Rapid amplification of cDNA ends
ಸಿಡಿಎನ್ಎ ತುದಿಗಳ ಕ್ಷಿಪ್ರ ವರ್ಧನೆಯು (ಆರ್ಎಸಿಇ) ಜೀವಕೋಶದೊಳಗೆ ಕಂಡುಬರುವ ಆರ್ಎನ್ಎ ಪ್ರತಿಲೇಖನದ ಪೂರ್ಣ ಉದ್ದದ ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ಪಡೆಯಲು ಆಣ್ವಿಕ ಜೀವಶಾಸ್ತ್ರದಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾಗುವ ತಂತ್ರವಾಗಿದೆ. ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ಮೂಲಕ ಉತ್ಪತ್ತಿಯಾಗುವ ಆಸಕ್ತಿಯ ಆರ್ಎನ್ಎ ಅನುಕ್ರಮದ ಸಿಡಿಎನ್ಎ ನಕಲನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸಲು ಆರ್ಎಸಿಇ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ, ನಂತರ ಸಿಡಿಎನ್ಎ ಪ್ರತಿಗಳ ಪಿಸಿಆರ್ ವರ್ಧನೆ (ಆರ್ಟಿ-ಪಿಸಿಆರ್ ನೋಡಿ). ವರ್ಧಿತ ಸಿಡಿಎನ್ಎ ಪ್ರತಿಗಳನ್ನು ನಂತರ ಅನುಕ್ರಮಗೊಳಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಸಾಕಷ್ಟು ಉದ್ದವಾಗಿದ್ದರೆ, ವಿಶಿಷ್ಟ ಜೀನೋಮಿಕ್ ಪ್ರದೇಶಕ್ಕೆ ನಕ್ಷೆ ಮಾಡಬೇಕು. ಮೂಲತಃ ಪ್ರತ್ಯೇಕ ಆರ್. ಎನ್. ಎ ಅಣುಗಳ ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ಮಾಡುವ ಮೊದಲು ಆರ್. ಎ. ಸಿ. ಇ. ಅನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಅಬೀಜ ಸಂತಾನೋತ್ಪತ್ತಿ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ. ಹೊಸ ಪ್ರತಿಲೇಖನ ರಚನೆಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಲು ಉಪಯುಕ್ತವಾದ ಹೆಚ್ಚು ಹೆಚ್ಚಿನ-ಥ್ರೋಪುಟ್ ಪರ್ಯಾಯವೆಂದರೆ, ಮುಂದಿನ ಪೀಳಿಗೆಯ ಅನುಕ್ರಮ ತಂತ್ರಜ್ಞಾನಗಳಿಂದ ಆರ್ಎಸಿಇ-ಉತ್ಪನ್ನಗಳನ್ನು ಅನುಕ್ರಮಗೊಳಿಸುವುದು. ಪ್ರಕ್ರಿಯೆ ಆರ್. ಎ. ಸಿ. ಇ. ಯು ಆರ್. ಎನ್. ಎ. ಯ 5 'ತುದಿಗೆ (5' ಆರ್. ಎ. ಸಿ. ಇ.-ಪಿ. ಸಿ. ಆರ್.) ಅಥವಾ 3 'ತುದಿಗೆ (3' ಆರ್. ಎ. ಸಿ. ಇ.-ಪಿ. ಸಿ. ಆರ್.) ಪ್ರತಿಲೇಖನದೊಳಗಿನ ಸಣ್ಣ ಪರಿಚಿತ ಅನುಕ್ರಮದಿಂದ ಆರ್. ಎನ್. ಎ. ಪ್ರತಿಲೇಖನದ ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ. ಈ ತಂತ್ರವನ್ನು ಕೆಲವೊಮ್ಮೆ ಏಕಪಕ್ಷೀಯ ಪಿಸಿಆರ್ ಅಥವಾ ಲಂಗರು ಹಾಕಿದ ಪಿಸಿಆರ್ ಎಂದು ಕರೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ. ಆರ್. ಎನ್. ಎ. ಪ್ರತಿಲೇಖನದ ಪ್ರದೇಶದ ಸಿಡಿಎನ್ಎ ನಕಲನ್ನು ತಯಾರಿಸಲು ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ಅನ್ನು ಬಳಸುವುದು ಆರ್. ಎ. ಸಿ. ಇ. ಯ ಮೊದಲ ಹಂತವಾಗಿದೆ. ಈ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ, ಪ್ರತಿಲೇಖನದ ಅಜ್ಞಾತ ಅಂತಿಮ ಭಾಗವನ್ನು ಪ್ರತಿಲೇಖನದ ಕೇಂದ್ರದಿಂದ ತಿಳಿದಿರುವ ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ನಕಲಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ನಕಲು ಮಾಡಲಾದ ಪ್ರದೇಶವು 5 'ಅಥವಾ 3' ತುದಿಯಲ್ಲಿ ತಿಳಿದಿರುವ ಅನುಕ್ರಮದಿಂದ ಸುತ್ತುವರಿಯಲ್ಪಟ್ಟಿದೆ. 5 'ಅಥವಾ 3' ಜಾತಿಗಳ ಶಿಷ್ಟಾಚಾರಗಳು ಸ್ವಲ್ಪ ಭಿನ್ನವಾಗಿರುತ್ತವೆ. 5 'ಆರ್ಎಸಿಇ-ಪಿಸಿಆರ್ ಆಸಕ್ತಿಯ ಜೀನ್ನ ಮಧ್ಯದಲ್ಲಿ ತಿಳಿದಿರುವ ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ಗುರುತಿಸುವ ಆ್ಯಂಟಿ-ಸೆನ್ಸ್ (ರಿವರ್ಸ್) ಒಲಿಗೋನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೋಟೈಡ್ ಪ್ರೈಮರ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಮೊದಲ ಸುತ್ತಿನ ಸಿಡಿಎನ್ಎ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆ (ಅಥವಾ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಷನ್) ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗೆ ಎಂಆರ್ಎನ್ಎಯನ್ನು ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಆಗಿ ಬಳಸಲು ಪ್ರಾರಂಭಿಸುತ್ತದೆ; ಪ್ರೈಮರ್ ಅನ್ನು ಜೀನ್ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪ್ರೈಮರ್ (ಜಿಎಸ್ಪಿ) ಎಂದು ಕರೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ. ಪ್ರೈಮರ್ ಎಂಆರ್ಎನ್ಎಗೆ ಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ, ಮತ್ತು ಕಿಣ್ವ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಏಕ-ಎಳೆ ಸಿಡಿಎನ್ಎ ಉತ್ಪನ್ನವನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸಲು ಪ್ರೈಮರ್ನ 3 'ತುದಿಯಲ್ಲಿ ಬೇಸ್ ಜೋಡಿಗಳನ್ನು ಸೇರಿಸುತ್ತದೆ; ಇದು ಎಂಆರ್ಎನ್ಎಗೆ ಹಿಮ್ಮುಖ ಪೂರಕವಾಗಿದೆ. ಸಿಡಿಎನ್ಎ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯ ನಂತರ, ಕಿಣ್ವದ ಟರ್ಮಿನಲ್ ಡಿಯೋಕ್ಸಿನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೋಟಿಡಿಲ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಫರೇಸ್ (ಟಿಡಿಟಿ) ಅನ್ನು ಸಿಡಿಎನ್ಎಯ 3 'ತುದಿಯಲ್ಲಿ ಹೋಮೋಪಾಲಿಮೆರಿಕ್ ಬಾಲ ಎಂದು ಕರೆಯಲಾಗುವ ಒಂದೇ ರೀತಿಯ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೋಟೈಡ್ಗಳ ಸರಣಿಯನ್ನು ಸೇರಿಸಲು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ. (ಡಿ ನೊವೊ ಸಿಡಿಎನ್ಎ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಮೊದಲ ಸ್ಟ್ರಾಂಡಿಗೆ 3 '-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ಸೇರಿಸಲು ಕೆಲವು ಮಾರ್ಗಗಳಿವೆ, ಇದು ಹೋಮೋಪಾಲಿಮೆರಿಕ್ ಟೈಲಿಂಗ್ಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚು ಪರಿಣಾಮಕಾರಿಯಾಗಿದೆ, ಆದರೆ ವಿಧಾನದ ಅರ್ಥವು ಒಂದೇ ಆಗಿರುತ್ತದೆ). ನಂತರ ಪಿಸಿಆರ್ ಅನ್ನು ನಡೆಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಇದು ತಿಳಿದಿರುವ ಅನುಕ್ರಮಕ್ಕೆ ಬಂಧಿಸುವ ಎರಡನೇ ಆಂಟಿ-ಸೆನ್ಸ್ ಜೀನ್ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪ್ರೈಮರ್ (ಜಿಎಸ್ಪಿ 2) ಅನ್ನು ಬಳಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಸಿಡಿಎನ್ಎಗಳ 3 'ತುದಿಗಳಿಗೆ ಸೇರಿಸಲಾದ ಹೋಮೋಪಾಲಿಮೆರಿಕ್ ಬಾಲವನ್ನು ಬಂಧಿಸುವ ಸೆನ್ಸ್ (ಫಾರ್ವರ್ಡ್) ಯೂನಿವರ್ಸಲ್ ಪ್ರೈಮರ್ (ಯುಪಿ) ಅನ್ನು 5' ತುದಿಯಿಂದ ಸಿಡಿಎನ್ಎ ಉತ್ಪನ್ನವನ್ನು ವರ್ಧಿಸುತ್ತದೆ. 3 'ಆರ್ಎಸಿಇ-ಪಿಸಿಆರ್ ಎಲ್ಲಾ ಯುಕಾರ್ಯೋಟಿಕ್ ಎಮ್ಆರ್ಎನ್ಎಗಳ 3' ತುದಿಯಲ್ಲಿ ಇರುವ ನೈಸರ್ಗಿಕ ಪಾಲಿಎ ಬಾಲವನ್ನು ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಪ್ರೈಮಿಂಗ್ಗಾಗಿ ಬಳಸುತ್ತದೆ, ಆದ್ದರಿಂದ ಈ ವಿಧಾನಕ್ಕೆ ಟಿಡಿಟಿಯಿಂದ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೋಟೈಡ್ಗಳನ್ನು ಸೇರಿಸುವ ಅಗತ್ಯವಿಲ್ಲ. ಸಿಡಿಎನ್ಎಗಳನ್ನು ಒಲಿಗೋ-ಡಿಟಿ-ಅಡಾಪ್ಟರ್ ಪ್ರೈಮರ್ (ಡಿಯೋಕ್ಸಿ-ಥೈಮಿನ್ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೋಟೈಡ್ಗಳ ಸಣ್ಣ ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಪ್ರೈಮರ್) ಬಳಸಿ ಉತ್ಪಾದಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಇದು ಪಾಲಿಎ ಸ್ಟ್ರೆಚ್ಗೆ ಪೂರಕವಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಪ್ರತಿ ಸಿಡಿಎನ್ಎಯ 5 'ತುದಿಯಲ್ಲಿ ವಿಶೇಷ ಅಡಾಪ್ಟರ್ ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ಸೇರಿಸುತ್ತದೆ. ಪಿಸಿಆರ್ ಅನ್ನು ನಂತರ ತಿಳಿದಿರುವ ಪ್ರದೇಶದಿಂದ 3 'ಸಿಡಿಎನ್ಎ ಅನ್ನು ಸೆನ್ಸ್ ಜಿಎಸ್ಪಿ ಬಳಸಿ ವರ್ಧಿಸಲು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಮತ್ತು ಅಡಾಪ್ಟರ್ ಅನುಕ್ರಮಕ್ಕೆ ಪೂರಕವಾದ ಆಂಟಿ-ಸೆನ್ಸ್ ಪ್ರೈಮರ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಆರ್ಎಸಿಇ-ಸೀಕ್ವೆನ್ಸಿಂಗ್ ಆರ್ಎಸಿಇಯಿಂದ ಉತ್ಪತ್ತಿಯಾಗುವ ಸಿಡಿಎನ್ಎ ಅಣುಗಳನ್ನು ಹೈ-ಥ್ರೋಪುಟ್ ಸೀಕ್ವೆನ್ಸಿಂಗ್ ತಂತ್ರಜ್ಞಾನಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಅನುಕ್ರಮಗೊಳಿಸಬಹುದು (ಆರ್ಎಸಿಇ-ಸೆಕ್ ಎಂದೂ ಕರೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ). ಆಣ್ವಿಕ ಅಬೀಜ ಸಂತಾನೋತ್ಪತ್ತಿಯೊಂದಿಗೆ ಆರ್. ಎ. ಸಿ. ಇ ತುಣುಕುಗಳ ಸಾಂಪ್ರದಾಯಿಕ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ಆರ್. ಎ. ಸಿ. ಇ ತುಣುಕುಗಳ ಹೈ-ಥ್ರೋಪುಟ್ ಸೀಕ್ವೆನ್ಸಿಂಗ್ ಗುಣಲಕ್ಷಣವು ಹೆಚ್ಚು ಸಮಯ-ದಕ್ಷ, ಹೆಚ್ಚು ಸೂಕ್ಷ್ಮ, ಕಡಿಮೆ ವೆಚ್ಚದಾಯಕ ಮತ್ತು ತಾಂತ್ರಿಕವಾಗಿ ಕಾರ್ಯಸಾಧ್ಯವಾಗಿದೆ. ಆರ್. ಎನ್. ಎ. ಅನುಕ್ರಮದ ಭಾಗವು ಜೀನ್-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪ್ರೈಮರ್ನಿಂದ ತಿಳಿದಿರುವ ಮತ್ತು ಗುರಿಯಾಗಿರಬಹುದಾದ ಆರ್. ಎನ್. ಎ. ಅಣುಗಳ ಅಜ್ಞಾತ 5 '(5'-ರೇಸ್) ಅಥವಾ 3 '(3'-ರೇಸ್) ಭಾಗಗಳನ್ನು ವರ್ಧಿಸಲು ಇತಿಹಾಸ ಮತ್ತು ಅನ್ವಯಿಕೆಗಳಾದ ಆರ್. ಎ. ಸಿ. ಇ. ಅನ್ನು ಬಳಸಬಹುದು. ಈ ವರ್ಧಿತ ಆರ್. ಎ. ಸಿ. ಇ ಉತ್ಪನ್ನಗಳ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳಿಗಾಗಿ ಹೆಚ್ಚಿನ-ಥ್ರೋಪುಟ್ ಅನುಕ್ರಮದೊಂದಿಗೆ, ಯಾವುದೇ ರೀತಿಯ ಕೋಡಿಂಗ್ ಅಥವಾ ನಾನ್-ಕೋಡಿಂಗ್ ಆರ್. ಎನ್. ಎ-ಅಣುಗಳನ್ನು ನಿರೂಪಿಸಲು ವಿಧಾನವನ್ನು