BÖLÜM 1 : ÖRNEK ALMA, HOMOJENİZASYON ve SEYRELTME 1.1 Örnek Alma ve Örnek miktarı Analize alınacak örnek miktarı doğrudan gıdanın çeşidi ile de ilgilidir. Pastörize sütte 10 mL örnek alınıp, bunun 1 mL’si koliform analizi için VRB Agar’a ekilebilir. Peynirde ise mutlaka homojenizasyon yapılmak zorundadır. Laboratuvar tipi standart bir blender kullanılıyor ise 10 gram peynir + 90 mL homojenizasyon çözeltisi yeterli değildir, blender bu düşük miktarı homojenize edemez. Dolayısı ile yaygın kullanılan şekli ile 25 gram peynir + 225 mL homojenizasyon çözeltisidir. Standart bir analizde 10 g örnek yeterli olmakla birlikte, yukarıda belirtildiği gibi özel homojenizasyon gereksinmeleri uyarınca, ilave her patojen testi için genellikle 25 g gıda maddesi gerekir. Buna göre toplam bakteri, koliform grup bakteriler, maya ve küf ile stafilokok için 10 g, Salmonella ve Listeria analizi için her birinden 25 g olmak üzere en az 60 g numunenin laboratuvara getirilmesi gerekir. Alınan örnek sayısının ilgili partiyi temsil etmesi ayrı bir sorundur ve genellikle partinin ne kadar homojen olduğu ile de yakından ilişkilidir. Bir süt tankerinin altından ya da üstünden alınan örneklerde farklı mikroorganizma sayıları çıkması beklenebilir. Süt işletmelerinde yapılacak analizlerde alınacak numunenin partiyi ne ölçüde temsil ettiği incelenmelidir ve olabildiğince rastgele örnek alınması sağlanmalıdır. Örnek sayısı ile ilgili genel kurallar aşağıda özetlenmiştir: · Analizi sırasında homojenizasyon sorunu olan gıdalardan daha fazla sayıda numune alınmalıdır. · Ambalaj boyutu küçüldükçe daha çok sayıda örnek alınmalıdır. · Büyük ambalajlar ile dökme ve yığın ürünlerden kompozit örnekler hazırlanmalıdır. · Çabuk bozulabilen gıdalardan daha çok örnek alınmalıdır. · Salmonella, Listeria vb. patojen riski yüksek olan gıdalardan daha çok örnek alınmalıdır. · Alınacak örnek sayısı uygulanan teknolojiye bağlıdır. Basit teknoloji uygulayan işletmelerde modern olanlara göre daha çok numune alınması gerekir. Örneğin Laboratuvara Getirilmesi ve Kabulü İşletmeden alınan örnek, mümkün olan en kısa süre içinde ve örnekteki mikroorganizma sayısını artıracak ya da azaltacak koşullardan tümüyle arındırılmış olarak laboratuvara getirilmeli ve analize alınmalıdır. Steril, kuru ve nem geçirmeyen ambalajlardakiler gibi mikrobiyel yönden stabil ürünlerde, taşıma sırasında soğutmaya gerek yoktur. Buna karşın işlem görmemiş, soğutulmuş, pastörize edilmiş, o o o bozulmuş vb. gıdalar 0 C ile +4 C arasında, dondurulmuş ürünler ise – 18 C’da taşınmalı, bombaj
yapmış (veya bombaj tehlikesi olanlar) olası patlamalara ve sızıntılara karşı ayrıca ambalajlanarak laboratuvara getirilmelidir. İşletme içinde prosesin çeşitli aşamalarında alınacak örneklerin aseptik koşullar altında ve steril ambalajlara alınması deneyim gerektirir. Öncelikle, laboratuvar tarafından analize alınmak üzere numune kabul edilmelidir. Bu kabul için laboratuvar personeli, numunenin laboratuvara gereken koşullarda getirilip getirilmediğini kontrol etmeli, eğer standart koşullarda getirildiğine emin olursa numuneyi analiz için kabul etmeli, aksi halde ya kabul etmemeli ya da kabul formuna bununla ilgili tüm olumsuzlukları yazmalıdır. Laboratuvara gelen ve kabul edilen örnek için, laboratuvarın özelliğine göre kabul tarihi, kabul saati, ürün ile ilgili tüm bilgiler (üretim tarihi, ambalaj özellikleri, parti numarası, vardiya numarası, numunenin alındığı saat, gerekli ise örnek alım sıcaklığı, laboratuvara giriş sıcaklığı vb.) kayda alınmalıdır. Bombaj yapmış ambalajlar açılırken laboratuvar kazasına karşı dikkatli olunmalı, açım sırasında personel zarar görmemelidir. Kalın bir torba içine konulan bombajlı örnek, torbaya el sokularak açılır. Bu şekilde, eğer patlama olursa laboratuvarın kontaminasyonu önlenmiş olur. Örneğin Açılması Analiz için gelen örnek mümkün olan en kısa süre içinde analize alınmalıdır. Analiz için bir süre beklemek zorunluluğu varsa; · Mikrobiyolojik olarak stabil olan ürünler son kullanma tarihinden önce ve elden geldiği kadar çabuk olarak analize alınmalıdır. · Taze ve soğutulmuş ürünler kabulden sonra 24 saat içinde analize alınmalıdır. Daha uzun bir depolama süresi kaçınılmaz ise, ürün derhal dondurulmalı ve – 18 oC’ın altında depolanmalıdır. Dondurma işlemi üründeki mikrobiyel florayı etkileyeceği için, bu durum analiz raporunda açıkça belirtilmelidir. Cl. perfringens gibi bazı mikroorganizmalar dondurma işleminden çok fazla etkilenir. Buna göre, analiz öncesinde dondurulmuş taze ürünlerde Cl. perfringens analizi yapmanın gereği yoktur. o · Dondurulmuş ürünler +4 C buzdolabı sıcaklığında çözündürülmelidir. Bu işlemde büyük porsiyonlar halindeki ürünlerin çözülmesinin küçük porsiyonlu olanlara göre daha uzun süre alacağı, çözündürme süresi içinde psikrofil bakterilerin gelişebileceği gözden uzak tutulmamalı, dolayısıyla gıda olanaklar ölçüsünde 50 gramdan fazla olmayacak porsiyonlar halinde dondurulmalıdır. Eğer örnek önceden tartılarak dondurulduysa, doğrudan homojenizasyon çözeltisine aktarılarak çözündürülebilir. · Pastörize ve benzeri ürünler son kullanma tarihinden önce ve elden geldiği kadar çabuk analize alınmalıdır. · Dondurulmuş ürün analiz amacıyla çözündürüldü ise analiz ertelenemez. · Laboratuvara gelen ve kabul edilen numunenin paraleli analiz bitinceye kadar ürün özellikleri değişmeyecek şekilde şahit olarak korunmalıdır. Kapalı ambalaj açılmadan önce, açılacak yer ve çevresi %76 (v/v) alkol ya da uygun bir diğer kimyasal ile dezenfekte edilmeli ve ambalaj uygun ise ayrıca alevden geçirilmelidir. Alevden geçirilemeyecek (kâğıt vb.) ambalajlarda kimyasal dezenfeksiyondan sonra dezenfektan steril su ile silinerek uzaklaştırılmalı, dezenfektan hiçbir şekilde gıda örneğine karışmamalıdır. Aksi halde sahte negatif sonuç alınabilir. Açımda kullanılacak makas, konserve açacağı, şişe açacağı, bisturi vb. materyal önceden uygun bir ambalaja (kâğıt, mutfak tipi alüminyum folyo) sarılarak etüvde ya da otoklavda sterilize ya da dezenfekte edilmiş olmalıdır.
