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630 | Las variantes gen茅ticas funcionales en DC-SIGNR est谩n asociadas con la transmisi贸n del VIH-1 de madre a hijohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2752805/Boily-Larouche, Genevi猫ve; Iscache, Anne-Laure; Zijenah, Lynn S.; Humphrey, Jean H.; Mouland, Andrew J.; Ward, Brian J.; Roger, Michel2009-10-07DOI:10.1371/journal.pone.0007211Licencia:cc-byAbstract: ANTECEDENTES: La transmisi贸n de madre a hijo (MTCT) es la principal causa de infecci贸n por VIH-1 en ni帽os de todo el mundo. Dado que el receptor de lectina de tipo C, el receptor de lectina dendr铆tico espec铆fico para c茅lulas ICAM no relacionado con la integraci贸n (DC-SIGNR, tambi茅n conocido como CD209L o ganglio hep谩tico/linfa-nodo espec铆fico para ICAM no integrador (L-SIGN)), puede interactuar con pat贸genos incluyendo el VIH-1 y se expresa en la interfaz materno-fetal, se hipotetiza que podr铆a influir en la TCM del VIH-1. M脡TODOS Y INDICACIONES: Para investigar el papel potencial de DC-SIGNR en la TCM del VIH-1, realizamos un estudio de asociaci贸n gen茅tica de DC-SIGNR en una cohorte bien caracterizada de 197 madres infectadas por el VIH y sus beb茅s reclutados en Harare, Zimbabwe. Los lactantes que albergaban dos copias de los haplotipos DC-SIGNR H1 y/o H3 (H1-H1, H1-H3, H3-H3) tuvieron un aumento de 3,6 veces el riesgo de infecci贸n por VIH-1 en el 煤tero (UI) (P = 0,013) y un aumento de 5,7 veces el riesgo de infecci贸n por VIH-1 en el intraparto (IP) (P = 0,025) despu茅s de ajustarse para varios factores maternos. Los haplotipos H1 y H3 implicados comparten dos polimorfismos de nucle贸tidos 煤nicos (SNP) en la regi贸n promotora (p-198A) e intron 2 (int2-180A) que se asociaron con un aumento del riesgo de ambas UI (P = 0,045 y P = 0,003, respectivamente) e IP (P = 0,025, para la infecci贸n por VIH-1) La variante En los lactantes homocigotos H1 con mutaciones tanto p-198A como int2-180A, observamos una disminuci贸n de 4 veces en el nivel de transcripciones DC-SIGNR placentarias, afectando desproporcionadamente la expresi贸n de isoformas ligadas a la membrana en comparaci贸n con las no portadoras infantiles (P = 0,011). CONCLUSI脫N: Estos resultados sugieren que DC-SIGNR juega un papel crucial en la TCM del VIH-1 y que la expresi贸n DC-SIGNR placentaria alterada aumenta el riesgo de transmisi贸n. Texto: Sin intervenciones espec铆ficas, la tasa de transmisi贸n del VIH-1 de madre a hijo (TCMM) es de aproximadamente 15-45% [1]. ONUSIDA estima que solo el a帽o pasado, m谩s de 400.000 ni帽os fueron infectados en todo el mundo, principalmente a trav茅s de la TCM y el 90% de ellos viv铆an en el 脕frica subsahariana. En los pa铆ses m谩s afectados, como Zimbabwe, el La TCM del VIH-1 puede ocurrir durante el embarazo (in utero, UI), el parto (intraparto, IP) o la lactancia materna (postparto, PP). La alta carga viral materna, el bajo recuento de c茅lulas CD4, el parto vaginal, la baja edad gestacional se han identificado como factores independientes asociados con la TCM del VIH-1 [1]. Aunque los antirretrovirales pueden reducir la TCM al 2%, el acceso limitado a diagn贸sticos y medicamentos oportunos en muchos pa铆ses en desarrollo limita el impacto potencial de esta estrategia. Una mejor comprensi贸n de los mecanismos que act煤an en la interfaz materno-fetal es crucial para el dise帽o de intervenciones alternativas a la terapia antirretroviral para la prevenci贸n de la transmisi贸n. Las c茅lulas dentr铆ticas espec铆ficas de la ICAM no relacionadas con la integraci贸n (DC-SIGNR, tambi茅n conocido como CD209L o ICAM no integrador (L-SIGN)) pueden interactuar con una pl茅tora de pat贸genos incluyendo VIH-1 y se expresa en c茅lulas endoteliales capilares placentarias [2]. DC-SIGNR se organiza en tres dominios distintos, una cola citopl谩smica N-terminal, una regi贸n de repetici贸n que contiene siete repeticiones de 23 amino谩cidos y un dominio C-terminal implicado en la uni贸n de pat贸genos. El empalme alternativo del gen DC-SIGNR conduce a la producci贸n de un repertorio de isoformas altamente diversificadas que incluye isoformas asociadas a la membrana y solubles [3]. Se ha propuesto que la interacci贸n entre DC-SIGNR y VIH-1 podr铆a mejorar la transferencia viral a otros tipos de c茅lulas sensibles [2] pero DC-SIGNR tambi茅n puede internalizar y mediar la degradaci贸n dependiente de proteasomas de virus [4] que pueden afectar de manera diferente el resultado de la infecci贸n. Dada la presencia de DC-SIGNR en la interfaz materno-fetal y su interacci贸n con el VIH-1, se hizo una hip贸tesis de que podr铆a influir en la TCM del VIH-1. Para investigar el papel potencial de DC-SIGNR en la TCM del VIH-1, se llev贸 a cabo un estudio de asociaci贸n gen茅tica de DC-SIGNR en una cohorte bien caracterizada de madres infectadas por el VIH y sus beb茅s reclutados en Zimbabwe, y se identificaron variantes espec铆ficas de DC-SIGNR asociadas con el aumento de los riesgos de transmisi贸n del VIH. Adem谩s, caracterizamos el impacto funcional de estas variantes gen茅ticas en la expresi贸n DC-SIGNR y demostramos que afectan tanto al nivel como al tipo de transcripciones DC-SIGNR producidas en la placenta. Las muestras consistieron en extractos de ADN almacenados obtenidos de 197 parejas madre-hijo co-inscritas inmediatamente despu茅s del parto en el ensayo de suplementaci贸n de vitamina A de ZVITAMBO (Harare, Zimbabwe) y seguidos a 6 semanas e intervalos de 3 meses hasta 24 meses. El proyecto ZVITAMBO fue un ensayo cl铆nico aleatorizado controlado con placebo que incluy贸 a 14.110 parejas madre-hijo, entre noviembre de 1997 y enero de 2000, con el objetivo principal de investigar el impacto de la suplementaci贸n inmediata de vitamina A de postparto en la TCM del VIH-1. Las muestras utilizadas en el presente estudio fueron de parejas madre-hijo asignadas aleatoriamente al grupo placebo del proyecto ZVI La profilaxis antirretroviral para mujeres embarazadas VIH-1 positivas no estaba disponible en el sector p煤blico de Harare durante el reclutamiento de pacientes de ZVITAMBO. Las muestras fueron obtenidas consecutivamente de dos grupos: 97 parejas de madres VIH-1 positivas/hijos VIH-1 positivos y 100 parejas de madres VIH-1 positivas/ni帽os VIH-negativos. El estado serol贸gico de la madre fue determinado por ELISA y confirmado por Western Blot. Se consider贸 que los lactantes estaban infectados si eran seropositivos a los 18 meses o mayores y ten铆an dos o m谩s resultados positivos de reacci贸n en cadena de la polimerasa del VIH-1-DNA (PCR) a edades m谩s tempranas. Se consider贸 que 100 ni帽os no estaban infectados por ser ELISA negativos a los 18 meses o mayores y tuvieron dos resultados negativos de PCR de ADN de muestras recogidas a una edad m谩s temprana. De los 97 ni帽os infectados por el VIH-1, 57 fueron infectados IU, 11 fueron infectados IP y 17 fueron infectados PP seg煤n los an谩lisis de PCR de muestras de sangre recolectadas al nacer, 6 semanas, 3 y 6 meses de edad y seg煤n las siguientes definiciones adaptadas de Bryson y colegas [5]. Brevemente, los beb茅s con ADN PCR positivo al nacer fueron infectados IU. Los beb茅s con PCR negativo resultado de la muestra obtenida al nacer pero que se hicieron positivos por 6 semanas de edad fueron infectados IP. Los lactantes con resultados negativos de PCR al nacer y 6 semanas de edad pero que posteriormente se convirtieron en DNA PCR positivo fueron considerados infectados durante el per铆odo PP. En el an谩lisis de comparaci贸n de los 3 modos diferentes de TCM, 12 beb茅s infectados por el VIH-1 fueron excluidos porque los resultados de PCR no estaban disponibles a las 6 semanas de edad. M茅todos completos de reclutamiento, recolecci贸n de caracter铆sticas basales, procedimientos de laboratorio La variaci贸n de la secuencia de nucle贸tidos de todo el promotor, codificaci贸n y parte de las 39 regiones UTR del gen DC-SIGNR en la poblaci贸n del estudio se determin贸 previamente [7]. La reconstrucci贸n del haplotipo se realiz贸 utilizando el m茅todo estad铆stico Bayesiano implementado en FASE [8], versi贸n 2.1.1, utilizando polimorfismo nucle贸tido 煤nico (SNP) con una frecuencia m铆nima de alelos (MAF) del 2%. Aplicamos el algoritmo cinco veces, utilizando diferentes semillas generadas aleatoriamente, y se obtuvieron resultados consistentes a lo largo de las carreras (Figura 1 ). Quince SNPs con etiqueta de haplotipo (htSNPs) fueron identificados por el software HaploBlockFinder [9] con un MAF $5%. Estos htSNPs fueron genotipados en los 197 infantes mediante el an谩lisis de secuenciaci贸n PCR directo como hemos descrito El genotipo de regi贸n de repetici贸n DC-SIGNR 4 fue determinado por amplificaci贸n PCR seguida de migraci贸n en geles de agarosa del 1,5% [10]. Se analizaron secuencias de ADN en la regi贸n promotora con la interfaz TESS (http//:www.cbil.upenn.edu/tess) para sitios de uni贸n de factores de transcripci贸n putativos utilizando la base de datos TRANSFAC. Se realizaron ensayos de reporteros Luciferase utilizando vector pGL2-B谩sico para investigar el efecto funcional de mutaciones en la actividad promotora DC-SIGNR. El ADN gen贸mico de los sujetos homocigotos para las variantes promotoras y WT fue amplificado desde la posici贸n nucle贸tida 2715 a 21 y clonado entre los sitios de clonaci贸n m煤ltiple BglII y HindIII en el vector pGL2-Basico que alberga un gen luciferasa de luciferasa de reportero aguas abajo (Invitrogen Canada inc, Burlington, Canad谩). Todos los clones recombinantes fueron verificados por secuenciaci贸n de ADN. El vector reportero de prueba de luciferasa de luciferasa de luciferasa de luciferasa de luciferasa de fuego fue co-transfectado a una proporci贸n de 10:1 con el expresor constitutivo de Renilla luciferasa, phRL-CMV (Promega, Madison, WI, EE.UU.). Cultivamos c茅lulas Las c茅lulas se lisaron y se realizaron ensayos de luciferasa utilizando 20 mg de extracto proteico seg煤n el fabricante (Promega) a 44 h de post-transfecci贸n. La actividad luciferasa de Firefly se normaliz贸 a la actividad de Renilla luciferasa. El vector CMV-Tat de 0 mg, 0,5 mg o 1 mg se transfect贸 con LTR-Luc como un control positivo en estos experimentos. Realizamos ensayos de lucierasa por triplicado en tres experimentos independientes. Los resultados se expresan como error est谩ndar medio 6 (S.E.M.). Los tejidos placentarios de primer t茅rmino se obtuvieron a partir de abortos tras la interrupci贸n voluntaria del embarazo en CHUM H么pital Saint-Luc (Montreal, Canad谩). Se utilizaron tejidos de 3 H1 (asociados con TCM del VIH-1) y 3 H15 (tipo salvaje) haplotipos homocigotos para analizar posibles diferencias en la expresi贸n isoforma. Los ARN placentarios totales fueron extra铆dos por MasterPure DNA y ARN Extraction Kit (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI, USA) seg煤n el fabricante. Fragmentos correspondientes a la regi贸n de codificaci贸n DC-SIGNR fueron transcritos (RT) invertidas y luego amplificados por PCR anidados con los siguientes imprimadores; RT imprimadores RR, primer PCR RF y RR y segundo PCR RcF y RcR seg煤n Liu y colegas [11]. 1 mg de ARN total fue transcrito con Expand RT (Roche Applied Science, Indian谩polis, IN, EE.UU.) seg煤n el fabricante y fue amplificado con PCR de ADN Platinum Taq Polymerase (Invitrogen). Los principales productos de PCR de la segunda reacci贸n PCR fueron extra铆dos en gel con el Qiagen Gel Extraction Kit (Qiagen Canada inc, Mississauga, ON, Canad谩) y clonados utilizando el TOPO TA Cloning Kit para secuenciaci贸n (Invitrogen). Para cada placenta, 15 clones diferentes fueron seleccionados aleatoriamente y amplificados con imprimadores M13 y secuenciados con secuenciador automatizado ABI PRISM 3100 capilar (Applicated Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Las secuencias fueron analizadas y alineadas con secuencia de referencia GeneBank NM La expresi贸n cuantitativa de las isoformas DC-SIGNR 1,5 mg de ARN placentario fue transcrita inversamente utilizando 2,5 mM de Oligo dT 20 y Expand RT en 20 ml de volumen seg煤n el fabricante (Roche Applied Science). 15 ng de cDNA total en un volumen final de 20 ml se utiliz贸 para realizar PCR cuantitativa en tiempo real utilizando Universal Express SYBR GreenER qPCR Supermix (Invitrogen) en un Rotor Gene Realtime Rotary Analyser (Corbett Life Science, Sydney, Australia). Se utilizaron muestras de 2 sujetos en cada grupo porque la calidad ARN de otros no era adecuada para un an谩lisis QRT-PCR. La amplificaci贸n de todas las isoformas DC-SIGNR se realiz贸 utilizando un par de primos espec铆fico exon 5 (Tabla S1 ). Las isoformas ligadas a la membrana se amplificaron utilizando imprimaciones espec铆ficas para el ex贸n 3, correspondientes al dominio transmembrana com煤n de DC-SIGNR. Las primeras fueron dirigidas a la uni贸n exon-ex贸n y los extractos de ARN fueron tratados con Dnasa (Fermantas International inc, Burlington, ON, Canad谩) para evitar la amplificaci贸n del ADN contaminante. Las curvas est谩ndar (50-500 000 copias por reacci贸n) fueron generadas mediante diluci贸n en serie de un DC-SIGNR de larga duraci贸n o ADN de plasma GAPDH comercial (Invitrogen). Todas las reacciones de qPCR tuvieron eficiencias que oscilaban entre el 99% y el 100%, incluso en presencia de 20 ng de 谩cidos nucleicos no espec铆ficos, y por lo tanto se pudo comparar. El n煤mero de copias de muestras desconocidas se estim贸 colocando el n煤mero de ciclo de PCR medido (u Para corregir las diferencias en calidad de ARN y cantidad entre muestras, los niveles de expresi贸n de las transcripciones fueron normalizados a las transcripciones gen茅ticas GAPDH de referencia. Las secuencias de primos GAPDH fueron amablemente proporcionadas por A. Mes-Masson en el CHUM. Los resultados se presentan como n煤mero de copia g茅nica objetivo por 10 5 copias de GAPDH. La relaci贸n de isoformas ligadas a membranas fue calculada como E3/E5. Las isoformas solubles fueron calculadas restando uni贸n de membranas de isoformas totales. Realizamos ensayos de QPCR en triplicado en tres experimentos independientes. Los resultados se expresan como media6S.E.M. El an谩lisis estad铆stico se realiz贸 utilizando el GraphPad PRISM 5.0 para Windows (GraphPad Software inc, San Diego, CA, EE.UU.). Se compararon diferencias en las caracter铆sticas basales y frecuencias genot铆picas de haplotipos o htSNPs entre los grupos utilizando el an谩lisis x 2 o la prueba exacta de Fisher, se utiliz贸 el an谩lisis de regresi贸n log铆stica para estimar las odds ratios (OR) para cada genotipo y factores de riesgo basales, se utiliz贸 regresi贸n log铆stica m煤ltiple para definir predictores independientes identificados como significativos en el an谩lisis bruto, se calcularon las OR y el intervalo de confianza del 95% con el m茅todo exacto, se evaluaron comparaciones de variables continuas entre grupos con la t de Student no pareada cuando las variables se distribu铆an normalmente y con la U de Mann-Whitney cuando lo contrario, se consideraron significativas en P0,05. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todas las madres que participaron en el estudio y el ensayo de ZVITAMBO, y la investigaci贸n reportada en este trabajo fue aprobada por The We realiz贸 un estudio de asociaci贸n de polimorfismo DC-SIGNR en 197 ni帽os nacidos de madres infectadas con VIH-1 no tratadas reclutados en Harare, Zimbabwe. De ellos, 97 ni帽os fueron infectados con VIH-1 y 100 ni帽os permanecieron sin infecci贸n. De los 97 ni帽os infectados con VIH-1, 57 fueron infectados con IU, 11 con IP infectada y 17 infectados con PP. No se determin贸 el momento de la infecci贸n para 12 ni帽os infectados con VIH-1. Las caracter铆sticas basales de las madres y lactantes se presentan en la Tabla 1. La edad materna y el recuento de c茅lulas CD4, el sexo infantil, el modo de parto, la duraci贸n de la ruptura de membrana y la edad gestacional fueron similares entre todos los grupos. Sin embargo, la carga viral materna 29 000 copias/ml se asoci贸 con un aumento del riesgo tanto en UI como en PP con odds ratios (OR) de 3,64 (IC 95% = 1,82-7,31, P = 0,0002) y 4,45 (IC 95% = 1,50-13,2, P = 0,0045) para la transmisi贸n del VIH-1, respectivamente. En nuestras muestras de estudio (Tablas S2 y S3 ) se identificaron 15 SNPs marcados con haplotipos (htSNPs) correspondientes a los 15 haplotipos principales de DC-SIGNR (Figura 1 ). H1 (31%) y H3 (11%) fueron los haplotipos m谩s frecuentes observados (Figura 1 ) siendo homocigosos para el haplotipo H1 se asociaron con un aumento del riesgo de ambas UI (OR: 4, Los beb茅s que albergaban dos combinaciones de copias de haplotipos H1 y/ o H3 (H1-H1, H1-H3 o H3-H3) ten铆an un mayor riesgo de IU (OR: 3,42, P = 0,007) e IP (OR: 5,71, P = 0,025) pero no de infecci贸n por VIH-1 (P = 0,098) en comparaci贸n con los no portadores infantiles (Tabla 2 ). Estas 煤ltimas asociaciones siguieron siendo significativas tras el ajuste de la carga viral materna para ambas UI (OR: 3,57, IC 95% = 1,30-9,82, P = 0,013) e IP (OR: 5,71, IC 95% = 1,40-23, P = 0,025) transmisi贸n del VIH-1. Los haplotipos H1 y H3 comparten un grupo de mutaciones (p-198A, int2-391C, int2-180A, ex4 De estos, las variantes p-198A e int2-180A se asociaron significativamente con la TCM del VIH-1 (Tabla S2 ). En el an谩lisis de regresi贸n no ajustado, los lactantes homocigotos para las variantes p-198A e int2-180A presentaron un aumento del riesgo de UI (OR: 2,07 P = 0,045, OR: 3,78, P = 0,003, respectivamente) e IP (OR: 2,47, P = 0,17, O.R: 5,71, P = 0,025, respectivamente) infecci贸n por VIH-1 en comparaci贸n con los lactantes o no portadores de heterocigoto (Tabla 3). Cuando se realiz贸 ajuste por factores maternos, s贸lo la asociaci贸n con la variante int2-180A sigui贸 siendo significativa para la transmisi贸n por IU (OR: 3,83, IC 95% = 1,42-10, 4, P = 0,008) e IP As铆, los beb茅s homocigotos para la variante DC-SIGNR int2-180A contenida en los haplotipos H1 y H3 tuvieron 4 a 6 veces m谩s probabilidades de ser infectados por el VIH-1 durante el embarazo o durante el parto, respectivamente. La empalme alternativa del gen DC-SIGNR en la placenta produce ambos repertorios isoformados unidos a membrana y solubles [3]. La proporci贸n relativa de DC-SIGNR unido a membrana y soluble podr铆a influir de manera plausible en la susceptibilidad a la infecci贸n VIH-1 [11]. Por lo tanto, hicimos una hip贸tesis de que las mutaciones DC-SIGNR asociadas con la TCM del VIH-1 tendr铆an un impacto tanto en el nivel de expresi贸n DC-SIGNR y en el repertorio isoforma producido. Se clon贸 DC-SIGNR a partir de tejidos placentarios mediante RT-PCR a partir de 3 muestras H1 homocigotas que conten铆an tanto las variantes DC-SIGNR p-198AA e int2-180AA asociadas a la transmisi贸n del VIH-1 y 3 muestras de tipo salvaje homocigoto (WT) (p-198CC, int2-180GG). Se seleccionaron quince clones por muestra al azar para su secuenciaci贸n. Como era de esperar, se encontr贸 un amplio repertorio de transcripciones DC-SIGNR en todas las muestras con 9 a 16 isoformas diferentes por individuo. Se identificaron un total de 65 transcripciones distintas (Figura S1), de las cuales 3 eran transcripciones de duraci贸n completa. 