂಪ್ರದಾಯಿಕ ಸೀಕ್ವೆನ್ಸಿಂಗ್ ವಿಧಾನಗಳಿಗಿಂತ ಹಲವಾರು ಪ್ರಯೋಜನಗಳನ್ನು ನೀಡುತ್ತದೆ. ಸ್ಯಾಂಗರ್ ಅನುಕ್ರಮಕ್ಕೆ ಎರಡು ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳು ಬೇಕಾಗುತ್ತವೆ, ಒಂದು ಫಾರ್ವರ್ಡ್ ಪ್ರೈಮರ್ಗೆ ಮತ್ತು ಇನ್ನೊಂದು ರಿವರ್ಸ್ ಪ್ರೈಮರ್ಗೆ. ಇಲ್ಯೂಮಿನಾಕ್ಕಿಂತ ಭಿನ್ನವಾಗಿ, ಸ್ಯಾಂಗರ್ ಅನುಕ್ರಮವು ಡಿಎನ್ಎ ತುಣುಕಿನ ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲು ಪ್ರತಿದೀಪಕವಾಗಿ ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ ಡೈಡಿಯೋಕ್ಸಿನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೋಸೈಡ್ ಟ್ರೈಫಾಸ್ಫೇಟ್ಗಳನ್ನು (ಡಿಡಿಎನ್ಟಿಪಿಗಳು) ಬಳಸುತ್ತದೆ. ಡಿ. ಡಿ. ಎನ್. ಟಿ. ಪಿಗಳು 3 'ಒ. ಎಚ್. ಗುಂಪನ್ನು ಕಳೆದುಕೊಂಡಿವೆ ಮತ್ತು ಡಿ. ಎನ್. ಎ. ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಶಾಶ್ವತವಾಗಿ ಕೊನೆಗೊಳಿಸುತ್ತವೆ. ಪ್ರತಿ ರಿಯಾಕ್ಷನ್ ಟ್ಯೂಬ್ನಲ್ಲಿ, ಡಿಎನ್ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಮತ್ತು ಪ್ರೈಮರ್ಗಳ ಜೊತೆಗೆ ಡಿಎನ್ಟಿಪಿಗಳು ಮತ್ತು ಡಿಡಿಎನ್ಟಿಪಿಗಳನ್ನು ಸೇರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಡಿ. ಡಿ. ಎನ್. ಟಿ. ಪಿ. ಗಳು ಮತ್ತು ಡಿ. ಎನ್. ಟಿ. ಪಿ. ಗಳ ಅನುಪಾತವು ಮುಖ್ಯವಾಗಿದೆ ಏಕೆಂದರೆ ಮಾದರಿ ಡಿ. ಎನ್. ಎ. ಯನ್ನು ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಬೇಕಾಗಿದೆ, ಮತ್ತು ಡಿ. ಡಿ. ಎನ್. ಟಿ. ಪಿ. ಗಳ ಹೆಚ್ಚಿನ ಪ್ರಮಾಣವು ಡಿ. ಎನ್. ಎ. ಮಾದರಿಯ ಒಂದೇ ಗಾತ್ರ ಮತ್ತು ಸ್ಥಾನದ ಅನೇಕ ತುಣುಕುಗಳನ್ನು ರಚಿಸುತ್ತದೆ. ಡಿಎನ್ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಡಿಡಿಎನ್ಟಿಪಿಯನ್ನು ಸೇರಿಸಿದಾಗ ತುಣುಕನ್ನು ಕೊನೆಗೊಳಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಹೊಸ ತುಣುಕನ್ನು ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಸಂಶ್ಲೇಷಿತವಾದ ಪ್ರತಿಯೊಂದು ತುಣುಕು ಕೊನೆಯದಕ್ಕಿಂತ ಒಂದು ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೋಟೈಡ್ ಉದ್ದವಾಗಿದೆ. ಡಿಎನ್ಎ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಅನ್ನು ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಿದ ನಂತರ, ತುಣುಕುಗಳನ್ನು ಕ್ಯಾಪಿಲ್ಲರಿ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್ನಿಂದ ಬೇರ್ಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಕ್ಯಾಪಿಲ್ಲರಿ ಟ್ಯೂಬ್ನ ಕೆಳಭಾಗದಲ್ಲಿ ಲೇಸರ್ ಪ್ರತಿದೀಪಕವಾಗಿ ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ ಡಿಡಿಎನ್ಟಿಪಿಗಳನ್ನು ಪ್ರಚೋದಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಕ್ಯಾಮರಾ ಹೊರಸೂಸುವ ಬಣ್ಣವನ್ನು ಸೆರೆಹಿಡಿಯುತ್ತದೆ. ಇಲ್ಯೂಮಿನಾ ಡೈ ಸೀಕ್ವೆನ್ಸಿಂಗ್ನ ಸ್ವಯಂಚಾಲಿತ ಸ್ವರೂಪದಿಂದಾಗಿ ಏಕಕಾಲದಲ್ಲಿ ಅನೇಕ ಎಳೆಗಳನ್ನು ಅನುಕ್ರಮಗೊಳಿಸಲು ಮತ್ತು ನಿಜವಾದ ಸೀಕ್ವೆನ್ಸಿಂಗ್ ಡೇಟಾವನ್ನು ತ್ವರಿತವಾಗಿ ಪಡೆಯಲು ಸಾಧ್ಯವಿದೆ. ಸ್ಯಾಂಗರ್ ಸೀಕ್ವೆನ್ಸಿಂಗ್ನೊಂದಿಗೆ, ಒಂದು ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಕೇವಲ ಒಂದು ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್ ಅನ್ನು ಮಾತ್ರ ಅನುಕ್ರಮಗೊಳಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಇದು ತುಲನಾತ್ಮಕವಾಗಿ ನಿಧಾನವಾಗಿರುತ್ತದೆ. ಇತರ ಅನುಕ್ರಮ ತಂತ್ರಗಳಿಗೆ ಅಗತ್ಯವಿರುವ ಬಹು, ದುಬಾರಿ ಕಿಣ್ವಗಳಿಗೆ ವಿರುದ್ಧವಾಗಿ ಇಲ್ಯೂಮಿನಾ ಡಿಎನ್ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಅನ್ನು ಮಾತ್ರ ಬಳಸುತ್ತದೆ (ಅಂದರೆ. ಪೈರೋಸೀಕ್ವೆನ್ಸಿಂಗ್). ಉಲ್ಲೇಖಗಳು ಡಿಎನ್ಎ ಅನುಕ್ರಮ ವಿಧಾನಗಳು