Sıvı örnekler doğrudan analize alınabilir. Katı gıdalar ise tartım, homojenizasyon vb. gibi ön işlemlerden geçmek zorundadır. Katı örneklerde belirli bir ağırlığın (10 g, 25 g vb.) tartılması aseptik koşullar altında yapılmalıdır. Dikey tip ekim kabini içinde tartım yapılması en sağlıklı yöntemdir. Tartımın yapılacağı kap önceden sterilize edilmiş, seyreltme veya Salmonella ‘da olduğu gibi ön zenginleştirme besiyerini rahatlıkla alabilecek boyutta olmalıdır. Katı gıda maddesi tartım sırasında sorun çıkaracak büyüklükte ve nitelikte parçalardan oluşuyor ise, tartımdan önce uygun boyutlara parçalanmalıdır. Terazi üzerine gereksiz ağırlık konulmasının sakıncalı olması ve eğer istenilen ağırlıktan daha fazla parça aktarıldı ise bunun geri alınmasındaki zorluk nedenleri ile, prensip olarak tartımlar erlen, beher gibi kaplara değil, steril saat camı, steril Petri kutusu, steril alüminyum folyo gibi materyalde yapılıp, tartılmış örnek daha sonra içinde besiyeri olan erlene, blendere ya da stomachere alınmalıdır. Tartım sırasında numunenin hedeflenen ağırlığa kesin olarak getirilmesini sağlamak amacı ile kontaminasyon riskini artıracak düzeyde uğraşılmamalıdır. Bu konuda deneyim önemlidir. Bazı gıdaların (örneğin parça et) önceden küçültülmüş olsa da tam olarak 10,0 gram tartılması hayli zordur. Böyle durumlarda tartım hatası seyreltme sıvısı miktarının değiştirilmesi ile ortadan kaldırılır. Standart çalışmada 10 gram gıda üzerine 90 mL seyreltme sıvısı konulmalıdır. Tartım sonucunda gıda 10,5 gram olarak tartıldı ise, seyreltme sıvısı 90 mL yerine 94,5 mL olarak alınır ve yine standart 1:10 oranı elde edilir. 90 mL olarak hazırlanmış seyreltme sıvısının üzerine pipet ile 4,5 mL steril (yedek) seyreltme sıvısı eklemek, gıdayı tam olarak 10,0 gram olarak tartmaktan çok daha kolay ve hızlıdır. Ayrıca tartım sırasında kontaminasyon olasılığı azaltılmış olur. 1.2 Homojenizasyon Genellikle katı ve yarı katı gıdaların bir homojenizasyon çözeltisi içinde homojen hale getirilme işlemidir. Sıvı gıdalar zaten homojen bir dağılım gösterir. Burada homojenlikten kasıt, gıdadaki mikroorganizmaların analiz yapılacak tüm kütleye homojen olarak dağıtılmasıdır. Homojenizasyon işlemi ister sayım, ister var/yok testleri amacıyla kullanılsın, genel olarak 1:9 oranında yapılır. Buna göre 1 kısım gıda 9 kısım çözelti ile homojenize edilir. Var/yok testlerinde ise, 1 kısım gıda 9 kısım besiyeri ile homojenizasyon işlemine alınır. Sayım yapılacak ise 1:9 oranında homojenizasyon, aynı zamanda 10– 1 seyreltme olarak da kullanılır. Bu nedenle homojenizasyonda gıda ve homojenizasyon çözeltisinin miktarına özen gösterilmelidir. 10 g gıda maddesi 90 mL seyreltme çözeltisi içinde homojenize edilir. Gıdanın her gramında “A” sayıda bakteri olduğu kabul edilirse 10 g gıda ile erlene “10A” sayıda bakteri gelmiştir. 90 g (mL)
seyreltme çözeltisi ile birlikte toplam miktar 100 g (mL) olur, ancak seyreltme sıvısı steril olduğu için, buradan bakteri gelmez. Sonuçta, toplam 100 g çözeltide yine “10A” sayıda bakteri vardır. Dolayısı ile bunun 1 mL’sinde bulunan bakteri sayısı 10A / 100= 0,1A olacaktır. Erlendeki çözelti orijinal örneğe göre 10 kez seyreltilmiştir ve 10– 1 olarak ifade edilir. İşlem, bu çözeltiden 1 mL alınıp, içinde 9 mL seyreltme çözeltisi olan tüpe aktarım ile devam eder. Aynı şekilde tüpteki bakteri sayısı erlene göre 10, orijinal gıdaya göre 100 kez seyrelmiş olur ve her mL’sinde 0,01A bakteri vardır. 10–2 olarak gösterilir. Erlendeki ve tüpteki seyreltilerden ayrı ayrı olmak üzere Petri kutularına 1’er mL aktarılır. Petri kutularına geçen bakteri sayısı sırası ile 0,1A ve 0,01A şeklindedir. Diğer bir deyiş ile, Petri kutularına sırası ile 0,1 g ve 0,01 g gıda maddesi aktarılmış olur. Standart uygulamada her seyreltiden 2’şer Petri kutusuna ekim yapılır. Petri kutuları inkübasyona bırakılır İnkübasyon sonunda erlenden yapılan ekimde, Petri kutularındaki koloni sayısı, tüptekinin 10 misli fazladır. Koloniler sayılarak gıda örneğindeki bakteri sayısı hesaplanır. 1.3 Seyreltme Gıdanın çeşidine göre değişmek üzere gıdada homojenizasyon ve/veya seyreltme yapılması gerekebilir. Sıvı ya da yoğurt, dondurma, süt tozu gibi suda kolaylıkla eriyen gıdalar için herhangi bir ön hazırlığa gerek yoktur. Bu gıdalar seyreltme sıvısı içinde basit bir mekanik karıştırma ile homojenize edilebilir. o Tereyağı homojenizasyonunda kullanılan çözeltiler 30–32 C’da olmalıdır. Pipetleme sırasında pipetin içinde tereyağının katılaşmasını önlemek için pipet birkaç kez alevden geçirilerek ısıtılır. Peynirler blender kullanılarak homojenize edilir.