64 de los clones secuenciados conten铆an un total de 69 sustituciones de amino谩cidos con 3 nuevos C terminos y 2 codones de parada Sin embargo, la diversidad se atribuy贸 principalmente a la eliminaci贸n total del ex贸n 2 o ex贸n 3 o a variaciones en la longitud de la regi贸n del cuello (ex贸n 4) del DC-SIGNR. La eliminaci贸n del ex贸n 3 elimina el dominio transmembrana de la prote铆na y conduce a la expresi贸n de isoformas solubles del DC-SIGNR [3]. Curiosamente, la abundancia de isoformas ligadas a la membrana en los tejidos placentarios de los homocigotos H1 parece ser menor que la observada en muestras de individuos de WT (Figura S1 ). La eliminaci贸n del ex贸n 3 fue confirmada por la secuenciaci贸n e hipotetizamos que el salto de ex贸n 3 podr铆a deberse a la presencia de la mutaci贸n int2-180A observada en lactantes con el haplotipo H1. De hecho, esta mutaci贸n intron se encuentra 180 pb aguas abajo del ex贸n 3 y potencialmente modifica los eventos de empalme (Figura 2A ). Confirmamos que la variaci贸n en las proporciones de transcripci贸n observadas entre los dos grupos tambi茅n se reflej贸 en el nivel de expresi贸n del ARNm en la placenta. Para cuantificar las isoformas unidos a la membrana frente a las isoformas solubles en muestras placentarias de beb茅s homocigosos H1 y WT, amplificamos la secuencia del ex贸n 5 (E5) presente en todas las isoformas DC-SIGNR (transcripciones totales). Luego amplificamos el ex贸n 3 (E3) que se elimina en las formas solubles y luego calculamos la relaci贸n E3:E5. Se encontr贸 que los tejidos placentarios de los lactantes homocigosos H1 expresan una proporci贸n significativamente menor de DC-SIGNR unido a la membrana (18%) en comparaci贸n con los de los individuos WT (36%) (P = 0,004) (Figura 2B ) sugiriendo que el salto de ex贸n 3 ocurre con mayor frecuencia en presencia de la variante DC-SIGNR int2-180A asociada con el TCM del VIH-1. La variante DC-SIGNR int2-180A siempre se transmite con la mutaci贸n promotora p-198A (Figura 1 ). En el an谩lisis de regresi贸n no ajustado, la variante p-198A se asoci贸 significativamente con UI pero no con la transmisi贸n IP y PP VIH-1 (Tabla 3). El an谩lisis del sitio de uni贸n del factor de transcripci贸n computacional predice Tabla 1. Figura 3A ). La actividad luciferasa del constructo variante p-198A fue significativamente menor que la del constructo promotor de WT p-198C (p-198C/A ratio = 2, P = 0,006) (Figura 3B ) sugiriendo que DC-SIGNR p-198A afecta a la actividad promotora. Los otros mutantes promotores (p-577C y p-323A) observados en la poblaci贸n zimbabuense no afectaron a la transcripci贸n DC-SIGNR en este ensayo (Figura S2). Para determinar el impacto neto de la mutaci贸n DC-SIGNR p-198A sobre la expresi贸n DC-SIGNR en la placenta, cuantificamos el n煤mero absoluto de transcripciones DC-SIGNR totales y de uni贸n de membrana en las muestras homocigoto H1 y placentales de tipo salvaje El n煤mero total de transcripciones DC-SIGNR se determin贸 en 6856213 (copias DC-SIGNR6S.E.M por 10 5 copias GAPDH) en las muestras placentarias de lactantes homocig贸ticos H1 y fue 4 veces menor en comparaci贸n con la encontrada en las placentas de individuos WT (27816638, P = 0.011) (Figura 3C ). Como se sugiri贸 anteriormente, la mutaci贸n int2-180A podr铆a inducir el salto de ex贸n 3 dando lugar a una menor producci贸n de DC-SIGNR unido a membrana. Aunque la disminuci贸n en el n煤mero total de transcripciones DC-SIGNR en muestras placentarias homocig贸ticas H1 que conten铆an tanto las variantes p-198AA como int2-180AA afect贸 la proporci贸n de isoformas solubles y ligadas a la membrana, el efecto de estas mutaciones fue m谩s pronunciado en las isoformas ligadas a la membrana con una disminuci贸n de 8 veces (H1 = 117636,2 vs WT = 9906220,6; P = 0,003) en comparaci贸n con una disminuci贸n de 3 veces en las isoformas solubles totales (H1 = 5686181,9 vs WT = 19256495,3; P = 0,03) (Figura 3C). Por lo tanto, las mutaciones DC-SIGNR p-198A e int2-180A asociadas con la TCM del VIH-1 disminuyeron significativamente el nivel Tabla 3. Asociaciones entre el promotor de DC-SIGNR infantil p-198 e intron 2 (int2)-180 variantes e intrauterina (UI), intraparto (IP) y postparto (PP) transmisi贸n del VIH-1 de madre a hijo. Nuestros resultados gen茅ticos, apoyados por el ensayo de expresi贸n en placenta, sugieren la implicaci贸n de DC-SIGNR en el TCM del VIH-1. La homocigosidad para el haplotipo H1 se asoci贸 con la transmisi贸n de UI en el an谩lisis de regresi贸n no ajustada. Sin embargo, la asociaci贸n desapareci贸 despu茅s del ajuste para los factores maternos presumiblemente debido al peque帽o n煤mero de beb茅s homocigotos H1 analizados en cada grupo. H1 y H3 fueron los haplotipos m谩s frecuentes observados en la poblaci贸n del estudio y comparten un grupo de mutaciones (Figura 1 ). La agrupaci贸n de haplotipos H1 y H3 aument贸 el poder del estudio y permiti贸 la identificaci贸n de mutaciones DC-SIGNR espec铆ficas asociadas con la TCM del VIH-1. De hecho, dos mutaciones compartidas por los haplotipos H1 y H3 se asociaron con la transmisi贸n vertical del VIH-1. La int2-180A se asoci贸 con un aumento de 4 veces en el riesgo de UI y 6 veces en el riesgo de IP despu茅s del ajuste por los factores maternos. Aunque la variante p-198A se asoci贸 con la transmisi贸n UI, la asociaci贸n desapareci贸 despu茅s del ajuste por la carga viral materna. Sin embargo, se demostr贸 que esta mutaci贸n reduce la actividad transcripcional DC-SIGNR in vitro y produce un menor nivel de transcripciones DC-SIGNR en tejidos placentarios en combinaci贸n con la variante int2-180A. Dado que int2-180A siempre se transmite con p-198A en los haplotipos combinados asociados a la ETMT H1/H3, mientras que p-198A se lleva a cabo en otros haplotipos no asociados (Figura 1), podemos especular que la mutaci贸n p-198A sola puede tener un efecto menor in vivo, mientras que en combinaci贸n con la variante int2-180A, ambos act煤an para reducir el nivel de expresi贸n DC-SIGNR placentaria que resulta en un aumento del riesgo de ETM de VIH-1. La mayor铆a de la transmisi贸n de UI ocurre durante el 煤ltimo trimestre del embarazo (revisado en [12] ). Las muestras de placenta a t茅rmino completo no estaban disponibles para el estudio actual y los ensayos de expresi贸n se realizaron en tejidos placentales de primer plazo. Un estudio previo que analiz贸 el repertorio de isoformas placentarias DC-SIGNR en muestras de placenta a t茅rmino demostr贸 una diversidad similar de transcripciones DC-SIGNR como en los tejidos placentarios de primer t茅rmino estudiados en este estudio [3]. Sin embargo, dado que los niveles de expresi贸n DC-SIGNR nunca se han comparado entre los diferentes t茅rminos del embarazo, no se sabe si la expresi贸n DC-SIGNR var铆a durante el embarazo. Sin embargo, es razonable suponer que las diferencias interindividuales tanto en el repertorio isoformo de DC-SIGNR como en los niveles de transcripci贸n observados entre los beb茅s homocig贸ticos H1 y WT se reflejar铆an a lo largo del embarazo. Hasta la fecha, la mayor铆a de los estudios se han centrado en el papel potencial de DC-SIGNR en la infecci贸n trans del VIH-1 in vitro [2, 10]. Sin embargo, los m煤ltiples mecanismos involucrados en la infecci贸n trans y redundancia entre las funciones de la lectina de tipo C dificultan la determinaci贸n de la participaci贸n real de DC-SIGNR en este modo de infecci贸n in vivo [13, 14]. La fuerte correlaci贸n que observamos entre la transmisi贸n vertical del VIH-1 y las variantes gen茅ticas de DC-SIGNR que producen bajos niveles de DC-SIGNR en la placenta sugiere que mecanismos distintos de la infecci贸n trans mediada por DC-SIGNR podr铆an operar durante la transmisi贸n vertical del VIH-1. Por ejemplo, DC-SIGNR tambi茅n ha demostrado funcionar como receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor [15]. Chan y sus colegas demostraron recientemente que las c茅lulas CHO transfectadas por DC-SIGNR disminuyen los t铆tulos de SARS-CoV mediante una mayor captura y degradaci贸n del virus de manera dependiente del proteasoma [4]. Dado que las c茅lulas endoteliales expresan MHC-I y II, los ant铆genos virales degradados podr铆an presentarse a las c茅lulas inmunes para provocar una respuesta inmune adaptativa [16, 17]. El receptor de n煤cleo HIV-1 CCR5, pero no CD4, se coexpresa con DC-SIGNR en las c茅lulas endoteliales placentarias y de barrera hematoencef谩lica (BBB) [18, 19]. La uni贸n del VIH-1 gp120 al receptor CCR5 en las c茅lulas endoteliales compromete la integridad del BBB y aumenta la adhesi贸n y transmigraci贸n de los monocitos a trav茅s del BBB [20, 21]. Por lo tanto, es posible que una menor expresi贸n de DC-SIGNR, en particular las isoformas ligadas a la membrana, en las c茅lulas endoteliales capilares placentarias pueda favorecer la uni贸n del VIH-1 al receptor CCR5, en lugar del receptor DC-SIGNR, facilitando la migraci贸n de las c茅lulas maternas infectadas por el VIH-1 a trav茅s de la barrera placentaria que resulta en la transmisi贸n UI del VIH-1. La variante int2-180A contenida en los haplotipos H1 y H3 se asoci贸 con la transmisi贸n IP, lo que sugiere que DC-SIGNR tambi茅n afecta a la transmisi贸n del VIH-1 durante el parto. El paso por el canal del parto podr铆a exponer potencialmente a los beb茅s a trav茅s de una entrada en el portal de la mucosa (presumiblemente oftalmol贸gica, cut谩nea o gastrointestinal), mientras que el insulto placentario durante el parto (f铆sico o inflamatorio) puede mejorar el paso transplacental de las c茅lulas maternas infectadas por el VIH-1 a la circulaci贸n fetal [22, 23]. Este proceso llamado microtransfusi贸n se ha propuesto con respecto a los resultados obtenidos en una cohorte malauiana. Kweik y sus colegas encontraron una asociaci贸n significativa entre los niveles de ADN materno en la sangre del cord贸n umbilical y la transmisi贸n IP del VIH-1, lo que sugiere que es probable que el paso de c茅lulas maternas infectadas a trav茅s de la placenta ocurra durante el parto [22]. As铆, de manera similar a lo sugerido anteriormente para la transmisi贸n de la IU, el nivel relativamente inferior de DC-SIGNR en la placenta de los beb茅s homocigotos que albergan la variante int2-180A podr铆a promover la uni贸n del VIH-1 al receptor CCR5 en las c茅lulas endoteliales que afectan la integridad de la barrera placentaria y facilitan el paso de las c茅lulas maternas infectadas en la circulaci贸n fetal durante el parto. Adem谩s de DC-SIGNR, se sabe que otros receptores del VIH-1 influyen en la TCM del VIH-1 (revisado en [24] ). Se ha demostrado que las variantes gen茅ticas de la CCR5 influyen en la transmisi贸n vertical del VIH-1. Las variantes promotoras de la CCR5 que resultan en una mayor expresi贸n del receptor se asocian con un mayor riesgo de TCM del VIH-1 entre los africanos subsaharianos [25, 26]. El polimorfismo de eliminaci贸n de 32 pb en la CCR5 se ha demostrado que protege de la transmisi贸n vertical del VIH-1 [27], pero esta variante est谩 pr谩cticamente ausente entre las poblaciones africanas [28]. El elevado n煤mero de copias de CCL3L1, un potente ligando supresor del VIH-1 para la CCR5, est谩 asociado con una mayor producci贸n de quimioquinas y un menor riesgo de TCM del VIH-1 entre los lactantes sudafricanos [29, 30]. La lectina de uni贸n a la manosa (MBL) es un receptor inmune innato sintetizado en el h铆gado y segregado en el torrente sangu铆neo en respuesta a la se帽al de inflamaci贸n. MBL promueve la eliminaci贸n de pat贸genos por opsonizaci贸n y fagocitosis, y la expresi贸n reducida de MBL resultante de polimorfismo en regiones codificantes y no codificantes se ha asociado con un aumento del riesgo de TCM del VIH En este estudio, demostramos por primera vez, el impacto funcional potencial de las mutaciones DC-SIGNR en su expresi贸n en la placenta y en la transmisi贸n vertical del VIH-1. Creemos que la presencia de DC-SIGNR en la superficie celular endotelial placentaria puede proteger a los beb茅s de la infecci贸n por el VIH-1 capturando virus y promoviendo su degradaci贸n/presentaci贸n. Sin embargo, en la placenta que contiene bajos niveles de DC-SIGNR, el VIH-1 se une preferentemente al CCR5 en c茅lulas endotelial, lo que resulta en una p茅rdida de integridad de la barrera placentaria y un mayor paso de las c茅lulas maternas infectadas por el VIH-1 en la circulaci贸n fetal que conduce al TCM del VIH-1. Este mecanismo tambi茅n puede aplicarse a otros pat贸genos transmitidos verticalmente conocidos por interactuar con DC-SIGNR como el VIH-2, hepatitis C y virus del dengue y Las asociaciones entre los genotipos de regi贸n repetida de DC-SIGNR infantil exon 4 y la transmisi贸n del VIH-1 de madre a hijo.CI, Intervalo de confianza; N, n煤mero; NA; no aplicable; OR, odds ratio a P-value seg煤n lo determinado por la prueba Chi-cuadrado. b Comparaci贸n entre el genotipo y todos los dem谩s. Se encontr贸 en: doi:10.1371/journal.pone.0007211.s003 (0,05 MB DOC) Figura S1 DC-SIGNR transcripciones repertorio en placenta. Los principales productos RT-PCR a partir del extracto de ARN de 3 muestras homocig贸ticas H1 y 3 homocig贸ticas WT placenta fueron purificadas, clonadas y secuenciadas. Se analizaron las secuencias seg煤n la secuencia de referencia NCBI NM_014257. TC; cola citoplasm谩tica, TM; dominio transmembrana; WT; tipo salvaje Se encontr贸 en: doi:10.1371/journal.pone.0007211.s004 (0,11 MB DOC) Figura S2 Efecto de la variante promotora DC-SIGNR sobre la actividad transcripcional en el ensayo de reporter de luciferasa in vitro en c茅lulas transfectadas HeLa. Expresi贸n relativa de luciferasa de pGL2-Basico, vector parental sin promotor. Expresi贸n Constructos de promotor DC-SIGNR, variante p-577C o variante p-323A se calcularon relativamente a este valor. Los datos se presentan en valores medios6S.E.M de tres experimentos independientes realizados por triplicado. Para comparar la expresi贸n relativa de luciferasa de los receptores de variantes p-557C y p-323A contra el constructo de tipo salvaje (WT) se utiliz贸 la prueba ANOVA de ida seguida de la prueba Dunnett para la comparaci贸n m煤ltiple. El vector CMV-Tat de 0 mg, 0,5 mg o 1 mg se transfect贸 con LTR-Luc como control positivo en estos experimentos. | 驴Cu谩l es la causa principal de la infecci贸n por el VIH-1 en los ni帽os? | false | 262 | {
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630 | Las variantes gen茅ticas funcionales en DC-SIGNR est谩n asociadas con la transmisi贸n del VIH-1 de madre a hijohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2752805/Boily-Larouche, Genevi猫ve; Iscache, Anne-Laure; Zijenah, Lynn S.; Humphrey, Jean H.; Mouland, Andrew J.; Ward, Brian J.; Roger, Michel2009-10-07DOI:10.1371/journal.pone.0007211Licencia:cc-byAbstract: ANTECEDENTES: La transmisi贸n de madre a hijo (MTCT) es la principal causa de infecci贸n por VIH-1 en ni帽os de todo el mundo. Dado que el receptor de lectina de tipo C, el receptor de lectina dendr铆tico espec铆fico para c茅lulas ICAM no relacionado con la integraci贸n (DC-SIGNR, tambi茅n conocido como CD209L o ganglio hep谩tico/linfa-nodo espec铆fico para ICAM no integrador (L-SIGN)), puede interactuar con pat贸genos incluyendo el VIH-1 y se expresa en la interfaz materno-fetal, se hipotetiza que podr铆a influir en la TCM del VIH-1. M脡TODOS Y INDICACIONES: Para investigar el papel potencial de DC-SIGNR en la TCM del VIH-1, realizamos un estudio de asociaci贸n gen茅tica de DC-SIGNR en una cohorte bien caracterizada de 197 madres infectadas por el VIH y sus beb茅s reclutados en Harare, Zimbabwe. Los lactantes que albergaban dos copias de los haplotipos DC-SIGNR H1 y/o H3 (H1-H1, H1-H3, H3-H3) tuvieron un aumento de 3,6 veces el riesgo de infecci贸n por VIH-1 en el 煤tero (UI) (P = 0,013) y un aumento de 5,7 veces el riesgo de infecci贸n por VIH-1 en el intraparto (IP) (P = 0,025) despu茅s de ajustarse para varios factores maternos. Los haplotipos H1 y H3 implicados comparten dos polimorfismos de nucle贸tidos 煤nicos (SNP) en la regi贸n promotora (p-198A) e intron 2 (int2-180A) que se asociaron con un aumento del riesgo de ambas UI (P = 0,045 y P = 0,003, respectivamente) e IP (P = 0,025, para la infecci贸n por VIH-1) (p En los lactantes homocigotos H1 con mutaciones tanto p-198A como int2-180A, observamos una disminuci贸n de 4 veces en el nivel de transcripciones DC-SIGNR placentarias, afectando desproporcionadamente la expresi贸n de isoformas ligadas a la membrana en comparaci贸n con las no portadoras infantiles (P = 0,011). CONCLUSI脫N: Estos resultados sugieren que DC-SIGNR juega un papel crucial en la TCM del VIH-1 y que la expresi贸n DC-SIGNR placentaria alterada aumenta el riesgo de transmisi贸n. Texto: Sin intervenciones espec铆ficas, la tasa de transmisi贸n del VIH-1 de madre a hijo (TCMM) es de aproximadamente 15-45% [1]. ONUSIDA estima que solo el a帽o pasado, m谩s de 400.000 ni帽os fueron infectados en todo el mundo, principalmente a trav茅s de la TCM y el 90% de ellos viv铆an en el 脕frica subsahariana. En los pa铆ses m谩s afectados, como Zimbabwe, el La TCM del VIH-1 puede ocurrir durante el embarazo (in utero, UI), el parto (intraparto, IP) o la lactancia materna (postparto, PP). La alta carga viral materna, el bajo recuento de c茅lulas CD4, el parto vaginal, la baja edad gestacional se han identificado como factores independientes asociados con la TCM del VIH-1 [1]. Aunque los antirretrovirales pueden reducir la TCM al 2%, el acceso limitado a diagn贸sticos y medicamentos oportunos en muchos pa铆ses en desarrollo limita el impacto potencial de esta estrategia. Una mejor comprensi贸n de los mecanismos que act煤an en la interfaz materno-fetal es crucial para el dise帽o de intervenciones alternativas a la terapia antirretroviral para la prevenci贸n de la transmisi贸n. Las c茅lulas dentr铆ticas espec铆ficas de la ICAM no relacionadas con la integrina (DC-SIGNR, tambi茅n conocido como CD209L o ICAM no integradora (L-SIGN)) pueden interactuar con una pl茅tora de pat贸genos incluyendo VIH-1 y se expresa en c茅lulas endoteliales capilares placentarias [2]. DC-SIGNR se organiza en tres dominios distintos, una cola citoplasm谩tica N-terminal, una regi贸n de repetici贸n que contiene siete repeticiones de 23 amino谩cidos y un dominio C-terminal implicado en la uni贸n de pat贸genos. El empalme alternativo del gen DC-SIGNR conduce a la producci贸n de un repertorio de isoformas altamente diversificadas que incluye isoformas asociadas a la membrana y solubles [3]. Se ha propuesto que la interacci贸n entre DC-SIGNR y VIH-1 podr铆a mejorar la transferencia viral a otros tipos de c茅lulas sensibles [2] pero DC-SIGNR tambi茅n puede internalizar y mediar la degradaci贸n dependiente de proteasomas de virus [4] que pueden afectar de manera diferente el resultado de la infecci贸n. Dada la presencia de DC-SIGNR en la interfaz materno-fetal y su interacci贸n con el VIH-1, se hizo una hip贸tesis de que podr铆a influir en la TCM del VIH-1. Para investigar el papel potencial de DC-SIGNR en la TCM del VIH-1, se llev贸 a cabo un estudio de asociaci贸n gen茅tica de DC-SIGNR en una cohorte bien caracterizada de madres infectadas por el VIH y sus beb茅s reclutados en Zimbabwe, y se identificaron variantes espec铆ficas de DC-SIGNR asociadas con el aumento de los riesgos de transmisi贸n del VIH. Adem谩s, caracterizamos el impacto funcional de estas variantes gen茅ticas en la expresi贸n DC-SIGNR y demostramos que afectan tanto al nivel como al tipo de transcripciones DC-SIGNR producidas en la placenta. Las muestras consistieron en extractos de ADN almacenados obtenidos de 197 parejas madre-hijo co-inscritas inmediatamente despu茅s del parto en el ensayo de suplementaci贸n de vitamina A de ZVITAMBO (Harare, Zimbabwe) y seguidos a 6 semanas e intervalos de 3 meses hasta 24 meses. El proyecto ZVITAMBO fue un ensayo cl铆nico aleatorizado controlado con placebo que incluy贸 a 14.110 parejas madre-hijo, entre noviembre de 1997 y enero de 2000, con el objetivo principal de investigar el impacto de la suplementaci贸n inmediata de vitamina A de postparto en la TCM del VIH-1. Las muestras utilizadas en el presente estudio fueron de parejas madre-hijo asignadas aleatoriamente al grupo placebo del proyecto ZVI La profilaxis antirretroviral para mujeres embarazadas VIH-1 positivas no estaba disponible en el sector p煤blico de Harare durante el reclutamiento de pacientes de ZVITAMBO. Las muestras fueron obtenidas consecutivamente de dos grupos: 97 parejas de madres VIH-1 positivas/hijos VIH-1 positivos y 100 parejas de madres VIH-1 positivas/ni帽os VIH-negativos. El estado serol贸gico de la madre fue determinado por ELISA y confirmado por Western Blot. Se consider贸 que los lactantes estaban infectados si eran seropositivos a los 18 meses o mayores y ten铆an dos o m谩s resultados positivos de reacci贸n en cadena de la polimerasa del VIH-1-DNA (PCR) a edades m谩s tempranas. Se consider贸 que 100 ni帽os no estaban infectados por ser ELISA negativos a los 18 meses o mayores y tuvieron dos resultados negativos de PCR de ADN de muestras recogidas a una edad m谩s temprana. De los 97 ni帽os infectados por el VIH-1, 57 fueron infectados IU, 11 fueron infectados IP y 17 fueron infectados PP seg煤n los an谩lisis de PCR de muestras de sangre recolectadas al nacer, 6 semanas, 3 y 6 meses de edad y seg煤n las siguientes definiciones adaptadas de Bryson y colegas [5]. Brevemente, los beb茅s con ADN PCR positivo al nacer fueron infectados IU. Los beb茅s con PCR negativo resultado de la muestra obtenida al nacer pero que se hicieron positivos por 6 semanas de edad fueron infectados IP. Los lactantes con resultados negativos de PCR al nacer y 6 semanas de edad pero que posteriormente se convirtieron en DNA PCR positivo fueron considerados infectados durante el per铆odo PP. En el an谩lisis de comparaci贸n de los 3 modos diferentes de TCM, 12 beb茅s infectados por el VIH-1 fueron excluidos porque los resultados de PCR no estaban disponibles a las 6 semanas de edad. M茅todos completos de reclutamiento, recolecci贸n de caracter铆sticas basales, procedimientos de laboratorio La variaci贸n de la secuencia de nucle贸tidos de todo el promotor, codificaci贸n y parte de las 39 regiones UTR del gen DC-SIGNR en la poblaci贸n del estudio se determin贸 previamente [7]. La reconstrucci贸n del haplotipo se realiz贸 utilizando el m茅todo estad铆stico Bayesiano implementado en FASE [8], versi贸n 2.1.1, utilizando polimorfismo nucle贸tido 煤nico (SNP) con una frecuencia m铆nima de alelos (MAF) del 2%. Aplicamos el algoritmo cinco veces, utilizando diferentes semillas generadas aleatoriamente, y se obtuvieron resultados consistentes a lo largo de las carreras (Figura 1 ). Quince SNPs con etiqueta de haplotipo (htSNPs) fueron identificados por el software HaploBlockFinder [9] con un MAF $5%. Estos htSNPs fueron genotipados en los 197 infantes mediante el an谩lisis de secuenciaci贸n PCR directo como hemos descrito El genotipo de regi贸n de repetici贸n DC-SIGNR 4 fue determinado por amplificaci贸n PCR seguida de migraci贸n en geles de agarosa del 1,5% [10]. Se analizaron secuencias de ADN en la regi贸n promotora con la interfaz TESS (http//:www.cbil.upenn.edu/tess) para sitios de uni贸n de factores de transcripci贸n putativos utilizando la base de datos TRANSFAC. Se realizaron ensayos de reporteros Luciferase utilizando vector pGL2-B谩sico para investigar el efecto funcional de mutaciones en la actividad promotora DC-SIGNR. El ADN gen贸mico de los sujetos homocigotos para las variantes promotoras y WT fue amplificado desde la posici贸n nucle贸tida 2715 a 21 y clonado entre los sitios de clonaci贸n m煤ltiple BglII y HindIII en el vector pGL2-Basico que alberga un gen luciferasa de luciferasa de reportero aguas abajo (Invitrogen Canada inc, Burlington, Canad谩). Todos los clones recombinantes fueron verificados por secuenciaci贸n de ADN. El vector reportero de prueba de luciferasa de luciferasa de luciferasa de luciferasa de luciferasa de fuego fue co-transfectado a una proporci贸n de 10:1 con el expresor constitutivo de Renilla luciferasa, phRL-CMV (Promega, Madison, WI, EE.UU.). Cultivamos c茅lulas Las c茅lulas se lisaron y se realizaron ensayos de luciferasa utilizando 20 mg de extracto proteico seg煤n el fabricante (Promega) a 44 h de post-transfecci贸n. La actividad luciferasa de Firefly se normaliz贸 a la actividad de Renilla luciferasa. El vector CMV-Tat de 0 mg, 0,5 mg o 1 mg se transfect贸 con LTR-Luc como un control positivo en estos experimentos. Realizamos ensayos de lucierasa por triplicado en tres experimentos independientes. Los resultados se expresan como error est谩ndar medio 6 (S.E.M.). Los tejidos placentarios de primer t茅rmino se obtuvieron a partir de abortos tras la interrupci贸n voluntaria del embarazo en CHUM H么pital Saint-Luc (Montreal, Canad谩). Se utilizaron tejidos de 3 H1 (asociados con TCM del VIH-1) y 3 H15 (tipo salvaje) haplotipos homocigotos para analizar posibles diferencias en la expresi贸n isoforma. Los ARN placentarios totales fueron extra铆dos por MasterPure DNA y ARN Extraction Kit (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI, USA) seg煤n el fabricante. Fragmentos correspondientes a la regi贸n de codificaci贸n DC-SIGNR fueron transcritos (RT) invertidas y luego amplificados por PCR anidados con los siguientes imprimadores; RT imprimadores RR, primer PCR RF y RR y segundo PCR RcF y RcR seg煤n Liu y colegas [11]. 1 mg de ARN total fue transcrito con Expand RT (Roche Applied Science, Indian谩polis, IN, EE.UU.) seg煤n el fabricante y fue amplificado con PCR de ADN Platinum Taq Polymerase (Invitrogen). Los principales productos de PCR de la segunda reacci贸n PCR fueron extra铆dos en gel con el Qiagen Gel Extraction Kit (Qiagen Canada inc, Mississauga, ON, Canad谩) y clonados utilizando el TOPO TA Cloning Kit para secuenciaci贸n (Invitrogen). Para cada placenta, 15 clones diferentes fueron seleccionados aleatoriamente y amplificados con imprimadores M13 y secuenciados con secuenciador automatizado ABI PRISM 3100 capilar (Applicated Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Las secuencias fueron analizadas y alineadas con secuencia de referencia GeneBank NM La expresi贸n cuantitativa de las isoformas DC-SIGNR 1,5 mg de ARN placentario fue transcrita inversamente utilizando 2,5 mM de Oligo dT 20 y Expand RT en 20 ml de volumen seg煤n el fabricante (Roche Applied Science). 15 ng de cDNA total en un volumen final de 20 ml se utiliz贸 para realizar PCR cuantitativa en tiempo real utilizando Universal Express SYBR GreenER qPCR Supermix (Invitrogen) en un Rotor Gene Realtime Rotary Analyser (Corbett Life Science, Sydney, Australia). Se utilizaron muestras de 2 sujetos en cada grupo porque la calidad ARN de otros no era adecuada para un an谩lisis QRT-PCR. La amplificaci贸n de todas las isoformas DC-SIGNR se realiz贸 utilizando un par de primos espec铆fico exon 5 (Tabla S1 ). Las isoformas ligadas a la membrana se amplificaron utilizando imprimaciones espec铆ficas para el ex贸n 3, correspondientes al dominio transmembrana com煤n de DC-SIGNR. Las primeras fueron dirigidas a la uni贸n exon-ex贸n y los extractos de ARN fueron tratados con Dnasa (Fermantas International inc, Burlington, ON, Canad谩) para evitar la amplificaci贸n del ADN contaminante. Las curvas est谩ndar (50-500 000 copias por reacci贸n) fueron generadas mediante diluci贸n en serie de un DC-SIGNR de larga duraci贸n o ADN de plasma GAPDH comercial (Invitrogen). Todas las reacciones de qPCR tuvieron eficiencias que oscilaban entre el 99% y el 100%, incluso en presencia de 20 ng de 谩cidos nucleicos no espec铆ficos, y por lo tanto se pudo comparar. El n煤mero de copias de muestras desconocidas se estim贸 colocando el n煤mero de ciclo de PCR medido (u Para corregir las diferencias en calidad de ARN y cantidad entre muestras, los niveles de expresi贸n de las transcripciones fueron normalizados a las transcripciones gen茅ticas GAPDH de referencia. Las secuencias de primos GAPDH fueron amablemente proporcionadas por A. Mes-Masson en el CHUM. Los resultados se presentan como n煤mero de copia g茅nica objetivo por 10 5 copias de GAPDH. La relaci贸n de isoformas ligadas a membranas fue calculada como E3/E5. Las isoformas solubles fueron calculadas restando uni贸n de membranas de isoformas totales. Realizamos ensayos de QPCR en triplicado en tres experimentos independientes. Los resultados se expresan como media6S.E.M. El an谩lisis estad铆stico se realiz贸 utilizando el GraphPad PRISM 5.0 para Windows (GraphPad Software inc, San Diego, CA, EE.UU.). Se compararon diferencias en las caracter铆sticas basales y frecuencias genot铆picas de haplotipos o htSNPs entre los grupos utilizando el an谩lisis x 2 o la prueba exacta de Fisher, se utiliz贸 el an谩lisis de regresi贸n log铆stica para estimar las odds ratios (OR) para cada genotipo y factores de riesgo basales, se utiliz贸 regresi贸n log铆stica m煤ltiple para definir predictores independientes identificados como significativos en el an谩lisis bruto, se calcularon las OR y el intervalo de confianza del 95% con el m茅todo exacto, se evaluaron comparaciones de variables continuas entre grupos con la t de Student no pareada cuando las variables se distribu铆an normalmente y con la U de Mann-Whitney cuando lo contrario, se consideraron significativas en P0,05. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todas las madres que participaron en el estudio y el ensayo de ZVITAMBO, y la investigaci贸n reportada en este trabajo fue aprobada por The We realiz贸 un estudio de asociaci贸n de polimorfismo DC-SIGNR en 197 ni帽os nacidos de madres infectadas con VIH-1 no tratadas reclutados en Harare, Zimbabwe. De ellos, 97 ni帽os fueron infectados con VIH-1 y 100 ni帽os permanecieron sin infecci贸n. De los 97 ni帽os infectados con VIH-1, 57 fueron infectados con IU, 11 con IP infectada y 17 infectados con PP. No se determin贸 el momento de la infecci贸n para 12 ni帽os infectados con VIH-1. Las caracter铆sticas basales de las madres y lactantes se presentan en la Tabla 1. La edad materna y el recuento de c茅lulas CD4, el sexo infantil, el modo de parto, la duraci贸n de la ruptura de membrana y la edad gestacional fueron similares entre todos los grupos. Sin embargo, la carga viral materna 29 000 copias/ml se asoci贸 con un aumento del riesgo tanto en UI como en PP con odds ratios (OR) de 3,64 (IC 95% = 1,82-7,31, P = 0,0002) y 4,45 (IC 95% = 1,50-13,2, P = 0,0045) para la transmisi贸n del VIH-1, respectivamente. En nuestras muestras de estudio (Tablas S2 y S3 ) se identificaron 15 SNPs marcados con haplotipos (htSNPs) correspondientes a los 15 haplotipos principales de DC-SIGNR (Figura 1 ). H1 (31%) y H3 (11%) fueron los haplotipos m谩s frecuentes observados (Figura 1 ) siendo homocigosos para el haplotipo H1 se asociaron con un aumento del riesgo de ambas UI (OR: 4, Los beb茅s que albergaban dos combinaciones de copias de haplotipos H1 y/ o H3 (H1-H1, H1-H3 o H3-H3) ten铆an un mayor riesgo de IU (OR: 3,42, P = 0,007) e IP (OR: 5,71, P = 0,025) pero no de infecci贸n por VIH-1 (P = 0,098) en comparaci贸n con los no portadores infantiles (Tabla 2 ). Estas 煤ltimas asociaciones siguieron siendo significativas tras el ajuste de la carga viral materna para ambas UI (OR: 3,57, IC 95% = 1,30-9,82, P = 0,013) e IP (OR: 5,71, IC 95% = 1,40-23, P = 0,025) transmisi贸n del VIH-1. Los haplotipos H1 y H3 comparten un grupo de mutaciones (p-198A, int2-391C, int2-180A, ex4 De estos, las variantes p-198A e int2-180A se asociaron significativamente con la TCM del VIH-1 (Tabla S2 ). En el an谩lisis de regresi贸n no ajustado, los lactantes homocigotos para las variantes p-198A e int2-180A presentaron un aumento del riesgo de UI (OR: 2,07 P = 0,045, OR: 3,78, P = 0,003, respectivamente) e IP (OR: 2,47, P = 0,17, O.R: 5,71, P = 0,025, respectivamente) infecci贸n por VIH-1 en comparaci贸n con los lactantes o no portadores de heterocigoto (Tabla 3). Cuando se realiz贸 ajuste por factores maternos, s贸lo la asociaci贸n con la variante int2-180A sigui贸 siendo significativa para la transmisi贸n por IU (OR: 3,83, IC 95% = 1,42-10, 4, P = 0,008) e IP As铆, los beb茅s homocigotos para la variante DC-SIGNR int2-180A contenida en los haplotipos H1 y H3 tuvieron 4 a 6 veces m谩s probabilidades de ser infectados por el VIH-1 durante el embarazo o durante el parto, respectivamente. La empalme alternativa del gen DC-SIGNR en la placenta produce ambos repertorios isoformados unidos a membrana y solubles [3]. La proporci贸n relativa de DC-SIGNR unido a membrana y soluble podr铆a influir de manera plausible en la susceptibilidad a la infecci贸n VIH-1 [11]. Por lo tanto, hicimos una hip贸tesis de que las mutaciones DC-SIGNR asociadas con la TCM del VIH-1 tendr铆an un impacto tanto en el nivel de expresi贸n DC-SIGNR y en el repertorio isoforma producido. Se clon贸 DC-SIGNR a partir de tejidos placentarios mediante RT-PCR a partir de 3 muestras H1 homocigotas que conten铆an tanto las variantes DC-SIGNR p-198AA e int2-180AA asociadas a la transmisi贸n del VIH-1 y 3 muestras de tipo salvaje homocigoto (WT) (p-198CC, int2-180GG). Se seleccionaron quince clones por muestra al azar para su secuenciaci贸n. Como era de esperar, se encontr贸 un amplio repertorio de transcripciones DC-SIGNR en todas las muestras con 9 a 16 isoformas diferentes por individuo. Se identificaron un total de 65 transcripciones distintas (Figura S1), de las cuales 3 eran transcripciones de duraci贸n completa. 64 de los clones secuenciados conten铆an un total de 69 sustituciones de amino谩cidos con 3 nuevos C terminos y 2 codones de parada Sin embargo, la diversidad se atribuy贸 principalmente a la eliminaci贸n total del ex贸n 2 o ex贸n 3 o a variaciones en la longitud de la regi贸n del cuello (ex贸n 4) del DC-SIGNR. La eliminaci贸n del ex贸n 3 elimina el dominio transmembrana de la prote铆na y conduce a la expresi贸n de isoformas solubles del DC-SIGNR [3]. Curiosamente, la abundancia de isoformas ligadas a la membrana en los tejidos placentarios de los homocigotos H1 parece ser menor que la observada en muestras de individuos de WT (Figura S1 ). La eliminaci贸n del ex贸n 3 fue confirmada por la secuenciaci贸n e hipotetizamos que el salto de ex贸n 3 podr铆a deberse a la presencia de la mutaci贸n int2-180A observada en lactantes con el haplotipo H1. De hecho, esta mutaci贸n intron se encuentra 180 pb aguas abajo del ex贸n 3 y potencialmente modifica los eventos de empalme (Figura 2A ). Confirmamos que la variaci贸n en las proporciones de transcripci贸n observadas entre los dos grupos tambi茅n se reflej贸 en el nivel de expresi贸n del ARNm en la placenta. Para cuantificar las isoformas unidos a la membrana frente a las isoformas solubles en muestras placentarias de beb茅s homocigosos H1 y WT, amplificamos la secuencia del ex贸n 5 (E5) presente en todas las isoformas DC-SIGNR (transcripciones totales). Luego amplificamos el ex贸n 3 (E3) que se elimina en las formas solubles y luego calculamos la relaci贸n E3:E5. Se encontr贸 que los tejidos placentarios de los lactantes homocigosos H1 expresan una proporci贸n significativamente menor de DC-SIGNR unido a la membrana (18%) en comparaci贸n con los de los individuos WT (36%) (P = 0,004) (Figura 2B ) sugiriendo que el salto de ex贸n 3 ocurre con mayor frecuencia en presencia de la variante DC-SIGNR int2-180A asociada con el TCM del VIH-1. La variante DC-SIGNR int2-180A siempre se transmite con la mutaci贸n promotora p-198A (Figura 1 ). En el an谩lisis de regresi贸n no ajustado, la variante p-198A se asoci贸 significativamente con UI pero no con la transmisi贸n IP y PP VIH-1 (Tabla 3). El an谩lisis del sitio de uni贸n del factor de transcripci贸n computacional predice Tabla 1. Figura 3A ). La actividad luciferasa del constructo variante p-198A fue significativamente menor que la del constructo promotor de WT p-198C (p-198C/A ratio = 2, P = 0,006) (Figura 3B ) sugiriendo que DC-SIGNR p-198A afecta a la actividad promotora. Los otros mutantes promotores (p-577C y p-323A) observados en la poblaci贸n zimbabuense no afectaron a la transcripci贸n DC-SIGNR en este ensayo (Figura S2). Para determinar el impacto neto de la mutaci贸n DC-SIGNR p-198A sobre la expresi贸n DC-SIGNR en la placenta, cuantificamos el n煤mero absoluto de transcripciones DC-SIGNR totales y de uni贸n de membrana en las muestras homocigoto H1 y placentales de tipo salvaje El n煤mero total de transcripciones DC-SIGNR se determin贸 en 6856213 (copias DC-SIGNR6S.E.M por 10 5 copias GAPDH) en las muestras placentarias de lactantes homocig贸ticos H1 y fue 4 veces menor en comparaci贸n con la encontrada en las placentas de individuos WT (27816638, P = 0.011) (Figura 3C ). Como se sugiri贸 anteriormente, la mutaci贸n int2-180A podr铆a inducir el salto de ex贸n 3 dando lugar a una menor producci贸n de DC-SIGNR unido a membrana. Aunque la disminuci贸n en el n煤mero total de transcripciones DC-SIGNR en muestras placentarias homocig贸ticas H1 que conten铆an tanto las variantes p-198AA como int2-180AA afect贸 la proporci贸n de isoformas solubles y ligadas a la membrana, el efecto de estas mutaciones fue m谩s pronunciado en las isoformas ligadas a la membrana con una disminuci贸n de 8 veces (H1 = 117636,2 vs WT = 9906220,6; P = 0,003) en comparaci贸n con una disminuci贸n de 3 veces en las isoformas solubles totales (H1 = 5686181,9 vs WT = 19256495,3; P = 0,03) (Figura 3C). Por lo tanto, las mutaciones DC-SIGNR p-198A e int2-180A asociadas con la TCM del VIH-1 disminuyeron significativamente el nivel Tabla 3. Asociaciones entre el promotor de DC-SIGNR infantil p-198 e intron 2 (int2)-180 variantes e intrauterina (UI), intraparto (IP) y postparto (PP) transmisi贸n del VIH-1 de madre a hijo. Nuestros resultados gen茅ticos, apoyados por el ensayo de expresi贸n en placenta, sugieren la implicaci贸n de DC-SIGNR en el TCM del VIH-1. La homocigosidad para el haplotipo H1 se asoci贸 con la transmisi贸n de UI en el an谩lisis de regresi贸n no ajustada. Sin embargo, la asociaci贸n desapareci贸 despu茅s del ajuste para los factores maternos presumiblemente debido al peque帽o n煤mero de beb茅s homocigotos H1 analizados en cada grupo. H1 y H3 fueron los haplotipos m谩s frecuentes observados en la poblaci贸n del estudio y comparten un grupo de mutaciones (Figura 1 ). La agrupaci贸n de haplotipos H1 y H3 aument贸 el poder del estudio y permiti贸 la identificaci贸n de mutaciones DC-SIGNR espec铆ficas asociadas con la TCM del VIH-1. De hecho, dos mutaciones compartidas por los haplotipos H1 y H3 se asociaron con la transmisi贸n vertical del VIH-1. La int2-180A se asoci贸 con un aumento de 4 veces en el riesgo de UI y 6 veces en el riesgo de IP despu茅s del ajuste por los factores maternos. Aunque la variante p-198A se asoci贸 con la transmisi贸n UI, la asociaci贸n desapareci贸 despu茅s del ajuste por la carga viral materna. Sin embargo, se demostr贸 que esta mutaci贸n reduce la actividad transcripcional DC-SIGNR in vitro y produce un menor nivel de transcripciones DC-SIGNR en tejidos placentarios en combinaci贸n con la variante int2-180A. Dado que int2-180A siempre se transmite con p-198A en los haplotipos combinados asociados a la ETMT H1/H3, mientras que p-198A se lleva a cabo en otros haplotipos no asociados (Figura 1), podemos especular que la mutaci贸n p-198A sola puede tener un efecto menor in vivo, mientras que en combinaci贸n con la variante int2-180A, ambos act煤an para reducir el nivel de expresi贸n DC-SIGNR placentaria que resulta en un aumento del riesgo de ETM de VIH-1. La mayor铆a de la transmisi贸n de UI ocurre durante el 煤ltimo trimestre del embarazo (revisado en [12] ). Las muestras de placenta a t茅rmino completo no estaban disponibles para el estudio actual y los ensayos de expresi贸n se realizaron en tejidos placentales de primer plazo. Un estudio previo que analiz贸 el repertorio de isoformas placentarias DC-SIGNR en muestras de placenta a t茅rmino demostr贸 una diversidad similar de transcripciones DC-SIGNR como en los tejidos placentarios de primer t茅rmino estudiados en este estudio [3]. Sin embargo, dado que los niveles de expresi贸n DC-SIGNR nunca se han comparado entre los diferentes t茅rminos del embarazo, no se sabe si la expresi贸n DC-SIGNR var铆a durante el embarazo. Sin embargo, es razonable suponer que las diferencias interindividuales tanto en el repertorio isoformo de DC-SIGNR como en los niveles de transcripci贸n observados entre los beb茅s homocig贸ticos H1 y WT se reflejar铆an a lo largo del embarazo. Hasta la fecha, la mayor铆a de los estudios se han centrado en el papel potencial de DC-SIGNR en la infecci贸n trans del VIH-1 in vitro [2, 10]. Sin embargo, los m煤ltiples mecanismos involucrados en la infecci贸n trans y redundancia entre las funciones de la lectina de tipo C dificultan la determinaci贸n de la participaci贸n real de DC-SIGNR en este modo de infecci贸n in vivo [13, 14]. La fuerte correlaci贸n que observamos entre la transmisi贸n vertical del VIH-1 y las variantes gen茅ticas de DC-SIGNR que producen bajos niveles de DC-SIGNR en la placenta sugiere que mecanismos distintos de la infecci贸n trans mediada por DC-SIGNR podr铆an operar durante la transmisi贸n vertical del VIH-1. Por ejemplo, DC-SIGNR tambi茅n ha demostrado funcionar como receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor [15]. Chan y sus colegas demostraron recientemente que las c茅lulas CHO transfectadas por DC-SIGNR disminuyen los t铆tulos de SARS-CoV mediante una mayor captura y degradaci贸n del virus de manera dependiente del proteasoma [4]. Dado que las c茅lulas endoteliales expresan MHC-I y II, los ant铆genos virales degradados podr铆an presentarse a las c茅lulas inmunes para provocar una respuesta inmune adaptativa [16, 17]. El receptor de n煤cleo HIV-1 CCR5, pero no CD4, se coexpresa con DC-SIGNR en las c茅lulas endoteliales placentarias y de barrera hematoencef谩lica (BBB) [18, 19]. La uni贸n del VIH-1 gp120 al receptor CCR5 en las c茅lulas endoteliales compromete la integridad del BBB y aumenta la adhesi贸n y transmigraci贸n de los monocitos a trav茅s del BBB [20, 21]. Por lo tanto, es posible que una menor expresi贸n de DC-SIGNR, en particular las isoformas ligadas a la membrana, en las c茅lulas endoteliales capilares placentarias pueda favorecer la uni贸n del VIH-1 al receptor CCR5, en lugar del receptor DC-SIGNR, facilitando la migraci贸n de las c茅lulas maternas infectadas por el VIH-1 a trav茅s de la barrera placentaria que resulta en la transmisi贸n UI del VIH-1. La variante int2-180A contenida en los haplotipos H1 y H3 se asoci贸 con la transmisi贸n IP, lo que sugiere que DC-SIGNR tambi茅n afecta a la transmisi贸n del VIH-1 durante el parto. El paso por el canal del parto podr铆a exponer potencialmente a los beb茅s a trav茅s de una entrada en el portal de la mucosa (presumiblemente oftalmol贸gica, cut谩nea o gastrointestinal), mientras que el insulto placentario durante el parto (f铆sico o inflamatorio) puede mejorar el paso transplacental de las c茅lulas maternas infectadas por el VIH-1 a la circulaci贸n fetal [22, 23]. Este proceso llamado microtransfusi贸n se ha propuesto con respecto a los resultados obtenidos en una cohorte malauiana. Kweik y sus colegas encontraron una asociaci贸n significativa entre los niveles de ADN materno en la sangre del cord贸n umbilical y la transmisi贸n IP del VIH-1, lo que sugiere que es probable que el paso de c茅lulas maternas infectadas a trav茅s de la placenta ocurra durante el parto [22]. As铆, de manera similar a lo sugerido anteriormente para la transmisi贸n de la IU, el nivel relativamente inferior de DC-SIGNR en la placenta de los beb茅s homocigotos que albergan la variante int2-180A podr铆a promover la uni贸n del VIH-1 al receptor CCR5 en las c茅lulas endoteliales que afectan la integridad de la barrera placentaria y facilitan el paso de las c茅lulas maternas infectadas en la circulaci贸n fetal durante el parto. Adem谩s de DC-SIGNR, se sabe que otros receptores del VIH-1 influyen en la TCM del VIH-1 (revisado en [24] ). Se ha demostrado que las variantes gen茅ticas de la CCR5 influyen en la transmisi贸n vertical del VIH-1. Las variantes promotoras de la CCR5 que resultan en una mayor expresi贸n del receptor se asocian con un mayor riesgo de TCM del VIH-1 entre los africanos subsaharianos [25, 26]. El polimorfismo de eliminaci贸n de 32 pb en la CCR5 se ha demostrado que protege de la transmisi贸n vertical del VIH-1 [27], pero esta variante est谩 pr谩cticamente ausente entre las poblaciones africanas [28]. El elevado n煤mero de copias de CCL3L1, un potente ligando supresor del VIH-1 para la CCR5, est谩 asociado con una mayor producci贸n de quimioquinas y un menor riesgo de TCM del VIH-1 entre los lactantes sudafricanos [29, 30]. La lectina de uni贸n a la manosa (MBL) es un receptor inmune innato sintetizado en el h铆gado y segregado en el torrente sangu铆neo en respuesta a la se帽al de inflamaci贸n. MBL promueve la eliminaci贸n de pat贸genos por opsonizaci贸n y fagocitosis, y la expresi贸n reducida de MBL resultante de polimorfismo en regiones codificantes y no codificantes se ha asociado con un aumento del riesgo de TCM del VIH En este estudio, demostramos por primera vez, el impacto funcional potencial de las mutaciones DC-SIGNR en su expresi贸n en la placenta y en la transmisi贸n vertical del VIH-1. Creemos que la presencia de DC-SIGNR en la superficie celular endotelial placentaria puede proteger a los beb茅s de la infecci贸n por el VIH-1 capturando virus y promoviendo su degradaci贸n/presentaci贸n. Sin embargo, en la placenta que contiene bajos niveles de DC-SIGNR, el VIH-1 se une preferentemente al CCR5 en c茅lulas endotelial, lo que resulta en una p茅rdida de integridad de la barrera placentaria y un mayor paso de las c茅lulas maternas infectadas por el VIH-1 en la circulaci贸n fetal que conduce al TCM del VIH-1. Este mecanismo tambi茅n puede aplicarse a otros pat贸genos transmitidos verticalmente conocidos por interactuar con DC-SIGNR como el VIH-2, hepatitis C y virus del dengue y Las asociaciones entre los genotipos de regi贸n repetida de DC-SIGNR infantil exon 4 y la transmisi贸n del VIH-1 de madre a hijo.CI, Intervalo de confianza; N, n煤mero; NA; no aplicable; OR, odds ratio a P-value seg煤n lo determinado por la prueba Chi-cuadrado. b Comparaci贸n entre el genotipo y todos los dem谩s. Se encontr贸 en: doi:10.1371/journal.pone.0007211.s003 (0,05 MB DOC) Figura S1 DC-SIGNR transcripciones repertorio en placenta. Los principales productos RT-PCR a partir del extracto de ARN de 3 muestras homocig贸ticas H1 y 3 homocig贸ticas WT placenta fueron purificadas, clonadas y secuenciadas. Se analizaron las secuencias seg煤n la secuencia de referencia NCBI NM_014257. TC; cola citoplasm谩tica, TM; dominio transmembrana; WT; tipo salvaje Se encontr贸 en: doi:10.1371/journal.pone.0007211.s004 (0,11 MB DOC) Figura S2 Efecto de la variante promotora DC-SIGNR sobre la actividad transcripcional en el ensayo de reporter de luciferasa in vitro en c茅lulas transfectadas HeLa. Expresi贸n relativa de luciferasa de pGL2-Basico, vector parental sin promotor. Expresi贸n Constructos de promotor DC-SIGNR, variante p-577C o variante p-323A se calcularon relativamente a este valor. Los datos se presentan en valores medios6S.E.M de tres experimentos independientes realizados por triplicado. Para comparar la expresi贸n relativa de luciferasa de los receptores de variantes p-557C y p-323A contra el constructo de tipo salvaje (WT) se utiliz贸 la prueba ANOVA de ida seguida de la prueba Dunnett para la comparaci贸n m煤ltiple. El vector CMV-Tat de 0 mg, 0,5 mg o 1 mg se transfect贸 con LTR-Luc como control positivo en estos experimentos. | Qu茅 desempe帽a el papel crucial en la transmisi贸n del VIH-1 de la madre al hijo y qu茅 aumenta el riesgo | false | 276 | {
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630 | Las variantes gen茅ticas funcionales en DC-SIGNR est谩n asociadas con la transmisi贸n del VIH-1 de madre a hijohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2752805/Boily-Larouche, Genevi猫ve; Iscache, Anne-Laure; Zijenah, Lynn S.; Humphrey, Jean H.; Mouland, Andrew J.; Ward, Brian J.; Roger, Michel2009-10-07DOI:10.1371/journal.pone.0007211Licencia:cc-byAbstract: ANTECEDENTES: La transmisi贸n de madre a hijo (MTCT) es la principal causa de infecci贸n por VIH-1 en ni帽os de todo el mundo. Dado que el receptor de lectina de tipo C, el receptor de lectina dendr铆tico espec铆fico para c茅lulas ICAM no relacionado con la integraci贸n (DC-SIGNR, tambi茅n conocido como CD209L o ganglio hep谩tico/linfa-nodo espec铆fico para ICAM no integrador (L-SIGN)), puede interactuar con pat贸genos incluyendo el VIH-1 y se expresa en la interfaz materno-fetal, se hipotetiza que podr铆a influir en la TCM del VIH-1. M脡TODOS Y INDICACIONES: Para investigar el papel potencial de DC-SIGNR en la TCM del VIH-1, realizamos un estudio de asociaci贸n gen茅tica de DC-SIGNR en una cohorte bien caracterizada de 197 madres infectadas por el VIH y sus beb茅s reclutados en Harare, Zimbabwe. Los lactantes que albergaban dos copias de los haplotipos DC-SIGNR H1 y/o H3 (H1-H1, H1-H3, H3-H3) tuvieron un aumento de 3,6 veces el riesgo de infecci贸n por VIH-1 en el 煤tero (UI) (P = 0,013) y un aumento de 5,7 veces el riesgo de infecci贸n por VIH-1 en el intraparto (IP) (P = 0,025) despu茅s de ajustarse para varios factores maternos. Los haplotipos H1 y H3 implicados comparten dos polimorfismos de nucle贸tidos 煤nicos (SNP) en la regi贸n promotora (p-198A) e intron 2 (int2-180A) que se asociaron con un aumento del riesgo de ambas UI (P = 0,045 y P = 0,003, respectivamente) e IP (P = 0,025, para la infecci贸n por VIH-1) La variante En los lactantes homocigotos H1 con mutaciones tanto p-198A como int2-180A, observamos una disminuci贸n de 4 veces en el nivel de transcripciones DC-SIGNR placentarias, afectando desproporcionadamente la expresi贸n de isoformas ligadas a la membrana en comparaci贸n con las no portadoras infantiles (P = 0,011). CONCLUSI脫N: Estos resultados sugieren que DC-SIGNR juega un papel crucial en la TCM del VIH-1 y que la expresi贸n DC-SIGNR placentaria alterada aumenta el riesgo de transmisi贸n. Texto: Sin intervenciones espec铆ficas, la tasa de transmisi贸n del VIH-1 de madre a hijo (TCMM) es de aproximadamente 15-45% [1]. ONUSIDA estima que solo el a帽o pasado, m谩s de 400.000 ni帽os fueron infectados en todo el mundo, principalmente a trav茅s de la TCM y el 90% de ellos viv铆an en el 脕frica subsahariana. En los pa铆ses m谩s afectados, como Zimbabwe, el La TCM del VIH-1 puede ocurrir durante el embarazo (in utero, UI), el parto (intraparto, IP) o la lactancia materna (postparto, PP). La alta carga viral materna, el bajo recuento de c茅lulas CD4, el parto vaginal, la baja edad gestacional se han identificado como factores independientes asociados con la TCM del VIH-1 [1]. Aunque los antirretrovirales pueden reducir la TCM al 2%, el acceso limitado a diagn贸sticos y medicamentos oportunos en muchos pa铆ses en desarrollo limita el impacto potencial de esta estrategia. Una mejor comprensi贸n de los mecanismos que act煤an en la interfaz materno-fetal es crucial para el dise帽o de intervenciones alternativas a la terapia antirretroviral para la prevenci贸n de la transmisi贸n. Las c茅lulas dentr铆ticas espec铆ficas de la ICAM no relacionadas con la integraci贸n (DC-SIGNR, tambi茅n conocido como CD209L o ICAM no integrador (L-SIGN)) pueden interactuar con una pl茅tora de pat贸genos incluyendo VIH-1 y se expresa en c茅lulas endoteliales capilares placentarias [2]. DC-SIGNR se organiza en tres dominios distintos, una cola citopl谩smica N-terminal, una regi贸n de repetici贸n que contiene siete repeticiones de 23 amino谩cidos y un dominio C-terminal implicado en la uni贸n de pat贸genos. El empalme alternativo del gen DC-SIGNR conduce a la producci贸n de un repertorio de isoformas altamente diversificadas que incluye isoformas asociadas a la membrana y solubles [3]. Se ha propuesto que la interacci贸n entre DC-SIGNR y VIH-1 podr铆a mejorar la transferencia viral a otros tipos de c茅lulas sensibles [2] pero DC-SIGNR tambi茅n puede internalizar y mediar la degradaci贸n dependiente de proteasomas de virus [4] que pueden afectar de manera diferente el resultado de la infecci贸n. Dada la presencia de DC-SIGNR en la interfaz materno-fetal y su interacci贸n con el VIH-1, se hizo una hip贸tesis de que podr铆a influir en la TCM del VIH-1. Para investigar el papel potencial de DC-SIGNR en la TCM del VIH-1, se llev贸 a cabo un estudio de asociaci贸n gen茅tica de DC-SIGNR en una cohorte bien caracterizada de madres infectadas por el VIH y sus beb茅s reclutados en Zimbabwe, y se identificaron variantes espec铆ficas de DC-SIGNR asociadas con el aumento de los riesgos de transmisi贸n del VIH. Adem谩s, caracterizamos el impacto funcional de estas variantes gen茅ticas en la expresi贸n DC-SIGNR y demostramos que afectan tanto al nivel como al tipo de transcripciones DC-SIGNR producidas en la placenta. Las muestras consistieron en extractos de ADN almacenados obtenidos de 197 parejas madre-hijo co-inscritas inmediatamente despu茅s del parto en el ensayo de suplementaci贸n de vitamina A de ZVITAMBO (Harare, Zimbabwe) y seguidos a 6 semanas e intervalos de 3 meses hasta 24 meses. El proyecto ZVITAMBO fue un ensayo cl铆nico aleatorizado controlado con placebo que incluy贸 a 14.110 parejas madre-hijo, entre noviembre de 1997 y enero de 2000, con el objetivo principal de investigar el impacto de la suplementaci贸n inmediata de vitamina A de postparto en la TCM del VIH-1. Las muestras utilizadas en el presente estudio fueron de parejas madre-hijo asignadas aleatoriamente al grupo placebo del proyecto ZVI La profilaxis antirretroviral para mujeres embarazadas VIH-1 positivas no estaba disponible en el sector p煤blico de Harare durante el reclutamiento de pacientes de ZVITAMBO. Las muestras fueron obtenidas consecutivamente de dos grupos: 97 parejas de madres VIH-1 positivas/hijos VIH-1 positivos y 100 parejas de madres VIH-1 positivas/ni帽os VIH-negativos. El estado serol贸gico de la madre fue determinado por ELISA y confirmado por Western Blot. Se consider贸 que los lactantes estaban infectados si eran seropositivos a los 18 meses o mayores y ten铆an dos o m谩s resultados positivos de reacci贸n en cadena de la polimerasa del VIH-1-DNA (PCR) a edades m谩s tempranas. Se consider贸 que 100 ni帽os no estaban infectados por ser ELISA negativos a los 18 meses o mayores y tuvieron dos resultados negativos de PCR de ADN de muestras recogidas a una edad m谩s temprana. De los 97 ni帽os infectados por el VIH-1, 57 fueron infectados IU, 11 fueron infectados IP y 17 fueron infectados PP seg煤n los an谩lisis de PCR de muestras de sangre recolectadas al nacer, 6 semanas, 3 y 6 meses de edad y seg煤n las siguientes definiciones adaptadas de Bryson y colegas [5]. Brevemente, los beb茅s con ADN PCR positivo al nacer fueron infectados IU. Los beb茅s con PCR negativo resultado de la muestra obtenida al nacer pero que se hicieron positivos por 6 semanas de edad fueron infectados IP. Los lactantes con resultados negativos de PCR al nacer y 6 semanas de edad pero que posteriormente se convirtieron en DNA PCR positivo fueron considerados infectados durante el per铆odo PP. En el an谩lisis de comparaci贸n de los 3 modos diferentes de TCM, 12 beb茅s infectados por el VIH-1 fueron excluidos porque los resultados de PCR no estaban disponibles a las 6 semanas de edad. M茅todos completos de reclutamiento, recolecci贸n de caracter铆sticas basales, procedimientos de laboratorio La variaci贸n de la secuencia de nucle贸tidos de todo el promotor, codificaci贸n y parte de las 39 regiones UTR del gen DC-SIGNR en la poblaci贸n del estudio se determin贸 previamente [7]. La reconstrucci贸n del haplotipo se realiz贸 utilizando el m茅todo estad铆stico Bayesiano implementado en FASE [8], versi贸n 2.1.1, utilizando polimorfismo nucle贸tido 煤nico (SNP) con una frecuencia m铆nima de alelos (MAF) del 2%. Aplicamos el algoritmo cinco veces, utilizando diferentes semillas generadas aleatoriamente, y se obtuvieron resultados consistentes a lo largo de las carreras (Figura 1 ). Quince SNPs con etiqueta de haplotipo (htSNPs) fueron identificados por el software HaploBlockFinder [9] con un MAF $5%. Estos htSNPs fueron genotipados en los 197 infantes mediante el an谩lisis de secuenciaci贸n PCR directo como hemos descrito El genotipo de regi贸n de repetici贸n DC-SIGNR 4 fue determinado por amplificaci贸n PCR seguida de migraci贸n en geles de agarosa del 1,5% [10]. Se analizaron secuencias de ADN en la regi贸n promotora con la interfaz TESS (http//:www.cbil.upenn.edu/tess) para sitios de uni贸n de factores de transcripci贸n putativos utilizando la base de datos TRANSFAC. Se realizaron ensayos de reporteros Luciferase utilizando vector pGL2-B谩sico para investigar el efecto funcional de mutaciones en la actividad promotora DC-SIGNR. El ADN gen贸mico de los sujetos homocigotos para las variantes promotoras y WT fue amplificado desde la posici贸n nucle贸tida 2715 a 21 y clonado entre los sitios de clonaci贸n m煤ltiple BglII y HindIII en el vector pGL2-Basico que alberga un gen luciferasa de luciferasa de reportero aguas abajo (Invitrogen Canada inc, Burlington, Canad谩). Todos los clones recombinantes fueron verificados por secuenciaci贸n de ADN. El vector reportero de prueba de luciferasa de luciferasa de luciferasa de luciferasa de luciferasa de fuego fue co-transfectado a una proporci贸n de 10:1 con el expresor constitutivo de Renilla luciferasa, phRL-CMV (Promega, Madison, WI, EE.UU.). Cultivamos c茅lulas Las c茅lulas se lisaron y se realizaron ensayos de luciferasa utilizando 20 mg de extracto proteico seg煤n el fabricante (Promega) a 44 h de post-transfecci贸n. La actividad luciferasa de Firefly se normaliz贸 a la actividad de Renilla luciferasa. El vector CMV-Tat de 0 mg, 0,5 mg o 1 mg se transfect贸 con LTR-Luc como un control positivo en estos experimentos. Realizamos ensayos de lucierasa por triplicado en tres experimentos independientes. Los resultados se expresan como error est谩ndar medio 6 (S.E.M.). Los tejidos placentarios de primer t茅rmino se obtuvieron a partir de abortos tras la interrupci贸n voluntaria del embarazo en CHUM H么pital Saint-Luc (Montreal, Canad谩). Se utilizaron tejidos de 3 H1 (asociados con TCM del VIH-1) y 3 H15 (tipo salvaje) haplotipos homocigotos para analizar posibles diferencias en la expresi贸n isoforma. Los ARN placentarios totales fueron extra铆dos por MasterPure DNA y ARN Extraction Kit (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI, USA) seg煤n el fabricante. Fragmentos correspondientes a la regi贸n de codificaci贸n DC-SIGNR fueron transcritos (RT) invertidas y luego amplificados por PCR anidados con los siguientes imprimadores; RT imprimadores RR, primer PCR RF y RR y segundo PCR RcF y RcR seg煤n Liu y colegas [11]. 1 mg de ARN total fue transcrito con Expand RT (Roche Applied Science, Indian谩polis, IN, EE.UU.) seg煤n el fabricante y fue amplificado con PCR de ADN Platinum Taq Polymerase (Invitrogen). Los principales productos de PCR de la segunda reacci贸n PCR fueron extra铆dos en gel con el Qiagen Gel Extraction Kit (Qiagen Canada inc, Mississauga, ON, Canad谩) y clonados utilizando el TOPO TA Cloning Kit para secuenciaci贸n (Invitrogen). Para cada placenta, 15 clones diferentes fueron seleccionados aleatoriamente y amplificados con imprimadores M13 y secuenciados con secuenciador automatizado ABI PRISM 3100 capilar (Applicated Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Las secuencias fueron analizadas y alineadas con secuencia de referencia GeneBank NM La expresi贸n cuantitativa de las isoformas DC-SIGNR 1,5 mg de ARN placentario fue transcrita inversamente utilizando 2,5 mM de Oligo dT 20 y Expand RT en 20 ml de volumen seg煤n el fabricante (Roche Applied Science). 15 ng de cDNA total en un volumen final de 20 ml se utiliz贸 para realizar PCR cuantitativa en tiempo real utilizando Universal Express SYBR GreenER qPCR Supermix (Invitrogen) en un Rotor Gene Realtime Rotary Analyser (Corbett Life Science, Sydney, Australia). Se utilizaron muestras de 2 sujetos en cada grupo porque la calidad ARN de otros no era adecuada para un an谩lisis QRT-PCR. La amplificaci贸n de todas las isoformas DC-SIGNR se realiz贸 utilizando un par de primos espec铆fico exon 5 (Tabla S1 ). Las isoformas ligadas a la membrana se amplificaron utilizando imprimaciones espec铆ficas para el ex贸n 3, correspondientes al dominio transmembrana com煤n de DC-SIGNR. Las primeras fueron dirigidas a la uni贸n exon-ex贸n y los extractos de ARN fueron tratados con Dnasa (Fermantas International inc, Burlington, ON, Canad谩) para evitar la amplificaci贸n del ADN contaminante. Las curvas est谩ndar (50-500 000 copias por reacci贸n) fueron generadas mediante diluci贸n en serie de un DC-SIGNR de larga duraci贸n o ADN de plasma GAPDH comercial (Invitrogen). Todas las reacciones de qPCR tuvieron eficiencias que oscilaban entre el 99% y el 100%, incluso en presencia de 20 ng de 谩cidos nucleicos no espec铆ficos, y por lo tanto se pudo comparar. El n煤mero de copias de muestras desconocidas se estim贸 colocando el n煤mero de ciclo de PCR medido (u Para corregir las diferencias en calidad de ARN y cantidad entre muestras, los niveles de expresi贸n de las transcripciones fueron normalizados a las transcripciones gen茅ticas GAPDH de referencia. Las secuencias de primos GAPDH fueron amablemente proporcionadas por A. Mes-Masson en el CHUM. Los resultados se presentan como n煤mero de copia g茅nica objetivo por 10 5 copias de GAPDH. La relaci贸n de isoformas ligadas a membranas fue calculada como E3/E5. Las isoformas solubles fueron calculadas restando uni贸n de membranas de isoformas totales. Realizamos ensayos de QPCR en triplicado en tres experimentos independientes. Los resultados se expresan como media6S.E.M. El an谩lisis estad铆stico se realiz贸 utilizando el GraphPad PRISM 5.0 para Windows (GraphPad Software inc, San Diego, CA, EE.UU.). Se compararon diferencias en las caracter铆sticas basales y frecuencias genot铆picas de haplotipos o htSNPs entre los grupos utilizando el an谩lisis x 2 o la prueba exacta de Fisher, se utiliz贸 el an谩lisis de regresi贸n log铆stica para estimar las odds ratios (OR) para cada genotipo y factores de riesgo basales, se utiliz贸 regresi贸n log铆stica m煤ltiple para definir predictores independientes identificados como significativos en el an谩lisis bruto, se calcularon las OR y el intervalo de confianza del 95% con el m茅todo exacto, se evaluaron comparaciones de variables continuas entre grupos con la t de Student no pareada cuando las variables se distribu铆an normalmente y con la U de Mann-Whitney cuando lo contrario, se consideraron significativas en P0,05. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todas las madres que participaron en el estudio y el ensayo de ZVITAMBO, y la investigaci贸n reportada en este trabajo fue aprobada por The We realiz贸 un estudio de asociaci贸n de polimorfismo DC-SIGNR en 197 ni帽os nacidos de madres infectadas con VIH-1 no tratadas reclutados en Harare, Zimbabwe. De ellos, 97 ni帽os fueron infectados con VIH-1 y 100 ni帽os permanecieron sin infecci贸n. De los 97 ni帽os infectados con VIH-1, 57 fueron infectados con IU, 11 con IP infectada y 17 infectados con PP. No se determin贸 el momento de la infecci贸n para 12 ni帽os infectados con VIH-1. Las caracter铆sticas basales de las madres y lactantes se presentan en la Tabla 1. La edad materna y el recuento de c茅lulas CD4, el sexo infantil, el modo de parto, la duraci贸n de la ruptura de membrana y la edad gestacional fueron similares entre todos los grupos. Sin embargo, la carga viral materna 29 000 copias/ml se asoci贸 con un aumento del riesgo tanto en UI como en PP con odds ratios (OR) de 3,64 (IC 95% = 1,82-7,31, P = 0,0002) y 4,45 (IC 95% = 1,50-13,2, P = 0,0045) para la transmisi贸n del VIH-1, respectivamente. En nuestras muestras de estudio (Tablas S2 y S3 ) se identificaron 15 SNPs marcados con haplotipos (htSNPs) correspondientes a los 15 haplotipos principales de DC-SIGNR (Figura 1 ). H1 (31%) y H3 (11%) fueron los haplotipos m谩s frecuentes observados (Figura 1 ) siendo homocigosos para el haplotipo H1 se asociaron con un aumento del riesgo de ambas UI (OR: 4, Los beb茅s que albergaban dos combinaciones de copias de haplotipos H1 y/ o H3 (H1-H1, H1-H3 o H3-H3) ten铆an un mayor riesgo de IU (OR: 3,42, P = 0,007) e IP (OR: 5,71, P = 0,025) pero no de infecci贸n por VIH-1 (P = 0,098) en comparaci贸n con los no portadores infantiles (Tabla 2 ). Estas 煤ltimas asociaciones siguieron siendo significativas tras el ajuste de la carga viral materna para ambas UI (OR: 3,57, IC 95% = 1,30-9,82, P = 0,013) e IP (OR: 5,71, IC 95% = 1,40-23, P = 0,025) transmisi贸n del VIH-1. Los haplotipos H1 y H3 comparten un grupo de mutaciones (p-198A, int2-391C, int2-180A, ex4 De estos, las variantes p-198A e int2-180A se asociaron significativamente con la TCM del VIH-1 (Tabla S2 ). En el an谩lisis de regresi贸n no ajustado, los lactantes homocigotos para las variantes p-198A e int2-180A presentaron un aumento del riesgo de UI (OR: 2,07 P = 0,045, OR: 3,78, P = 0,003, respectivamente) e IP (OR: 2,47, P = 0,17, O.R: 5,71, P = 0,025, respectivamente) infecci贸n por VIH-1 en comparaci贸n con los lactantes o no portadores de heterocigoto (Tabla 3). Cuando se realiz贸 ajuste por factores maternos, s贸lo la asociaci贸n con la variante int2-180A sigui贸 siendo significativa para la transmisi贸n por IU (OR: 3,83, IC 95% = 1,42-10, 4, P = 0,008) e IP As铆, los beb茅s homocigotos para la variante DC-SIGNR int2-180A contenida en los haplotipos H1 y H3 tuvieron 4 a 6 veces m谩s probabilidades de ser infectados por el VIH-1 durante el embarazo o durante el parto, respectivamente. La empalme alternativa del gen DC-SIGNR en la placenta produce ambos repertorios isoformados unidos a membrana y solubles [3]. La proporci贸n relativa de DC-SIGNR unido a membrana y soluble podr铆a influir de manera plausible en la susceptibilidad a la infecci贸n VIH-1 [11]. Por lo tanto, hicimos una hip贸tesis de que las mutaciones DC-SIGNR asociadas con la TCM del VIH-1 tendr铆an un impacto tanto en el nivel de expresi贸n DC-SIGNR y en el repertorio isoforma producido. Se clon贸 DC-SIGNR a partir de tejidos placentarios mediante RT-PCR a partir de 3 muestras H1 homocigotas que conten铆an tanto las variantes DC-SIGNR p-198AA e int2-180AA asociadas a la transmisi贸n del VIH-1 y 3 muestras de tipo salvaje homocigoto (WT) (p-198CC, int2-180GG). Se seleccionaron quince clones por muestra al azar para su secuenciaci贸n. Como era de esperar, se encontr贸 un amplio repertorio de transcripciones DC-SIGNR en todas las muestras con 9 a 16 isoformas diferentes por individuo. Se identificaron un total de 65 transcripciones distintas (Figura S1), de las cuales 3 eran transcripciones de duraci贸n completa. 64 de los clones secuenciados conten铆an un total de 69 sustituciones de amino谩cidos con 3 nuevos C terminos y 2 codones de parada Sin embargo, la diversidad se atribuy贸 principalmente a la eliminaci贸n total del ex贸n 2 o ex贸n 3 o a variaciones en la longitud de la regi贸n del cuello (ex贸n 4) del DC-SIGNR. La eliminaci贸n del ex贸n 3 elimina el dominio transmembrana de la prote铆na y conduce a la expresi贸n de isoformas solubles del DC-SIGNR [3]. Curiosamente, la abundancia de isoformas ligadas a la membrana en los tejidos placentarios de los homocigotos H1 parece ser menor que la observada en muestras de individuos de WT (Figura S1 ). La eliminaci贸n del ex贸n 3 fue confirmada por la secuenciaci贸n e hipotetizamos que el salto de ex贸n 3 podr铆a deberse a la presencia de la mutaci贸n int2-180A observada en lactantes con el haplotipo H1. De hecho, esta mutaci贸n intron se encuentra 180 pb aguas abajo del ex贸n 3 y potencialmente modifica los eventos de empalme (Figura 2A ). Confirmamos que la variaci贸n en las proporciones de transcripci贸n observadas entre los dos grupos tambi茅n se reflej贸 en el nivel de expresi贸n del ARNm en la placenta. Para cuantificar las isoformas unidos a la membrana frente a las isoformas solubles en muestras placentarias de beb茅s homocigosos H1 y WT, amplificamos la secuencia del ex贸n 5 (E5) presente en todas las isoformas DC-SIGNR (transcripciones totales). Luego amplificamos el ex贸n 3 (E3) que se elimina en las formas solubles y luego calculamos la relaci贸n E3:E5. Se encontr贸 que los tejidos placentarios de los lactantes homocigosos H1 expresan una proporci贸n significativamente menor de DC-SIGNR unido a la membrana (18%) en comparaci贸n con los de los individuos WT (36%) (P = 0,004) (Figura 2B ) sugiriendo que el salto de ex贸n 3 ocurre con mayor frecuencia en presencia de la variante DC-SIGNR int2-180A asociada con el TCM del VIH-1. La variante DC-SIGNR int2-180A siempre se transmite con la mutaci贸n promotora p-198A (Figura 1 ). En el an谩lisis de regresi贸n no ajustado, la variante p-198A se asoci贸 significativamente con UI pero no con la transmisi贸n IP y PP VIH-1 (Tabla 3). El an谩lisis del sitio de uni贸n del factor de transcripci贸n computacional predice Tabla 1. Figura 3A ). La actividad luciferasa del constructo variante p-198A fue significativamente menor que la del constructo promotor de WT p-198C (p-198C/A ratio = 2, P = 0,006) (Figura 3B ) sugiriendo que DC-SIGNR p-198A afecta a la actividad promotora. Los otros mutantes promotores (p-577C y p-323A) observados en la poblaci贸n zimbabuense no afectaron a la transcripci贸n DC-SIGNR en este ensayo (Figura S2). Para determinar el impacto neto de la mutaci贸n DC-SIGNR p-198A sobre la expresi贸n DC-SIGNR en la placenta, cuantificamos el n煤mero absoluto de transcripciones DC-SIGNR totales y de uni贸n de membrana en las muestras homocigoto H1 y placentales de tipo salvaje El n煤mero total de transcripciones DC-SIGNR se determin贸 en 6856213 (copias DC-SIGNR6S.E.M por 10 5 copias GAPDH) en las muestras placentarias de lactantes homocig贸ticos H1 y fue 4 veces menor en comparaci贸n con la encontrada en las placentas de individuos WT (27816638, P = 0.011) (Figura 3C ). Como se sugiri贸 anteriormente, la mutaci贸n int2-180A podr铆a inducir el salto de ex贸n 3 dando lugar a una menor producci贸n de DC-SIGNR unido a membrana. Aunque la disminuci贸n en el n煤mero total de transcripciones DC-SIGNR en muestras placentarias homocig贸ticas H1 que conten铆an tanto las variantes p-198AA como int2-180AA afect贸 la proporci贸n de isoformas solubles y ligadas a la membrana, el efecto de estas mutaciones fue m谩s pronunciado en las isoformas ligadas a la membrana con una disminuci贸n de 8 veces (H1 = 117636,2 vs WT = 9906220,6; P = 0,003) en comparaci贸n con una disminuci贸n de 3 veces en las isoformas solubles totales (H1 = 5686181,9 vs WT = 19256495,3; P = 0,03) (Figura 3C). Por lo tanto, las mutaciones DC-SIGNR p-198A e int2-180A asociadas con la TCM del VIH-1 disminuyeron significativamente el nivel Tabla 3. Asociaciones entre el promotor de DC-SIGNR infantil p-198 e intron 2 (int2)-180 variantes e intrauterina (UI), intraparto (IP) y postparto (PP) transmisi贸n del VIH-1 de madre a hijo. Nuestros resultados gen茅ticos, apoyados por el ensayo de expresi贸n en placenta, sugieren la implicaci贸n de DC-SIGNR en el TCM del VIH-1. La homocigosidad para el haplotipo H1 se asoci贸 con la transmisi贸n de UI en el an谩lisis de regresi贸n no ajustada. Sin embargo, la asociaci贸n desapareci贸 despu茅s del ajuste para los factores maternos presumiblemente debido al peque帽o n煤mero de beb茅s homocigotos H1 analizados en cada grupo. H1 y H3 fueron los haplotipos m谩s frecuentes observados en la poblaci贸n del estudio y comparten un grupo de mutaciones (Figura 1 ). La agrupaci贸n de haplotipos H1 y H3 aument贸 el poder del estudio y permiti贸 la identificaci贸n de mutaciones DC-SIGNR espec铆ficas asociadas con la TCM del VIH-1. De hecho, dos mutaciones compartidas por los haplotipos H1 y H3 se asociaron con la transmisi贸n vertical del VIH-1. La int2-180A se asoci贸 con un aumento de 4 veces en el riesgo de UI y 6 veces en el riesgo de IP despu茅s del ajuste por los factores maternos. Aunque la variante p-198A se asoci贸 con la transmisi贸n UI, la asociaci贸n desapareci贸 despu茅s del ajuste por la carga viral materna. Sin embargo, se demostr贸 que esta mutaci贸n reduce la actividad transcripcional DC-SIGNR in vitro y produce un menor nivel de transcripciones DC-SIGNR en tejidos placentarios en combinaci贸n con la variante int2-180A. Dado que int2-180A siempre se transmite con p-198A en los haplotipos combinados asociados a la ETMT H1/H3, mientras que p-198A se lleva a cabo en otros haplotipos no asociados (Figura 1), podemos especular que la mutaci贸n p-198A sola puede tener un efecto menor in vivo, mientras que en combinaci贸n con la variante int2-180A, ambos act煤an para reducir el nivel de expresi贸n DC-SIGNR placentaria que resulta en un aumento del riesgo de ETM de VIH-1. La mayor铆a de la transmisi贸n de UI ocurre durante el 煤ltimo trimestre del embarazo (revisado en [12] ). Las muestras de placenta a t茅rmino completo no estaban disponibles para el estudio actual y los ensayos de expresi贸n se realizaron en tejidos placentales de primer plazo. Un estudio previo que analiz贸 el repertorio de isoformas placentarias DC-SIGNR en muestras de placenta a t茅rmino demostr贸 una diversidad similar de transcripciones DC-SIGNR como en los tejidos placentarios de primer t茅rmino estudiados en este estudio [3]. Sin embargo, dado que los niveles de expresi贸n DC-SIGNR nunca se han comparado entre los diferentes t茅rminos del embarazo, no se sabe si la expresi贸n DC-SIGNR var铆a durante el embarazo. Sin embargo, es razonable suponer que las diferencias interindividuales tanto en el repertorio isoformo de DC-SIGNR como en los niveles de transcripci贸n observados entre los beb茅s homocig贸ticos H1 y WT se reflejar铆an a lo largo del embarazo. Hasta la fecha, la mayor铆a de los estudios se han centrado en el papel potencial de DC-SIGNR en la infecci贸n trans del VIH-1 in vitro [2, 10]. Sin embargo, los m煤ltiples mecanismos involucrados en la infecci贸n trans y redundancia entre las funciones de la lectina de tipo C dificultan la determinaci贸n de la participaci贸n real de DC-SIGNR en este modo de infecci贸n in vivo [13, 14]. La fuerte correlaci贸n que observamos entre la transmisi贸n vertical del VIH-1 y las variantes gen茅ticas de DC-SIGNR que producen bajos niveles de DC-SIGNR en la placenta sugiere que mecanismos distintos de la infecci贸n trans mediada por DC-SIGNR podr铆an operar durante la transmisi贸n vertical del VIH-1. Por ejemplo, DC-SIGNR tambi茅n ha demostrado funcionar como receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor [15]. Chan y sus colegas demostraron recientemente que las c茅lulas CHO transfectadas por DC-SIGNR disminuyen los t铆tulos de SARS-CoV mediante una mayor captura y degradaci贸n del virus de manera dependiente del proteasoma [4]. Dado que las c茅lulas endoteliales expresan MHC-I y II, los ant铆genos virales degradados podr铆an presentarse a las c茅lulas inmunes para provocar una respuesta inmune adaptativa [16, 17]. El receptor de n煤cleo HIV-1 CCR5, pero no CD4, se coexpresa con DC-SIGNR en las c茅lulas endoteliales placentarias y de barrera hematoencef谩lica (BBB) [18, 19]. La uni贸n del VIH-1 gp120 al receptor CCR5 en las c茅lulas endoteliales compromete la integridad del BBB y aumenta la adhesi贸n y transmigraci贸n de los monocitos a trav茅s del BBB [20, 21]. Por lo tanto, es posible que una menor expresi贸n de DC-SIGNR, en particular las isoformas ligadas a la membrana, en las c茅lulas endoteliales capilares placentarias pueda favorecer la uni贸n del VIH-1 al receptor CCR5, en lugar del receptor DC-SIGNR, facilitando la migraci贸n de las c茅lulas maternas infectadas por el VIH-1 a trav茅s de la barrera placentaria que resulta en la transmisi贸n UI del VIH-1. La variante int2-180A contenida en los haplotipos H1 y H3 se asoci贸 con la transmisi贸n IP, lo que sugiere que DC-SIGNR tambi茅n afecta a la transmisi贸n del VIH-1 durante el parto. El paso por el canal del parto podr铆a exponer potencialmente a los beb茅s a trav茅s de una entrada en el portal de la mucosa (presumiblemente oftalmol贸gica, cut谩nea o gastrointestinal), mientras que el insulto placentario durante el parto (f铆sico o inflamatorio) puede mejorar el paso transplacental de las c茅lulas maternas infectadas por el VIH-1 a la circulaci贸n fetal [22, 23]. Este proceso llamado microtransfusi贸n se ha propuesto con respecto a los resultados obtenidos en una cohorte malauiana. Kweik y sus colegas encontraron una asociaci贸n significativa entre los niveles de ADN materno en la sangre del cord贸n umbilical y la transmisi贸n IP del VIH-1, lo que sugiere que es probable que el paso de c茅lulas maternas infectadas a trav茅s de la placenta ocurra durante el parto [22]. As铆, de manera similar a lo sugerido anteriormente para la transmisi贸n de la IU, el nivel relativamente inferior de DC-SIGNR en la placenta de los beb茅s homocigotos que albergan la variante int2-180A podr铆a promover la uni贸n del VIH-1 al receptor CCR5 en las c茅lulas endoteliales que afectan la integridad de la barrera placentaria y facilitan el paso de las c茅lulas maternas infectadas en la circulaci贸n fetal durante el parto. Adem谩s de DC-SIGNR, se sabe que otros receptores del VIH-1 influyen en la TCM del VIH-1 (revisado en [24] ). Se ha demostrado que las variantes gen茅ticas de la CCR5 influyen en la transmisi贸n vertical del VIH-1. Las variantes promotoras de la CCR5 que resultan en una mayor expresi贸n del receptor se asocian con un mayor riesgo de TCM del VIH-1 entre los africanos subsaharianos [25, 26]. El polimorfismo de eliminaci贸n de 32 pb en la CCR5 se ha demostrado que protege de la transmisi贸n vertical del VIH-1 [27], pero esta variante est谩 pr谩cticamente ausente entre las poblaciones africanas [28]. El elevado n煤mero de copias de CCL3L1, un potente ligando supresor del VIH-1 para la CCR5, est谩 asociado con una mayor producci贸n de quimioquinas y un menor riesgo de TCM del VIH-1 entre los lactantes sudafricanos [29, 30]. La lectina de uni贸n a la manosa (MBL) es un receptor inmune innato sintetizado en el h铆gado y segregado en el torrente sangu铆neo en respuesta a la se帽al de inflamaci贸n. MBL promueve la eliminaci贸n de pat贸genos por opsonizaci贸n y fagocitosis, y la expresi贸n reducida de MBL resultante de polimorfismo en regiones codificantes y no codificantes se ha asociado con un aumento del riesgo de TCM del VIH En este estudio, demostramos por primera vez, el impacto funcional potencial de las mutaciones DC-SIGNR en su expresi贸n en la placenta y en la transmisi贸n vertical del VIH-1. Creemos que la presencia de DC-SIGNR en la superficie celular endotelial placentaria puede proteger a los beb茅s de la infecci贸n por el VIH-1 capturando virus y promoviendo su degradaci贸n/presentaci贸n. Sin embargo, en la placenta que contiene bajos niveles de DC-SIGNR, el VIH-1 se une preferentemente al CCR5 en c茅lulas endotelial, lo que resulta en una p茅rdida de integridad de la barrera placentaria y un mayor paso de las c茅lulas maternas infectadas por el VIH-1 en la circulaci贸n fetal que conduce al TCM del VIH-1. Este mecanismo tambi茅n puede aplicarse a otros pat贸genos transmitidos verticalmente conocidos por interactuar con DC-SIGNR como el VIH-2, hepatitis C y virus del dengue y Las asociaciones entre los genotipos de regi贸n repetida de DC-SIGNR infantil exon 4 y la transmisi贸n del VIH-1 de madre a hijo.CI, Intervalo de confianza; N, n煤mero; NA; no aplicable; OR, odds ratio a P-value seg煤n lo determinado por la prueba Chi-cuadrado. b Comparaci贸n entre el genotipo y todos los dem谩s. Se encontr贸 en: doi:10.1371/journal.pone.0007211.s003 (0,05 MB DOC) Figura S1 DC-SIGNR transcripciones repertorio en placenta. Los principales productos RT-PCR a partir del extracto de ARN de 3 muestras homocig贸ticas H1 y 3 homocig贸ticas WT placenta fueron purificadas, clonadas y secuenciadas. Se analizaron las secuencias seg煤n la secuencia de referencia NCBI NM_014257. TC; cola citoplasm谩tica, TM; dominio transmembrana; WT; tipo salvaje Se encontr贸 en: doi:10.1371/journal.pone.0007211.s004 (0,11 MB DOC) Figura S2 Efecto de la variante promotora DC-SIGNR sobre la actividad transcripcional en el ensayo de reporter de luciferasa in vitro en c茅lulas transfectadas HeLa. Expresi贸n relativa de luciferasa de pGL2-Basico, vector parental sin promotor. Expresi贸n Constructos de promotor DC-SIGNR, variante p-577C o variante p-323A se calcularon relativamente a este valor. Los datos se presentan en valores medios6S.E.M de tres experimentos independientes realizados por triplicado. Para comparar la expresi贸n relativa de luciferasa de los receptores de variantes p-557C y p-323A contra el constructo de tipo salvaje (WT) se utiliz贸 la prueba ANOVA de ida seguida de la prueba Dunnett para la comparaci贸n m煤ltiple. El vector CMV-Tat de 0 mg, 0,5 mg o 1 mg se transfect贸 con LTR-Luc como control positivo en estos experimentos. | 驴Cu谩ntos ni帽os fueron infectados por el VIH-1 en 2008-2009, en todo el mundo? | false | 278 | {
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630 | Las variantes gen茅ticas funcionales en DC-SIGNR est谩n asociadas con la transmisi贸n del VIH-1 de madre a hijohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2752805/Boily-Larouche, Genevi猫ve; Iscache, Anne-Laure; Zijenah, Lynn S.; Humphrey, Jean H.; Mouland, Andrew J.; Ward, Brian J.; Roger, Michel2009-10-07DOI:10.1371/journal.pone.0007211Licencia:cc-byAbstract: ANTECEDENTES: La transmisi贸n de madre a hijo (MTCT) es la principal causa de infecci贸n por VIH-1 en ni帽os de todo el mundo. Dado que el receptor de lectina de tipo C, el receptor de lectina dendr铆tico espec铆fico para c茅lulas ICAM no relacionado con la integraci贸n (DC-SIGNR, tambi茅n conocido como CD209L o ganglio hep谩tico/linfa-nodo espec铆fico para ICAM no integrador (L-SIGN)), puede interactuar con pat贸genos incluyendo el VIH-1 y se expresa en la interfaz materno-fetal, se hipotetiza que podr铆a influir en la TCM del VIH-1. M脡TODOS Y INDICACIONES: Para investigar el papel potencial de DC-SIGNR en la TCM del VIH-1, realizamos un estudio de asociaci贸n gen茅tica de DC-SIGNR en una cohorte bien caracterizada de 197 madres infectadas por el VIH y sus beb茅s reclutados en Harare, Zimbabwe. Los lactantes que albergaban dos copias de los haplotipos DC-SIGNR H1 y/o H3 (H1-H1, H1-H3, H3-H3) tuvieron un aumento de 3,6 veces el riesgo de infecci贸n por VIH-1 en el 煤tero (UI) (P = 0,013) y un aumento de 5,7 veces el riesgo de infecci贸n por VIH-1 en el intraparto (IP) (P = 0,025) despu茅s de ajustarse para varios factores maternos. Los haplotipos H1 y H3 implicados comparten dos polimorfismos de nucle贸tidos 煤nicos (SNP) en la regi贸n promotora (p-198A) e intron 2 (int2-180A) que se asociaron con un aumento del riesgo de ambas UI (P = 0,045 y P = 0,003, respectivamente) e IP (P = 0,025, para la infecci贸n por VIH-1) (p En los lactantes homocigotos H1 con mutaciones tanto p-198A como int2-180A, observamos una disminuci贸n de 4 veces en el nivel de transcripciones DC-SIGNR placentarias, afectando desproporcionadamente la expresi贸n de isoformas ligadas a la membrana en comparaci贸n con las no portadoras infantiles (P = 0,011). CONCLUSI脫N: Estos resultados sugieren que DC-SIGNR juega un papel crucial en la TCM del VIH-1 y que la expresi贸n DC-SIGNR placentaria alterada aumenta el riesgo de transmisi贸n. Texto: Sin intervenciones espec铆ficas, la tasa de transmisi贸n del VIH-1 de madre a hijo (TCMM) es de aproximadamente 15-45% [1]. ONUSIDA estima que solo el a帽o pasado, m谩s de 400.000 ni帽os fueron infectados en todo el mundo, principalmente a trav茅s de la TCM y el 90% de ellos viv铆an en el 脕frica subsahariana. En los pa铆ses m谩s afectados, como Zimbabwe, el La TCM del VIH-1 puede ocurrir durante el embarazo (in utero, UI), el parto (intraparto, IP) o la lactancia materna (postparto, PP). La alta carga viral materna, el bajo recuento de c茅lulas CD4, el parto vaginal, la baja edad gestacional se han identificado como factores independientes asociados con la TCM del VIH-1 [1]. Aunque los antirretrovirales pueden reducir la TCM al 2%, el acceso limitado a diagn贸sticos y medicamentos oportunos en muchos pa铆ses en desarrollo limita el impacto potencial de esta estrategia. Una mejor comprensi贸n de los mecanismos que act煤an en la interfaz materno-fetal es crucial para el dise帽o de intervenciones alternativas a la terapia antirretroviral para la prevenci贸n de la transmisi贸n. Las c茅lulas dentr铆ticas espec铆ficas de la ICAM no relacionadas con la integrina (DC-SIGNR, tambi茅n conocido como CD209L o ICAM no integradora (L-SIGN)) pueden interactuar con una pl茅tora de pat贸genos incluyendo VIH-1 y se expresa en c茅lulas endoteliales capilares placentarias [2]. DC-SIGNR se organiza en tres dominios distintos, una cola citoplasm谩tica N-terminal, una regi贸n de repetici贸n que contiene siete repeticiones de 23 amino谩cidos y un dominio C-terminal implicado en la uni贸n de pat贸genos. El empalme alternativo del gen DC-SIGNR conduce a la producci贸n de un repertorio de isoformas altamente diversificadas que incluye isoformas asociadas a la membrana y solubles [3]. Se ha propuesto que la interacci贸n entre DC-SIGNR y VIH-1 podr铆a mejorar la transferencia viral a otros tipos de c茅lulas sensibles [2] pero DC-SIGNR