ಅನ್ವಯಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಿದೆ. ಒಂದೇ ಜೀವಕೋಶ-ರೇಖೆಯಲ್ಲಿ 17 ವಂಶವಾಹಿಗಳ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ಸ್ಟಾರ್ಟ್ ಸೈಟ್ಗಳ (ಟಿಎಸ್ಎಸ್) ಮ್ಯಾಪಿಂಗ್ ಅನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸಲು ಆರ್ಎಸಿಇಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿನ-ಥ್ರೋಪುಟ್ ಅನುಕ್ರಮದೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಜಿಸುವ ಕಲ್ಪನೆಯನ್ನು ಮೊದಲ ಬಾರಿಗೆ 2009 ರಲ್ಲಿ ಡೀಪ್-ರೇಸ್ ಎಂದು ಪರಿಚಯಿಸಲಾಯಿತು. ಉದಾಹರಣೆಗೆ, ಸಂಶ್ಲೇಷಿತ ಸಿಆರ್ಎನ್ಎಗಳಿಂದ ನಿರ್ದೇಶಿಸಲ್ಪಟ್ಟ ಗುರಿ ಆರ್ಎನ್ಎಗಳ ಸೀಳು ತಾಣಗಳನ್ನು ನಿಖರವಾಗಿ ನಕ್ಷೆ ಮಾಡಲು 2014ರ ಅಧ್ಯಯನದಲ್ಲಿ, ಈ ವಿಧಾನವನ್ನು ಮೊದಲು ಆರ್ಎಸಿಇ-ಸೆಕ್ ಎಂದು ಹೆಸರಿಸಲಾಯಿತು. ಇದಲ್ಲದೆ, ಕೊಲೊರೆಕ್ಟಲ್ ಕ್ಯಾನ್ಸರ್ನಲ್ಲಿನ ಹೊಸ ನಕಲುಗಳು ಮತ್ತು ಸಮ್ಮಿಳನ ನಕಲುಗಳ ಪೂರ್ಣ-ಉದ್ದದ ಅಜ್ಞಾತ ಭಾಗಗಳನ್ನು ನಿರೂಪಿಸಲು ಈ ವಿಧಾನವನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು. ಎಲ್. ಎನ್. ಸಿ. ಆರ್. ಎನ್. ಎ. ಗಳ ಅಜ್ಞಾತ ಪ್ರತಿಲೇಖನ ರಚನೆಗಳನ್ನು ನಿರೂಪಿಸುವ ಗುರಿಯನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಮತ್ತೊಂದು ಅಧ್ಯಯನದಲ್ಲಿ, ಆರ್. ಎ. ಸಿ. ಇ. ಯನ್ನು ಅರೆ-ಉದ್ದದ 454 ಅನುಕ್ರಮದ ಸಂಯೋಜನೆಯೊಂದಿಗೆ ಬಳಸಲಾಯಿತು. ಮಾಲಿಕ್ಯುಲರ್ ಕ್ಲೋನಿಂಗ್ಃ ಎ ಲ್ಯಾಬೊರೇಟರಿ ಮ್ಯಾನ್ಯುಯಲ್ (ಆವೃತ್ತಿಗಳು) ನಲ್ಲಿ "5 'ಸಿಡಿಎನ್ಎಯ ಕ್ಷಿಪ್ರ ವರ್ಧನೆಯು ಕೊನೆಗೊಳ್ಳುತ್ತದೆ" ಎಂಬ ಉಲ್ಲೇಖಗಳಿವೆ. ಸಾಂಬ್ರೂಕ್, ಜೆ. ) ಚಾಪ್ಟರ್ 8 ಪ್ರೊಟೊಕಾಲ್ 9,854-8.60 (ಕೋಲ್ಡ್ ಸ್ಪ್ರಿಂಗ್ ಹಾರ್ಬರ್ ಲ್ಯಾಬೊರೇಟರಿ ಪ್ರೆಸ್, ಕೋಲ್ಡ್ ಸ್ಪ್ರಿಂಗ್ ಹಾರ್ಬರ್, ನ್ಯೂಯಾರ್ಕ್, ಯುಎಸ್ಎ, 2001) ಪ್ರಿನ್ಸಿಪಲ್ಸ್ ಆಫ್ ಜೀನ್ ಮ್ಯಾನಿಪ್ಯುಲೇಷನ್ ಅಂಡ್ ಜೀನೋಮಿಕ್ಸ್, ಎಸ್. ಬಿ. ಪ್ರಿಮ್ರೋಸ್ ಮತ್ತು ಆರ್. ಎಂ. ಟ್ವಿಮನ್, ಬ್ಲ್ಯಾಕ್ವೆಲ್ ಪಬ್ಲಿಷಿಂಗ್, 2006 (7ನೇ ಆವೃತ್ತಿ. ), ಪುಟಗಳು 111-12. ಬಾಹ್ಯ ಕೊಂಡಿಗಳು ಆರ್ಎಸಿಇ-ಸೆಕ್ ಬಯೋಕೆಮಿಸ್ಟ್ರಿ ಪತ್ತೆ ವಿಧಾನಗಳ ಬಗ್ಗೆ ಬ್ಲಾಗ್ ಲೇಖನ ಜೆನೆಟಿಕ್ ಮ್ಯಾಪಿಂಗ್ ಜೆನೆಟಿಕ್ಸ್ ತಂತ್ರಗಳು ಆಣ್ವಿಕ ಜೀವಶಾಸ್ತ್ರ