Kremada erimeyi kolaylaştırmak için ilk seyreltmenin yapılacağı erlene (sterilizasyon öncesinde) yaklaşık 6 mm çaplı cam boncuk atılması önerilmektedir. Homojenizasyon (ilk seyreltme) ve sonraki seyreltmeler, standart olarak 1:9 oranında yapılır. Bunun için başlangıçta 10 g gıda örneği 90 mL seyreltme çözeltisi ile homojenize edilir. Salmonella, E. coli O157:H7 serotipi ve Listeria analizinde ise 25 g gıda 225 mL besiyerine ilave edilir. Bu uygulamada seyreltme amacı yoktur, sadece gıda için yeterli miktarda besiyeri kullanılmaktadır. 11 g numunenin 99 mL seyreltme çözeltisinde homojenize edilmesi de uygulanan bir yöntemdir. Seyreltmenin 1:9 oranında yapılmasının nedeni hesap kolaylığı içindir. Petri kutusunda sayılan koloni basit olarak seyreltme faktörü ile çarpılır. Bu faktör, 1:9 oranı kullanıldığında 10, 100, 1000 gibi bir değerdir. 1:99 oranında seyreltme kullanılarak doğrudan 100 kez seyreltme de yapılabilir. Aşağıda açıklanacağı gibi katı (agarlı) besiyeri kullanımlarında ve En Muhtemel Sayı yönteminde de ilk seyreltmenin 1:9 oranında yapılması zorunlu değildir. İlk seyrelti (10– 1) yapıldıktan sonra 10–2 ve 10–3 seyreltilere yine aynı seyreltme çözeltisi ile devam edilir. Standart gıda analizlerinde daha fazla seyreltmeye gerek yoktur. Bu seyreltmeler steril 1 mL’lik pipet kullanılarak standart şekilde yapılır. Bu amaçla erlenden 1 mL alınıp, 9 mL seyreltme sıvısına aktarılır ve tüp karıştırıcıda karıştırılır. Bu şekilde 10–2 seyrelti elde edilir. Buradan bir başka steril pipet ile 1 mL alınıp diğer tüpe aktarılır ve yine mekanik tüp karıştırıcıda karıştırılır. Bu tüp ise 10–3 seyreltidir. Bir başka homojenizasyon yöntemi, gıdayı kum ile ezmektir. İçinde steril kum ve seyreltme çözeltisi bulunan laboratuvar tipi porselen havanlarda gıda ezilerek ilk seyrelti yapılır. Sonra havan kendi halinde 5– 10 dakika tutularak, kum ve katı parçacıkların çökmesi beklenir ve yukarıda açıklandığı şekilde steril bir pipet ile 10 mL alınıp, steril bir boş tüpe aktarılır. Peynir gibi gıdalar için kullanılabilen bu uygulamada seyreltme çözeltisinin tamamı havana konulursa iyi bir ezme yapılmayabilir. Bu nedenle, önce seyreltme çözeltisinden yeteri kadar kısım havana ilave edilir, homojenizasyon bittikten sonra çözeltinin kalan kısmı da eklenir ve karıştırılır. Seyreltme işlemi yapıldıktan sonra tercihen 15 dakika içinde ekim işlemi bitirilmiş olmalıdır. Bu süre uzarsa, koliformlar gibi hızlı çoğalan bakteriler sayılarını artırabilir. Homojenizasyon aşamasından itibaren ekime kadar geçen süre en çok 30 dakika olarak verilmektedir. Seyreltme Çözeltileri Genel amaçlı seyreltme çözeltisi olarak “Serum Fizyolojik” (%0,85 NaCl) yaygın kullanım alanı bulmuşsa da, bugün ISO 6887’ye göre formülü Serum Fizyolojik (%0,85) + Pepton (%0,1) olan “Maximum Recovery Diluent” kullanılmaktadır. Bu çözelti “pepton–tuz (saline–peptone)” olarak da anılmaktadır. Yine ISO 6887’ye göre ‘’%0,1 pepton çözeltisi’’ ile “Tamponlanmış Peptonlu Su” seyreltme amacı ile kullanılmaktadır. Başta peynirler olmak üzere süt ürünlerinin mikrobiyolojik analizinde, seyreltme sıvısı olarak ¼ kuvvetinde Ringer çözeltisi kullanılmalıdır. Peynirlerde %2 sodyum sitrat çözeltisi, ISO 6887’de seyreltme çözeltisi olarak verilmektedir.