tambi茅n puede internalizar y mediar la degradaci贸n dependiente de proteasomas de virus [4] que pueden afectar de manera diferente el resultado de la infecci贸n. Dada la presencia de DC-SIGNR en la interfaz materno-fetal y su interacci贸n con el VIH-1, se hizo una hip贸tesis de que podr铆a influir en la TCM del VIH-1. Para investigar el papel potencial de DC-SIGNR en la TCM del VIH-1, se llev贸 a cabo un estudio de asociaci贸n gen茅tica de DC-SIGNR en una cohorte bien caracterizada de madres infectadas por el VIH y sus beb茅s reclutados en Zimbabwe, y se identificaron variantes espec铆ficas de DC-SIGNR asociadas con el aumento de los riesgos de transmisi贸n del VIH. Adem谩s, caracterizamos el impacto funcional de estas variantes gen茅ticas en la expresi贸n DC-SIGNR y demostramos que afectan tanto al nivel como al tipo de transcripciones DC-SIGNR producidas en la placenta. Las muestras consistieron en extractos de ADN almacenados obtenidos de 197 parejas madre-hijo co-inscritas inmediatamente despu茅s del parto en el ensayo de suplementaci贸n de vitamina A de ZVITAMBO (Harare, Zimbabwe) y seguidos a 6 semanas e intervalos de 3 meses hasta 24 meses. El proyecto ZVITAMBO fue un ensayo cl铆nico aleatorizado controlado con placebo que incluy贸 a 14.110 parejas madre-hijo, entre noviembre de 1997 y enero de 2000, con el objetivo principal de investigar el impacto de la suplementaci贸n inmediata de vitamina A de postparto en la TCM del VIH-1. Las muestras utilizadas en el presente estudio fueron de parejas madre-hijo asignadas aleatoriamente al grupo placebo del proyecto ZVI La profilaxis antirretroviral para mujeres embarazadas VIH-1 positivas no estaba disponible en el sector p煤blico de Harare durante el reclutamiento de pacientes de ZVITAMBO. Las muestras fueron obtenidas consecutivamente de dos grupos: 97 parejas de madres VIH-1 positivas/hijos VIH-1 positivos y 100 parejas de madres VIH-1 positivas/ni帽os VIH-negativos. El estado serol贸gico de la madre fue determinado por ELISA y confirmado por Western Blot. Se consider贸 que los lactantes estaban infectados si eran seropositivos a los 18 meses o mayores y ten铆an dos o m谩s resultados positivos de reacci贸n en cadena de la polimerasa del VIH-1-DNA (PCR) a edades m谩s tempranas. Se consider贸 que 100 ni帽os no estaban infectados por ser ELISA negativos a los 18 meses o mayores y tuvieron dos resultados negativos de PCR de ADN de muestras recogidas a una edad m谩s temprana. De los 97 ni帽os infectados por el VIH-1, 57 fueron infectados IU, 11 fueron infectados IP y 17 fueron infectados PP seg煤n los an谩lisis de PCR de muestras de sangre recolectadas al nacer, 6 semanas, 3 y 6 meses de edad y seg煤n las siguientes definiciones adaptadas de Bryson y colegas [5]. Brevemente, los beb茅s con ADN PCR positivo al nacer fueron infectados IU. Los beb茅s con PCR negativo resultado de la muestra obtenida al nacer pero que se hicieron positivos por 6 semanas de edad fueron infectados IP. Los lactantes con resultados negativos de PCR al nacer y 6 semanas de edad pero que posteriormente se convirtieron en DNA PCR positivo fueron considerados infectados durante el per铆odo PP. En el an谩lisis de comparaci贸n de los 3 modos diferentes de TCM, 12 beb茅s infectados por el VIH-1 fueron excluidos porque los resultados de PCR no estaban disponibles a las 6 semanas de edad. M茅todos completos de reclutamiento, recolecci贸n de caracter铆sticas basales, procedimientos de laboratorio La variaci贸n de la secuencia de nucle贸tidos de todo el promotor, codificaci贸n y parte de las 39 regiones UTR del gen DC-SIGNR en la poblaci贸n del estudio se determin贸 previamente [7]. La reconstrucci贸n del haplotipo se realiz贸 utilizando el m茅todo estad铆stico Bayesiano implementado en FASE [8], versi贸n 2.1.1, utilizando polimorfismo nucle贸tido 煤nico (SNP) con una frecuencia m铆nima de alelos (MAF) del 2%. Aplicamos el algoritmo cinco veces, utilizando diferentes semillas generadas aleatoriamente, y se obtuvieron resultados consistentes a lo largo de las carreras (Figura 1 ). Quince SNPs con etiqueta de haplotipo (htSNPs) fueron identificados por el software HaploBlockFinder [9] con un MAF $5%. Estos htSNPs fueron genotipados en los 197 infantes mediante el an谩lisis de secuenciaci贸n PCR directo como hemos descrito El genotipo de regi贸n de repetici贸n DC-SIGNR 4 fue determinado por amplificaci贸n PCR seguida de migraci贸n en geles de agarosa del 1,5% [10]. Se analizaron secuencias de ADN en la regi贸n promotora con la interfaz TESS (http//:www.cbil.upenn.edu/tess) para sitios de uni贸n de factores de transcripci贸n putativos utilizando la base de datos TRANSFAC. Se realizaron ensayos de reporteros Luciferase utilizando vector pGL2-B谩sico para investigar el efecto funcional de mutaciones en la actividad promotora DC-SIGNR. El ADN gen贸mico de los sujetos homocigotos para las variantes promotoras y WT fue amplificado desde la posici贸n nucle贸tida 2715 a 21 y clonado entre los sitios de clonaci贸n m煤ltiple BglII y HindIII en el vector pGL2-Basico que alberga un gen luciferasa de luciferasa de reportero aguas abajo (Invitrogen Canada inc, Burlington, Canad谩). Todos los clones recombinantes fueron verificados por secuenciaci贸n de ADN. El vector reportero de prueba de luciferasa de luciferasa de luciferasa de luciferasa de luciferasa de fuego fue co-transfectado a una proporci贸n de 10:1 con el expresor constitutivo de Renilla luciferasa, phRL-CMV (Promega, Madison, WI, EE.UU.). Cultivamos c茅lulas Las c茅lulas se lisaron y se realizaron ensayos de luciferasa utilizando 20 mg de extracto proteico seg煤n el fabricante (Promega) a 44 h de post-transfecci贸n. La actividad luciferasa de Firefly se normaliz贸 a la actividad de Renilla luciferasa. El vector CMV-Tat de 0 mg, 0,5 mg o 1 mg se transfect贸 con LTR-Luc como un control positivo en estos experimentos. Realizamos ensayos de lucierasa por triplicado en tres experimentos independientes. Los resultados se expresan como error est谩ndar medio 6 (S.E.M.). Los tejidos placentarios de primer t茅rmino se obtuvieron a partir de abortos tras la interrupci贸n voluntaria del embarazo en CHUM H么pital Saint-Luc (Montreal, Canad谩). Se utilizaron tejidos de 3 H1 (asociados con TCM del VIH-1) y 3 H15 (tipo salvaje) haplotipos homocigotos para analizar posibles diferencias en la expresi贸n isoforma. Los ARN placentarios totales fueron extra铆dos por MasterPure DNA y ARN Extraction Kit (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI, USA) seg煤n el fabricante. Fragmentos correspondientes a la regi贸n de codificaci贸n DC-SIGNR fueron transcritos (RT) invertidas y luego amplificados por PCR anidados con los siguientes imprimadores; RT imprimadores RR, primer PCR RF y RR y segundo PCR RcF y RcR seg煤n Liu y colegas [11]. 1 mg de ARN total fue transcrito con Expand RT (Roche Applied Science, Indian谩polis, IN, EE.UU.) seg煤n el fabricante y fue amplificado con PCR de ADN Platinum Taq Polymerase (Invitrogen). Los principales productos de PCR de la segunda reacci贸n PCR fueron extra铆dos en gel con el Qiagen Gel Extraction Kit (Qiagen Canada inc, Mississauga, ON, Canad谩) y clonados utilizando el TOPO TA Cloning Kit para secuenciaci贸n (Invitrogen). Para cada placenta, 15 clones diferentes fueron seleccionados aleatoriamente y amplificados con imprimadores M13 y secuenciados con secuenciador automatizado ABI PRISM 3100 capilar (Applicated Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Las secuencias fueron analizadas y alineadas con secuencia de referencia GeneBank NM La expresi贸n cuantitativa de las isoformas DC-SIGNR 1,5 mg de ARN placentario fue transcrita inversamente utilizando 2,5 mM de Oligo dT 20 y Expand RT en 20 ml de volumen seg煤n el fabricante (Roche Applied Science). 15 ng de cDNA total en un volumen final de 20 ml se utiliz贸 para realizar PCR cuantitativa en tiempo real utilizando Universal Express SYBR GreenER qPCR Supermix (Invitrogen) en un Rotor Gene Realtime Rotary Analyser (Corbett Life Science, Sydney, Australia). Se utilizaron muestras de 2 sujetos en cada grupo porque la calidad ARN de otros no era adecuada para un an谩lisis QRT-PCR. La amplificaci贸n de todas las isoformas DC-SIGNR se realiz贸 utilizando un par de primos espec铆fico exon 5 (Tabla S1 ). Las isoformas ligadas a la membrana se amplificaron utilizando imprimaciones espec铆ficas para el ex贸n 3, correspondientes al dominio transmembrana com煤n de DC-SIGNR. Las primeras fueron dirigidas a la uni贸n exon-ex贸n y los extractos de ARN fueron tratados con Dnasa (Fermantas International inc, Burlington, ON, Canad谩) para evitar la amplificaci贸n del ADN contaminante. Las curvas est谩ndar (50-500 000 copias por reacci贸n) fueron generadas mediante diluci贸n en serie de un DC-SIGNR de larga duraci贸n o ADN de plasma GAPDH comercial (Invitrogen). Todas las reacciones de qPCR tuvieron eficiencias que oscilaban entre el 99% y el 100%, incluso en presencia de 20 ng de 谩cidos nucleicos no espec铆ficos, y por lo tanto se pudo comparar. El n煤mero de copias de muestras desconocidas se estim贸 colocando el n煤mero de ciclo de PCR medido (u Para corregir las diferencias en calidad de ARN y cantidad entre muestras, los niveles de expresi贸n de las transcripciones fueron normalizados a las transcripciones gen茅ticas GAPDH de referencia. Las secuencias de primos GAPDH fueron amablemente proporcionadas por A. Mes-Masson en el CHUM. Los resultados se presentan como n煤mero de copia g茅nica objetivo por 10 5 copias de GAPDH. La relaci贸n de isoformas ligadas a membranas fue calculada como E3/E5. Las isoformas solubles fueron calculadas restando uni贸n de membranas de isoformas totales. Realizamos ensayos de QPCR en triplicado en tres experimentos independientes. Los resultados se expresan como media6S.E.M. El an谩lisis estad铆stico se realiz贸 utilizando el GraphPad PRISM 5.0 para Windows (GraphPad Software inc, San Diego, CA, EE.UU.). Se compararon diferencias en las caracter铆sticas basales y frecuencias genot铆picas de haplotipos o htSNPs entre los grupos utilizando el an谩lisis x 2 o la prueba exacta de Fisher, se utiliz贸 el an谩lisis de regresi贸n log铆stica para estimar las odds ratios (OR) para cada genotipo y factores de riesgo basales, se utiliz贸 regresi贸n log铆stica m煤ltiple para definir predictores independientes identificados como significativos en el an谩lisis bruto, se calcularon las OR y el intervalo de confianza del 95% con el m茅todo exacto, se evaluaron comparaciones de variables continuas entre grupos con la t de Student no pareada cuando las variables se distribu铆an normalmente y con la U de Mann-Whitney cuando lo contrario, se consideraron significativas en P0,05. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todas las madres que participaron en el estudio y el ensayo de ZVITAMBO, y la investigaci贸n reportada en este trabajo fue aprobada por The We realiz贸 un estudio de asociaci贸n de polimorfismo DC-SIGNR en 197 ni帽os nacidos de madres infectadas con VIH-1 no tratadas reclutados en Harare, Zimbabwe. De ellos, 97 ni帽os fueron infectados con VIH-1 y 100 ni帽os permanecieron sin infecci贸n. De los 97 ni帽os infectados con VIH-1, 57 fueron infectados con IU, 11 con IP infectada y 17 infectados con PP. No se determin贸 el momento de la infecci贸n para 12 ni帽os infectados con VIH-1. Las caracter铆sticas basales de las madres y lactantes se presentan en la Tabla 1. La edad materna y el recuento de c茅lulas CD4, el sexo infantil, el modo de parto, la duraci贸n de la ruptura de membrana y la edad gestacional fueron similares entre todos los grupos. Sin embargo, la carga viral materna 29 000 copias/ml se asoci贸 con un aumento del riesgo tanto en UI como en PP con odds ratios (OR) de 3,64 (IC 95% = 1,82-7,31, P = 0,0002) y 4,45 (IC 95% = 1,50-13,2, P = 0,0045) para la transmisi贸n del VIH-1, respectivamente. En nuestras muestras de estudio (Tablas S2 y S3 ) se identificaron 15 SNPs marcados con haplotipos (htSNPs) correspondientes a los 15 haplotipos principales de DC-SIGNR (Figura 1 ). H1 (31%) y H3 (11%) fueron los haplotipos m谩s frecuentes observados (Figura 1 ) siendo homocigosos para el haplotipo H1 se asociaron con un aumento del riesgo de ambas UI (OR: 4, Los beb茅s que albergaban dos combinaciones de copias de haplotipos H1 y/ o H3 (H1-H1, H1-H3 o H3-H3) ten铆an un mayor riesgo de IU (OR: 3,42, P = 0,007) e IP (OR: 5,71, P = 0,025) pero no de infecci贸n por VIH-1 (P = 0,098) en comparaci贸n con los no portadores infantiles (Tabla 2 ). Estas 煤ltimas asociaciones siguieron siendo significativas tras el ajuste de la carga viral materna para ambas UI (OR: 3,57, IC 95% = 1,30-9,82, P = 0,013) e IP (OR: 5,71, IC 95% = 1,40-23, P = 0,025) transmisi贸n del VIH-1. Los haplotipos H1 y H3 comparten un grupo de mutaciones (p-198A, int2-391C, int2-180A, ex4 De estos, las variantes p-198A e int2-180A se asociaron significativamente con la TCM del VIH-1 (Tabla S2 ). En el an谩lisis de regresi贸n no ajustado, los lactantes homocigotos para las variantes p-198A e int2-180A presentaron un aumento del riesgo de UI (OR: 2,07 P = 0,045, OR: 3,78, P = 0,003, respectivamente) e IP (OR: 2,47, P = 0,17, O.R: 5,71, P = 0,025, respectivamente) infecci贸n por VIH-1 en comparaci贸n con los lactantes o no portadores de heterocigoto (Tabla 3). Cuando se realiz贸 ajuste por factores maternos, s贸lo la asociaci贸n con la variante int2-180A sigui贸 siendo significativa para la transmisi贸n por IU (OR: 3,83, IC 95% = 1,42-10, 4, P = 0,008) e IP As铆, los beb茅s homocigotos para la variante DC-SIGNR int2-180A contenida en los haplotipos H1 y H3 tuvieron 4 a 6 veces m谩s probabilidades de ser infectados por el VIH-1 durante el embarazo o durante el parto, respectivamente. La empalme alternativa del gen DC-SIGNR en la placenta produce ambos repertorios isoformados unidos a membrana y solubles [3]. La proporci贸n relativa de DC-SIGNR unido a membrana y soluble podr铆a influir de manera plausible en la susceptibilidad a la infecci贸n VIH-1 [11]. Por lo tanto, hicimos una hip贸tesis de que las mutaciones DC-SIGNR asociadas con la TCM del VIH-1 tendr铆an un impacto tanto en el nivel de expresi贸n DC-SIGNR y en el repertorio isoforma producido. Se clon贸 DC-SIGNR a partir de tejidos placentarios mediante RT-PCR a partir de 3 muestras H1 homocigotas que conten铆an tanto las variantes DC-SIGNR p-198AA e int2-180AA asociadas a la transmisi贸n del VIH-1 y 3 muestras de tipo salvaje homocigoto (WT) (p-198CC, int2-180GG). Se seleccionaron quince clones por muestra al azar para su secuenciaci贸n. Como era de esperar, se encontr贸 un amplio repertorio de transcripciones DC-SIGNR en todas las muestras con 9 a 16 isoformas diferentes por individuo. Se identificaron un total de 65 transcripciones distintas (Figura S1), de las cuales 3 eran transcripciones de duraci贸n completa. 64 de los clones secuenciados conten铆an un total de 69 sustituciones de amino谩cidos con 3 nuevos C terminos y 2 codones de parada Sin embargo, la diversidad se atribuy贸 principalmente a la eliminaci贸n total del ex贸n 2 o ex贸n 3 o a variaciones en la longitud de la regi贸n del cuello (ex贸n 4) del DC-SIGNR. La eliminaci贸n del ex贸n 3 elimina el dominio transmembrana de la prote铆na y conduce a la expresi贸n de isoformas solubles del DC-SIGNR [3]. Curiosamente, la abundancia de isoformas ligadas a la membrana en los tejidos placentarios de los homocigotos H1 parece ser menor que la observada en muestras de individuos de WT (Figura S1 ). La eliminaci贸n del ex贸n 3 fue confirmada por la secuenciaci贸n e hipotetizamos que el salto de ex贸n 3 podr铆a deberse a la presencia de la mutaci贸n int2-180A observada en lactantes con el haplotipo H1. De hecho, esta mutaci贸n intron se encuentra 180 pb aguas abajo del ex贸n 3 y potencialmente modifica los eventos de empalme (Figura 2A ). Confirmamos que la variaci贸n en las proporciones de transcripci贸n observadas entre los dos grupos tambi茅n se reflej贸 en el nivel de expresi贸n del ARNm en la placenta. Para cuantificar las isoformas unidos a la membrana frente a las isoformas solubles en muestras placentarias de beb茅s homocigosos H1 y WT, amplificamos la secuencia del ex贸n 5 (E5) presente en todas las isoformas DC-SIGNR (transcripciones totales). Luego amplificamos el ex贸n 3 (E3) que se elimina en las formas solubles y luego calculamos la relaci贸n E3:E5. Se encontr贸 que los tejidos placentarios de los lactantes homocigosos H1 expresan una proporci贸n significativamente menor de DC-SIGNR unido a la membrana (18%) en comparaci贸n con los de los individuos WT (36%) (P = 0,004) (Figura 2B ) sugiriendo que el salto de ex贸n 3 ocurre con mayor frecuencia en presencia de la variante DC-SIGNR int2-180A asociada con el TCM del VIH-1. La variante DC-SIGNR int2-180A siempre se transmite con la mutaci贸n promotora p-198A (Figura 1 ). En el an谩lisis de regresi贸n no ajustado, la variante p-198A se asoci贸 significativamente con UI pero no con la transmisi贸n IP y PP VIH-1 (Tabla 3). El an谩lisis del sitio de uni贸n del factor de transcripci贸n computacional predice Tabla 1. Figura 3A ). La actividad luciferasa del constructo variante p-198A fue significativamente menor que la del constructo promotor de WT p-198C (p-198C/A ratio = 2, P = 0,006) (Figura 3B ) sugiriendo que DC-SIGNR p-198A afecta a la actividad promotora. Los otros mutantes promotores (p-577C y p-323A) observados en la poblaci贸n zimbabuense no afectaron a la transcripci贸n DC-SIGNR en este ensayo (Figura S2). Para determinar el impacto neto de la mutaci贸n DC-SIGNR p-198A sobre la expresi贸n DC-SIGNR en la placenta, cuantificamos el n煤mero absoluto de transcripciones DC-SIGNR totales y de uni贸n de membrana en las muestras homocigoto H1 y placentales de tipo salvaje El n煤mero total de transcripciones DC-SIGNR se determin贸 en 6856213 (copias DC-SIGNR6S.E.M por 10 5 copias GAPDH) en las muestras placentarias de lactantes homocig贸ticos H1 y fue 4 veces menor en comparaci贸n con la encontrada en las placentas de individuos WT (27816638, P = 0.011) (Figura 3C ). Como se sugiri贸 anteriormente, la mutaci贸n int2-180A podr铆a inducir el salto de ex贸n 3 dando lugar a una menor producci贸n de DC-SIGNR unido a membrana. Aunque la disminuci贸n en el n煤mero total de transcripciones DC-SIGNR en muestras placentarias homocig贸ticas H1 que conten铆an tanto las variantes p-198AA como int2-180AA afect贸 la proporci贸n de isoformas solubles y ligadas a la membrana, el efecto de estas mutaciones fue m谩s pronunciado en las isoformas ligadas a la membrana con una disminuci贸n de 8 veces (H1 = 117636,2 vs WT = 9906220,6; P = 0,003) en comparaci贸n con una disminuci贸n de 3 veces en las isoformas solubles totales (H1 = 5686181,9 vs WT = 19256495,3; P = 0,03) (Figura 3C). Por lo tanto, las mutaciones DC-SIGNR p-198A e int2-180A asociadas con la TCM del VIH-1 disminuyeron significativamente el nivel Tabla 3. Asociaciones entre el promotor de DC-SIGNR infantil p-198 e intron 2 (int2)-180 variantes e intrauterina (UI), intraparto (IP) y postparto (PP) transmisi贸n del VIH-1 de madre a hijo. Nuestros resultados gen茅ticos, apoyados por el ensayo de expresi贸n en placenta, sugieren la implicaci贸n de DC-SIGNR en el TCM del VIH-1. La homocigosidad para el haplotipo H1 se asoci贸 con la transmisi贸n de UI en el an谩lisis de regresi贸n no ajustada. Sin embargo, la asociaci贸n desapareci贸 despu茅s del ajuste para los factores maternos presumiblemente debido al peque帽o n煤mero de beb茅s homocigotos H1 analizados en cada grupo. H1 y H3 fueron los haplotipos m谩s frecuentes observados en la poblaci贸n del estudio y comparten un grupo de mutaciones (Figura 1 ). La agrupaci贸n de haplotipos H1 y H3 aument贸 el poder del estudio y permiti贸 la identificaci贸n de mutaciones DC-SIGNR espec铆ficas asociadas con la TCM del VIH-1. De hecho, dos mutaciones compartidas por los haplotipos H1 y H3 se asociaron con la transmisi贸n vertical del VIH-1. La int2-180A se asoci贸 con un aumento de 4 veces en el riesgo de UI y 6 veces en el riesgo de IP despu茅s del ajuste por los factores maternos. Aunque la variante p-198A se asoci贸 con la transmisi贸n UI, la asociaci贸n desapareci贸 despu茅s del ajuste por la carga viral materna. Sin embargo, se demostr贸 que esta mutaci贸n reduce la actividad transcripcional DC-SIGNR in vitro y produce un menor nivel de transcripciones DC-SIGNR en tejidos placentarios en combinaci贸n con la variante int2-180A. Dado que int2-180A siempre se transmite con p-198A en los haplotipos combinados asociados a la ETMT H1/H3, mientras que p-198A se lleva a cabo en otros haplotipos no asociados (Figura 1), podemos especular que la mutaci贸n p-198A sola puede tener un efecto menor in vivo, mientras que en combinaci贸n con la variante int2-180A, ambos act煤an para reducir el nivel de expresi贸n DC-SIGNR placentaria que resulta en un aumento del riesgo de ETM de VIH-1. La mayor铆a de la transmisi贸n