Yağ oranı yüksek örneklerin homojenizasyonu için Tween 80 (Merck 8.22187) kullanılabilir. Bu amaçla seyreltme sıvısı içine (sterilizasyon öncesinde) %1 oranında Tween 80 katılması, özellikle krema gibi çok yağlı süt ürünleri için önerilmektedir. 2. BESİYERLERİ Besiyeri Bileşimine Giren Maddeler Besiyerleri hazırlanırken amaç, hedef organizmanın gelişmesini optimize edecek konsantrasyonlarda gerekli besin maddelerinin dengelenmiş karışımını sağlamaktır. Bütün besin öğelerini oldukça fazla miktarda sağlayarak, olabildiğince zengin bir besiyeri yapma yaklaşımı ile optimal besiyeri elde edilemez. Örneğin, aminoasitlerin dengelenmemesi ve bir amino asidin fazla olması, ilişkili bir amino asidin gelişme için kullanımını baskılayabilir. Glikoz dahil olmak üzere tüm besin öğeleri, konsantrasyonları arttıkça baskılayıcı etki yaparlar. Besiyeri bileşimine giren maddeler gelişme açısından; a)Gelişme için gerekli olanlar, b)İnhibitörler, c)Diğerleri olmak üzere 3 gruba ayrılabilir. Gelişme için gerekli olan maddeler doğrudan mikroorganizmaların beslenme şekilleri ile ilgilidir ve besiyeri içinde bir anlamda zorunlu olarak bulunur. İnhibitörler ise gelişmesi istenmeyen mikroorganizmalar için gerektiğinde selektif besiyerlerine ilave edilir. Bunların dışında yine gerektiğinde indikatörler, jelleştiriciler vb. pek çok madde de besiyeri bileşimine girer. 1. Su Besiyeri hazırlamada kullanılan suyun damıtma veya deiyonizasyon ile taze hazırlanmış olması, başta bakır olmak üzere toksik metalleri içermemesi gerekir. İyon değiştirici reçineden geçirilerek elde edilen deiyonize (demineralize) su kullanıldığında bunun içinde yüksek sayıda mikroorganizma bulunabileceği dikkate alınmalıdır. Damıtık (distile) su için en ideali, cam sistemlerden elde edilen suyun kullanılmasıdır. Gerek deiyonize gerek damıtık su elde edilmesinde saf su sisteminin ve benzer şekilde saf suyun depolandığı kapların belirli aralıklarla temizlenmesi gerekir. Bu kaplarda zamanla alg gelişimi olabilir ve alg metabolitleri bazı duyarlı mikroorganizmaların gelişimini baskılayabilir. 2. Peptonlar Pepton terimi, proteinlerin hidrolizi ile elde edilen ürünlere verilen genel isimdir. Bu terim ilk kez R. Koch’un çalışma arkadaşlarından Nägeli tarafından 1880 yılında kullanılmıştır. Nägeli, kemoorganotrof mikroorganizmaların kısmen parçalanmış (hazmedilmiş, sindirilmiş) protein içeren besiyerinde iyi geliştiklerini açıklayan ilk bilim adamıdır. Yaşayan tüm hücrelerde olduğu gibi mikroorganizmalar da azot, karbon, tuzlar ve diğer besin maddelerine gereksinim duyarlar. İstisnalar dışında, mikroorganizma gruplarının oldukça büyük bir bölümü, proteinleri azot kaynağı
olarak kolaylıkla kullanamaz. Bu nedenle azotlu bileşikleri, çok daha kolay kullanabildikleri protein hidrolizatlarından sağlar. Peptonlar sadece azot değil, karbon kaynağı olarak da mikroorganizmalar tarafından kullanılır. Bunun yanında, peptonların bileşiminde bulunan bazı aminoasitler ve vitaminler de bazı mikroorganizmalar için gelişme faktörü olarak oldukça önemli işlev görür. Proteinler; kuvvetli asitler ve kuvvetli alkaliler ile ya da enzimatik olarak temel bileşenleri olan peptit ve aminoasitlere ayrışır. Bu amaçla en çok kullanılan proteolitik enzimler papain, pepsin ve pankreatindir. Peptonlar, birçok ticari firma tarafından çeşitli hayvansal dokulardan, sütten ve soyadan farklı yöntemlerle elde edilir ve farklı ticari isimlerle pazarlanır ve/veya dehidre besiyerleri içine katılır. 3. Maya Ekstraktı Maya ekstraktı (maya özütü, yeast extract), proteolitik olarak otolize edilmiş (parçalanmış) bira mayasının (Saccharomyces cerevisiae) sulu ekstraksiyonu ile elde edilir. Özellikle, yüksek B kompleks vitamini konsantrasyonu sayesinde çoğu mikroorganizmanın iyi bir şekilde gelişmesini sağlar. Bileşimindeki aminoasitler, peptitler, vitaminler, karbohidratlar ve mineraller nedeniyle pek çok mikrobiyolojik çalışmada besiyeri katkısı olarak kullanılır. Karbohidrat içermesi nedeniyle karbohidratlardan asit oluşturma testlerinde kullanılmaz. 4. Et Ekstraktı Et ekstraktı (et özütü, meat extract), genellikle yağı ve tendonları ayrılmış, ekstraksiyon öncesi hafifçe hidrolize edilmiş etten elde edilir. Karbohidrat içermez. Bu nedenle karbohidratlardan asit oluşturma testlerinde kullanılabilir. Çeşitli besiyerlerinde et peptonlarının yerini alabilir. 5. Malt Ekstraktı Malt ekstraktı (malt özütü, malt extract), biralık arpanın çimlendirilmesi ve kavrulması ile elde edilen malttan üretilir. Başta maltoz olmak üzere, çeşitli karbohidratların yüksek konsantrasyonuna bağlı olarak maya ve küflerin geliştirilmesi için kullanılır. %1,7 konsantrasyondaki çözeltisi maya ve küflerin geliştirilmesi için uygun bir besiyeridir. Gerekirse bu çözelti çeşitli peptonlar ile desteklenebilir ve/veya asitlendirilebilir ve/veya agar ve pepton eklenerek Malt Extract Agar şeklinde katı besiyeri olarak kullanılabilir. 6. Beyin ve Kalp Ekstraktı Beyin ekstraktı (brain extract) ve kalp ekstraktı (heart extract) streptokoklar, pneumokoklar, meningokoklar, gonokoklar vb. gibi zor gelişen (fastidious) patojen bakterilerin geliştirilmesi için Brain Heart Broth ve Brain Heart Infusion gibi isimlerle anılan besiyerlerinin bileşimine katılır. Ayrıca, çeşitli toksin testleri için patojenlerin bu besiyerinde geliştirilmesi önerilmektedir. 7. Agar
Besiyerlerinin katı hale getirilmesi için en çok kullanılan jelleştiricidir. Çoğu kez diğer agarlı besiyerleri ile karıştırılmaması için “agar agar” olarak anılır. Agar bir poligalaktozid olup, “Agarophytes” olarak adlandırılan bazı kırmızı deniz yosunlarından (Gelidium, Eucheuma, Gracilaria, Acanthopeltis, Ahnfeltia, Pterocladia türleri) elde edilir. Bazı hidroksil grupları sülfürik asit ile esterleştirilmiştir. Mikrobiyolojik kullanım amacıyla en iyi kalitedeki agar Gelidium türünden elde edilir. Gıda sanayisinde de jelleştirici olarak kullanılan agar, yeteri kadar saf olmadığı için mikrobiyolojik analizlerde kullanılamaz. Agarın katılaştırma (jelleştirme) özelliğini bileşimindeki D-galakton sağlar. Bileşiminde ayrıca inorganik tuzlar, çok az miktarda protein benzeri maddeler ve eser miktarda yağ vardır. Mikrobiyolojide kullanılan agarlar özel olarak saflaştırılarak antimikrobiyel maddeler ve pigmentlerden arındırılır. Bileşiminde bulunan agaroz ve agaropektin adlı iki polisakkarit, agarın etkisini belirler. Agaroz, agarın yüksek jelleştirme özelliğinden sorumlu iken, agaropektin viskoz özellik verir. Agardaki agaroz/agaropektin oranı ham maddeye göre değişir. Agardaki agaroz oranı en çok %75’e kadar çıkabilir. Özel çalışmalarda saf agaroz kullanılır. Agar, besiyeri bileşimine sadece jelleştirici olarak katılır. Uzun ve dallanmış zincir yapısı nedeniyle -bir kaç istisna dışında- mikroorganizmalar tarafından besin maddesi olarak kullanılamaz. 8. Karbohidratlar Bazı besiyerlerinin bileşimine bakteriler için enerji ve karbon kaynağı olarak katılan karbohidratların bir başka kullanım şekli karbohidratlardan asit oluşturmaya dayalı identifikasyon testleridir Besiyeri bileşiminde karbon kaynağı olarak en çok kullanılan karbohidratlar glikoz, laktoz ve sakkarozdur. Bunlardan glikoz pek çok bakteri tarafından kullanılabildiği için, daha çok genel besiyeri bileşimlerinde yer alır. Adonitol, arabinoz, dekstroz (glikoz), dulsitol, galaktoz, inositol, inulin, laktoz, levuloz (früktoz), maltoz, mannitol, mannoz, melezitoz, melibiyoz, nişasta, rafinoz, ramnoz, sakkaroz (sukroz), salisin, sellobiyoz, selüloz, sorbitol, trehaloz ve ksiloz çeşitli karbohidrat testlerinde kullanılmak üzere çoğunlukla sıvı ya da katı besiyerlerine katılabilmektedir. Glikoz, laktoz sakkaroz, mannitol gibi bazı karbohidratlar çeşitli katı besiyerlerine yine karbohidratlardan asit oluşumunun izlenmesi ve buna göre koloninin ön identifikasyonu amacı ile katılır. Koliform grubu bakterilerin geliştirileceği besiyerlerinin hemen hepsinde karbon kaynağı olarak laktoz kullanılır. Koliformların analizi için hazırlanmış sıvı besiyerlerinde laktozdan gaz oluşumu bu grup için belirleyicidir. Gaz çıkışı basit olarak Durham tüpü ile belirlenir Nişasta kullanımı (hidrolizi) bazı bakteriler için tipik olduğundan çeşitli özel besiyerlerinin bileşimine katılır. Genel olarak karbohidratların çözelti halinde filtrasyon ile sterilize edilmesi önerilir. Çeşitli besiyerlerinin bileşimine katılan glikoz, laktoz, sakkaroz gibi şekerler besiyeri ile birlikte otoklavda da sterilize edilebilir. 9. Tuz
Aksine bir belirtme yoksa “tuz” denilince sodyum klorür anlaşılır. Çoğu besiyerinin bileşimine izotonik bir ortam oluşturmak için katılır. %0,85 NaCl, serum fizyolojik adı ile seyreltme çözeltisi olarak yaygın olarak kullanılır. Klinik birimlerde bu ad ile bilinen çözelti de budur ve insan vücudu için de aynı şekilde izotonik denge oluşturur. Tuza dayanıklı (halotolerant) ve tuz seven (halofil) bakterilerin selektif izolasyonu için yüksek konsantrasyonlarda özel besiyerlerinin bileşimine katılır. 10. Tampon Maddeler Mikroorganizmalar genel olarak nötr ve nötre yakın pH’larda iyi gelişir. Bazı mikroorganizmalar alkali pH’ları yeğlerken (örneğin Rhizobium bakterileri), bazıları (örneğin mayalar, küfler, asidofilik bakteriler) asidik ortamları severler. Bir besiyerinde elden geldiğince çok sayıda mikroorganizma geliştirilmesi isteniyorsa pH nötre yakın değerde olmalıdır. Tersine olarak geliştirilmesi istenen mikroorganizma yüksek asitliğe veya yüksek alkaliliğe dirençli ise, besiyeri pH’sı bu mikroorganizmanın gelişebileceği pH’ya ayarlanmalıdır. Asitlik/alkalilik, besiyerlerine selektivite kazandırmak amacıyla, çok kolay ve dolayısıyla çok yaygın olarak kullanılan bir faktördür. Örneğin maya ve küflerin, asidofilik bakterilerin geliştirileceği ortamlarda pH düşürülerek pek çok bakterinin gelişmesi kayda değer ölçüde baskılanır. Metabolizmaya bağlı olarak besiyeri pH’sında değişmeler meydana gelir. Sadece pepton olan ortamda geliştirilen bakteriler pH’yı yükseltir. Buna karşın bileşiminde pepton yanında karbohidrat da olan besiyerinde karbohidrat tükenmediği sürece pH düşer. Bazı çalışmalarda inkübasyon sırasında pH’nın değişmesi, geliştirilmesi istenen mikroorganizmaya zarar vereceği için istenmez. pH değişiminin minimumda tutulması amacıyla besiyerine çeşitli tampon maddeler ilave edilir. BESİYERİ ÇEŞİTLERİ 1. Genel Besiyerleri Herhangi bir inhibitör madde içermeyen, besin maddelerince yeterli veya zengin, herhangi bir mikroorganizma grubunun gelişmesini özel olarak desteklemeyen, bazı zor gelişenlerin de dahil olduğu çok sayıda mikroorganizmanın gelişmesini sağlayan besiyerleridir.