de UI ocurre durante el 煤ltimo trimestre del embarazo (revisado en [12] ). Las muestras de placenta a t茅rmino completo no estaban disponibles para el estudio actual y los ensayos de expresi贸n se realizaron en tejidos placentales de primer plazo. Un estudio previo que analiz贸 el repertorio de isoformas placentarias DC-SIGNR en muestras de placenta a t茅rmino demostr贸 una diversidad similar de transcripciones DC-SIGNR como en los tejidos placentarios de primer t茅rmino estudiados en este estudio [3]. Sin embargo, dado que los niveles de expresi贸n DC-SIGNR nunca se han comparado entre los diferentes t茅rminos del embarazo, no se sabe si la expresi贸n DC-SIGNR var铆a durante el embarazo. Sin embargo, es razonable suponer que las diferencias interindividuales tanto en el repertorio isoformo de DC-SIGNR como en los niveles de transcripci贸n observados entre los beb茅s homocig贸ticos H1 y WT se reflejar铆an a lo largo del embarazo. Hasta la fecha, la mayor铆a de los estudios se han centrado en el papel potencial de DC-SIGNR en la infecci贸n trans del VIH-1 in vitro [2, 10]. Sin embargo, los m煤ltiples mecanismos involucrados en la infecci贸n trans y redundancia entre las funciones de la lectina de tipo C dificultan la determinaci贸n de la participaci贸n real de DC-SIGNR en este modo de infecci贸n in vivo [13, 14]. La fuerte correlaci贸n que observamos entre la transmisi贸n vertical del VIH-1 y las variantes gen茅ticas de DC-SIGNR que producen bajos niveles de DC-SIGNR en la placenta sugiere que mecanismos distintos de la infecci贸n trans mediada por DC-SIGNR podr铆an operar durante la transmisi贸n vertical del VIH-1. Por ejemplo, DC-SIGNR tambi茅n ha demostrado funcionar como receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor [15]. Chan y sus colegas demostraron recientemente que las c茅lulas CHO transfectadas por DC-SIGNR disminuyen los t铆tulos de SARS-CoV mediante una mayor captura y degradaci贸n del virus de manera dependiente del proteasoma [4]. Dado que las c茅lulas endoteliales expresan MHC-I y II, los ant铆genos virales degradados podr铆an presentarse a las c茅lulas inmunes para provocar una respuesta inmune adaptativa [16, 17]. El receptor de n煤cleo HIV-1 CCR5, pero no CD4, se coexpresa con DC-SIGNR en las c茅lulas endoteliales placentarias y de barrera hematoencef谩lica (BBB) [18, 19]. La uni贸n del VIH-1 gp120 al receptor CCR5 en las c茅lulas endoteliales compromete la integridad del BBB y aumenta la adhesi贸n y transmigraci贸n de los monocitos a trav茅s del BBB [20, 21]. Por lo tanto, es posible que una menor expresi贸n de DC-SIGNR, en particular las isoformas ligadas a la membrana, en las c茅lulas endoteliales capilares placentarias pueda favorecer la uni贸n del VIH-1 al receptor CCR5, en lugar del receptor DC-SIGNR, facilitando la migraci贸n de las c茅lulas maternas infectadas por el VIH-1 a trav茅s de la barrera placentaria que resulta en la transmisi贸n UI del VIH-1. La variante int2-180A contenida en los haplotipos H1 y H3 se asoci贸 con la transmisi贸n IP, lo que sugiere que DC-SIGNR tambi茅n afecta a la transmisi贸n del VIH-1 durante el parto. El paso por el canal del parto podr铆a exponer potencialmente a los beb茅s a trav茅s de una entrada en el portal de la mucosa (presumiblemente oftalmol贸gica, cut谩nea o gastrointestinal), mientras que el insulto placentario durante el parto (f铆sico o inflamatorio) puede mejorar el paso transplacental de las c茅lulas maternas infectadas por el VIH-1 a la circulaci贸n fetal [22, 23]. Este proceso llamado microtransfusi贸n se ha propuesto con respecto a los resultados obtenidos en una cohorte malauiana. Kweik y sus colegas encontraron una asociaci贸n significativa entre los niveles de ADN materno en la sangre del cord贸n umbilical y la transmisi贸n IP del VIH-1, lo que sugiere que es probable que el paso de c茅lulas maternas infectadas a trav茅s de la placenta ocurra durante el parto [22]. As铆, de manera similar a lo sugerido anteriormente para la transmisi贸n de la IU, el nivel relativamente inferior de DC-SIGNR en la placenta de los beb茅s homocigotos que albergan la variante int2-180A podr铆a promover la uni贸n del VIH-1 al receptor CCR5 en las c茅lulas endoteliales que afectan la integridad de la barrera placentaria y facilitan el paso de las c茅lulas maternas infectadas en la circulaci贸n fetal durante el parto. Adem谩s de DC-SIGNR, se sabe que otros receptores del VIH-1 influyen en la TCM del VIH-1 (revisado en [24] ). Se ha demostrado que las variantes gen茅ticas de la CCR5 influyen en la transmisi贸n vertical del VIH-1. Las variantes promotoras de la CCR5 que resultan en una mayor expresi贸n del receptor se asocian con un mayor riesgo de TCM del VIH-1 entre los africanos subsaharianos [25, 26]. El polimorfismo de eliminaci贸n de 32 pb en la CCR5 se ha demostrado que protege de la transmisi贸n vertical del VIH-1 [27], pero esta variante est谩 pr谩cticamente ausente entre las poblaciones africanas [28]. El elevado n煤mero de copias de CCL3L1, un potente ligando supresor del VIH-1 para la CCR5, est谩 asociado con una mayor producci贸n de quimioquinas y un menor riesgo de TCM del VIH-1 entre los lactantes sudafricanos [29, 30]. La lectina de uni贸n a la manosa (MBL) es un receptor inmune innato sintetizado en el h铆gado y segregado en el torrente sangu铆neo en respuesta a la se帽al de inflamaci贸n. MBL promueve la eliminaci贸n de pat贸genos por opsonizaci贸n y fagocitosis, y la expresi贸n reducida de MBL resultante de polimorfismo en regiones codificantes y no codificantes se ha asociado con un aumento del riesgo de TCM del VIH En este estudio, demostramos por primera vez, el impacto funcional potencial de las mutaciones DC-SIGNR en su expresi贸n en la placenta y en la transmisi贸n vertical del VIH-1. Creemos que la presencia de DC-SIGNR en la superficie celular endotelial placentaria puede proteger a los beb茅s de la infecci贸n por el VIH-1 capturando virus y promoviendo su degradaci贸n/presentaci贸n. Sin embargo, en la placenta que contiene bajos niveles de DC-SIGNR, el VIH-1 se une preferentemente al CCR5 en c茅lulas endotelial, lo que resulta en una p茅rdida de integridad de la barrera placentaria y un mayor paso de las c茅lulas maternas infectadas por el VIH-1 en la circulaci贸n fetal que conduce al TCM del VIH-1. Este mecanismo tambi茅n puede aplicarse a otros pat贸genos transmitidos verticalmente conocidos por interactuar con DC-SIGNR como el VIH-2, hepatitis C y virus del dengue y Las asociaciones entre los genotipos de regi贸n repetida de DC-SIGNR infantil exon 4 y la transmisi贸n del VIH-1 de madre a hijo.CI, Intervalo de confianza; N, n煤mero; NA; no aplicable; OR, odds ratio a P-value seg煤n lo determinado por la prueba Chi-cuadrado. b Comparaci贸n entre el genotipo y todos los dem谩s. Se encontr贸 en: doi:10.1371/journal.pone.0007211.s003 (0,05 MB DOC) Figura S1 DC-SIGNR transcripciones repertorio en placenta. Los principales productos RT-PCR a partir del extracto de ARN de 3 muestras homocig贸ticas H1 y 3 homocig贸ticas WT placenta fueron purificadas, clonadas y secuenciadas. Se analizaron las secuencias seg煤n la secuencia de referencia NCBI NM_014257. TC; cola citoplasm谩tica, TM; dominio transmembrana; WT; tipo salvaje Se encontr贸 en: doi:10.1371/journal.pone.0007211.s004 (0,11 MB DOC) Figura S2 Efecto de la variante promotora DC-SIGNR sobre la actividad transcripcional en el ensayo de reporter de luciferasa in vitro en c茅lulas transfectadas HeLa. Expresi贸n relativa de luciferasa de pGL2-Basico, vector parental sin promotor. Expresi贸n Constructos de promotor DC-SIGNR, variante p-577C o variante p-323A se calcularon relativamente a este valor. Los datos se presentan en valores medios6S.E.M de tres experimentos independientes realizados por triplicado. Para comparar la expresi贸n relativa de luciferasa de los receptores de variantes p-557C y p-323A contra el constructo de tipo salvaje (WT) se utiliz贸 la prueba ANOVA de ida seguida de la prueba Dunnett para la comparaci贸n m煤ltiple. El vector CMV-Tat de 0 mg, 0,5 mg o 1 mg se transfect贸 con LTR-Luc como control positivo en estos experimentos. | 驴Cu谩l es el papel de C-C Motif Chemokine Ligand 3 Like 1 (CCL3L1) en la transmisi贸n del VIH-1 de madre a hijo? | false | 316 | {
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630 | Las variantes gen茅ticas funcionales en DC-SIGNR est谩n asociadas con la transmisi贸n del VIH-1 de madre a hijohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2752805/Boily-Larouche, Genevi猫ve; Iscache, Anne-Laure; Zijenah, Lynn S.; Humphrey, Jean H.; Mouland, Andrew J.; Ward, Brian J.; Roger, Michel2009-10-07DOI:10.1371/journal.pone.0007211Licencia:cc-byAbstract: ANTECEDENTES: La transmisi贸n de madre a hijo (MTCT) es la principal causa de infecci贸n por VIH-1 en ni帽os de todo el mundo. Dado que el receptor de lectina de tipo C, el receptor de lectina dendr铆tico espec铆fico para c茅lulas ICAM no relacionado con la integraci贸n (DC-SIGNR, tambi茅n conocido como CD209L o ganglio hep谩tico/linfa-nodo espec铆fico para ICAM no integrador (L-SIGN)), puede interactuar con pat贸genos incluyendo el VIH-1 y se expresa en la interfaz materno-fetal, se hipotetiza que podr铆a influir en la TCM del VIH-1. M脡TODOS Y INDICACIONES: Para investigar el papel potencial de DC-SIGNR en la TCM del VIH-1, realizamos un estudio de asociaci贸n gen茅tica de DC-SIGNR en una cohorte bien caracterizada de 197 madres infectadas por el VIH y sus beb茅s reclutados en Harare, Zimbabwe. Los lactantes que albergaban dos copias de los haplotipos DC-SIGNR H1 y/o H3 (H1-H1, H1-H3, H3-H3) tuvieron un aumento de 3,6 veces el riesgo de infecci贸n por VIH-1 en el 煤tero (UI) (P = 0,013) y un aumento de 5,7 veces el riesgo de infecci贸n por VIH-1 en el intraparto (IP) (P = 0,025) despu茅s de ajustarse para varios factores maternos. Los haplotipos H1 y H3 implicados comparten dos polimorfismos de nucle贸tidos 煤nicos (SNP) en la regi贸n promotora (p-198A) e intron 2 (int2-180A) que se asociaron con un aumento del riesgo de ambas UI (P = 0,045 y P = 0,003, respectivamente) e IP (P = 0,025, para la infecci贸n por VIH-1) La variante En los lactantes homocigotos H1 con mutaciones tanto p-198A como int2-180A, observamos una disminuci贸n de 4 veces en el nivel de transcripciones DC-SIGNR placentarias, afectando desproporcionadamente la expresi贸n de isoformas ligadas a la membrana en comparaci贸n con las no portadoras infantiles (P = 0,011). CONCLUSI脫N: Estos resultados sugieren que DC-SIGNR juega un papel crucial en la TCM del VIH-1 y que la expresi贸n DC-SIGNR placentaria alterada aumenta el riesgo de transmisi贸n. Texto: Sin intervenciones espec铆ficas, la tasa de transmisi贸n del VIH-1 de madre a hijo (TCMM) es de aproximadamente 15-45% [1]. ONUSIDA estima que solo el a帽o pasado, m谩s de 400.000 ni帽os fueron infectados en todo el mundo, principalmente a trav茅s de la TCM y el 90% de ellos viv铆an en el 脕frica subsahariana. En los pa铆ses m谩s afectados, como Zimbabwe, el La TCM del VIH-1 puede ocurrir durante el embarazo (in utero, UI), el parto (intraparto, IP) o la lactancia materna (postparto, PP). La alta carga viral materna, el bajo recuento de c茅lulas CD4, el parto vaginal, la baja edad gestacional se han identificado como factores independientes asociados con la TCM del VIH-1 [1]. Aunque los antirretrovirales pueden reducir la TCM al 2%, el acceso limitado a diagn贸sticos y medicamentos oportunos en muchos pa铆ses en desarrollo limita el impacto potencial de esta estrategia. Una mejor comprensi贸n de los mecanismos que act煤an en la interfaz materno-fetal es crucial para el dise帽o de intervenciones alternativas a la terapia antirretroviral para la prevenci贸n de la transmisi贸n. Las c茅lulas dentr铆ticas espec铆ficas de la ICAM no relacionadas con la integraci贸n (DC-SIGNR, tambi茅n conocido como CD209L o ICAM no integrador (L-SIGN)) pueden interactuar con una pl茅tora de pat贸genos incluyendo VIH-1 y se expresa en c茅lulas endoteliales capilares placentarias [2]. DC-SIGNR se organiza en tres dominios distintos, una cola citopl谩smica N-terminal, una regi贸n de repetici贸n que contiene siete repeticiones de 23 amino谩cidos y un dominio C-terminal implicado en la uni贸n de pat贸genos. El empalme alternativo del gen DC-SIGNR conduce a la producci贸n de un repertorio de isoformas altamente diversificadas que incluye isoformas asociadas a la membrana y solubles [3]. Se ha propuesto que la interacci贸n entre DC-SIGNR y VIH-1 podr铆a mejorar la transferencia viral a otros tipos de c茅lulas sensibles [2] pero DC-SIGNR tambi茅n puede internalizar y mediar la degradaci贸n dependiente de proteasomas de virus [4] que pueden afectar de manera diferente el resultado de la infecci贸n. Dada la presencia de DC-SIGNR en la interfaz materno-fetal y su interacci贸n con el VIH-1, se hizo una hip贸tesis de que podr铆a influir en la TCM del VIH-1. Para investigar el papel potencial de DC-SIGNR en la TCM del VIH-1, se llev贸 a cabo un estudio de asociaci贸n gen茅tica de DC-SIGNR en una cohorte bien caracterizada de madres infectadas por el VIH y sus beb茅s reclutados en Zimbabwe, y se identificaron variantes espec铆ficas de DC-SIGNR asociadas con el aumento de los riesgos de transmisi贸n del VIH. Adem谩s, caracterizamos el impacto funcional de estas variantes gen茅ticas en la expresi贸n DC-SIGNR y demostramos que afectan tanto al nivel como al tipo de transcripciones DC-SIGNR producidas en la placenta. Las muestras consistieron en extractos de ADN almacenados obtenidos de 197 parejas madre-hijo co-inscritas inmediatamente despu茅s del parto en el ensayo de suplementaci贸n de vitamina A de ZVITAMBO (Harare, Zimbabwe) y seguidos a 6 semanas e intervalos de 3 meses hasta 24 meses. El proyecto ZVITAMBO fue un ensayo cl铆nico aleatorizado controlado con placebo que incluy贸 a 14.110 parejas madre-hijo, entre noviembre de 1997 y enero de 2000, con el objetivo principal de investigar el impacto de la suplementaci贸n inmediata de vitamina A de postparto en la TCM del VIH-1. Las muestras utilizadas en el presente estudio fueron de parejas madre-hijo asignadas aleatoriamente al grupo placebo del proyecto ZVI La profilaxis antirretroviral para mujeres embarazadas VIH-1 positivas no estaba disponible en el sector p煤blico de Harare durante el reclutamiento de pacientes de ZVITAMBO. Las muestras fueron obtenidas consecutivamente de dos grupos: 97 parejas de madres VIH-1 positivas/hijos VIH-1 positivos y 100 parejas de madres VIH-1 positivas/ni帽os VIH-negativos. El estado serol贸gico de la madre fue determinado por ELISA y confirmado por Western Blot. Se consider贸 que los lactantes estaban infectados si eran seropositivos a los 18 meses o mayores y ten铆an dos o m谩s resultados positivos de reacci贸n en cadena de la polimerasa del VIH-1-DNA (PCR) a edades m谩s tempranas. Se consider贸 que 100 ni帽os no estaban infectados por ser ELISA negativos a los 18 meses o mayores y tuvieron dos resultados negativos de PCR de ADN de muestras recogidas a una edad m谩s temprana. De los 97 ni帽os infectados por el VIH-1, 57 fueron infectados IU, 11 fueron infectados IP y 17 fueron infectados PP seg煤n los an谩lisis de PCR de muestras de sangre recolectadas al nacer, 6 semanas, 3 y 6 meses de edad y seg煤n las siguientes definiciones adaptadas de Bryson y colegas [5]. Brevemente, los beb茅s con ADN PCR positivo al nacer fueron infectados IU. Los beb茅s con PCR negativo resultado de la muestra obtenida al nacer pero que se hicieron positivos por 6 semanas de edad fueron infectados IP. Los lactantes con resultados negativos de PCR al nacer y 6 semanas de edad pero que posteriormente se convirtieron en DNA PCR positivo fueron considerados infectados durante el per铆odo PP. En el an谩lisis de comparaci贸n de los 3 modos diferentes de TCM, 12 beb茅s infectados por el VIH-1 fueron excluidos porque los resultados de PCR no estaban disponibles a las 6 semanas de edad. M茅todos completos de reclutamiento, recolecci贸n de caracter铆sticas basales, procedimientos de laboratorio La variaci贸n de la secuencia de nucle贸tidos de todo el promotor, codificaci贸n y parte de las 39 regiones UTR del gen DC-SIGNR en la poblaci贸n del estudio se determin贸 previamente [7]. La reconstrucci贸n del haplotipo se realiz贸 utilizando el m茅todo estad铆stico Bayesiano implementado en FASE [8], versi贸n 2.1.1, utilizando polimorfismo nucle贸tido 煤nico (SNP) con una frecuencia m铆nima de alelos (MAF) del 2%. Aplicamos el algoritmo cinco veces, utilizando diferentes semillas generadas aleatoriamente, y se obtuvieron resultados consistentes a lo largo de las carreras (Figura 1 ). Quince SNPs con etiqueta de haplotipo (htSNPs) fueron identificados por el software HaploBlockFinder [9] con un MAF $5%. Estos htSNPs fueron genotipados en los 197 infantes mediante el an谩lisis de secuenciaci贸n PCR directo como hemos descrito El genotipo de regi贸n de repetici贸n DC-SIGNR 4 fue determinado por amplificaci贸n PCR seguida de migraci贸n en geles de agarosa del 1,5% [10]. Se analizaron secuencias de ADN en la regi贸n promotora con la interfaz TESS (http//:www.cbil.upenn.edu/tess) para sitios de uni贸n de factores de transcripci贸n putativos utilizando la base de datos TRANSFAC. Se realizaron ensayos de reporteros Luciferase utilizando vector pGL2-B谩sico para investigar el efecto funcional de mutaciones en la actividad promotora DC-SIGNR. El ADN gen贸mico de los sujetos homocigotos para las variantes promotoras y WT fue amplificado desde la posici贸n nucle贸tida 2715 a 21 y clonado entre los sitios de clonaci贸n m煤ltiple BglII y HindIII en el vector pGL2-Basico que alberga un gen luciferasa de luciferasa de reportero aguas abajo (Invitrogen Canada inc, Burlington, Canad谩). Todos los clones recombinantes fueron verificados por secuenciaci贸n de ADN. El vector reportero de prueba de luciferasa de luciferasa de luciferasa de luciferasa de luciferasa de fuego fue co-transfectado a una proporci贸n de 10:1 con el expresor constitutivo de Renilla luciferasa, phRL-CMV (Promega, Madison, WI, EE.UU.). Cultivamos c茅lulas Las c茅lulas se lisaron y se realizaron ensayos de luciferasa utilizando 20 mg de extracto proteico seg煤n el fabricante (Promega) a 44 h de post-transfecci贸n. La actividad luciferasa de Firefly se normaliz贸 a la actividad de Renilla luciferasa. El vector CMV-Tat de 0 mg, 0,5 mg o 1 mg se transfect贸 con LTR-Luc como un control positivo en estos experimentos. Realizamos ensayos de lucierasa por triplicado en tres experimentos independientes. Los resultados se expresan como error est谩ndar medio 6 (S.E.M.). Los tejidos placentarios de primer t茅rmino se obtuvieron a partir de abortos tras la interrupci贸n voluntaria del embarazo en CHUM H么pital Saint-Luc (Montreal, Canad谩). Se utilizaron tejidos de 3 H1 (asociados con TCM del VIH-1) y 3 H15 (tipo salvaje) haplotipos homocigotos para analizar posibles diferencias en la expresi贸n isoforma. Los ARN placentarios totales fueron extra铆dos por MasterPure DNA y ARN Extraction Kit (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI, USA) seg煤n el fabricante. Fragmentos correspondientes a la regi贸n de codificaci贸n DC-SIGNR fueron transcritos (RT) invertidas y luego amplificados por PCR anidados con los siguientes imprimadores; RT imprimadores RR, primer PCR RF y RR y segundo PCR RcF y RcR seg煤n Liu y colegas [11]. 1 mg de ARN total fue transcrito con Expand RT (Roche Applied Science, Indian谩polis, IN, EE.UU.) seg煤n el fabricante y fue amplificado con PCR de ADN Platinum Taq Polymerase (Invitrogen). Los principales productos de PCR de la segunda reacci贸n PCR fueron extra铆dos en gel con el Qiagen Gel Extraction Kit (Qiagen Canada inc, Mississauga, ON, Canad谩) y clonados utilizando el TOPO TA Cloning Kit para secuenciaci贸n (Invitrogen). Para cada placenta, 15 clones diferentes fueron seleccionados aleatoriamente y amplificados con imprimadores M13 y secuenciados con secuenciador automatizado ABI PRISM 3100 capilar (Applicated Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Las secuencias fueron analizadas y alineadas con secuencia de referencia GeneBank NM La expresi贸n cuantitativa de las isoformas DC-SIGNR 1,5 mg de ARN placentario fue transcrita inversamente utilizando 2,5 mM de Oligo dT 20 y Expand RT en 20 ml de volumen seg煤n el fabricante (Roche Applied Science). 