Bu grupta değerlendirilen besiyerleri genel olarak bakteriler için kullanılır. Bununla beraber, bu besiyerlerinde maya ve küfler de gelişebilir. Benzer şekilde E. coli fajları ile ilgili bir çalışmada genel nitelikli bir besiyeri kullanılabilir. Genel besiyerleri başlıca toplam mezofil aerob bakteri sayımı, toplam psikrofil aerob bakteri sayımı, bozulma ya da hastalık etmeninin ön izolasyonu gibi amaçlar için kullanılır. Buna göre; -Başta gıda maddeleri olmak üzere pek çok örnekte “toplam mezofil aerob bakteri sayısı” ile “toplam psikrofil aerob bakteri sayısı” tayinleri önemli kalite kriterleridir. Toplam mezofil aerob bakteri sayısından kasıt 28–30 C’da (kimi kaynaklara ve amaca göre 35–37 C’da) gelişebilen aerob bakterilerin sayısıdır. 2. Selektif Besiyerleri Selektif besiyerleri, karışık bir mikrobiyel floradan gelişmesi istenmeyenleri olabildiğince fazla baskılamak, ancak gelişmesi istenenler için -tersine olarak- minimum düzeyde olumsuz etki yapmak üzere formülize edilir. Bu amaçla genellikle çeşitli inhibitör maddeler kullanılır. 3. Diferansiyel (Ayırt Edici, Fark Ettirici) Besiyerleri Diferansiyel besiyerlerinde gelişmesi istenen mikroorganizma yanında diğer mikroorganizmalar da gelişebilir. Ancak başta koloni morfolojisi olmak üzere çeşitli farklılıklar ile hedef mikroorganizma diğerlerinden ayrılır. Bu tanımlamaya göre diferansiyel besiyerleri, zayıf ve orta güçte selektivite gösteren selektif besiyerlerinin modifikasyonu olarak nitelendirilebilir. Ayırt edici koloni özelliği, çeşitli pH indikatörleri, boya maddeleri, indirgeyiciler, diğer indikatörler vb. maddelerin besiyerine ilavesi ile yapılır. Pek çok mikroorganizma belirli bir karbohidratı kullanırken asit oluşturur ve bu asitlik pH indikatörü ile kolayca belirlenebilir. Ayrıca mikroorganizmanın jelatinaz, lipaz, lesitinaz vb. enzim aktiviteleri besiyerinde oluşan berrak zonlar ile belirlenebilir. 4. Zenginleştirme Besiyerleri Karışık bir mikroflora içinde hedeflenen bir mikroorganizmayı geliştirmek, sayısını artırmak, hücrede olası hasarların giderilmesini sağlamak vb. amaçlarla kullanılan zenginleştirme besiyerleri, ön zenginleştirme besiyerleri ve selektif zenginleştirme besiyerleri olarak 2 alt gruba ayrılır. Ön zenginleştirme besiyerleri genel olarak hasar görmüş (yaralanmış, stres altında) mikroorganizmaların aktivitelerini kazanmaları için kullanılan, bileşiminde inhibitör içermeyen, dolayısı ile aktivite kazanması istenen mikroorganizma yanında refakatçi mikrofloran ın da gelişmesini sağlayan sıvı besiyerleridir. Buna göre “özel amaçla kullanılan genel besiyerleri” olarak da nitelendirilebilirler. Bu besiyerlerine en tipik örnek, gıdalarda Salmonella aranmasına yönelik çalışmaların ilk aşaması olan ön zenginleştirmede kullanılan “Tamponlanmış Peptonlu Su” besiyeridir. Bileşimi 10 g/L et peptonu, 5 g/L NaCl ve 10 g/L fosfat tampon olan bu besiyerinde Salmonella yanında ortamdaki diğer bakteriler de kolaylıkla ve iyi bir şekilde gelişebilir.
Selektif zenginleştirme besiyerleri ise özel amaçla kullanılan selektif sıvı besiyerleridir. Bunlara en tipik örnekler Listeria ve Salmnella aranmasında kullanılan besiyerleridir. Selektif zenginleştirme aşamasında karışık kültür olarak bulunan bakterilerden gelişmesi istenmeyenler, çeşitli selektif inhibitörlerin kullanımı ile kısmen ya da tümüyle engellenir. Selektif zenginleştirme aşamasını genellikle selektif bir katı besiyerine sürme yapılarak aranan bakterinin selektif izolasyonu aşaması izler. Buna göre selektif zenginleştirmenin amacı, selektif izolasyonda başarı şansını artırmak için aranan bakterinin karışık kültür içindeki sayısını artırmaktır. 5. İdentifikasyon Besiyerleri Selektif ve diferansiyel besiyerlerinin ön identifikasyonda kullanılabileceğine yukarıda değinilmiştir. Tam selektif bir besiyerinde gelişen bir mikroorganizmanın identifikasyonu cins ve hatta tür bazında tamamlanabilir. Diferansiyel besiyerlerinde de aynı durum geçerlidir. MUG içeren bir selektif katı besiyerinde floresan veren koloni E. coli olarak değerlendirilir. Bir mikroorganizma izolatının tanımlanması için halen en çok kullanılan testler biyokimyasal nitelikli olanlardır. İdentifikasyon besiyerleri, mikroorganizmanın belirli bir besin maddesini (örneğin, laktoz) kullanıp kullanmadığının saptanması, belirli bir besin maddesinden metabolizma sonunda tayin edilebilecek metabolitleri (örneğin, triptofandan indol) oluşturup oluşturmadığının belirlenmesi vb. amaçlar ile kullanılır. Bakterinin hareketli olup olmadığının saptanması amacıyla kullanılan yarı katı besiyerleri de bu gruba dahil edilmektedir. Yarı katıolarak Nutrient Agar gibi genel besiyeri ya da SIM Medium gibi kombine bir besiyeri kullanılabilir. Besiyerlerinin Hazırlanması Laboratuvarlarda kullanılan pek çok besiyeri, dehidre formdan hazırlanır. Bu amaçla, gereken miktar dehidre besiyeri tartılıp, üzerine damıtık su eklenir ve gerekli ise başka kaplara (örneğin tüplere) dağıtılıp, sterilize edilir. Bazı besiyerlerinin formülden hazırlanmasıgerektiği gibi, selektif besiyerlerinin bir kısmına sterilizasyon sonrasında çeşitli katkılar ilave edilir. Besiyerlerinin bir kısmı otoklavda, bir kısmı sadece kaynatılarak sterilize edilir. Bir diğer deyiş ile, kullanılan besiyerlerine göre değişmek üzere bunların hazırlanma şekillerinde kayda değer ölçüde farklar vardır. Hatta bazen aynı besiyerinin 2 farklı ticari markası arasında bile hazırlanma farkı görülebilmektedir. ISO gibi uluslararası bir kuruluşta yapılan talimat değişikliği, besiyeri formülüne ve dolayısı ile hazırlanış şekline de yansımaktadır. Bu gibi nedenlerle aynı marka kullanılıyor olsa da, besiyeri ambalajıüzerindeki bilgiler her zaman çok dikkatlice okunmalıdır. Her besiyeri kutusunda, katalogunda ya da prospektüsünde, o besiyerinin nasıl hazırlanması gerektiği yer almaktadır. 1. Cam Malzeme
Besiyeri hazırlamada kullanılacak cam malzemenin çok iyi bir şekilde yıkanmış ve durulanmış, besiyeri hazırlamada kullanılan kalitede sudan geçirilmiş ve yeterince kurutulmuşolması gerekmektedir. Kırık ve çatlak cam malzeme kullanılmamalıdır. Besiyerinin hazırlanacağı cam malzemenin yeterli büyüklükte olması çoğu kere ihmal edilen, ancak çok önemli bir ayrıntıdır. Cam kapların hacmi mutlaka yeterli bir karıştırma sağlanacak ölçüde olmalıdır. 2.Tartım ve Eritme Tartımın yapılacağı terazinin duyarlılığı, besiyerinin hazırlanış şekli ile doğrudan ilgilidir. Genel olarak günlük kullanımda 0,1 gram duyarlılıktaki terazi kullanımı yeterlidir. Bileşimden giderek az miktarda hazırlanan besiyerlerinde bu duyarlılık yeterli olmaz ise seyreltme tekniği uygulanabilir ya da daha duyarlı bir terazi kullanılabilir. Özellikle bileşimden hazırlanarak çok düşük miktarda tartım yapılacak ise, terazinin kalibrasyonuna özellikle önem verilmelidir. Tartım için özel tartım kayıkçıkları ya da küçük beherler kullan ılmalı, doğrudan erlen ya dabalona tartımdan olabildiğince kaçınılmalıdır. Özellikle bileşimden hazırlamalarda tartım sırasında her madde için temiz spatül (kaşık) kullanılması, besiyeri ve/veya besiyeri bileşenlerinin kapakları açıldıktan sonra hata yapmamaya özen gösterilerek tartımın elden geldiğince çabuk bitirilmesi ve besiyeri kapağının sıkıca kapatılması gerekir. Tartım sırasındabesiyeri ve/veya bileşenlerinin çok az da olsa toz bulutu oluşturmamasına özen gösterilmeli, eğer toz bulutu oluştu ise kesinlikle solunulmamalıdır. 3. pH Ayarlama İster ticari olarak hazırlanmış dehidre besiyeri hazırlama katalogları ve prospektüslerinde isterbilimsel çalışmalara yönelik literatür bilgisinde olsun, besiyeri pH’sından kasıt,sterilizasyon sonu ve oda sıcaklığındaki (25 oC) pH’dır. Usulüne uygun olarak depolanmış ve raf ömrü bitmemiş ticari dehidre besiyerlerinde nötral su ve temiz cam malzeme kullanılması, besiyerinin doğru hazırlanması ve sterilizasyonun sulandırmadan sonra vakit geçirmeden yapılması ile besiyeri pH’sında bir sorun çıkmaz. Besiyeri pH’sının sterilizasyon öncesi ayarlanması yanlış olur. Çünkü sterilizasyon sonrasında pH az da olsa değişir. Dolayısı ile besiyeri pH’sının sterilizasyon öncesinde ayarlanması, sterilizasyon sonrasında yanlış pH elde edilmesine yol açar. Sterilizasyon sonrasında pH ayarlanması gerekli ise, aseptik koşullarda alınacak belirli bir hacimdeki besiyerinde titrasyon ile pH ayarlaması yapılır, basit orantı ile asıl kaptakbesiyerine ilave edilecek asit ya da alkali miktarı hesaplanır. 