15 ng de cDNA total en un volumen final de 20 ml se utiliz贸 para realizar PCR cuantitativa en tiempo real utilizando Universal Express SYBR GreenER qPCR Supermix (Invitrogen) en un Rotor Gene Realtime Rotary Analyser (Corbett Life Science, Sydney, Australia). Se utilizaron muestras de 2 sujetos en cada grupo porque la calidad ARN de otros no era adecuada para un an谩lisis QRT-PCR. La amplificaci贸n de todas las isoformas DC-SIGNR se realiz贸 utilizando un par de primos espec铆fico exon 5 (Tabla S1 ). Las isoformas ligadas a la membrana se amplificaron utilizando imprimaciones espec铆ficas para el ex贸n 3, correspondientes al dominio transmembrana com煤n de DC-SIGNR. Las primeras fueron dirigidas a la uni贸n exon-ex贸n y los extractos de ARN fueron tratados con Dnasa (Fermantas International inc, Burlington, ON, Canad谩) para evitar la amplificaci贸n del ADN contaminante. Las curvas est谩ndar (50-500 000 copias por reacci贸n) fueron generadas mediante diluci贸n en serie de un DC-SIGNR de larga duraci贸n o ADN de plasma GAPDH comercial (Invitrogen). Todas las reacciones de qPCR tuvieron eficiencias que oscilaban entre el 99% y el 100%, incluso en presencia de 20 ng de 谩cidos nucleicos no espec铆ficos, y por lo tanto se pudo comparar. El n煤mero de copias de muestras desconocidas se estim贸 colocando el n煤mero de ciclo de PCR medido (u Para corregir las diferencias en calidad de ARN y cantidad entre muestras, los niveles de expresi贸n de las transcripciones fueron normalizados a las transcripciones gen茅ticas GAPDH de referencia. Las secuencias de primos GAPDH fueron amablemente proporcionadas por A. Mes-Masson en el CHUM. Los resultados se presentan como n煤mero de copia g茅nica objetivo por 10 5 copias de GAPDH. La relaci贸n de isoformas ligadas a membranas fue calculada como E3/E5. Las isoformas solubles fueron calculadas restando uni贸n de membranas de isoformas totales. Realizamos ensayos de QPCR en triplicado en tres experimentos independientes. Los resultados se expresan como media6S.E.M. El an谩lisis estad铆stico se realiz贸 utilizando el GraphPad PRISM 5.0 para Windows (GraphPad Software inc, San Diego, CA, EE.UU.). Se compararon diferencias en las caracter铆sticas basales y frecuencias genot铆picas de haplotipos o htSNPs entre los grupos utilizando el an谩lisis x 2 o la prueba exacta de Fisher, se utiliz贸 el an谩lisis de regresi贸n log铆stica para estimar las odds ratios (OR) para cada genotipo y factores de riesgo basales, se utiliz贸 regresi贸n log铆stica m煤ltiple para definir predictores independientes identificados como significativos en el an谩lisis bruto, se calcularon las OR y el intervalo de confianza del 95% con el m茅todo exacto, se evaluaron comparaciones de variables continuas entre grupos con la t de Student no pareada cuando las variables se distribu铆an normalmente y con la U de Mann-Whitney cuando lo contrario, se consideraron significativas en P0,05. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todas las madres que participaron en el estudio y el ensayo de ZVITAMBO, y la investigaci贸n reportada en este trabajo fue aprobada por The We realiz贸 un estudio de asociaci贸n de polimorfismo DC-SIGNR en 197 ni帽os nacidos de madres infectadas con VIH-1 no tratadas reclutados en Harare, Zimbabwe. De ellos, 97 ni帽os fueron infectados con VIH-1 y 100 ni帽os permanecieron sin infecci贸n. De los 97 ni帽os infectados con VIH-1, 57 fueron infectados con IU, 11 con IP infectada y 17 infectados con PP. No se determin贸 el momento de la infecci贸n para 12 ni帽os infectados con VIH-1. Las caracter铆sticas basales de las madres y lactantes se presentan en la Tabla 1. La edad materna y el recuento de c茅lulas CD4, el sexo infantil, el modo de parto, la duraci贸n de la ruptura de membrana y la edad gestacional fueron similares entre todos los grupos. Sin embargo, la carga viral materna 29 000 copias/ml se asoci贸 con un aumento del riesgo tanto en UI como en PP con odds ratios (OR) de 3,64 (IC 95% = 1,82-7,31, P = 0,0002) y 4,45 (IC 95% = 1,50-13,2, P = 0,0045) para la transmisi贸n del VIH-1, respectivamente. En nuestras muestras de estudio (Tablas S2 y S3 ) se identificaron 15 SNPs marcados con haplotipos (htSNPs) correspondientes a los 15 haplotipos principales de DC-SIGNR (Figura 1 ). H1 (31%) y H3 (11%) fueron los haplotipos m谩s frecuentes observados (Figura 1 ) siendo homocigosos para el haplotipo H1 se asociaron con un aumento del riesgo de ambas UI (OR: 4, Los beb茅s que albergaban dos combinaciones de copias de haplotipos H1 y/ o H3 (H1-H1, H1-H3 o H3-H3) ten铆an un mayor riesgo de IU (OR: 3,42, P = 0,007) e IP (OR: 5,71, P = 0,025) pero no de infecci贸n por VIH-1 (P = 0,098) en comparaci贸n con los no portadores infantiles (Tabla 2 ). Estas 煤ltimas asociaciones siguieron siendo significativas tras el ajuste de la carga viral materna para ambas UI (OR: 3,57, IC 95% = 1,30-9,82, P = 0,013) e IP (OR: 5,71, IC 95% = 1,40-23, P = 0,025) transmisi贸n del VIH-1. Los haplotipos H1 y H3 comparten un grupo de mutaciones (p-198A, int2-391C, int2-180A, ex4 De estos, las variantes p-198A e int2-180A se asociaron significativamente con la TCM del VIH-1 (Tabla S2 ). En el an谩lisis de regresi贸n no ajustado, los lactantes homocigotos para las variantes p-198A e int2-180A presentaron un aumento del riesgo de UI (OR: 2,07 P = 0,045, OR: 3,78, P = 0,003, respectivamente) e IP (OR: 2,47, P = 0,17, O.R: 5,71, P = 0,025, respectivamente) infecci贸n por VIH-1 en comparaci贸n con los lactantes o no portadores de heterocigoto (Tabla 3). Cuando se realiz贸 ajuste por factores maternos, s贸lo la asociaci贸n con la variante int2-180A sigui贸 siendo significativa para la transmisi贸n por IU (OR: 3,83, IC 95% = 1,42-10, 4, P = 0,008) e IP As铆, los beb茅s homocigotos para la variante DC-SIGNR int2-180A contenida en los haplotipos H1 y H3 tuvieron 4 a 6 veces m谩s probabilidades de ser infectados por el VIH-1 durante el embarazo o durante el parto, respectivamente. La empalme alternativa del gen DC-SIGNR en la placenta produce ambos repertorios isoformados unidos a membrana y solubles [3]. La proporci贸n relativa de DC-SIGNR unido a membrana y soluble podr铆a influir de manera plausible en la susceptibilidad a la infecci贸n VIH-1 [11]. Por lo tanto, hicimos una hip贸tesis de que las mutaciones DC-SIGNR asociadas con la TCM del VIH-1 tendr铆an un impacto tanto en el nivel de expresi贸n DC-SIGNR y en el repertorio isoforma producido. Se clon贸 DC-SIGNR a partir de tejidos placentarios mediante RT-PCR a partir de 3 muestras H1 homocigotas que conten铆an tanto las variantes DC-SIGNR p-198AA e int2-180AA asociadas a la transmisi贸n del VIH-1 y 3 muestras de tipo salvaje homocigoto (WT) (p-198CC, int2-180GG). Se seleccionaron quince clones por muestra al azar para su secuenciaci贸n. Como era de esperar, se encontr贸 un amplio repertorio de transcripciones DC-SIGNR en todas las muestras con 9 a 16 isoformas diferentes por individuo. Se identificaron un total de 65 transcripciones distintas (Figura S1), de las cuales 3 eran transcripciones de duraci贸n completa. 64 de los clones secuenciados conten铆an un total de 69 sustituciones de amino谩cidos con 3 nuevos C terminos y 2 codones de parada Sin embargo, la diversidad se atribuy贸 principalmente a la eliminaci贸n total del ex贸n 2 o ex贸n 3 o a variaciones en la longitud de la regi贸n del cuello (ex贸n 4) del DC-SIGNR. La eliminaci贸n del ex贸n 3 elimina el dominio transmembrana de la prote铆na y conduce a la expresi贸n de isoformas solubles del DC-SIGNR [3]. Curiosamente, la abundancia de isoformas ligadas a la membrana en los tejidos placentarios de los homocigotos H1 parece ser menor que la observada en muestras de individuos de WT (Figura S1 ). La eliminaci贸n del ex贸n 3 fue confirmada por la secuenciaci贸n e hipotetizamos que el salto de ex贸n 3 podr铆a deberse a la presencia de la mutaci贸n int2-180A observada en lactantes con el haplotipo H1. De hecho, esta mutaci贸n intron se encuentra 180 pb aguas abajo del ex贸n 3 y potencialmente modifica los eventos de empalme (Figura 2A ). Confirmamos que la variaci贸n en las proporciones de transcripci贸n observadas entre los dos grupos tambi茅n se reflej贸 en el nivel de expresi贸n del ARNm en la placenta. Para cuantificar las isoformas unidos a la membrana frente a las isoformas solubles en muestras placentarias de beb茅s homocigosos H1 y WT, amplificamos la secuencia del ex贸n 5 (E5) presente en todas las isoformas DC-SIGNR (transcripciones totales). Luego amplificamos el ex贸n 3 (E3) que se elimina en las formas solubles y luego calculamos la relaci贸n E3:E5. Se encontr贸 que los tejidos placentarios de los lactantes homocigosos H1 expresan una proporci贸n significativamente menor de DC-SIGNR unido a la membrana (18%) en comparaci贸n con los de los individuos WT (36%) (P = 0,004) (Figura 2B ) sugiriendo que el salto de ex贸n 3 ocurre con mayor frecuencia en presencia de la variante DC-SIGNR int2-180A asociada con el TCM del VIH-1. La variante DC-SIGNR int2-180A siempre se transmite con la mutaci贸n promotora p-198A (Figura 1 ). En el an谩lisis de regresi贸n no ajustado, la variante p-198A se asoci贸 significativamente con UI pero no con la transmisi贸n IP y PP VIH-1 (Tabla 3). El an谩lisis del sitio de uni贸n del factor de transcripci贸n computacional predice Tabla 1. Figura 3A ). La actividad luciferasa del constructo variante p-198A fue significativamente menor que la del constructo promotor de WT p-198C (p-198C/A ratio = 2, P = 0,006) (Figura 3B ) sugiriendo que DC-SIGNR p-198A afecta a la actividad promotora. Los otros mutantes promotores (p-577C y p-323A) observados en la poblaci贸n zimbabuense no afectaron a la transcripci贸n DC-SIGNR en este ensayo (Figura S2). Para determinar el impacto neto de la mutaci贸n DC-SIGNR p-198A sobre la expresi贸n DC-SIGNR en la placenta, cuantificamos el n煤mero absoluto de transcripciones DC-SIGNR totales y de uni贸n de membrana en las muestras homocigoto H1 y placentales de tipo salvaje El n煤mero total de transcripciones DC-SIGNR se determin贸 en 6856213 (copias DC-SIGNR6S.E.M por 10 5 copias GAPDH) en las muestras placentarias de lactantes homocig贸ticos H1 y fue 4 veces menor en comparaci贸n con la encontrada en las placentas de individuos WT (27816638, P = 0.011) (Figura 3C ). Como se sugiri贸 anteriormente, la mutaci贸n int2-180A podr铆a inducir el salto de ex贸n 3 dando lugar a una menor producci贸n de DC-SIGNR unido a membrana. Aunque la disminuci贸n en el n煤mero total de transcripciones DC-SIGNR en muestras placentarias homocig贸ticas H1 que conten铆an tanto las variantes p-198AA como int2-180AA afect贸 la proporci贸n de isoformas solubles y ligadas a la membrana, el efecto de estas mutaciones fue m谩s pronunciado en las isoformas ligadas a la membrana con una disminuci贸n de 8 veces (H1 = 117636,2 vs WT = 9906220,6; P = 0,003) en comparaci贸n con una disminuci贸n de 3 veces en las isoformas solubles totales (H1 = 5686181,9 vs WT = 19256495,3; P = 0,03) (Figura 3C). Por lo tanto, las mutaciones DC-SIGNR p-198A e int2-180A asociadas con la TCM del VIH-1 disminuyeron significativamente el nivel Tabla 3. Asociaciones entre el promotor de DC-SIGNR infantil p-198 e intron 2 (int2)-180 variantes e intrauterina (UI), intraparto (IP) y postparto (PP) transmisi贸n del VIH-1 de madre a hijo. Nuestros resultados gen茅ticos, apoyados por el ensayo de expresi贸n en placenta, sugieren la implicaci贸n de DC-SIGNR en el TCM del VIH-1. La homocigosidad para el haplotipo H1 se asoci贸 con la transmisi贸n de UI en el an谩lisis de regresi贸n no ajustada. Sin embargo, la asociaci贸n desapareci贸 despu茅s del ajuste para los factores maternos presumiblemente debido al peque帽o n煤mero de beb茅s homocigotos H1 analizados en cada grupo. H1 y H3 fueron los haplotipos m谩s frecuentes observados en la poblaci贸n del estudio y comparten un grupo de mutaciones (Figura 1 ). La agrupaci贸n de haplotipos H1 y H3 aument贸 el poder del estudio y permiti贸 la identificaci贸n de mutaciones DC-SIGNR espec铆ficas asociadas con la TCM del VIH-1. De hecho, dos mutaciones compartidas por los haplotipos H1 y H3 se asociaron con la transmisi贸n vertical del VIH-1. La int2-180A se asoci贸 con un aumento de 4 veces en el riesgo de UI y 6 veces en el riesgo de IP despu茅s del ajuste por los factores maternos. Aunque la variante p-198A se asoci贸 con la transmisi贸n UI, la asociaci贸n desapareci贸 despu茅s del ajuste por la carga viral materna. Sin embargo, se demostr贸 que esta mutaci贸n reduce la actividad transcripcional DC-SIGNR in vitro y produce un menor nivel de transcripciones DC-SIGNR en tejidos placentarios en combinaci贸n con la variante int2-180A. Dado que int2-180A siempre se transmite con p-198A en los haplotipos combinados asociados a la ETMT H1/H3, mientras que p-198A se lleva a cabo en otros haplotipos no asociados (Figura 1), podemos especular que la mutaci贸n p-198A sola puede tener un efecto menor in vivo, mientras que en combinaci贸n con la variante int2-180A, ambos act煤an para reducir el nivel de expresi贸n DC-SIGNR placentaria que resulta en un aumento del riesgo de ETM de VIH-1. La mayor铆a de la transmisi贸n de UI ocurre durante el 煤ltimo trimestre del embarazo (revisado en [12] ). Las muestras de placenta a t茅rmino completo no estaban disponibles para el estudio actual y los ensayos de expresi贸n se realizaron en tejidos placentales de primer plazo. Un estudio previo que analiz贸 el repertorio de isoformas placentarias DC-SIGNR en muestras de placenta a t茅rmino demostr贸 una diversidad similar de transcripciones DC-SIGNR como en los tejidos placentarios de primer t茅rmino estudiados en este estudio [3]. Sin embargo, dado que los niveles de expresi贸n DC-SIGNR nunca se han comparado entre los diferentes t茅rminos del embarazo, no se sabe si la expresi贸n DC-SIGNR var铆a durante el embarazo. Sin embargo, es razonable suponer que las diferencias interindividuales tanto en el repertorio isoformo de DC-SIGNR como en los niveles de transcripci贸n observados entre los beb茅s homocig贸ticos H1 y WT se reflejar铆an a lo largo del embarazo. Hasta la fecha, la mayor铆a de los estudios se han centrado en el papel potencial de DC-SIGNR en la infecci贸n trans del VIH-1 in vitro [2, 10]. Sin embargo, los m煤ltiples mecanismos involucrados en la infecci贸n trans y redundancia entre las funciones de la lectina de tipo C dificultan la determinaci贸n de la participaci贸n real de DC-SIGNR en este modo de infecci贸n in vivo [13, 14]. La fuerte correlaci贸n que observamos entre la transmisi贸n vertical del VIH-1 y las variantes gen茅ticas de DC-SIGNR que producen bajos niveles de DC-SIGNR en la placenta sugiere que mecanismos distintos de la infecci贸n trans mediada por DC-SIGNR podr铆an operar durante la transmisi贸n vertical del VIH-1. Por ejemplo, DC-SIGNR tambi茅n ha demostrado funcionar como receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor [15]. Chan y sus colegas demostraron recientemente que las c茅lulas CHO transfectadas por DC-SIGNR disminuyen los t铆tulos de SARS-CoV mediante una mayor captura y degradaci贸n del virus de manera dependiente del proteasoma [4]. Dado que las c茅lulas endoteliales expresan MHC-I y II, los ant铆genos virales degradados podr铆an presentarse a las c茅lulas inmunes para provocar una respuesta inmune adaptativa [16, 17]. El receptor de n煤cleo HIV-1 CCR5, pero no CD4, se coexpresa con DC-SIGNR en las c茅lulas endoteliales placentarias y de barrera hematoencef谩lica (BBB) [18, 19]. La uni贸n del VIH-1 gp120 al receptor CCR5 en las c茅lulas endoteliales compromete la integridad del BBB y aumenta la adhesi贸n y transmigraci贸n de los monocitos a trav茅s del BBB [20, 21]. Por lo tanto, es posible que una menor expresi贸n de DC-SIGNR, en particular las isoformas ligadas a la membrana, en las c茅lulas endoteliales capilares placentarias pueda favorecer la uni贸n del VIH-1 al receptor CCR5, en lugar del receptor DC-SIGNR, facilitando la migraci贸n de las c茅lulas maternas infectadas por el VIH-1 a trav茅s de la barrera placentaria que resulta en la transmisi贸n UI del VIH-1. La variante int2-180A contenida en los haplotipos H1 y H3 se asoci贸 con la transmisi贸n IP, lo que sugiere que DC-SIGNR tambi茅n afecta a la transmisi贸n del VIH-1 durante el parto. El paso por el canal del parto podr铆a exponer potencialmente a los beb茅s a trav茅s de una entrada en el portal de la mucosa (presumiblemente oftalmol贸gica, cut谩nea o gastrointestinal), mientras que el insulto placentario durante el parto (f铆sico o inflamatorio) puede mejorar el paso transplacental de las c茅lulas maternas infectadas por el VIH-1 a la circulaci贸n fetal [22, 23]. Este proceso llamado microtransfusi贸n se ha propuesto con respecto a los resultados obtenidos en una cohorte malauiana. Kweik y sus colegas encontraron una asociaci贸n significativa entre los niveles de ADN materno en la sangre del cord贸n umbilical y la transmisi贸n IP del VIH-1, lo que sugiere que es probable que el paso de c茅lulas maternas infectadas a trav茅s de la placenta ocurra durante el parto [22]. As铆, de manera similar a lo sugerido anteriormente para la transmisi贸n de la IU, el nivel relativamente inferior de DC-SIGNR en la placenta de los beb茅s homocigotos que albergan la variante int2-180A podr铆a promover la uni贸n del VIH-1 al receptor CCR5 en las c茅lulas endoteliales que afectan la integridad de la barrera placentaria y facilitan el paso de las c茅lulas maternas infectadas en la circulaci贸n fetal durante el parto. Adem谩s de DC-SIGNR, se sabe que otros receptores del VIH-1 influyen en la TCM del VIH-1 (revisado en [24] ). Se ha demostrado que las variantes gen茅ticas de la CCR5 influyen en la transmisi贸n vertical del VIH-1. Las variantes promotoras de la CCR5 que resultan en una mayor expresi贸n del receptor se asocian con un mayor riesgo de TCM del VIH-1 entre los africanos subsaharianos [25, 26]. El polimorfismo de eliminaci贸n de 32 pb en la CCR5 se ha demostrado que protege de la transmisi贸n vertical del VIH-1 [27], pero esta variante est谩 pr谩cticamente ausente entre las poblaciones africanas [28]. El elevado n煤mero de copias de CCL3L1, un potente ligando supresor del VIH-1 para la CCR5, est谩 asociado con una mayor producci贸n de quimioquinas y un menor riesgo de TCM del VIH-1 entre los lactantes sudafricanos [29, 30]. La lectina de uni贸n a la manosa (MBL) es un receptor inmune innato sintetizado en el h铆gado y segregado en el torrente sangu铆neo en respuesta a la se帽al de inflamaci贸n. MBL promueve la eliminaci贸n de pat贸genos por opsonizaci贸n y fagocitosis, y la expresi贸n reducida de MBL resultante de polimorfismo en regiones codificantes y no codificantes se ha asociado con un aumento del riesgo de TCM del VIH En este estudio, demostramos por primera vez, el impacto funcional potencial de las mutaciones DC-SIGNR en su expresi贸n en la placenta y en la transmisi贸n vertical del VIH-1. Creemos que la presencia de DC-SIGNR en la superficie celular endotelial placentaria puede proteger a los beb茅s de la infecci贸n por el VIH-1 capturando virus y promoviendo su degradaci贸n/presentaci贸n. Sin embargo, en la placenta que contiene bajos niveles de DC-SIGNR, el VIH-1 se une preferentemente al CCR5 en c茅lulas endotelial, lo que resulta en una p茅rdida de integridad de la barrera placentaria y un mayor paso de las c茅lulas maternas infectadas por el VIH-1 en la circulaci贸n fetal que conduce al TCM del VIH-1. Este mecanismo tambi茅n puede aplicarse a otros pat贸genos transmitidos verticalmente conocidos por interactuar con DC-SIGNR como el VIH-2, hepatitis C y virus del dengue y Las asociaciones entre los genotipos de regi贸n repetida de DC-SIGNR infantil exon 4 y la transmisi贸n del VIH-1 de madre a hijo.CI, Intervalo de confianza; N, n煤mero; NA; no aplicable; OR, odds ratio a P-value seg煤n lo determinado por la prueba Chi-cuadrado. b Comparaci贸n entre el genotipo y todos los dem谩s. Se encontr贸 en: doi:10.1371/journal.pone.0007211.s003 (0,05 MB DOC) Figura S1 DC-SIGNR transcripciones repertorio en placenta. Los principales productos RT-PCR a partir del extracto de ARN de 3 muestras homocig贸ticas H1 y 3 homocig贸ticas WT placenta fueron purificadas, clonadas y secuenciadas. Se analizaron las secuencias seg煤n la secuencia de referencia NCBI NM_014257. TC; cola citoplasm谩tica, TM; dominio transmembrana; WT; tipo salvaje Se encontr贸 en: doi:10.1371/journal.pone.0007211.s004 (0,11 MB DOC) Figura S2 Efecto de la variante promotora DC-SIGNR sobre la actividad transcripcional en el ensayo de reporter de luciferasa in vitro en c茅lulas transfectadas HeLa. Expresi贸n relativa de luciferasa de pGL2-Basico, vector parental sin promotor. Expresi贸n Constructos de promotor DC-SIGNR, variante p-577C o variante p-323A se calcularon relativamente a este valor. Los datos se presentan en valores medios6S.E.M de tres experimentos independientes realizados por triplicado. Para comparar la expresi贸n relativa de luciferasa de los receptores de variantes p-557C y p-323A contra el constructo de tipo salvaje (WT) se utiliz贸 la prueba ANOVA de ida seguida de la prueba Dunnett para la comparaci贸n m煤ltiple. 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"Dendritic cell-specific ICAM-grabbing non-integrin-related (DC-SIGNR, also known as CD209L or liver/lymph node-specific ICAM-grabbing non-integrin (L-SIGN)) can interact with a plethora of pathogens including HIV-1 and is expressed in placental capillary endothelial cells"
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