4. Katkıların İlavesi Çeşitli antibiyotikler, vitaminler, kan ve yumurta sarısı başta olmak üzere besiyeri bileşimine giren bazı maddeler otoklavlama sırasında tahrip olur ya da yüksek sıcaklıkta bileşimdeki maddeler birbirleri ile reaksiyona girer. Bunun en tipik örneği asit–agar etkileşimidir. Bu gibimaddeler otoklav sonrasında bazal besiyerine ilave edilir. Sıvı besiyeri için katkıların ilavesinde herhangi bir sorun yoktur. Besiyeri ve katkı maddeleri oda sıcaklığında aseptik olarak karıştırılır. 5. Petri Kutularına Döküm
Otoklav veya daha geniş tarifi ile ısıl işlem ile sterilizasyon sonrası agarlı besiyerleri çoğunlukla Petri kutularına dökülerek kullanılır. Besiyeri dökülmeden önce, homojenliğinden emin olmak için çalkalanmalıdır. Agarlı besiyerlerinin diğer kullanılış şekilleri arasında tüplerde yatık veya dik agar ile Roux şişelerinde kullanım sayılabilir. Bu diğer kullanım şekillerinde agarlı besiyeri genellikle anılan kaplarda sterilize edilir. 3. KÜLTÜREL SAYIM YÖNTEMLERİ 1. Koloni Sayımı Bu yöntemlerin prensibi mikroorganizmanın katı besiyerinde koloni oluşturması, bu kolonilerin sayılarak örnekteki mikroorganizma sayısının hesaplanmasıdır. 1.1. Dökme Yöntemi o Dökme yönteminde 1 ml örnek steril petri kutusuna pipetlenir, üzerine 45 C ‘a kadar soğutulmuş agarlı besiyerinden yaklaşık 15 ml dökülür, besiyeri ile örnek karıştırılır, besiyeri katılaştıktan sonra petri kutuları inkübasyona bırakılır. Bu yöntemin avantajı ekim yapılacak tüpten 1 ml pipetlendiği için yayma yöntemine göre 10 misli daha az mikroorganizma içeren örneklerde sayım yapılabilmesidir. Dezavantajları ise sıcak dökülen besiyerinin mikroorganizmaya zarar verme olasılığının yüksek olması, besiyerinin petrilere ekim yapılıncaya kadar erimiş halde (50 oC su banyosunda) tutulması ve bunun besiyeri üzerine olumsuz etkisi, herhangi bir ekim hatasında yedek besiyeri kullanımındaki sıkıntılar, mikroorganizmaların petri kutusunun tabanına veya besiyeri yüzeyine yakın olmalarına bağlı olarak oksijenden farklı düzeyde faydalanmaları ve dolayısı ile farklı düzeyde gelişmeleridir. 1.2. Yayma Yöntemi Yayma yönteminin esası, önceden petri kutularına dökülüp katılaştırılmış (hatta bu şekilde stoklanmış) ve belirli bir düzeyde kurutulmuş besiyerleri üzerine 0,1 ml örnek aktarılarak drigalski spatülü denilen kıvrık bir cam baget ile bu miktarın besiyeri yüzeyine yayılmasıdır. Yukarıda dökme yöntemi için verilen tüm dezavantajlar bu yöntemde avantaj, avantaj olarak verilen ise dezavantajdır. Bu yöntemin uygulanmasında dikkat edilmesi gereken hususlar drigalski spatülünün sterilize edildiği alkol çözeltisinin (%70 v/v) sürekli olarak yenilenme ve kontrol gerekliliği, alkol ile drigalski spatülünün temas süresinin 5-10 dakikadan az olmaması gerektiği ve buna göre yeterli sayıda spatül bulundurulması, alkolden çıkarılan spatülün bunzen beki alevinden geçirilme nedeninin ısı ile sterilizasyon değil sadece alkolü uzaklaştırmak olduğunun unutulmaması, beherdeki alkolün alev almasının önlenmesidir. Gıda mikrobiyolojisi laboratuvarında en yaygın olarak kullanılan ve kullanımı önerilen yöntem budur. 2. Koloni Sayısının Hesaplanması Hangi yöntem kullanılırsa kullanılsın inkübasyon bitiminde petri kutularında sayım vakit geçirmeden yapılmalıdır. Önceleri 30-300 arasındaki koloni içeren seyreltilerdeki ekimler dikkate alınır iken, son zamanlarda ardışık iki seyreltiden yapılan ekim sonuçlarından hareketle ve ağırlıklı aritmetik ortalama ile örnekteki sayı hesaplanmaktadır.
3. En Muhtemel Sayı (EMS) Yöntemi Yöntemin prensibi ardışık 3 seyreltiden sıvı besiyerlerine ekim yapıp inkübasyon sonunda gelişme olanları pozitif olarak değerlendirmek ve istatistik yöntemlerle elde edilmiş tablolardan yararlanılarak örnekteki sayıyı hesaplamaktır. Yöntemin “En Muhtemel Sayı (Most Probable Number ; MPN) olarak adlandırılma nedeni yukarıda da belirtildiği gibi örnekteki mikroorganizma sayısının istatistik şekilde elde edilmiş tablolardan yararlanılarak hesaplanmasıdır. EMS yöntemi tüp dilüsyon yönteminin bir modifikasyonudur. Kaynaklar: Halkman, K. Gıda Mikrobiyolojisi ve Uygulamaları, 2005. Ankara Üniversitesi Gıda Mühendisliği Bölümü “ISO 7218 TS 7894 sayılı Gıda ve Hayvan Yemlerinin Mikrobiyolojisi- Mikrobiyolojik Muayeneler İçin Genel Kurallar” ve “ISO 6887 TS 6235 sayılı Gıda ve Hayvan Yemleri Mikrobiyolojisi- Deney Numunelerinin Başlangıç Süspansiyonunun ve Ondalık Seyreltilerinin Hazırlanması İçin Genel Kurallar Şebnem Ö.Budak
…